proteomanalytische charakterisierung des glioblastoms im ... · proteomanalytische...
TRANSCRIPT
Proteomanalytische Charakterisierung des
Glioblastoms im Hinblick auf das Langzeitüberleben
Dissertation
zur Erlangung des Grades Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat)
an der Fakultät für Chemie und Biochemie der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von Anja Stefanski
angefertigt am Medizinischen Proteom-Center
Bochum 2014
i
Die vorgelegte Arbeit wurde in der Zeit von August 2008 bis Dezember 2014 im Medizinischen
Proteom-Center der Ruhr-Universität Bochum unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Helmut E. Meyer
und in Kooperation am Molecular-Proteomics Laboratory der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf
unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Kai Stühler angefertigt.
Gutachter/in: 1. Prof. Dr. Helmut E. Meyer
2. Prof. Dr. Christian Herrmann
Datum der Abgabe: Dezember 2014
ii
Meiner Familie
“Die Naturwissenschaft ist der harte Kern
der neuzeitlichen Kultur, der neuzeitlichen,
abendländischen Kultur.”
Carl Friedrich von Weizsäcker
Inhalt
iii
Inhalt
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................................................ vi
Zusammenfassung ................................................................................................................................. viii
Summary .................................................................................................................................................. x
1. Einleitung ......................................................................................................................................... 1
Tumoren des zentralen Nervensystems .................................................................................. 1 1.1.
Das Glioblastom multiforme ................................................................................................... 2 1.2.
Genetische und epigenetische Faktoren ................................................................................. 3 1.3.
1.3.1. Amplifikation und Mutation des EGF-Rezeptors ............................................................. 4
1.3.2. Aberrante Methylierung des MGMT-Promotors............................................................. 5
1.3.3. Mutationen in den Genen von IDH1 und IDH2 ............................................................... 5
Veränderte Stoffwechselprozesse in Glioblastomen .............................................................. 8 1.4.
Entstehung, Therapie und Prognose bei Glioblastomen ....................................................... 10 1.5.
Gliomstammzellen und Resistenzen ..................................................................................... 11 1.6.
Die Rolle des Immunsystems bei Glioblastomen .................................................................. 12 1.7.
Charakterisierung der Tumorbiologie des Glioblastom mithilfe der Proteomanalyse ......... 15 1.8.
2. Zielsetzung der Arbeit ................................................................................................................... 18
3. Material und Methoden ................................................................................................................ 19
Material ................................................................................................................................. 19 3.1.
3.1.1. Puffer und Lösungen ..................................................................................................... 19
3.1.2. Laborgeräte und Verbrauchsmaterialien ...................................................................... 21
3.1.3. Software ........................................................................................................................ 22
3.1.4. Chemikalienliste ............................................................................................................ 23
3.1.5. Antikörper & Zelllinien .................................................................................................. 25
Methoden .............................................................................................................................. 26 3.2.
3.2.1. Methoden zur Probenvorbereitung .............................................................................. 26
3.2.2. Methoden zur Proteinkonzentrationsbestimmung ...................................................... 29
Inhalt
iv
3.2.3. Methoden zur Proteintrennung .................................................................................... 31
3.2.4. Methoden zum Nachweis von Proteinen ...................................................................... 33
3.2.5. Quantitative Nachweistechniken .................................................................................. 35
3.2.6. Bioinformatische Datenanalyse..................................................................................... 39
4. Ergebnisse...................................................................................................................................... 43
Differentielle Proteomstudie von Proteinüberständen extrahierter Glioblastome.............. 43 4.1.
4.1.1. 2D-DIGE Experiment ...................................................................................................... 43
4.1.2. Validierung differentieller Kandidatenproteine mittels Proteinblotting und
Transkriptomdaten ........................................................................................................ 47
4.1.3. Erweiterte Analyse der verwendeten Tumorproben hinsichtlich einer Mutation im Gen
der IDH1 ......................................................................................................................... 50
Differentielle Proteomstudie von mikrodissektierten Glioblastomen .................................. 50 4.2.
4.2.1. Etablierung der Mikrodissektion für Glioblastomproben ............................................. 50
4.2.2. Differentielle Proteomanalyse von Wildtyp-Glioblastomen ......................................... 55
4.2.3. Differentielle Proteomanalyse von Glioblastomen in Abhängigkeit von der IDH1
Mutation ........................................................................................................................ 59
Proteomanalytische Charakterisierung von murinen Gliomstammzelllinien unter 4.3.
sphärenbildenden Bedingungen .............................................................................................. 63
Identifizierung von tumorassoziierten Autoantigenen ......................................................... 65 4.4.
4.4.1. Sammlung von Patientenplasma und Demographie ..................................................... 65
4.4.2. Detektion und differentielle Analyse von tumorspezifischen Autoimmunreaktionen
mittels Proteinarrays ..................................................................................................... 67
4.4.3. Bioinformatische Analyse der tumorassoziierten Autoantigene .................................. 68
4.4.4. Vergleich der Proteom- mit Transkriptomdaten ........................................................... 69
4.4.5. Nachweis von tumorassoziierten Autoantikörpern im Plasma von progressionsfreien,
resektierten Glioblastompatienten mit mehr als 22 Monaten Gesamtüberleben ....... 72
4.4.6. Validierung von potentiellen tumorassoziierten Autoantigenen .................................. 74
5. Diskussion ...................................................................................................................................... 78
Methodische Aspekte der proteomanalytischen Charakterisierung des Glioblastoms ........ 78 5.1.
Inhalt
v
5.1.1. Klinische Proteomanalyse von Glioblastomen .............................................................. 78
5.1.2. Quantitative Proteomanalyse von Glioblastomen ........................................................ 80
5.1.3. Proteinarrays zur Detektion zum Nachweis von Tumorantigenen ............................... 81
Biologische Aspekte der proteomanalytischen Charakterisierung des Glioblastoms ........... 83 5.2.
5.2.1. Differentielle Proteomanalyse des Tumorgewebes von Glioblastomen hinsichtlich des
Langzeitüberleben ......................................................................................................... 84
5.2.2. Differentielle Proteomanalyse des Tumorgewebes von Glioblastomen in Abhängigkeit
von der IDH1 Mutation .................................................................................................. 88
5.2.3. Differentielle Proteomanalyse von Mausstammzellen ................................................. 94
5.2.4. Fazit ............................................................................................................................... 96
5.2.5. Identifizierung von tumorassoziierten Autoantigenen des Glioblastoms .................... 97
5.2.6. Fazit ............................................................................................................................. 101
5.2.7. Ausblick ........................................................................................................................ 102
6. Literatur ....................................................................................................................................... 104
Anhang ................................................................................................................................................ 116
A. Tabellen ................................................................................................................................... 116
B. Publikationen ........................................................................................................................... 142
C. Lebenslauf ............................................................................................................................... 143
D. Danksagung ............................................................................................................................. 144
E. Erklärung ................................................................................................................................. 145
Abkürzungsverzeichnis
vi
Abkürzungsverzeichnis
1D Eindimensional
2D Zweidimensional
2HG D-2-Hydroxyglutarat
3D Dreidimensional
5hmC 5-Hydroxymethylcytosin
5mC 5-Methylcytosin
AMIDA autoantibody-mediated identification of antigens
APS Ammoniumperoxodisulfat
ASA Aminosäureanalyse
ATP Adenosintriphosphat
BSA Rinderalbumin (bovine serum albumin)
cDNA komplementäre DNA (complementary DNA)
CHAPS 3-[N-(Cholamidopropyl)-dimethyl-ammonio]-1-propansulfat
CID Collision-induced Dissociation
CoA Coenzym A
CpG Cytosin-Guanin-Dinukleotid
CV Variationskoeffizient
Cy Cyanin-Fluoreszenzfarbstoff
Da Dalton
DIGE Differentielle Gelelektrophorese
DNA Desoxyribonukleinsäure
DTT Dithiothreitol
ECL enhanced chemiluminescence
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
ESI Elektrospray-Ionisation
FDR false discovery rate
GBM Glioblastom
GGN deutsches Gliomnetz
GO Gene Ontology
GSZ Genset-Anreicherungs-Wert
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography)
ICAT Isotope-coded affinity tag
IEF isoelektrische Fokussierung
Ig Immunoglobulin
iTRAQ isobaric tags for relative and absolute quantitation
kDa Kilo-Dalton
KPS Karnofsky Performance Score
LC-ESI-MS Kopplung von HPLC und ESI-MS
LTS Langzeitüberlebende (long term survivor)
LTSwt Tumore von Langzeitüberlebenden ohne Mutation im IDH1 Gen
Abkürzungsverzeichnis
vii
LTSmut Tumore von Langzeitüberlebenden mit Mutation im IDH1 Gen
m/z Masse-zu-Ladungs-Verhältnis
MALDI Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation
mRNA messenger RNA
MRS 1H-Magnetresonanzspektroskopie
MS Massenspektrometrie
MS/MS Tandemmassenspektrometrie
mut mutiert
MW Molekulargewicht
NADP+ Nicotinamidadenindinukleotidphosphat, oxidiert
NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat, reduziert
NS nicht-sphärische Stammzellen (nonsphere cultures)
PAGE Polyacrylamidgel Elektrophorese
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)
PET Positronen Emissions Tomographie
pI isoelektrischer Punkt
PROTEOMEX a combination of proteomics and SEREX
PVDF Polyvinylidenfluorid
RNA Ribonukleinsäure
ROS reaktive Sauerstoff Spezies (reactive oxygen specie)s
SC Tumorsphären (sphere cultures)
SDS Natriumdodecylsulfat (sodiumdodecylsulfate)
SEREX serological identification of antigens by recombinant expression cloning
SILAC stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture
SOM Selbstorganisierende Karte (self-organizing ma)
SOP Standard Operation Procedure
SRM selected reaction monitoring
STS Kurzzeitüberlebende (short term survivor)
STSwt Tumore von Kurzzeitüberlebenden ohne Mutation im IDH1 Gen
TAA tumorassoziiertes Autoantigen
TEMED N, N, N’ ,N’-Tetramethylethylendiamin
TFA Trifluoressigsäure
TOF Flugzeit (time of flight)
Tris Tris(hydroxymethyl-)aminomethan
WHO Weltgesundheitsorganisation (world health organisation)
wt Wildtyp
Zusammenfassung
viii
Zusammenfassung
Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Proteinen, die mit dem Langzeitüberleben von
Glioblastompatienten assoziiert sind. Hierfür sollten sowohl zelluläre als auch immunologische
Mechanismen mittels Proteomanalyse untersucht werden. Für die Analyse zellulärer Mechanismen
wurde Tumorgewebe von Patienten mit unterschiedlichen klinischen Verläufen und genetischem
Status, bzw. zur Charakterisierung eines Gliomstammzellmodells zur Untersuchung von Resistenzen,
ein Zellkulturmodell eingesetzt. Für die Analyse immunologischer Faktoren wurden Plasmaproben
von Patienten und nicht-tumorerkrankten Kontrollen zur Detektion einer humoralen Immunantwort
mittels Protein-Array Technik verwendet.
Für die Analyse von Tumorgewebe mittels 2D-DIGE Technik konnte zunächst erfolgreich ein
Protokoll zur materialsparenden Verwendung von Proteinfraktionen aus der DNA-Analytik
etabliert und für die Analyse von Glioblastomgewebe adaptiert werden (Grzendowski et al.
2009).
Durch Kombination der Lasermikrodissektion mit markierungsfreier quantitativer
Massenspektrometrie konnte das Proteom von Tumoren von Langzeit- und
Kurzzeitüberlebenden ohne IDH1 Mutation mit über 3000 Proteinen erstellt werden. Der
Vergleich der beiden Patientengruppen ergab einen signifikanten Abundanzunterschied für
178 Proteine. Bei den Proteinen, die in den Tumoren von Kurzzeitüberlebenden höher
abundant waren, konnte aufgrund der Anreicherung von Proteinen mitochondrialen
Ursprungs ein Hinweis auf eine Beteiligung an der Reduktion von NADPH und damit auf eine
möglicherweise bessere Protektion der Tumorzelle gegen oxidativen Stress gefunden
werden.
Die markierungsfreie differentielle Analyse von mikrodissektierten Glioblastomproben mit
und ohne Mutation im IDH1-Gen ergab, dass 130 Proteine einen signifikanten
Abundanzunterschied aufwiesen. Die anschließende bioinformatische Analyse zeigte zum
ersten Mal, dass in den IDH1 mutierten Tumoren RNA-bindende Proteine und hier
insbesondere Spleißfaktoren höher abundant sind und somit möglicherweise Veränderungen
im alternativen Spleißen bei der Tumorgenese IDH1 mutierter Glioblastome eine wichtige
Rolle spielen.
Die differentielle Analyse von Plasma von Tumorpatienten und Kontrollplasmen zeigte, dass
im Plasma von Tumorpatienten vermehrt Autoantikörper gegen Antigene mit bekannter
tumorbiologischer Relevanz, wie z.B. ERBB2, vorhanden sind. Diese erhöhte Abundanz der
Antikörper im Plasma von Patienten war auch mehrere Monate nach der Erkrankung noch zu
Zusammenfassung
ix
beobachten. Eine Korrelation der Immunantwort von Tumorpatienten mit der Konzentration
potentieller tumorassoziierter Antigene konnte nicht festgestellt werden, jedoch zeigte sich,
dass vermehrt Autoantikörper gegen Antigene mit zinkbindenden Motiven detektiert
wurden.
Durch die Proteomanalyse von vier murinen Gliomstammzelllinien unter normalen und
sphärenbildenden Bedingungen konnte gezeigt werden, dass die Veränderungen auf
Proteomebene durch die untersuchten Kulturbedingungen gegenüber dem biologischen
Ursprung der Zelllinien vernachlässigbar ist. Zudem konnte gezeigt werden, dass unter
sphärenbildenden Bedingungen eine erhöhte Abundanz spezifischer Stammzellproteine
vorliegt (Ahmad et al. 2014).
Summary
x
Summary
It has been shown that a subgroup of glioblastoma patients exhibits a significant longer survival time,
but until now less is known about the underlying causes for the differences in clinical outcome. The
aim of this work was to reveal the cellular and immunological mechanisms involved in long-term
survival in glioblastoma patients by a proteomic approach. For this purpose, tumor tissue of patients
with different clinical courses and genetic status as well as plasma for the detection of a humoral
immune response was used. Furthermore, we investigated the role of therapy associated resistance
by a tumor stem cell model. To reach the aim of this work the following results were obtained:
A protocol for the parallel and material saving analysis of tissue samples by transcriptomics
and proteomics using cesium chloride fractions has been established (Grzendowski et al.
2009). With this protocol a 2D-DIGE study of glioblastoma tissue was successfully performed.
Identification of more than 3000 proteins in the proteome of tumors of long term and short
term survivors by the combination of laser microdissection and mass spectrometry.
The quantitative label free analysis of long term and short term survivors revealed an
aberrant abundance of 178 proteins. Within the group of proteins with an increased
abundance in tumors of short-term survivors an enrichment of proteins with mitochondrial
origin was observed therewith suggesting a relevant role in NADPH mediated cell protection.
The label-free differential analysis of long term glioblastomas patients in dependency of the
IDH1 mutation led to the identification of 130 proteins with an aberrant expression. The
subsequent bioinformatic analysis revealed for the first time that RNA-binding proteins and
in particular splicing factors are higher abundant in IDH1 mutant tumors and thus alternative
splicing may play an important role in tumorigenesis of glioblastomas with IDH1 mutation.
The autoantibody profile of glioblastoma patients obtained by protein array analysis of
plasma revealed a high number of autoantibodies directed against antigens with known
tumor-biological relevance, such as ERBB2. Interestingly, the increased abundance of
antibodies in the plasma of patients was also observed several months after tumor resection
suggesting an immunological control mechanism.
The proteome analysis of four mouse glioma stem cell lines under normal and sphere-
forming conditions showed that the changes in the proteome of the studied culture
conditions compared to the biological origin of the cell lines is negligible. In addition, it was
shown that under sphere forming conditions an increased abundance of specific stem cell
proteins is present (Ahmad et al. 2014).
Summary
xi
This work is the first that exhaustively explored the proteome of glioblastoma from long and short
time survivors. With the help of this work first results have been obtained suggesting that short time
survivor exhibit an anti-oxidative phenotype helping the tumor cell to resist oxidative stress and
protect them for apoptosis. Whereas for long time survivors with IDH1 mutation an alternative
splicing phenotype has been revealed and is discussed in the context of clinical outcome of
glioblastoma patients. To further validate the results of this work the use of clinical samples is self-
evident as in vitro models of long-time survival are not available yet.
Kapitel 1: Einleitung
1
1. Einleitung
Tumoren des zentralen Nervensystems 1.1.
Die Diagnose von malignen Tumoren des zentralen Nervensystems geht für die Patienten meist nicht
nur mit einer schlechten Prognose einher. Wegen der durch die Tumoren hervorgerufenen starken
Beeinträchtigung von kognitiver Funktion und Lebensqualität gehören sie zu den am meisten
gefürchteten Krebsarten (Omuro und DeAngelis 2013). Die insgesamt häufigsten Hirntumoren sind
Metastasen (33-50%) ausgehend vor allem von Bronchial-, Nieren- und Mammakarzinomen,
malignem Melanomen, gastrointestinalen Tumoren, grundsätzlich aber auch von fast allen anderen
extrakraniellen malignen Tumoren. Bei den neu diagnostizierten hirneigenen Tumoren macht die
Gruppe der neuroepithelialen Tumoren einen wesentlichen Anteil aus, aber auch Tumoren der
Menignen, der Nervenscheiden, Lymphome, der Sellarregion und einige andere werden in dieser
Gruppe von Tumoren zusammengefasst.
Abbildung 1.1: Tumoren des zentralen Nervensystems. Zu den häufigsten Tumoren zählen Tumoren der
Hirnhäute und des neuroepithelialen Gewebes. Die Gruppe der neuroepithelialen Tumoren umfasst auch
Glioblastome (nach Ostrom et al. (2013)).
Tumoren des neuroepithelialen
Gewebes 31%
Tumoren der kranialen und
spinalen Nerven 8%
Tumoren der Meningen
37%
Lymphome und Hämatopoetische
Neoplasien 2%
Keimzelltumoren und Zysten
0%
Tumoren der Sellarregion
16%
nicht-klassifizierte
Tumoren 6%
Tumoren des zentralen Nervensystems
Kapitel 1: Einleitung
2
Jedoch handelt es sich bei diesen Tumoren um eine eher seltene Erkrankung. Der Anteil der primären
Gehirntumoren an allen neu diagnostizierten Neoplasien im Erwachsenenalter beträgt in
Deutschland nur ca. 2% (Kaatsch et al. 2013). Zwischen 2006 und 2010 lag laut Ostrom et al. (2013) in
den USA die geschätzte Zahl der neu an solchen Neoplasien Erkrankten bei 326.700. Im gleichen
Zeitraum verstarben schätzungsweise 68.000 der an einem Hirntumor erkrankten Patienten. Damit
liegt die Inzidenz aller primären Hirntumoren – benigne wie maligne – bei 21,03 auf 100.000
Personen, die malignen alleine bei 7,27.
Den größten Anteil in der Gruppe neuroepithelialer Tumoren machen Gliome aus. Diese primären
Tumore, die histologische Ähnlichkeiten mit Gliazellen aufweisen und möglicherweise von Glia-
Vorläuferzellen des Zentralnervensystems ihren Ausgang nehmen, werden nach dem glialen Zelltyp,
dem sie histologisch am meisten ähneln, eingeteilt. Somit werden Gliome in Oligodendrogliome,
Ependymome und Astrozytome eingeteilt. Letztere machen ca. 75% aller neuroepithelialen Tumoren
aus und treten vorwiegend im mittleren Lebensalter auf (Ostrom et al. 2013). Astrozytome werden
ihrerseits ebenfalls in verschiedene Grade eingeteilt. Das gebräuchlichste Graduierungssystem der
Tumoren des zentralen Nervensystems ist das der Weltgesundheitsorganisation (WHO), welches
Astrozytome entsprechend ihrer Malignität in die Stufen I-IV einteilt (Louis et al. 2007) (Tabelle 1.1).
Tabelle 1.1: WHO-Klassifikation der Astrozytome
WHO Grad Bezeichnung
WHO Grad I: Pilocytisches Astrozytom
WHO Grad II: Diffuses Astrozytom
WHO Grad III: Anaplastisches Astrozytom
WHO Grad IV: Glioblastom multiforme
Das Glioblastom multiforme 1.2.
Als WHO Grad IV wird das Glioblastom multiforme (GBM) eingestuft, ein diffus infiltrierender,
unkontrolliert proliferierender Tumortyp, welcher mit rund 50% aller Gliome den häufigsten
malignen hirneigenen Tumor bei Erwachsenen darstellt (DeAngelis 2001; Maher et al. 2001). Trotz
ihres invasiven Wachstums sind sie dennoch meist auf das Zentralnervensystem beschränkt und
metastasieren nicht. Der Begriff Glioblastoma multiforme wurde 1926 von Percival Bailey und Harvey
Cushing geprägt und basierte auf der Vorstellung, dass sich der Tumor aus primitiven Vorstufen von
Gliazellen (Glioblasten) entwickelt sowie der Beobachtung, dass das Erscheinungsbild mit Nekrosen,
Einblutungen und Zysten sowie Zellen, welche sich in Größe und Form teilweise stark unterscheiden,
sehr inhomogen (multiform) sein kann (Bailey und Cushing 1926). Histologisch werden sie
Kapitel 1: Einleitung
3
charakterisiert durch erhebliche mitotische Aktivität, vaskuläre Proliferation sowie nekrotische
Bereiche. Außerdem kann zwischen primären und sekundären Glioblastomen unterschieden werden.
Als primäre Glioblastome werden die Tumoren bezeichnet, welche spontan auftreten, sekundäre
Glioblastome sind deutlich seltener und entstehen aus niedriggradigeren Gliomen (Furnari et al.
2007). Der Tumor tritt am häufigsten bei älteren Erwachsenen auf, das mediane Alter bei
Diagnosestellung beträgt 64 Jahre. Männer sind deutlich öfter betroffen als Frauen (Verhältnis 1,7:1).
Daten des amerikanischen Hirntumorregisters zeigen, dass Glioblastome bei Weißen mindestens
doppelt so häufig sind wie in der schwarzen Bevölkerung. Im Vergleich zu Erwachsenen sind
Glioblastome bei Kindern sehr selten. Die Inzidenz wurde in Europa und Nordamerika mit 2,9 bis 3,5
Neuerkrankungen pro Jahr auf 100.000 Einwohner ermittelt (Polednak und Flannery 1995).
Genetische und epigenetische Faktoren 1.3.
Auch vom molekularen Standpunkt aus sind Glioblastome eher als heterogen zu bezeichnen
(Abbildung 1.2) und die Untersuchung genetischer Aberrationen bei Glioblastomen führte bereits zu
einer Reihe neuer Biomarkerkandiaten, die derzeit hinsichtlich ihrer Eignung im Bereich der
Vorhersage der Therapieantwort oder Prognose in Kliniken getestet werden. Die integrative Analyse
einer Vielzahl genomweiter Expressionsstudien (z.B.(Mischel et al. 2003; Freije et al. 2004; Liang et
al. 2005)) und Kopienzahlvariations–Analysen (Ruano et al. 2006; Beroukhim et al. 2007) zeigen, dass
im Wesentlichen vier genetische Subklassen (Klassisch, Mesenchymal, Proneural und Neural)
basierend auf den molekularen Profilen unterschieden werden können (Verhaak et al. 2010). Auch
können z.B. primäre und sekundäre Glioblastome nicht nur anamnestisch sondern auch
molekulargenetisch unterschieden werden. Sekundäre Glioblastome weisen hauptsächlich
Mutationen des TP53 Gens auf, während primäre Glioblastome vorwiegend durch eine Amplifikation
und Überexpression des EGFR Gens und eine Deletion von Chromosom 10 gekennzeichnet sind.
Kapitel 1: Einleitung
4
Abbildung 1.2: Häufig mutierte Onkogene und Tumorsuppressorgene in Glioblastomen. Onkogene
Genprodukte sind als grüne Pfeile, Tumorsuppressoren als rote Oktaeder dargestellt. Mut.= Mutation; Amp.=
Amplifikation; Del. = Deletion. (modifiziert nach Purow und Schiff (2009))
Im Falle der oligodendroglialen Tumoren konnte sogar gezeigt werden, dass kombinierte Deletionen
der Arme 1p und 19q als günstige prognostische Faktoren gewertet werden können (Cairncross et al.
2006). In Glioblastomen ist diese genetische Veränderung jedoch selten und die prognostische
Signifikanz ist weniger eindeutig (Ino et al. 2000), (Houillier et al. 2006). In den folgenden Abschnitten
werden die wichtigsten Aberrationen in Glioblastomen kurz erläutert.
1.3.1. Amplifikation und Mutation des EGF-Rezeptors
Die häufigste genetische Veränderung assoziiert mit GBM ist die Amplifikation des epidermalen
Wachstumsfaktorrezeptorgens (EGFR), welche in der Überexpression dieses transmembranen
Tyrosinkinaserezeptors resultiert (Ekstrand et al. 1991). Der Großteil der Glioblastome mit EGFR-
Amplifikation enthält die Mutationsvariante EGFRvIII (Wikstrand et al. 1997), welche charakterisiert
ist durch die Deletion der Exone 2-7 und zur Expression einer trunkierten extrazellulären Domäne mit
Liganden unabhängiger, konstitutiver Aktivität führt. Die Rolle der Überexpression von EGFR und
seiner Variante (vIII) in der malignen Progression bei glialen Tumoren und ihr möglicher Einfluss auf
Kapitel 1: Einleitung
5
die Gesamtüberlebensdauer der Patienten wurde in der Literatur oft diskutiert. Überexpression des
Wildtyp-EGFR konnte in mehreren Studien nicht als unabhängiger prognostischer Faktor bestätigt
werden (Waha et al. 1996; Galanis et al. 1998; Newcomb et al. 1998). EGFR und EGFRvIII
Amplifikation verstärken die Gliomproliferation und Invasion in vitro (Sunderkotter et al. 1994). Im
Vergleich zu Kontrollgruppen unselektierter Glioblastompatienten gibt es einen Trend zu weniger
häufigen, jedoch nicht statistisch signifikanten, EGFR Amplifikationen bei Glioblastomen von
Langzeitüberlebenden (Heimberger et al. 2005).
1.3.2. Aberrante Methylierung des MGMT-Promotors
Eine epigenetische Veränderung bei Glioblastomen mit klinischer Signifikanz ist der
Methylierungsstatus des Gens der O6-Methylguanin-Methyltransferase (MGMT). MGMT kodiert ein
DNA-Reparatur Protein, welches im Zellkern lokalisiert ist. Es ist mitverantwortlich für die Reparatur
methylierter DNA und vermittelt daher auch Resistenzen gegen DNA alkylierende Agenzien wie z.B.
Nitrosoharnstoffe und Temozolomid, welche in der Tumortherapie häufig eingesetzt werden
(Johannessen und Bjerkvig 2012). Transkriptionelles Silencing der MGMT Gene durch Promotor
Hypermethylierung wird bei ca. 50% aller Glioblastome beobachtet und ist sowohl assoziiert mit
verlängertem proggressionsfreiem Überleben als auch der Gesamtüberlebenszeit von Patienten,
welche im Rahmen ihrer Therapie mit alkylierenden Reagenzien behandelt wurden (Hegi et al. 2005).
Passend zu diesen Daten konnte MGMT Promotormethylierung bei einem signifikant erhöhten Anteil
von Langzeitüberlebenden des Glioblastoms (74%) gegenüber einer unselektierten Kontrollgruppe
(43%) beobachtet werden (Krex et al. 2007).
1.3.3. Mutationen in den Genen von IDH1 und IDH2
Eine Entdeckung jüngerer Zeit ist, dass Mutationen im Gen der Isocitrat-Dehydrogenasen 11 und 2
(IDH1/ IDH2) gehäuft bei Glioblastomen auftreten (Parsons et al. 2008). Diese befinden sich meist im
aktiven Zentrum der Isocitrat-Dehydrogenase. Die subzelluläre Lokalisation der IDH1 kodierten
Isocitrat Dehydrogenase ist das Cytoplasma und die Peroxisomen (Geisbrecht und Gould 1999). Eine
Mutation findet sich bei 12% aller Glioblastome und charakterisiert den proneuralen Typ (Verhaak et
al. 2010). Nahezu alle detektierten Mutationen resultieren in einem Austausch der Aminosäure
Arginin in Position 132 und besonders häufig ist hier ein Adenin anstelle eines Guanin als zweites
Nukleotid des Codons 132 zu finden, was in einem Histidin an Position 132 resultiert (Parsons et al.
1 Die Bezeichnung von Proteinen erfolgt in dieser Arbeit nach der Uniprot-Nomenklatur (Uniprot, 2014).
Kapitel 1: Einleitung
6
2008; Pusch et al. 2011). Die höchste Frequenz an IDH1 Mutationen tritt in diffusen Astrozytomen
(68%), Oligodendrogliomen (69%), Oligoastrozytomen (78%) und sekundären Glioblastomen (88%)
auf. Primäre Glioblastome und andere Entitäten sind charakterisiert durch eine geringe Frequenz
oder Abwesenheit von Mutationen der Aminosäure 132 der IDH1 (Balss et al. 2008). Die besonders
hohe Frequenz der IDH1 Mutation in WHO Grad II astrozytären und oligodendroglialen Gliomen
suggeriert eine Rolle in der frühen Tumorentstehung. Die Isocitrat-Dehydrogenasen 1 und 2
katalysieren die oxidative Decarboxylierung von Isocitrat zu α-Ketoglutarat unter Reduzierung von
NADP+ zu NADPH. Die mutierte Aminosäure Arginin in Position 132 gehört zu einer evolutionär
konservierten Region, welche in der Bindungstelle des Isocitrats lokalisiert ist.
Die physiologische Funktion der NADP-abhängigen Enzyme Isocitrat-Dehydrogenasen 1 und 2 ist
bisher nicht im Detail aufgeklärt, aber es wird davon ausgegangen, dass sie eine Rolle im Glukose-,
Fettsäure- und Glutaminmetabolismus spielen und darüber hinaus an der Aufrechterhaltung des
normalen zellulären Redox-Status beteiligt sind (Cairns und Mak 2013). NADPH ist einer der
Hauptträger von Reduktionsäquivalenten innerhalb der Zelle und wird zur Biosynthese diverser
Makromoleküle sowie für antioxidativen Schutzsysteme benötigt, welche die Zelle vor oxidativem
Stress durch reaktive Sauerstoff Spezies (reactive oxygen species, ROS) schützen. So werden z.B.
sowohl Thioredoxin als auch Glutathion NADPH-abhängig regeneriert (Holmgren 1977; Vogel et al.
1999).
Abbildung 1.3: Enzymatische Reaktionen der normalen und der mutierten Variante der Isocitrat
Dehydrogenasen. Die Isocitrat-Dehydrogenasen 1 und 2 katalysieren die Umsetzung von Isocitrat zu α-Ketoglutarat.
Dabei wird ein Molekül NADP+ zu NADPH reduziert. Die mutierten Varianten von IDH1 reduzieren gebildetes α-
Ketoglutarat weiter zu D-2-Hydroxyglutarat unter Verbrauch eines Moleküls NADPH. (modifiziert nach Cairns und
Mak (2013))
Mutierte Varianten der Isocitrat-Dehydrogenasen 1 und 2 zeigen eine signifikant verringerte
enzymatische Aktivität. Zudem weisen diese Enzyme mit der NADPH-abhängigen Reduktion von α-
Kapitel 1: Einleitung
7
Ketoglutarat zu D-2-Hydroxyglutarat (2HG) (siehe Abbildung 1.3) eine neue Aktivität auf (Dang et al.
2009).
Genau diese Eigenschaft der mutierten Isocitrat-Dehydrogenase 1 trägt möglicherweise
entscheidend zur Gliomgenese bei. In Zellen liegen normalerweise über 80 verschiedene
Dioxygenasen vor, welche α-Ketoglutarat als Kofaktor benötigen. 2HG ist strukturell sehr ähnlich zu
α-Ketoglutarat, inhibiert aber die enzymatische Aktivität dieser Dioxygenasen kompetitiv (Xu et al.
2011).
Abbildung 1.4: Veränderungen im Stoffwechsel durch die Produktion des Onkometaboliten 2HG durch die
mutierte IDH1. Mutationen in IDH1 können zur Akkumulation von D-2-Hydroxyglutarat führen. Dieser Metabolit
inhibiert u.a. die Funktion α-Ketoglutarat-abhängiger Enzyme, wie z.B. TET2 und KDM, welche für die Demethylierung
von DNA und Histonen verantwortlich sind. (modifiziert nach Ichimura (2012))
Diese Dioxygenasen sind an vielen verschiedenen Prozessen innerhalb der Zelle beteiligt (siehe
Abbildung 1.4). So wird z.B. davon ausgegangen, dass die Dioxygenase TET2 durch 2HG inhibiert wird,
wodurch in der Folge 5-Methylcytosin nicht mehr demethyliert wird. Dies könnte die Erklärung für
die sehr häufig im Einklang mit einer IDH1 Mutation beobachteten CpG Hypermethylierung der
Tumor DNA, dem sogenannten glioma-CpG island methylator Phänotyp (G-CIMP), liefern (Figueroa et
al. 2010; Noushmehr et al. 2010; Turcan et al. 2012). Darüber hinaus werden auch einige Histon-
Demethylasen, z.B. aus der KDM-Familie, inhibiert, wodurch auch Histone hypermethyliert werden
Kapitel 1: Einleitung
8
(Xu et al. 2011; Lu et al. 2012). Weiterhin wird auch der Abbau des Transkriptionsfaktors HIF-1α
durch eine 2HG abhängige Dioxygenase, HIF-PH3, reguliert. Dadurch kann HIF-1α in der Zelle
akkumulieren. HIF-1α kann seinerseits die Transkription von über 40 verschiedenen Genen
aktivieren, darunter z.B. auch VEGF, welche mit Tumor Proliferation und Angiogenese in Verbindung
gebracht werden können (Xu et al. 2011). Daher stehen die mutierten Varianten von IDH1 und IDH2
im Verdacht, als aktivierte Onkogene und ihr Produkt 2HG, als Onkometabolit zu fungieren.
Veränderte Stoffwechselprozesse in Glioblastomen 1.4.
Glioblastomzellen zeigen neben morphologischen auch auf molekularer Ebene deutliche
Aberrationen gegenüber normalen Gliazellen. Der Prozess der zellulären Transformation und
Krebsprogression beinhaltet nicht nur genetische Mutationen und epigenetische Veränderungen,
sondern auch Änderungen in der zellulären Kommunikation sowie den beschriebenen metabolischen
Wegen (Hanahan und Weinberg 2011). Mittlerweile konnte gezeigt werden, dass diese
Veränderungen im Metabolismus häufig als Konsequenz aus Mutationen und veränderter zellulärer
Kommunikation hervorgehen (Carracedo et al. 2013).
Gesunde Zellen unterliegen normalerweise einem Kontrollsystem, welches die übermäßige
Proliferation verhindert. Nährstoffaufnahme findet hier nur nach Stimulation durch
Wachstumsfaktoren statt (Vander Heiden et al. 2009). In Krebszellen ist dieser Signalweg häufig
durch Mutationen in den Rezeptoren der Wachstumsfaktoren verändert, was die unbegrenzte
Aufnahme von Nährstoffen zur Folge hat (DeBerardinis et al. 2008; Hsu und Sabatini 2008). Darüber
hinaus ist auch der Metabolismus dieser Nährstoffe dahingehend verändert, dass die Zellen
ausreichend Bausteine für schnelle Proliferation zur Verfügung haben.
So nehmen Krebszellen verstärkt Glukose auf, oxidieren diese aber nicht mehr hauptsächlich zur
Gewinnung von ATP, sondern nutzen sie vorwiegend für anabolische Prozesse wie die Produkltion
von Ribose, Glykosilierung von Proteinen und die Synthese von Serinen (Christofk et al. 2008; Vander
Heiden et al. 2010; Hitosugi et al. 2012). Dies geschieht in der Nutzung von Glykolyse auch unter
aeroben Bedingungen anstelle der oxidativen Phosphorylierung in den Mitochondrien zur
Verstoffwechslung von Glukose (Abbildung 1.5). Das Phänomen der aeroben Glykolyse bei
Krebszellen wird allgemein nach seinem Entdecker „Warburg-Effekt“ genannt (Warburg 1956) und
wird auch bei Glioblastomzellen beobachtet (Oudard et al. 1996). Es wird mittlerweile davon
ausgegangen, dass es sich bei dieser glykolytischen Verschiebung um ein sehr frühes Ereignis in der
Tumorgenese handelt (Tennant et al. 2010).
Kapitel 1: Einleitung
9
Abbildung 1.5: Schematische Darstellung der Unterschiede zwischen der Energiegewinnung in
differenziertem Gewebe und Tumorgewebe. In der Gegenwart von Sauerstoff nutzen normale Zellen zunächst die
Glykolyse und oxidative Phosphorylierung zur Energiegewinnung. Ist kein Sauerstoff verfügbar, wird das aus der
Glykolyse gewonnene Pyruvat mittels anaerober Glykolyse zu Laktat umgesetzt. Dieser Prozess liefert jedoch deutlich
weniger ATP-Moleküle pro eingesetztem Glukose-Molekül. Krebszellen verwenden verstärkt die anaerobe Glykolyse
auch unter aeroben Bedingungen. (modifiziert nach Vander Heiden et al. (2009))
Neben Glukose sind auch Fettsäuren ein wichtiger Energielieferant von Zellen. Unter normalen
Bedingungen liefern Fettsäuren bei ihrer Verstoffwechselung, der β-Oxidation, sogar zweimal so viel
ATP wie Kohlenhydrate. Diesen Umstand scheinen Krebszellen auszunutzen, wenn sie unter
Stressbedingungen erhöhten ATP-Bedarf haben. So konnte gezeigt werden, dass bei Tumorzellen
durch Verlust des Kontakts zur extrazellulären Matrix die Aufnahme durch Glukose und in der Folge
auch die Glukose-abhängige ATP-Produktion zunächst inhibiert wird. Gleichzeitig steigt die
Konzentration so genannter reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) an, welche wiederum die β-Oxidation
inhibiert. Greifen nun die antioxidativen Schutzmechanismen der Zelle und beseitigen ROS, wird die
β-Oxidation reaktiviert und die ATP-Konzentration in der Zelle steigt wieder an (Schafer et al. 2009).
Darüber hinaus sind Tumorzellen für Wachstum und Proliferation auf große Mengen an NADPH
angewiesen, da NADPH neben seiner Rolle bei der Bekämpfung von oxidativem Stress auch ein
wichtiges Coenzym für anabolische Enzyme in der Lipid- und Nukleinsäuresynthese darstellt (Chiarugi
et al. 2012). Die β-Oxidation liefert hier mit Acetyl-CoA den Ausgangsbaustein für zwei von vier
möglichen Wegen über die die Zelle NADPH herstellen kann. In einer Reihe von Reaktionen wird
Acetyl-CoA zu den Baustoffen umgesetzt, durch welche schlussendlich entweder das NADP+-
abhängige Malatenzym oder die Isocitrat-Dehydrogenasen 1 NADPH herstellen können. Inhibiert
Kapitel 1: Einleitung
10
man die β-Oxidation in Gliomzellen, sinkt auch der NADPH-Spiegel, wodurch ROS akkumulieren
können und die Zellen in der Folge absterben (Pike et al. 2011). Diese Veränderungen im
Stoffwechsel des Tumors macht man sich teilweise bereits in der Diagnostik, z.B. die erhöhte
Glukose-Aufnahme bei der Fluordesoxyglukose Positron-Emissions-Tomographie (Wienhard et al.
1989), zu Nutze.
Entstehung, Therapie und Prognose bei Glioblastomen 1.5.
Bei den meisten Glioblastomen ist keine genetische Prädisposition bekannt. Lediglich einige seltene
erbliche Erkrankungen konnten als schlechte prognostische Faktoren ausgemacht werden, darunter
das Turcot Syndrom (Hamilton et al. 1995) oder das Li-Fraumeni Syndrom (Kleihues et al. 1997). Seit
vielen Jahren wird mit Nachdruck nach Faktoren gesucht, die das Risiko für Tumorentstehung
erhöhen. Im Zuge dessen wurde der Einfluss verschiedener exogener Faktoren wie Rauchen (Zheng
et al. 2001), Diäten (Lee et al. 1997), ionisierende Strahlung (Braganza et al. 2012), Mobilfunkgeräte
(Inskip et al. 2001), elektromagnetische Felder (Theriault et al. 1994), sozioökonomischer Status und
Bildungsstand (Schlehofer et al. 2005), aber auch medizinische Risikofaktoren wie Allergien (Wiemels
et al. 2002), immunologischer Status (Schlehofer et al. 1999) und virale Infektionen (Vilchez und
Butel 2003) untersucht. All diese Studien konnten jedoch keine eindeutige Verknüpfung von
Glioblastomen zu spezifischen Risikofaktoren herstellen.
Die Standardbehandlung von Glioblastom Patienten sieht die möglichst vollständige Resektion des
Tumors sowie anschließender adjuvante Radiochemotherapie vor. Allerdings bereiten das schnelle
und maligne Wachstum, das geringe Ansprechen auf therapeutische Maßnahmen und das kurze
Intervall bis zum Rezidiv nach wie vor, große Schwierigkeiten bei der Behandlung. Generell kann man
sagen, dass die Patienten bislang von allen therapeutischen Maßnahmen am meisten von einer
Operation profitieren (Wilson et al. 2014). Bei der Chemotherapie wird überwiegend auf Zytostatika
wie z.B. Temozolomid oder Nitrosoharnstoffe zurückgegriffen, welche durch Alkylierung der DNA die
Replikation der Tumorzellen inhibieren. Studien zeigen, dass eine Chemotherapie das Leben um
weitere 2,5 Monate verlängert (Stupp et al. 2005). Bei einer Ausschöpfung aller therapeutischen
Maßnahmen kann in der Regel eine Verlängerung des Lebens um ein Jahr erreicht werden. Dennoch
kommt es in fast allen Fällen innerhalb kürzester Zeit zum Rezidiv, eine endgültige Heilung konnte bis
heute nicht erreicht werden. Weniger als 20% der Betroffenen leben länger als ein Jahr und die
durchschnittliche Lebenserwartung liegt bei ungefähr 12 Monaten (Johnson und O'Neill 2012;
Ronning et al. 2012). Lediglich 4,7 % der Patienten zeigen entgegen der Prognose einen besseren
klinischen Verlauf und können mit einer Überlebensdauer von mehr als 60 Monaten als
Langzeitüberlebenden eingestuft werden (Dolecek et al. 2012). Hierbei gelten ein Lebensalter unter
Kapitel 1: Einleitung
11
60 Jahren, die perioperative Konstitution des Erkrankten, welche anhand des Karnofsky-Index erfasst
wird, und eine gute Tumorlokalisation hinsichtlich der Resektion als etablierte positive prognostische
Parameter (Curran et al. 1993). Somit ist die Frage nach Faktoren, welche den Krankheitsverlauf und
die Gesamtüberlebensdauer positiv beeinflussen, nach wie vor von hoher Relevanz.
Gliomstammzellen und Resistenzen 1.6.
Krebszellen werden häufig als Zellen mit unbegrenzter Lebensdauer betrachtet, eine Eigenschaft,
welche normalerweise Stammzellen, zugeschrieben wird. Im Rahmen neuerer Studien konnte jedoch
gezeigt werden, dass innerhalb eines Tumors nur eine kleine Population von Tumor-initiierenden
Zellen stammzellähnliche Fähigkeiten aufweisen. Diese sind nicht nur in der Lage sich selbst zu
erneuern, vielmehr generieren sie auch jene schnell proliferierenden Nachkommen, die letztlich den
größten Teil des Tumors ausmachen (Lapidot et al. 1994; Al-Hajj et al. 2003; Singh et al. 2003). Es
wird davon ausgegangen, dass diese Tumor-initiierenden Zellen aufgrund ihrer Eigenschaften nicht
nur eine entscheidende Rolle bei der Krebsentstehung, sondern auch im Rahmen der
Tumorbehandlung und der Entstehung von Rezidiven spielen. Für die Tumortherapie sind besonders
Resistenzen des Tumors gegen die Behandlung für den Therapieerfolg von ausschlaggebender
Bedeutung. Theorien besagen, dass solche Gliomstammzellen in der Lage sind, Resistenzen
gegenüber nicht-operativen Therapieansätzen zu vermitteln (Ignatova et al. 2002; Singh et al. 2003;
Galli et al. 2004; Eramo et al. 2006). Sie sollen in der Lage sein, als Antwort auf Radio- und
Chemotherapie mit DNA alkylierenden Reagenzien, Proteine zu exprimieren, die spezifisch DNA-
Schäden reparieren oder Wirkstoffe gezielt aus der Zelle transportieren (Bao et al. 2006; Eramo et al.
2006; Liu et al. 2006; Zhou et al. 2009). Die Folgen sind ein vermindertes Ansprechen auf die
Behandlung und schnelles Auftreten von Rezidiven. Für die Entwicklung wirksamer Therapeutika ist
es daher von entscheidender Bedeutung, sowohl die molekularen Eigenschaften als auch ablaufende
biologische Prozesse dieser Gliomstammzellen im Detail zu verstehen. Zur Untersuchung dieser
Attribute werden in der Regel Modellsysteme herangezogen. Hierfür werden aus resektierten
Tumoren oder Gliomzelllinien Zellen mit stammzellähnlichen Eigenschaften isoliert und unter
Kulturbedingungen neuraler Stammzellen als Tumorsphären expandiert (Singh et al. 2003; Galli et al.
2004; Eramo et al. 2006; Shen et al. 2008; Qiang et al. 2009). Ähnlich dieser neuralen Stammzellen
konnte auch für diese putativen Gliomstammzellen gezeigt werden, dass sie zu klonalem Wachstum
in der Lage sind, ausgeprägtes Differenzierungpotential besitzen und diverse Stammzellmarker, wie
z.B. CD133, Nestin, Musashi-1 und Sox2 sowie α6 Integrin, exprimieren (Pellegatta et al. 2006; Wu et
al. 2008; Qiang et al. 2009; Zhou et al. 2009; Lathia et al. 2010; Muto et al. 2012).
Kapitel 1: Einleitung
12
Die Rolle des Immunsystems bei Glioblastomen 1.7.
Ein weiterer Parameter, dessen Einfluss auf den Verlauf der Erkrankung bisher nur wenige Daten
vorliegen, ist das Immunsystem des Patienten. Das Immunsystem hat die schwierige Aufgabe,
kontinuierlich zwischen körpereigenen und körperfremden Molekülen zu unterscheiden, um letztere
anschließend unschädlich zu machen. Die körpereigene Immunantwort wird durch ein streng
reguliertes, aber dennoch flexibles Netzwerk aus Antikörpern, Antigen präsentierenden Zellen, T-
Lymphozyten, Cytokinen, Chemokinen etc. umgesetzt. Die zielgerichtete Antwort auf (Protein-)
Antigene beruht hierbei auf der Entwicklung von Antikörpern und/ oder T-Lymphozyten gegen
Epitope des Zielantigens. T-Lymphozyten erkennen in erster Linie kurze Peptide welche von MHC-
Molekülen präsentiert werden (Anderson und LaBaer 2005). Intrazelluläre Proteine (z.B. virale
Antigene) werden vorwiegend von CD8+ positiven cytotoxischen T-Lymphozyten erkannt, exogene
Antigene von CD4+ positiven Helfer-T-Lymphozyten welche in der Folge den direkten oder indirekten
Abbau infizierter Zellen einleiten (Abbildung 1.6).
Abbildung 1.6: Schematisches Modell der Präsentation von Peptiden durch antigenpräsentierende Zellen
mittels Haupthistokompatibilitätskomplexen und ihre Erkennung durch T-Lymphozyten. Helfer-T-
Lymphozyten erkennen Peptide intrazellulärer Antigene, die von MHC-Klasse II-Molekülen präsentiert werden.
Cytotoxische-T-Lymphozyten erkennen hingegen durch MHC-Klasse I-Molekülen präsentierte Peptide extrazellulärer
Antigene.
Antikörper sind hingegen Teil der humoralen Immunantwort. Sie werden in aktivierten B-
Lymphozyten produziert und machen mit ca. 20 % eine der Hauptproteinkomponenten des Blutes
aus. Zur Aktivierung der B-Lymphozyten kommt es, wenn deren membrangebundener B-Zell-
Kapitel 1: Einleitung
13
Rezeptor sein spezifisches Antigen erkennt, sowie gleichzeitig ein zweites Signal seitens eines Helfer-
T-Lymphozyten eintrifft. Antikörpern kommt die Aufgabe zu, nach Bindung an ihr Epitop zum einen
das betreffende Molekül durch Kreuzvernetzung zu inaktivieren, zum anderen das
Komplementsystem und verschiedene Typen von Leukozyten, welche zur Phagozytose befähigt sind,
zu rekrutieren.
Das Immunsystem wendet einen komplexen Mechanismus an, um zwischen eigenen und fremden
Makromolekülen zu unterscheiden. Sowohl T-Lymphozyten als auch die Antikörper produzierenden
B-Lymphozyten unterliegen während ihrer Entwicklung einer negativen Selektion. Zellen, die
während der Reifung eine Bindung an körpereigene Antigene zeigen, werden unterdrückt. Erkennen
z.B. unreife B-Lymphozyten Selbstantigene, kann in einem Prozess, der Rezeptor-Editierung genannt
wird, entweder sein Rezeptor dahingehend verändert werden, dass er kein Autoantigen mehr
erkennt (Gay et al. 1993; Tiegs et al. 1993) oder die Zelle wird apoptotisch. Überlebt ein
selbstreaktiver B-Lymphozyt diese Reifung, führt im späteren Verlauf die Bindung an ein Autoantigen
ohne gleichzeitiges kostimulatorisches Signal von einem Helfer-T-Lymphozyten ebenfalls zur
Inaktivierung bzw. Apoptose der Zelle (Abbildung 1.7) (Nossal 1989).
Abbildung 1.7: Schematisches Modell der negativen Selektion zur Entwicklung immunologischer Toleranz
gegen Autoantigene. Erkennen unreife B-Lymphozyten Autoantigene erfolgt entweder die klonale Deletion
(Apoptose) des B-Lymphozyten oder der Rezeptor wird dahingehend editiert, dass er nun Fremdantigene erkennt.
Sollte ein solcher selbstreaktiver B-Lymphozyt dennoch Ausreifen, wird die Zelle nach Erkennung eines
Selbstantigens ohne gleichzeitige Stimulation durch einen Helfer-T-Lymphozyten ebenfalls deletiert.
Unreifer B-Lymphozyt
Reifer B-Lymphozyt
Aktiver Lymphozyt
Helfer T-Lymphozyt
Klonale Deletion oder Inaktivierung
Klonale Deletion
Autoantigen
Fremdantigen
Stimulation
Kapitel 1: Einleitung
14
Trotzdem entstehen immer wieder Situationen, z.B. bei Autoimmunerkrankungen, in denen das
Immunsystem dennoch auf körpereigene Antigene reagiert. Mögliche Ursache für die veränderte
Immunogenität der Antigene können eine abweichende Abundanz, aberrante Lokalisation oder das
Auftreten neuer modifizierter Isoformen etc. sein (van der Bruggen und Van den Eynde 1992). So
kann auch bei Krebspatienten häufig eine Antwort gegen körpereigene Proteine, so genannte
Tumorantigene, welche vom Tumor in veränderter Form oder Abundanz exprimiert werden,
beobachtet werden. Diese Tumorantigene werden, je nach Ursache für die Immunogenität, grob in
verschiedene Gruppen eingeteilt: Differenzierungsantigene, Amplifizierungsantigene, Mutations- und
Spleißvariantenantigene, virale Antigene und cancer-testis-Antigene (Piura und Piura 2010).
Allerdings sind die zu Grunde liegenden Faktoren, wann eine humorale Antwort bei Krebspatienten
ausgelöst wird, noch nicht vollständig verstanden. Die Immunantwort auf Tumoren fällt für
gewöhnlich schwächer aus als bei infektiösen, entzündlichen Prozessen. Dennoch konnten
Antikörperantworten bei verschiedenen Tumoren gegen diverse Onkogene gefunden werden. So
wurden bei Patienten mit kolorektalen Karzinomen Antikörper gegen das c-myc Protein, gegen c-
erbB2 bei Brustkrebspatientinnen und gegen c-myb bei Patienten mit Lymphomen nachgewiesen
(Ben-Mahrez et al. 1990; Sorokine et al. 1991; Disis et al. 1994). Zusätzlich konnten bei einigen
Tumorerkrankungen Antikörper gegen nichtonkogene Proteine identifiziert werden, wie z.B. den
eukaryotischen Initiationsfaktor 4γ bei Lungenkarzinomen und eine neue Hyaluronidase in
Meningiomen (Brass et al. 1997). Mittlerweile sind auch Antikörper im Blut von Patienten mit
Gliomen nachgewiesen worden. So wurde bei Gliompatienten ein erhöhter Level von Autoantikörper
gegen das azide Gliafaserprotein beschrieben (Wei et al. 2013) und bei Patienten mit niedriggradigen
Gliomen gegen src-homology 3-domain GRB2-like 1 (Matsutani et al. 2012). Patienten mit
Glioblastomen zeigen zudem eine Antikörperantwort gegen die Proteine GLEA1, GLEA2 und PHF3
(Fischer et al. 2001; Struss et al. 2001; Pallasch et al. 2005). In einigen Studien konnte darüber hinaus
gezeigt werden, dass die Anwesenheit von bestimmten Tumor-infiltrierenden Lymphozyten mit einer
verbesserten Prognose bei Glioblastompatienten korreliert (Brooks et al. 1978; Boker et al. 1984).
Allerdings existieren ebenfalls Arbeiten, in denen ein gegenläufiger Effekt gezeigt wurde (Safdari et
al. 1985) oder die Ergebnisse nicht bestätigt werden konnten (Schiffer et al. 1979). In jedem Fall muss
davon ausgegangen werden, dass das Immunsystem der Patienten einen Einfluss auf den
Krankheitsverlauf nimmt und somit entscheidend zum Gesamtüberleben eines Patienten beitragen
könnte.
Kapitel 1: Einleitung
15
Charakterisierung der Tumorbiologie des Glioblastom 1.8.
mithilfe der Proteomanalyse
Die Veränderungen, die während der Tumorgenese beobachtet werden können, finden auf
verschiedenen molekularen Ebenen statt. In den letzten Jahren wurde daher vermehrt versucht
durch die Integration verschiedener OMICS-Methoden, wie z.B. der Genom-, Transkriptomananalyse
aber auch Proteom- und Metabolomanalyse, ein umfassendes Bild der Tumorbiologie des GBM zu
erstellen. Insbesondere der Proteomanalyse mit dem Schwerpunkt der Bestimmung der
Veränderungen auf der Ebene der Proteine kommt bei der Beschreibung des Phänotyps eine
besondere Rolle zu. Ziel der Proteomanalyse ist es, die Gesamtheit aller Proteine, die zu einem
definierten Zeitpunkt von einem Organismus oder Gewebe exprimiert werden, zu charakterisieren.
Das Proteom selbst wird durch zahlreiche Faktoren beeinflusst (z.B.: Umwelteinflüsse, Medikamente,
Stoffwechsel etc.), und befindet sich durch den ständigen Auf- und Abbau von Proteinen in einem
dynamischen Prozess (Anderson und Anderson 1996).
So existiert oft nicht nur ein Genprodukt, sondern teilweise auch viele, durch alternatives Spleißen
entstandene, Varianten (Missler und Sudhof 1998). Darüber hinaus korreliert auch die Menge der
mRNA nicht immer mit der Menge an exprimiertem Protein (Gygi et al. 1999). Zudem spielen
posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierungen, Glykosilierungen oder Acetylierungen
eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion und anderen wichtigen Vorgängen in der Zelle. Die
Proteomanalyse ist somit eine wichtige Ergänzung zur Analyse des Genoms, denn sie ermöglicht es,
Veränderungen zu beschreiben, die auf genomischer Ebene nicht erfassbar sind.
Mit der Proteomik sind in den letzten Jahren eine Reihe von Methoden entwickelt worden, welche
Analysen von hochkomplexen Proteingemischen ermöglichen. Die Anforderungen, die an ein System
gestellt werden, mit dem eine quantitative Erfassung von Expressionsänderungen in einer komplexen
Probe möglich ist, sind hoch. Nach Zuo et al. (2001) kann man von circa 10.000–20.000
Proteinspezies im Proteom einer einzigen Säugetierzelle ausgehen, deren Abundanz sich in einem
dynamischen Bereich von 7-8 Größenordnungen bewegt (Anderson und Anderson 1996). Klassische
Methoden der Proteomanalyse sind die 2D-Gelelektrophorese (Klose und Kobalz 1995) und
massenspektrometriebasierte Quantifizierungstechniken wie z.B. die markierungsfreie Analyse (Silva
et al. 2005) oder SILAC (Ong et al. 2002). All diesen Methoden wohnt inne, dass eine komplexe
Protein- oder Peptidmischung zunächst in verschiedene Dimensionen aufgetrennt wird und
anschließend Signalintensitäten für die separierten Analyten aufgezeichnet werden. Die
Kapitel 1: Einleitung
16
Quantifizierung eines Proteins/ Peptids kann dann über mehrere Proben hinweg anhand dieser
Signalintensitäten vorgenommen werden (Abbildung 1.8).
Abbildung 1.8: Übersicht verschiedener Methoden zur Proteinquantifizierung in der Proteomik. Neben der 2D-
Gelelektrophorese stehen auch diverse massenspektrometriebasierte Techniken zur Verfügung. Hierbei kann
zwischen Methoden, die sich der Markierung einer Probe mit schweren Isotopen bedienen, und markierungsfreien
Ansätzen unterschieden werden.
Der Massenspektrometrie kommt hier eine besondere Rolle zu. Durch die Entwicklung von weichen
Ionisierungsmethoden wie der MALDI- oder ESI-Technologie in den 1980er Jahren ist es möglich
geworden, Proteine mittels Massenspektrometrie zu analysieren. Dem Ansatz, die Proteine zunächst
in gering komplexen Mischungen intakt zu vermessen, ist einer Methode gewichen, Proteine vor
ihrer Analyse mittels einer Protease zu verdauen und die resultierenden Peptide dann nach HPLC-
Trennung mittels MS zu analysieren. Für die Massenanalyse wurden darüber hinaus in letzten Jahren
eine Vielzahl von Analysatoren, wie TOF-Instrumente, Ionenfallen, Triple-Quadrupole aber auch die
Orbitrap entwickelt und etabliert. Mit diesen Techniken sind umfassende Analysen der Proteine
sowohl mit gerichteten Methoden wie dem selected reaction monitoring (SRM) (Anderson und
Hunter 2006) als auch mit ungerichteten Methoden, wie z.B. markierungsfreier Quantifizierung,
Kapitel 1: Einleitung
17
möglich. Ein Vorteil der ungerichteten Methoden gegenüber der Gelelektrophorese besteht darin,
die Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen auf einer Methodenplattform zu vereinigen. So
wurden zunächst Methoden basierend auf der Isotopenverdünnung wie z.B. ICAT, SILAC, aber auch
markierungsfreie Methoden (z.B. Quantifizierung basierend auf der Intensität des Mutterions (Silva
et al. 2005) oder spectral counting (Liu et al. 2004) entwickelt. Mittlerweile hat sich aufgrund der
Reproduzierbarkeit und Robustheit von Massenspektrometrie und nanoHPLC die markierungsfreie
Massenspektrometrie als Standardmethode durchgesetzt. Sie erlaubt es, ohne weitere Manipulation
der Proteine in der Zellkultur oder durch chem. Modifikation, die biologische Probe direkt zu
vermessen. Dieser Aspekt hat sich insbesondere bei der Verwendung von klinischem Material als
vorteilhaft erwiesen (Shapiro et al. 2012; Martinez-Pinna et al. 2014).
Zunehmend nehmen aber auch Biochips, wie sie bereits in der DNA/RNA-Analyse weit verbreitet
sind, Einzug in die Proteomanalyse. In den letzten Jahren sind verschiedene Formate von Biochips,
wie z.B. Protein Arrays, Peptid Arrays, Antikörper Arrays und Gewebe Arrays, entwickelt worden, die
je nach Typ für unterschiedliche Anwendungen geeignet sind. Diese Chips erlauben es, parallel
tausende von Proteinen hinsichtlich Protein-Antikörper, Protein-Protein oder Protein-Liganden
Interaktion zu überprüfen. So wurden Protein Arrays mittlerweile eingesetzt, um Protein-Protein-
Interaktionen zu charakterisieren (MacBeath und Schreiber 2000; Zhu et al. 2001), neue Biomarker
für Krankheiten zu detektieren (Lalive et al. 2006) und die Spezifität DNA-bindender Proteine zu
analysieren (Boutell et al. 2004). Darüber hinaus werden sie häufig eingesetzt, um die humorale
Immunantwort zu charakterisieren (Robinson et al. 2002; Sundaresh et al. 2006; Lubomirski et al.
2007), die Spezifität von Antikörpern zu testen (Michaud et al. 2003; Predki et al. 2005) und liefern
neue Erkenntnisse im Rahmen der Medikamentenentwicklung (He und Chiu 2003; Kumble 2003). So
stellen Protein Biochips mittlerweile z.B. eine interessante Alternative zu den bisher für die Detektion
von Autoantikörpern häufig verwendeten Phagenbibliotheken (Sahin et al. 1997) dar, da die
enthaltenen Proteine rekombinant in Insektenzellen hergestellt werden und somit auch
posttranslationale Modifikationen, welche relevante antigene Signaturen darstellen können,
enthalten (Predki et al. 2005).
Kapitel 2: Zielsetzung der Arbeit
18
2. Zielsetzung der Arbeit
Im Rahmen dieser Arbeit sollen mit Hilfe der Proteomanalyse Proteine identifiziert werden, die mit
dem Langzeitüberleben von Glioblastompatienten assoziiert sind. Diese Proteine sollen wichtige
Hilfestellung beim Verständnis der bisher erst zu einem Teil aufgeklärten zellulären und
immunologischen Mechanismen geben, die die Unterschiede in klinischen Verläufen von
Glioblastompatienten hervorrufen. Um dieses Ziel zu erreichen, sollen sowohl Analysen von
Tumorgewebe als auch von Plasmaproben verschiedener Patientenkollektive durchgeführt werden.
Spezielle Ziele umfassen:
Etablierung und Adaption einer Methode zur Analyse von Proteinfraktionen, erhalten bei der
Aufarbeitung von Tumorproben für die DNA-Analytik für die quantitative differentielle
Proteomanalyse, bestehend aus 2D-DIGE und Massenspektrometrie.
Erstellung des Proteomprofils von Langzeit- und Kurzzeitüberlebenden des Glioblastoms
durch markierungsfreie differentielle Proteomanalyse nach Einsatz der Lasermikrodissektion.
Identifizierung differentiell exprimierter Proteine im Tumorgewebe sowie deren
bioinformatische Charakterisierung mithilfe der Anreicherungsanalyse zur Bestimmung der
zugrundeliegenden biologischen Prozesse.
Ermittlung differentieller Proteine zwischen Glioblastomen von Langzeitüberlebenden in
Abhängigkeit der Mutation im IDH1 Gen mittels Lasermikrodissektion und markierungsfreier
massenspektrometriebasierter Proteomanalyse und deren bioinformatische Analyse mithilfe
der Anreicherungsanalyse zur Bestimmung der zugrundeliegenden biologischen Prozesse.
Die proteomanalytische Charakterisierung von Mausgliomstammzellen unter normalen und
sphärenbildenden Kulturbedingungen zur Etablierung eines Modells zur Untersuchung von
stammzellvermittelten Therapieresistenzen.
Die Untersuchung immunologischer Prozesse, die möglicherweise zu den unterschiedlichen
klinischen Verläufen beitragen, durch die Identifizierung von tumorassoziierten
Autoantigenen im Plasma von Glioblastompatienten durch den Nachweis von
Autoantikörpern.
Kapitel 3: Material und Methoden
19
3. Material und Methoden
Material 3.1.
3.1.1. Puffer und Lösungen
3.1.1.1. Zellaufschluss
2D-Probenpuffer 4x 1D-Probenpuffer
30 mM Tris Base 600 mM DTT 7 M Harnstoff 30 % Glycerin 2 M Thioharnstoff 12 % SDS 4% (w/v) CHAPS 150 mM Tris/HCl pH 8,5 mit HCl Wenig Bromphenolblau, pH 7.0
3.1.1.2. Gelelektrophorese
Separationsgel pH 2-11 Abschlussgel pH 2-11
3,5 % (w/v) Acrylamid 12,3 % (w/v) Acrylamid 0,3 % Piperazindiacrylamid 0,13 % Piperazindiacrylamid 9 M Harnstoff 9 M Harnstoff 5,0% (w/v) Glycerin 5,0% (w/v) Glycerin 0,06 % (v/v) TEMED 0,06 % (v/v) TEMED 4,0 % (v/v) Trägerampholytmix 4,0 % (v/v) Trägerampholytmix 0,03 % (w/v) APS 0,02 % (w/v) APS
Trägerampholytmix Sephadex-Suspension
8 mL Ampholine pH 3,5-10 20 g Sephadex 8 mL Servalyt pH 2-11 Gelöst in 25 % Glycerin 16 mL Pharmalyt pH 5-8 24 mL Pharmalyt pH 4-6,5
Sephadexlösung IEF Schutzlösung
270 mg Sephadex-Suspension 30 % Harnstoff 25 µl DTT (1,4 M) 5 % Glycerin 25 µl Trägerampholytmix 2 % Servalyt 2-4 311 mg Harnstoff/Thioharnstoff
Kathodenpuffer IEF Anodenpuffer IEF
3 M Harnstoff 9 M Harnstoff 0,742 M Phosphorsäure 5 % (v/v) Ethylendiamin 5 % (v/v) Glycerin
2D-Schutzlösung Inkubationspuffer
375 mM Tris Base 125 mM Tris Base 375 mM Tris HCl 40 % Glycerin 3,5 mM SDS 65 mM DTT 104 mM SDS
Kapitel 3: Material und Methoden
20
Trenngel Sammelgel
15 % Acrylamid 4 % Acrylamid 0,2 % Bisacrylamid 0,05 % Bisacrylamid 0,08 % APS 0,3 % APS ansetzen mit SDS Gelpuffer ansetzen mit SDS Gelpuffer filtrieren und entgasen filtrieren und entgasen
SDS-Gelpuffer 10x Laufpuffer für PAGE
750 mM Tris Base 250 mM Tris Base 750 mM Tris HCl 1,92 M Glycin 0,06 % TEMED 35 mM SDS 7 mM SDS
3.1.1.3. Silberfärbung
Fixierung Inkubationslösung
50 % (v/v) Ethanol absolut 0,5M Natriumacetat 10 % (v/v) Essigsäure 0,2 % (w/v) Natriumthiosulfat 30,0 % (v/v) Ethanol
Färbelösung Spüllösung
0,1 % (w/v) Silbernitrat 2,5 % (w/v) Natriumcarbonat
Entwickler Stopplösung
2,5 % (w/v) Natriumcarbonat 0,05 M EDTA 0,1 % (v/v) Formaldehyd
3.1.1.4. Massenspektrometrie
Waschlösung A Waschlösung B
10 mM Ammoniumhydrogencarbonat 5 mM Ammoniumhydrogencarbonat 50 % Acetonitril
Entfärbungslösung Trypsinlösung
15 mM Natriumthiosulfat 20 µg Trypsin 50 mM Kaliumhexacyanoferrat 600 µL Waschlösung A
DTT-Lösung Iodacetamid-Lösung
10 mM DTT 55 mM Iodacetamid 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat
3.1.1.5. Westernblotanalyse
Kathodenpuffer für Blot Anodenpuffer für Blot
300 mM Aminocapronsäure 300 mM Tris Base 30 mM Tris Base 100 mM Tricine
TBS Puffer Blockingpuffer
50 mM Tris Base 3 % (w/v) Milchpulver 150 mM NaCl 1 % (w/v) BSA 0,1 % (v/v) Tween 20 % in TBS pH 8,0 mit HCl
Kapitel 3: Material und Methoden
21
3.1.1.6. ProtoArray-Analyse
Block Puffer für ProtoArray Wasch Puffer für ProtoArray
50 mM HEPES pH 7,5 1 x PBS 200 mM NaCl 1 x Synthetic Block 0,08 % Triton X-100 0,1 % Tween 20 25 % Glycerin 20 mM Reduziertes Glutathion 1 mM DTT 1 x Synthetic Block
3.1.1.7. ELISA
Beschichtungspuffer
100 mM Natriumcarbonat 100 mM Natriumbicarbonat pH 9.6
3.1.2. Laborgeräte und Verbrauchsmaterialien
Bruker Daltonics HCT plus Ionenfalle Bruker Daltonik, Bremen, Deutschland
Array-Scanner FR202 Strix Diagnostics GmbH, Berlin, Deutschland
Aminosäure-Analyse Waters, Milford, USA
CapSure Macro LCM Caps Life Technologies, Carlsbad, USA
Durchlichtscanner (PowerLook 2100) Umax Data Systems Inc., Taiwan
ECL Hyperfilm GE Healthcare, München, Deutschland
Einmalküvetten (halbmikro) Sarstedt, Nürnberg, Deutschland
ESI Nadeln New Objective, Woburn, USA
Fluoreszenzscanner Typhoon Trio GE Healthcare, München, Deutschland
HPLC Säule 15 cm Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland
HPLC Säule 25 cm Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland
IEF-Glasröhrchen Schott Medica, Wertheim, Deutschland
IEF-Kammern Selbstbau nach Klose, Werkstatt Ruhr-Universität Bochum, Bochum, Deutschland
Arcturus PixCell II LCM System Life Technologies, Carlsbad, USA
Lasermikrodissektionsmikroskop LMD6500 Leica, Wetzlar, Deutschland
LTQ OrbitrapElite Massenspektrometer Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland
Heparin Röhrchen Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
Mikrotiterplatten Greiner, Frickenhausen, Deutschland
Mikrotiterplattenleser Multimode DTX880 Beckman-Coulter, Krefeld, Deutschland
Multifuge 3S-R Heraeus, Hanau, Deuschland
Objektträger für Mikrodissektion Leica, Wetzlar, Deutschland
PAGE-Kammer, 1D-PAGE Life Technologies, Carlsbad, USA
PAGE-Kammer, 2D-PAGE Desaga, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
ProtoArray Human Protein Microarray v5.0 Life Technologies, Carlsbad, USA
PVDF Membran Immobilon-FL Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland
RSLCnanoTM UltiMate 3000 HPLC Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland
Spannungsgerät 1 D-PAGE GE Healthcare, München, Deutschland
Kapitel 3: Material und Methoden
22
Spannungsgerät IEF und 2 D-PAGE VWR, Darmstadt, Deutschland
Spektrometer Spectronic 200 Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland
Tris-Glycin-SDS Fertiggele (4-20 %, 1,5 mm) Anamed, Darmstadt, Deutschland
UltiMate 3000 HPLC Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland
Ultraschallbad Bandelin, Berlin, Deuschland
Vakuumkonzentrator Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Kartuschenvorsäule Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland
Kapillarvorsäule Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland
X-Bridge Säule Waters, Milford, USA
Zentrifugationsfiltereinheit MicroconTM YM-10 Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Zentrifuge Eppendorf, Hamburg, Deutschland
3.1.3. Software
DeCyder 2D 6.0 GE Healthcare, München, Deutschland
Chromeleon Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland
Esquire Control 6.1 Bruker Daltonik, Bremen, Deutschland
GenePix 6.0 microarray image analysis
Molecular Devices GmbH, Biberach an der Riss, Germany
ImageQuantTM Software GE Healthcare, München, Deutschland
Mascot Matrix Science, London, UK
Progenesis Nonlinear Dynamics
ProteinScapeTM 1.3 Proteom Datenbank
Bruker Daltonik, Bremen, Deutschland
Proteome Discoverer Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland
ProtoArray Prospector V5.2 Life Technologies, Carlsbad, USA
Tune/ X-Calibur Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland
Kapitel 3: Material und Methoden
23
3.1.4. Chemikalienliste
1,4-Dithiothreitol (DTT) BioRad, München, Deutschland
AccQ-Tag Waters, Milford, USA
Aceton Merck, Darmstadt, Deutschland
Acetonitril Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Acrylamid (für die IEF) BioRad, München, Deutschland
Acrylamid-Bis Lösung (30 % Acrylamid, 0,4 % Bis) für SDS-PAGE
Serva, Heidelberg, Deutschland
Agarose BioRad, München, Deutschland
Ameisensäure Merck, Darmstadt, Deutschland
Amersham ECL PlusTM Western-Blotting Detection System
GE Healthcare, München, Deutschland
Aminocapronsäure Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Ammoniumhydrogencarbonat Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Ammoniumperoxodisulfat (APS) BioRad, München, Deutschland
Ampholine pH 3,5-10 GE Healthcare, München, Deutschland
BioRad Protein Assay BioRad, München, Deutschland
Bromphenolblau BioRad, München, Deutschland
BSA Typ VH Gerbu, Gaiberg, Deutschland
CHAPS Serva, Heidelberg, Deutschland
Cy- Farbstoffe für die Minimalmarkierung GE Healthcare, München, Deutschland
DMF Sigma-Aldrich, München, Deutschland
EDTA Merck, Darmstadt, Deutschland
ELISA Ultrablock AbD Serotec, Pucheim, Deutschland
Essigsäure 100 % Merck, Darmstadt, Deutschland
Ethanol absolut Merck, Darmstadt, Deutschland
Ethanol MEK vergällt Merck, Darmstadt, Deutschland
Ethylendiamin Merck, Darmstadt, Deutschland
FA Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Formaldehydlösung 37 % säurefrei Merck, Darmstadt, Deutschland
Glutathion Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Glycerin wasserfrei Merck, Darmstadt, Deutschland
Glycin Serva, Heidelberg, Deutschland
Hämatoxilin Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Harnstoff (für die IEF-Gele) BioRad, München, Deutschland
Harnstoff (für IEF-Puffer) Merck, Darmstadt, Deutschland
HCl Merck, Darmstadt, Deutschland
HEPES Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Interner Standard ASA Waters, Milford, USA
Iodacetamid Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Kaliumchlorid Merck, Darmstadt, Deutschland
Kaliumhexacyanoferrat Merck, Darmstadt, Deutschland
Lysin Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Magnesiumsulfat-Hexahydrat Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Methanol Merck, Darmstadt, Deutschland
Kapitel 3: Material und Methoden
24
Milchpulver AppliChem, Darmstadt, Deutschland
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) BioRad, München, Deutschland
Natriumacetat Merck, Darmstadt, Deutschland
Natriumacetatpuffer für ASA Waters, Milford, USA
Natriumcarbonat Merck, Darmstadt, Deutschland
Natriumbicarbonat Merck, Darmstadt, Deutschland
Natriumchlorid Merck, Darmstadt, Deutschland
Natriumdodecylsulfat (SDS) Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Natriumthiosulfat Sigma-Aldrich, München, Deutschland
N-Tris(hydroxymethyl)methylglycin (Tricine) Sigma-Aldrich, München, Deutschland
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific, Bonn, Deutschland
PBS, pH 7,4 Life Technologies, Darmstadt, Deutschand
Pharmalyt 4-6,5 GE Healthcare, München, Deutschland
Pharmalyt 5-8 GE Healthcare, München, Deutschland
Phenol Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Phosphorsäure Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Piperazin Diacrylamid BioRad, München, Deutschland
Rekombinantes ERBB2 ProQuinase, Freiburg, Deutschland
Rekombinantes FABP3 Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Rekombinantes FHL1 OriGene, Rockville, USA
Rekombinantes MAPK1 Life Technologies, Darmstadt, Deutschand
Schwefelsäure Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Sephadex GE Healthcare, München, Deutschland
Servalyt 2-11 Serva, Heidelberg, Deutschland
Servalyt 2-4 Serva, Heidelberg, Deutschland
Silbernitrat Merck, Darmstadt, Deutschland
Synthetic Block Life Technologies, Darmstadt, Deutschand
TFA Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Thioharnstoff Merck, Darmstadt, Deutschland
TMB Ultra Thermo Fisher Scientific, Bonn, Deutschland
Trifluoressigsäure Merck, Darmstadt, Deutschland
Tris HCl Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Tris(hydroxymethyl-)aminomethan (Tris Base) Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Triton X-100 Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Trypsin (aus Schweinepankreas) Promega, Mannheim, Deutschland
Tween 20 Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Xylol Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Kapitel 3: Material und Methoden
25
3.1.5. Antikörper & Zelllinien
Tabelle 3.1: Verwendete Antikörper
Antigen Firma Bestellnummer Spezies Verdünnung Experiment
CAPG Sigma HPA019080 Kaninchen 1:300 Primärer AK/ Immunoblotting
SFPQ Antikörper-online.de
ABIN183984 Kaninchen 1,25 µg/ml Primärer AK/ Immunoblotting
MitoProfile Total OXPHOS Human
AB Ab110411 Maus 1:500 Primärer AK/ Immunoblotting
Anti Kaninchen
Cell signaling 7074 Ziege 1:7500 Sekundärer AK/ Immunoblotting
Alexa Fluor 555 Anti-Maus IgG
Invitrogen A21424 Ziege 1:5000 Sekundärer AK/ Immunoblotting
Alexa FluorR 647 Anti-Human IgG
Invitrogen A21445 Ziege 1µg/mL Sekundärer AK/ Protein Array
HRP Anti-Human IgG
Dianova 109-036-044 Ziege 1:1000 Sekundärer AK/ ELISA
Tabelle 3.2: Verwendete Zelllinien
Zellinie Bezugsquelle Ursprungsorganismus Literatur
A172 ATCC: CRL-1620 Homo sapiens Giard et al. (1973) T98G ATCC: CRL-1690 Homo sapiens Stein (1979) GL-261 Zur Verfügung gestellt von X.
Breakefield (Boston, MA, USA)
Mus musculus Ausman et al. (1970)
SMA-497 Zur Verfügung gestellt von Dr. D. Bigner (Durham, NC, USA)
Mus musculus Serano et al. (1980)
SMA-540 Zur Verfügung gestellt von Dr. D. Bigner (Durham, NC, USA)
Mus musculus Serano et al. (1980)
SMA-560 Zur Verfügung gestellt von Dr. D. Bigner (Durham, NC, USA)
Mus musculus Serano et al. (1980)
Kapitel 3: Material und Methoden
26
Methoden 3.2.
3.2.1. Methoden zur Probenvorbereitung
3.2.1.1. Aufarbeitung der Proteinfraktion für die Proteomanalyse
Für die differentielle Proteomanalyse von Tumorgewebe von Langzeit- bzw. Kurzzeitüberlebenden
des Glioblastoms mittels 2D-PAGE wurden Proteinfraktionen, welche bei der Aufarbeitung von
DNA/RNA entstehen, etabliert. Dieses Vorgehen ermöglichte sowohl einen möglichst effizienten
Materialeinsatz des zum Teil knappen Tumormaterials als auch, aufgrund der Untersuchung
desselben Patientenmaterials, eine bessere Vergleichbarkeit von Daten aus der DNA, RNA und
Proteinanalyse. Um Störungen bei der isoelektrischen Fokussierung zu vermeiden, wurde die Salzlast
der Proteinfraktionen (4 M Guanidinisothiocyanat mit Cäsiumchlorid) vor dem Einsatz in der 2D-
PAGE reduziert (Grzendowski et al. 2009). Dazu wurde die Proteinfraktion durch Ultrafiltration mit
Microcon™ YM-10 Filtern aufkonzentriert (Durchlassgrenze von 10 kDa). 100 μl der Proteinfraktionen
wurden dazu in einem Microcon™-Filter pipettiert und anschließend zentrifugiert (120 min, 4°C,
14.000 x g). Nach Ende der Zentrifugation wurden 100 μl 2D-Probenpuffer zugefügt, die Filtereinheit
umgekehrt, in ein neues Probengefäß verbracht und ein weiteres Mal kurz zentrifugiert. Im Anschluss
wurde der Proteingehalt der Proteinfraktionen mit dem BioRad Protein Assay nach Bradford
bestimmt (siehe 3.2.2.1).
3.2.1.2. Laser Mikrodissektion
Die Laser Mikrodissektion ist ein mikroskopisches Verfahren, bei dem durch Verwendung eines
Lasers definierte Bereiche und/oder einzelne Zellen aus einem Gewebeverbund herausgelöst werden
können. Dieses Verfahren ist sowohl auf kryofixiertes Gewebe, auf formalin-fixiertes in Paraffin-
eingebettetes Gewebe als auch, unter bestimmten Voraussetzungen, auf lebende Zellkulturen
anwendbar. Im Rahmen diese Arbeit wurden zwei unterschiedliche Systeme angewendet.
Laser Capture Mikrodissektion mit einem Gerät der Firma Arcturus
Bei der Laser Capture Mikrodissektion der Firma Arcturus wird der zu isolierenden Bereich des
Gewebes mithilfe eines Infrarot-Lasers auf eine thermoplastische Membran geschmolzen. Dabei
verbindet sich die inerte Membran mit dem darunterliegenden Gewebeausschnitt und kann im
darauffolgenden Schritt samt Gewebe herausgelöst werden.
Kapitel 3: Material und Methoden
27
Für die Laser Capture Mikrodissektion wurden 7 µm dicke Schnitte mit einem Mikrotom angefertigt
und auf einen, für die Mikrodissektion geeigneten Objektträger, verbracht. Die Schnitte wurden
anschließend nach folgendem Schema (Tabelle 3.3) mit Hämatoxylin gefärbt:
Tabelle 3.3: Färbeprotokoll für Gewebeschnitte
Zeit Lösung
30'' 75% Ethanol
30'' Wasser
30'' Hämatoxylin (1:1000 verdünnt in H2O)
30'' Wasser
30'' 75% Ethanol
30'' 95% Ethanol
Ein weiterer Schnitt wurde als Referenz mit Hämatoxilin-Eosin angefärbt und tumorhaltige Bereiche
vom Neuropathologen angezeichnet. Anschließend wurden ca. 10 mm2 Zellen anhand der Vorlage
mit einem Arcturus PixCell II Gerät ausgelasert. Hierfür wurden Macro Caps und eine Laserintensität
von maximal 65 V verwendet. Für die Extraktion der Proteine von der Folie des Caps wurden 20 µL
2D-Probenpuffer auf das Cap pipettiert und die Probe mit 6x10 s Ultraschall im Eisbad und
intensivem Vortexen behandelt (Schritte wurden bei Bedarf wiederholt). Anschließend wurde die
Probe für 5 min bei 2.000 x g zentrifugiert und das Cap verworfen. Die Probe wurde bis zur weiteren
Verwendung bei -80°C gelagert.
Laser Mikrodissektion mit einem Gerät der Firma Leica
Das Gerät der Firma Leica verwendet spezielle Objektträger, welche aus einer dünnen, inerten Folie
bestehen, auf die die Gewebeschnitte zunächst aufgebracht werden müssen. Im Verlauf der
Mikrodissektion werden sowohl Gewebe als auch Folie mit Hilfe des Lasers durchschnitten und das
gewünschte Gewebestück fällt samt Folie mittels Gravitation in das darunter bereitgestellte
Reaktionsgefäß.
Für die Laser Mikrodissektion von Glioblastomen mit dem Gerät der Firma Leica wurden in der
Neuropathologie der Universitätsklinik Düsseldorf je 10 konsekutive Schnitte (7 µm Dicke) eines
Tumors auf spezielle Objektträger für die Mikrodissektion aufgebracht. Ein elfter Schnitt wurde mit
Hämatoxilin-Eosin gefärbt und tumorhaltige Bereiche vom Neuropathologen markiert. Für jede
Probe wurde in ein Reaktionsgefäß 20 µL 2D-Probenpuffer vorgelegt und anhand der markierten
Vorlage die entsprechenden Bereiche aus dem Gewebe ausgeschnitten. Für die finale
markierungsfreie Studie wurde, basierend auf den Ergebnissen der Methodenoptimierung,
angestrebt, pro Patient mindestens 10 mm2 Material zu gewinnen. Hierfür wurden je nach
Kapitel 3: Material und Methoden
28
Tumorgröße 5-7 Schnitte desselben Patienten vereint. Die am Gerät gewählten
Parametereinstellungen können der Tabelle 3.4 entnommen werden.
Tabelle 3.4: Einstellungen für die Lasermikrodissektion
Parameter Wert
Power 40 µJ
Aperture 23
Speed 26
Pulsfrequenz 964 Hz
Offset 60
Vergrößerung 10x
Die Proben wurden bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert.
3.2.1.3. Zellaufschluss von mikrodissektiertem Gewebe für die
markierungsfreie Quantifizierung
Für den Zellaufschluss wurden die mit 2D-Probenpuffer versetzten Gewebestücke für 6x10 s mit
Ultraschall im Eisbad behandelt. Daran anschließend wurde für 15 min bei 16.000 x g und 4°C
zentrifugiert und der Überstand in frische Reaktionsgefäße überführt. Von jeder Probe wurden
10 mm2 mikrodissektiertes Gewebe mit 4 x 1D-Probenpuffer versetzt und für 10 min bei 40 °C
inkubiert. Die weitere Prozessierung erfolgte analog zu 3.2.3.1, jedoch wurde die Trennung kurz nach
dem vollständigen Einlaufen der Proben in das Gel abgebrochen. Zur Visualisierung der Proben im
Gel wurden diese silbergefärbt.
3.2.1.4. Sammlung von Plasma
Für die Detektion von Autoantikörpern im Plasma von Glioblastompatienten wurde im Rahmen des
Deutschen Gliomnetzwerkes in den klinischen Zentren für die Sammlung von Plasma ein
standardisiertes Protokoll etabliert: Innerhalb eines 90 minütigen Zeitfensters wurden den Patienten
zwei 9 mL Heparin-Röhrchen Blut abgenommen und bei 3.000 x g für 15 min bei Raumtemperatur
zentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend in 1 mL Aliquots aufgeteilt und bei -80°C bis zur
weiteren Verwendung gelagert. Darüber hinaus wurden umfassende Patientendaten, wie z.B. Alter,
Geschlecht, Resektionsausmaß und Karnofsky Performance Score (KPS), erhoben und dokumentiert.
Für die Proteinarray-basierte Studie wurde bei der Auswahl der 20 neu diagnostizierten
Glioblastompatienten, der 20 Patienten, deren Diagnose bereits mindestens zwei Jahre zurücklag,
sowie den 20 nicht tumorerkrankten Kontrollen auf eine gleiche Verteilung der o.g. Kriterien in den
jeweiligen Gruppen geachtet.
Kapitel 3: Material und Methoden
29
3.2.1.1. Präparation für massenspektrometrische Analysen
Für die massenspektrometrischen Analysen wurden 2D-Proteinspots entweder nach Visualisierung
durch Silberfärbung oder durch Unterlegen eines Ausdrucks des Fluoreszenzscans in Originalgröße
mit Stanzen (Ø 0,5 cm, 1 cm oder 1,5 cm) ausgestochen. Um eine Kontamination der Proben durch
Fremdproteine zu vermeiden, wurde die Stanze nach jedem Schritt gereinigt. Für die
markierungsfreie Analyse wurden die silberangefärbten Gelbanden des 1D-Kurzgels mit Hilfe eines
Skalpells ausgeschnitten und in Verdauröhrchen überführt. Gelstücke aus silbergefärbten Gelen
wurden mit Entfärbungslösung entfärbt. Hierfür wurden auf jeden Gelspot 15-30 µL der Lösung
gegeben und die Flüssigkeit nach einminütiger Inkubation wieder abgenommen. Daran anschließend
wurden die Gelstücke gewaschen, indem sie abwechselnd für je 10 min mit je 10-30 µL der
Waschlösung A oder der Waschlösung B inkubiert wurden. Abschließend wurden die Gelstücke für
30-45 min im Vakuumkonzentrator eingetrocknet. Für die markierungsfreie, quantitative Analyse
wurden die Proben zusätzlich mit 50 µL DTT-Lösung reduziert (45 min bei 56°C) und anschließend die
Cysteine durch 50 µL Iodacetamid-Lösung carbamidomethyliert (30 min bei RT, abgedunkelt). Darauf
folgend wurde erneut abwechselnd für je 10 min mit je 10-30 µL der Waschlösung A oder der
Waschlösung B inkubiert und die Gelstücke anschließend für 30-45 min im Vakuumkonzentrator
eingetrocknet. Für die Präparation zur späteren Analyse mittels nano-HPLC ESI MS/MS wurden die
Gelstücke, durch Zugabe von je 2-6 µL Trypsinlösung (0,033 µg/µL) bei 37 °C über Nacht verdaut. Für
die Extraktion wurden die Gelstücke mit 10 µl einer Lösung von Acetonitril und 0,1 %iger TFA (50:50,
v/v) versetzt und 15 min mit Ultraschall behandelt. Der Überstand wurde abgenommen und das
Gelstück erneut mit 10 µL Lösung versetzt und für 15 min mit Ultraschall behandelt. Die Überstände
wurden vereinigt und das Acetonitril im Vakuumkonzentrator entfernt.
3.2.2. Methoden zur Proteinkonzentrationsbestimmung
3.2.2.1. Proteinkonzenztrationsbestimmung nach Bradford
Zur Bestimmung der Proteinkonzentration der Proben wurde der Proteinassay nach Bradford
eingesetzt. Dieser beruht auf der Verschiebung des Absorptionsmaximums von Coomassie Brilliant
Blue G-250 (Triarylmethanfarbstoff) von 465 zu 595 nm bei Bindung an Proteine (Farbverschiebung
von Rotbraun nach Blau). Zunächst wurde eine Konzentrationsreihe durch Verdünnung einer BSA
Stammlösung (10 µg/µL) erstellt (siehe Tabelle 3.5).
Kapitel 3: Material und Methoden
30
Tabelle 3.5: Ansatzschema zur Erstellung einer Eichreihe für die Proteinbestimmung nach Bradford
Konzentration [µg/µL]
Stammlösung BSA [µL]
H2O [µL]
0 0 0 0,25 25 25 0,50 50 50 0,75 75 75 1,00 100 100 1,25 125 125 1,50 150 150 1,75 175 175 2,00 200 200
Die Proben sollten eine Proteinkonzentration im Bereich von 0,2 – 2 µg/µL aufweisen. In alle
Küvetten wurden 800 µL H2O vorgelegt. Dann wurden jeweils 200 µL Bradford Reagenz (BioRad
Protein Assay) und anschließend 10 µL der Konzentrationsreihe zugegeben, kurz gemischt und sofort
die Extinktion bei 595 nm gemessen. Für die Messung der Proben wurden anstatt der
Konzentrationsreihe je 10 µL einer entsprechenden Verdünnung der Probe zugegeben.
3.2.2.2. Aminosäureanalyse
Mit der Aminosäureanalyse (ASA) lässt sich neben der Proteinmenge auch die
Aminosäurezusammensetzung einer Probe bestimmen. Hierfür werden die einzelnen Aminosäuren
der Proteine und/oder der Peptide mittels sauerer Hydrolyse freigesetzt, mit einem Fluorophor
markiert und über eine C18-Säule mittels HPLC aufgetrennt. Die getrennten Aminosäurederivate
können dann durch ihr Absorptionssignal im UV-Chromatogramm detektiert und anhand der
enthaltenen Signalintensitäten quantifiziert werden
Im Vorfeld der Analyse wurden alle verwendeten Probengefäße bei 400 °C für mindestens 4 h erhitzt,
(Muffelofen), um Kontaminationen zu entfernen. Die Probe wurde auf den Boden eines kleinen
Reagenzglases pipettiert und vollständig im Eppendorf Konzentrator eingeengt. Für die saure
Gasphasenhydrolyse wurde das Reagenzglas mittels einer Pinzette in ein Vakuumgefäß überführt.
Dann wurden 500 µl 6 N HCl und 5 Phenolkristalle als Antioxidans in das Vakuumgefäß gegeben. Das
Vakuumgefäß wurde verschlossen und für eine vollständige Entfernung des Sauerstoffs an eine
Vakuumpumpe angeschlossen und dreimal unter Argon evakuiert. Die Hydrolyse erfolgte für 60 min
bei 180°C in einem Trockenschrank. Überschüssiges HCl wurde im Anschluss über die Vakuumpumpe
entfernt. Als Hydrolysekontrolle wurden parallel stets 0.5 µg BSA hydrolysiert. Die hydrolisierte
Probe wurde in 10 µl 20 mM HCl gelöst. Zur gelösten Probe wurden nun 30 µl Interner Standard
gegeben. Die Derivatisierung erfolgte nach Zugabe von 10 µl AccQ-Tag Reagenz im verschlossenen
Reagenzglas für 10 min bei 56 °C und 200 rpm. Die derivatisierte Probe wurde anschließend in
spezielle Probengefäße überführt. Pro Analyse wurden je 10 µl Probe auf die X-Bridge Säule injiziert
Kapitel 3: Material und Methoden
31
und bei einer Flussrate von 300 µl/min und 37 °C über einen AccQ-TagTM (Natriumacetatpuffer pH
5.0)/ Acetonitril Gradienten separiert und eluiert (siehe Tabelle 3.6). Die Detektion der
derivatisierten Aminosäuren erfolgte fluorometrisch (Extinktion 250nm, Emission 395nm).
Tabelle 3.6: HPLC Gradient für die Aminosäure-Analyse
Zeit [min]
AccQ-TagTM [%]
Acetonitril [%]
H2O [%]
0.5 99 1 0 24 95 5 0 29 91 9 0
39.5 83 17 0 48 0 60 40 51 100 0 0 60 100 0 0
Die anschließende Auswertung und Quantifizierung erfolgte mittels der Software Millenium 32 4.0
der Firma Waters.
3.2.3. Methoden zur Proteintrennung
3.2.3.1. Proteintrennung mittels 1D-SDS PAGE
Zur schnellen qualitativen Überprüfung von Proben wurde die eindimensionale SDS PAGE verwendet.
Hierbei werden die Proteine eines Proteingemischs zunächst durch Beladung mit dem anionischen
Detergenz SDS denaturiert und ihre Eigenladung maskiert. Anschließend wird die Probe auf ein
Polyacrylamidgel gegeben und die Proteine durch Anlegen einer Spannung entsprechend ihrer Größe
aufgetrennt.
Für die Polyacrylamidgelelektrophorese wurden Tris-Glycin-Fertiggele (4-20 %) von Anamed
eingesetzt. Die gewünschte Probenmenge (zwischen 10 und 20 µg) wurde mit 4 x Probenpuffer
versetzt und für 10 min bei 40 °C inkubiert. Nach dem Spülen der Taschen mit Laufpuffer wurden die
Gele beladen (inklusive 5 µL eines Größenstandards) und die Kammern mit 1 x Laufpuffer für die 1D-
PAGE befüllt. Der Eintritt der Proteine in das Gel erfolgte über 15 min bei 50 V/Gel und die
anschließende Trennung bei 60 mA/Gel.
3.2.3.2. 2D-PAGE
Bei der 2D-Gelelektrophorese werden die Proteine eines Proteingemischs zunächst mittels
isoelektrischer Fokussierung (IEF) entsprechend ihres isoelektrischen Punktes entlang eines pH-
Gradienten aufgetrennt. Anschließend erfolgt eine Trennung entsprechend des Molekulargewichtes
durch die oben beschriebene SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.
Kapitel 3: Material und Methoden
32
Die (ggf. fluoreszenzmarkierten) Proben wurden mit je 1/10 des Volumens an DTT und Servalyt 2-4
versetzt. Die Ansätze für ein Gel wurden vereinigt, gründlich durchmischt und kurz anzentrifugiert.
Für die IEF wurden präparative Rundgele mit einer Länge von 20 cm eingesetzt. Diese waren
mindestens drei Tage, maximal sieben Tage vor dem gewünschten Einsatz hergestellt worden. Im
basischen Bereich wurde das Separationsgel zum Schutz noch mit ca. 1 cm Abschlussgel
überschichtet. Zur Vermeidung von störenden Proteinpräzipitationen an der Auftragsstelle wurde vor
dem Probenauftrag 10 µL Sephadexlösung auf das Separationsgel aufgetragen. Anschließend wurden
die Proben auf das Gel aufgetragen und mit IEF Schutzlösung überschichtet. Die Kammer wurde mit
Anodenpuffer bzw. Kathodenpuffer für die IEF gefüllt und die Röhrchen mit Anodenpuffer aufgefüllt.
Danach wurde das Spannungsprogramm entsprechend der Röhrchenlänge gestartet (Tabelle 3.7):
Tabelle 3.7: Spannungsprogramm für die 20 cm IEF
Zeit Spannung
1 h 100 V
1 h 200 V
17,5 h 400 V
1 h 650 V
30 min 1000 V
10 min 1500 V
5 min 2000 V
Die Laufkammern wurden ggf. mit einer Schutzhülle abgedunkelt, um das Ausbleichen der
Fluoreszenzfarbstoffe zu verhindern. Im Anschluss an die Fokussierung wurden die Rundgele, nach
Abnahme des flüssigen Überstands, mit einem Polyacrylamidstopfen versehen und zur basischen
Seite ausgestoßen. Die IEF-Gelstränge wurden 10 min in Inkubationspuffer äquilibriert und dann
mehrfach mit 1 x Laufpuffer für die SDS PAGE gespült. Die Gele wurden entweder sofort mittels 2D-
SDS PAGE weiter prozessiert oder bis zur weiteren Verwendung für wenige Tage bei -80 °C gelagert.
Für die zweite Dimension wurden Trenngele mit den Maßen 20x30 cm inklusive 2 cm Sammelgel
verwendet, welche bereits am Tag vor der Gelelektrophorese gegossen wurden. Die Gele wurden bis
zur Verwendung mit 2D-Schutzlösung überschichtet. Für ein 2D-Experiment wurde das IEF-Gel
vorsichtig auf das SDS-Gel aufgebracht und mit einer 1 %igen Agaroselösung (mit Bromphenolblau)
fixiert. Die Laufkammern wurden mit 1 x Laufpuffer für die 2D-PAGE befüllt, die Gelkassetten
blasenfrei eingesetzt und die Kammern ggf. mit Schutzhüllen verdunkelt. Das Einwandern der
Proteine in das Gel erfolgte für 15 min bei 37,5 mA/Gel und die gesamte elektrophoretische
Trennung wurde bei 100 mA/Gel durchgeführt. Die Gelkammern wurden konstant auf 15°C
temperiert und die Trennstrecke betrug 30 cm bei einer Gelstärke von 1,5 mm.
Kapitel 3: Material und Methoden
33
3.2.3.3. Trennung niedrig-komplexer Proben mittels nano-HPLC
Jede Probe wurde mit 0,1 %iger TFA auf ein Volumen von 16 µl eingestellt. Für die Aufnahme der
Massenspektren mittels HPLC ESI-MS/MS, wurden die extrahierten Proben zunächst mittels online
Reversed-Phase nano-HPLC (Ultimate 3000, Dionex GmbH, Idstein, Deutschland) aufgetrennt. Hierfür
wurde eine Vorkonzentrierung über eine Vorsäule (Acclaim PepMap C18, 2 cm Länge, 75 µm
Innendurchmesser, 3 µm Partikelgröße, 100 Ǻ Porengröße) vorgenommen, die eigentliche Trennung
erfolgte über eine C18 Pepmap Säule (15 cm Länge, 75 µm Innendurchmesser, 3 µm Partikelgröße,
100 Ǻ Porengröße) mittels eines linearen Gradienten von B (84 % Acetonitril, 0,1% Ameisensäure)
über 60 min bei einer Flussrate von 300 nL/min.
3.2.3.4. Trennung hoch-komplexer Proben mittels nano-HPLC
Damit jeweils dieselbe Menge extrahierter Peptide auf die HPLC-Säule geladen wurde, wurde im
Vorfeld der Analyse von allen Proben eine Konzentrationsbestimmung mittels Aminosäureanalyse
(3.2.2.2) durchgeführt. Für die markierungsfreie Quantifizierung wurden 300 ng Probe mit 0,1% TFA
auf ein Endvolumen von 16 µL gebracht und zunächst mittels Reversed-Phase nano HPLC (RSLCnano
UltiMate 3000, Dionex GmbH, Idstein, Deutschland) getrennt. Hierfür wurden die Proben auf eine
C18 Vorsäule geladen (Acclaim PepMap C18, 2 cm Länge, 100 µm Innendurchmesser, 3 µm
Partikelgröße, 100 Å Porengröße) und für 10 min mit 0.1% TFA entsalzt. Anschließend wurde die
Vorsäule vor die analytische Hauptsäule (Acclaim PepMap RSLC C18; 25 cm Länge, 75 µm
Innendurchmesser, 2 µm Partikelgröße, 100 Å Porengröße) geschaltet und die Peptide im Verlauf von
120 min bei einer Flussrate von 300 nL/min aufgetrennt, bevor sie in das Massenspektrometer
gelangten. Die mobile Phase bestand aus 0,1% Ameisensäure in Wasser (Lösungsmittel A) bzw. 84%
Acetonitril, 0.1% Ameisensäure in Wasser (Lösungsmittel B). Der Gradient startete mit 4% B, wurde
innerhalb von 5 min auf 10% B, dann innerhalb von 62 min auf 20% B, weiteren 35 min auf 30% B, in
15 min auf 40% B und schließlich in 3 min auf 95% B angehoben.
3.2.4. Methoden zum Nachweis von Proteinen
3.2.4.1. Silberfärbung von Proteingelen
Die in den Gelen aufgetrennten Proteine wurden mit einer Silberfärbung nach (Heukeshoven und
Dernick 1988) gefärbt. Für die Silberfärbung wurden die Gele zunächst über Nacht in 50 mL
Fixierlösung eingelegt. Anschließend wurden die Gele 30 min in 50 mL Inkubationslösung belassen
und dann mit zweimal 100 mL Reinstwasser je 20 min gewaschen. Für die anschließende Färbung
Kapitel 3: Material und Methoden
34
wurden die Gele 30 min in 50 mL der Färbelösung geschüttelt und hinterher einige Sekunden erneut
mit Reinstwasser gewaschen. Es folgte ein einminütiger Spülschritt in 50 mL der Spüllösung und dann
die eigentliche Entwicklung durch ca. 7 min Inkubation in 50 mL Entwicklungslösung; bei beiden
Schritten wurde mit der Hand geschüttelt. Nach ausreichender Entwicklung wurde die Reaktion
durch Inkubation für 20 min in 50 mL der Stopplösung abgestoppt und abschließend
nochmals mindestens 10 min mit Reinstwasser gewaschen.
3.2.4.2. Fluoreszenzmarkierung von Proteinen
Für die spätere Visualisierung in der quantitativen 2D-PAGE wurden die Proben im Vorfeld der
Elektrophorese mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert.
Bei der hier eingesetzten Minimalfluoreszenzmarkierung finden spezielle Cyanin-
Fluoreszenzfarbstoffe Verwendung, die mit ihrer reaktiven Estergruppe kovalent an die ε-
Aminogruppe von Lysinen binden. Durch Einhalten eines bestimmten Protein-zu-Farbstoff
Verhältnisses werden nur etwa 3 % der Proteine markiert. Der Einsatz von drei unterschiedlich
fluoreszierenden Farbstoffen ermöglicht, dass mehrere Proben im selben Gel aufgetrennt und
unabhängig voneinander detektiert werden können, so dass diese Proben exakt dieselben
Bedingungen bei der Gelelektrophorese erfahren. Um ein Ausbleichen der Farbstoffe zu verhindern,
ist darauf zu achten, dass diese im Verlauf des Experiments stets lichtgeschützt sind.
Zunächst wurden die Proben mit den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt. Hierfür wurden
die Minimalfluoreszenzmarkierungssfarbstoffe entsprechend den Herstellerangaben mit DMF p.a.
angesetzt. Es wurden je 50 µg Probe und 1 µL des jeweiligen Farbstoffs (400 mM) eingesetzt. Die
Ansätze wurden 30 min abgedunkelt auf Eis inkubiert. Danach wurde 1 µL einer 10 mM Lysin-Lösung
zugegeben (Abstoppen der Reaktion) und weitere 10 min (abgedunkelt, auf Eis) inkubiert. Die
isoelektrische Fokussierung erfolgte direkt im Anschluss an die Kopplungsreaktion.
Mithilfe eines Fluoreszenzscanners wurden die Proteinmuster im Anschluss an die elektrophoretische
Trennung bei den entsprechenden Wellenlängen der Fluoreszenzfarbstoffe detektiert (siehe Tabelle
3.8).
Tabelle 3.8: Übersicht der eingesetzten Emissionsfilter zu Detektion der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe
Farbstoff Max. Absorption
[nm]
Emissionsfilter [nm]
Cy 2 491 520 BP 40 Cy 3 553 580 BP 30 Cy 5 645 670 BP 30
Kapitel 3: Material und Methoden
35
3.2.4.3. Nachweis von Proteinen mittels Massenspektromerie
Um Peptidmischungen geringer Komplexizität, insbesondere 2D-Spots, zu analysieren, wurde eine
3D-Ionenfalle verwendet. Dieser Gerätetyp zeichnet sich durch eine hohe Robustheit aus und erlaubt
eine vollautomatisierte Fragmentanalyse von Peptidionen.
Für die Elektrospray Ionisations Tandem Massenspektrometrie (ESI-MS/MS) wurde eine HCTultra
Ionenfalle der Firma Bruker Daltonics, welche mit einer Nanoelektrosprayionenquelle (Bruker
Daltonik) und online Nanospray Nadeln (FS360–20–10-D-20; New Objective, Woburn, MA, USA)
ausgestattet war, eingesetzt. Das Gerät wurde vor den Messungen über einen externen Standard
kalibriert. Die massenspektrometrischen Parameter sind Tabelle 3.9 zu entnehmen.
Tabelle 3.9: Massenspektrometrische Parameter für die ESI MS/MS-Analysen mit der HCTultra
Parameter Wert
Kapillarspannung 1000-1400 V Endkappenpotential 500 V Spülgasfluß 10.0 l/min Temperatur des Spülgases 160°C aimed ICC 150000 Maximale Fallenfüllzeit 500 ms
Für die MS/MS Analysen wurde die Software Esquire Control 6.1 (Bruker Daltonics) eingesetzt. Zur
Generierung von Fragmentionen wurde bei isolierten, mehrfach geladenen Peptidionen, welche eine
Intensität von 100.000 aufwiesen, niederenergetische kollisionsinduzierte Dissoziation (CID)
durchgeführt. Die Ausschlusszeit für vorher bereits selektierte Peptidionen betrug 1,2 min. Die
Massenspektren ergaben sich aus einer Aufsummierung von sieben individuellen Scans im Bereich
von m/z 300-1500 mit einer Scangeschwindigkeit von 8,100 (m/z)/s. Die MS/MS Spektren ergaben
sich aus einer Summe von vier Scans im Bereich von m/z 100-2200 bei einer Scangeschwindigkeit von
26,000 (m/z)/s.
3.2.5. Quantitative Nachweistechniken
3.2.5.1. Quantitativer Nachweis von Proteinen mittels Massenspektrometrie
Für die Proteomanalyse hochkomplexer Proteingemische und die markierungsfreie Quantifizierung
wurde ein Orbitrap EliteTM Hybrid Ionenfallen-Orbitrap Massenspektrometer eingesetzt, welches mit
einer nano-ESI-Quelle ausgestattet und online mit einem nano HPLC-System gekoppelt war. Dieses
Hybridmassenspektrometer besteht aus einer linearen Ionenfalle, welche in der Lage ist, sehr schnell
Kapitel 3: Material und Methoden
36
CID-Fragmentspektren aufzuzeichnen, sowie einer Orbitrap, in der hochauflösend und mit einer sehr
hohen Massengenauigkeit die Übersichtsspektren aufgenommen werden. Die Systemparameter sind
Tabelle 3.10 zu entnehmen.
Tabelle 3.10: Massenspektrometrische Parameter für die ESI MS/MS-Analysen mit der Orbitrap Elite
Parameter Wert
Spray Spannung 1,4 kV
Temperatur des ion transfer tube 275 °C
Druck des Kollisionsgases (Helium) 1.3 mTorr
Normalisierte Kollisionsenergie 35%
MS Scan Bereich 350-1700 m/z
MS Auflösung 60.000
Breite des Isolationsfenster für MS/MS 2 m/z
MS/MS Scan Bereich 150-2000 m/z
MS/MS Auflösung normal
Schwellenwert der Intensität für die MS/MS Auswahl 500 counts
Ausschlusszeit eines Ions nach Aufnahme eines MS/MS-Spektrums 45 sek
Das Orbitrap Elite Massenspektrometer wurde in einem Top 20 datenabhängigen Modus betrieben,
wobei einfach und höher als dreifach geladene Ionen von der weiteren Fragmentierung
ausgeschlossen wurden. In diesem Modus wählt das Gerät an einen MS Übersichtsscan
anschließend, die 20 intensivsten Signale für die Aufnahme von Fragmentspektren in der linearen
Ionenfalle aus. Für die interne Kalibrierung (Lock-Masse) wurde Dodecamethylcyclohexasiloxan
(445.120030 Th) aus der Raumluft verwendet.
3.2.5.2. Proteinblotting mit anschließender Immundetektion
Für einen hochsensitiven und spezifischen Nachweis und Quantifizierung von Kandidatenproteinen
wurde Proteinblotting in Verbindung mit anschließender Immundetektion eingesetzt. Hierbei werden
Proteine, nach der Trennung in einem 1D-SDS-PAGE Gel und anschließendem Transfer auf eine
Trägermembran, gezielt mit einen Antikörper nachgewiesen und quantifiziert. Der Nachweis der
Protein-Antikörper-Bindung findet meist durch sekundäre Antikörper statt, welche eine fluorophore
Gruppe oder ein Enzym zum chemiluminizenten Nachweis tragen.
Das Proteinblotting fand im Anschluss an eine 1D-SDS PAGE statt. Der Transfer der Proteine aus dem
Gel auf die PVDF-Membran erfolgte für 1 h bei 2 mA pro cm2 Gelfläche. Anschließend wurden
unspezifische Bindungsstellen auf der Membran mit Blockingpuffer für 1 h blockiert. Die Inkubation
mit dem primären Antikörper (siehe Tabelle 3.1) erfolgte bei 4°C über Nacht. Die Membran wurde
Kapitel 3: Material und Methoden
37
anschließend mit TBS Puffer für 3 x 15 min bei RT gewaschen. Im Anschluss erfolgte die Inkubation
mit dem sekundären Antikörper (siehe Tabelle 3.1) für 1 h bei RT, gefolgt von erneutem Waschen.
Die Detektion der Immunkomplexe erfolgte entweder durch Erzeugung von Chemilumineszenz mit
dem Amersham ECL PlusTM Western-Blotting Detection System und einem Amersham Hyperfilm ECL
oder durch Verwendung eines bereits fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpers und Scannen der
Blotmembran mit einem Fluoreszenzscanners.
3.2.5.3. Detektion von Immunkomplexen mittels Protein Microarrays
Für die Detektion autoimmunogener Proteine wurden die ProtoArray Human Protein Microarrays
v5.0 der Firma Invitrogen (jetzt Thermo Fisher) eingesetzt. Diese bieten die Möglichkeit, parallel über
9.000 potentielle Antigene simultan zu analysieren. Hierbei werden über ein Bacculovirus basiertes
Expressionssystem rekombinant in Insektenzellen hergestellte Proteine in Duplikaten auf
Objektträger aufgebracht. Zusätzlich werden diverse Kontrollen (z.B. Postitionierungspunkte,
humane IgG und anti-human IgG Gradienten) aufgedruckt (siehe Abbildung 3.1). Die Arrays werden
mit Plasma inkubiert und eine Antigen-Antikörperbindung über einen fluoreszenzmarkierten
Sekundärantikörper nachgewiesen.
Die Arrays wurden den Vorgaben des Herstellers entsprechend prozessiert. Jeder Array wurde
zunächst für 15 min bei 4°C und dann weitere 15 min bei RT equilibriert. Alle folgenden Schritte
erfolgten bei 4°C und bei 50 rpm auf einem kreisenden Schüttler. Zunächst wurde auf jeden Array
5 mL Block-Puffer gegeben und für 1 h inkubiert. Der Block-Puffer wurde vorsichtig abgenommen
und 5 mL Wasch-Puffer zugegeben und für weitere 5 min inkubiert. Nach dem Abnehmen des Puffers
wurden 5 mL einer 1:500 Verdünnung von Plasma in Wasch-Puffer zugegeben und für 90 min
inkubiert. Dann wurde die Probe abgenommen und insgesamt fünfmal für je 5 min mit Wasch-Puffer
gewaschen. Anschließend wurde mit 5 mL Sekundärantikörper (siehe Tabelle 3.1) für 90 min
inkubiert. Nach Abnehmen der Antikörperlösung wurde erneut fünfmal gewaschen und dann der
Array durch einminütiges Zentrifugieren bei 200 x g getrocknet. Abschließend erfolgte die Detektion
der Signale mit einem Array-Scanner FR202. Für die Aufnahme der Fluoreszenzintensität wurde die
Software GenePix 6.0 microarray image analysis eingesetzt. Hierfür wurde die Lot-spezifische
GenePix Array List Datei, welche von Life Technologies zur Verfügung gestellt wird, sowie die
Bilddateien der Arrays eingeladen und mit Hilfe der Postitionierungspunkte übereinander gelegt,
Spots detektiert und deren Größe ggf. angepasst bzw. fehlerhafte Spots von der Analyse
ausgeschlossen.
Kapitel 3: Material und Methoden
38
Abbildung 3.1: Aufbau eines ProtoArrays. Jeder Array besteht aus insgesamt 48 Subarrays welche jeweils aus
22x22 Spots bestehen. Alle Spots sind in Duplikaten gedruckt. Darüber hinaus befinden sich in jedem Subarray
Postitionierungspunkte, positiv und negativ Kontrollen sowie eine Verdünngsreihe von humanem anti-IgG.
3.2.5.4. Detektion von Immunkomplexen mittels ELISA
Für die Detektion einer Antikörperantwort in Plasmaproben wurde der Enzyme Linked
Immunosorbent Assay eingesetzt. Hierbei wird rekombinantes Protein adsorptiv an Mikrotiterplatten
gebunden und anschließend mit Plasma inkubiert. Die Detektion des Primärantikörpers erfolgt über
einen mit Meerrettichperoxidase gekoppelten humanen Zweitantikörper.
Rekombinantes Antigen wurden mit Beschichtungspuffer auf eine Konzentration von 0,3 ng/µL
verdünnt und je 100 µL in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettiert. Die Bindung des Antigens
erfolgte bei 4 °C über Nacht. Anschließend wurde die Lösung entfernt und für 2 h mit je 150 µL ELISA
Ultrablock bei 4 °C geblockt. Jede Vertiefung wurde dann zweimal mit je 200 µL PBS mit 0,05 %
Tween 20 gespült. Die Plasmaproben wurden 1:500 mit PBS mit 0,05 % Tween 20 vorverdünnt und
jeweils 100 µL pro Vertiefung aufgetragen und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend
wurde weitere dreimal mit PBS mit 0,05 % Tween 20 gewaschen und dann mit je 100 µL
Sekundärantikörper (1:1000 verdünnt in PBS mit 0,05 % Tween 20; siehe Tabelle 3.1) für eine weitere
Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde erneut viermal mit PBS mit 0,05 % Tween 20
gewaschen und je 80 µL TMB Ultra in jede Vertiefung pipettiert. Nach ca. dreiminütiger Inkubation
Alexa Fluor 647 AB
(Block Positionen / Postitionierungspunkte)
Anti-human IgG Verdünnung
(Normalisierung / Bestimmung der IgG-Konzentration in der Probe)
Human IgG Verdünnung
(Normalisierung /Positivkontrolle für sek. AK)
Negativ Kontrollen
1
48
Kapitel 3: Material und Methoden
39
wurde die Reaktion mit je 40 µL 2 M Schwefelsäure gestoppt. Die Signaldetektion erfolgte im
Mikroplattenleser bei 450 nm.
3.2.6. Bioinformatische Datenanalyse
3.2.6.1. Softwaregestütze Auswertung der DIGE-Scans
Die eingescannten Gelbilder wurden mittels ImageQuantTM Software (GE Healthcare) für die
Bildanalyse beschnitten und anschließend die Bildauswertung mit Hilfe der DeCyder 2D 6.0 Software
(GE Healthcare) vorgenommen. Die Spot-Detektion und Quantifizierung wurde mit dem Differential
In-gel Analysis Modus der DeCyder Software durchgeführt. Die geschätzte Spotanzahl war hierbei auf
10.000 gesetzt, zusätzlich wurden Spots mit einem Volumen < 30.000 durch einen Ausschlussfilter
aussortiert. Der interne Standard, markiert mit dem Cy2 Farbstoff, wurde zur Standardisierung und
Normalisierung der einzelnen Spot-Intensitäten benutzt. Die anschließende statistische Analyse
(Student’s t-tests) der Spots wurde mit dem Biological Variation Analysis Modul der Software
ausgeführt. Als Proteine mit differentieller Abundanz wurden alle Proteinspots mit einem p-Wert
≤ 0,05 und mit einer Abundanzänderung von ≥ ±1,5 angesehen.
3.2.6.2. Proteinidentifizierung von Massenspektren der 3D Ionenfalle
Die Peaklisten der gemessenen MS/MS Spektren wurden mit der Software DataAnalysis 3.3 und den
voreingestellten Parametern generiert. Für die Identifikation von Peptiden und Proteinen wurde
unter Verwendung der ProteinScapeTM (Version 1.3, Bruker Daltonics) Software und der human
International Protein Index (Human IPI v.3.30 Decoy Datenbank, www.ebi.ac.uk) mithilfe des
Suchalgorithmus MASCOT (Version 2.2.0) Datenbanksuchen durchgeführt. Hier wurde eine Decoy-
Variante dieser Datenbank verwendet, die neben der humanen IPI eine Variante derselben
Datenbank enthält, in welcher die Aminosäuresequenzen aller Proteineinträge zufällig durchmischt
wurden. Für die Suche wurden folgende Parameter berücksichtigt:
Cystein modifiziert mit Propionamid
Variable Modifikationen in Folge von Methioninoxidation
Maximal eine ausgelassene Schnittstelle durch unvollständiger Trypsin-Spaltung
keine Details über Proteinmassen und pI aus der 2D- Elektrophorese.
Die Ergebnisse wurden über das Protein Extraktor Modul der Protein Scape Software
zusammengefasst. Dieses Modul entfernt automatisch Redundanzen in Proteineinträgen. Für die
Kapitel 3: Material und Methoden
40
MS/MS Spektren wurde ein Ausschluss-Score von 22 sowie eine Massentoleranz von 1.2 Da für
Peptide und 0.6 Da für Fragmente festgelegt. Als identifiziert wurden Proteine erachtet, für die in
beiden Suchen mindestens 2 Peptide gefunden wurden, einen Mascot-Score >90 aufwiesen und
keine offensichtlichen Kontaminanten waren. (z.B. Keratin 1).
3.2.6.3. Proteinidentifizierung von Massenspektren des Hybrid Ionenfallen-
Orbitrap Massenspektrometer
Für die Proteinidentifizierung von Spektren, die mittels Orbitrap aufgenommen wurden, wurde die
Software Proteome DiscovererTM (Version 1.3, Thermo Fisher Scientific) und die Suchmaschine
MASCOTTM (Version 2.4.1, Matrix Science, London, UK) eingesetzt. Die MS/MS-Spektren wurden
gegen die UniProtKB/Swiss-Prot Datenbank (16608 humane Sequenzen; Datum 04/03/2013) gesucht,
mit folgenden Suchparametern: Protease: Trypsin; maximal zwei überlesene Schnittstellen;
Taxonomie: homo sapiens; 10 ppm Vorläuferion-Massentoleranz; 0.4 Da Fragment-Massentoleranz;
Variable Modifikationen: Oxidation von Methionin; Feste Modifikationen: Carbamidomethylierung an
Cystein. Die false discovery rate (FDR) wurde auf 1% (p ≤ 0.01) gesetzt. Konnten identifizierte Peptide
mehreren Proteinen zugeordnet werden, wurden diese in einer Proteingruppe zusammengefasst.
3.2.6.4. Quantitative Auswertung massenspektrometrischer Daten
Die quantitative Auswertung der mittels Massenspektrometrie generierten Daten wurde mit der
Software ProgenesisTMLC-MS v4.0 vorgenommen. Diese Software gleicht zunächst die einzelnen MS-
Läufe anhand m/z-Werten und Retentionszeiten an und nimmt anschließend eine Normalisierung der
Intensitäten vor. Die differentielle Analyse wird anschließend anhand der Flächen unter den Kurven
der einzelnen Peptidsignale vorgenommen.
Hierfür wurden zunächst alle HPLC-MS-Läufe im raw-Format in die Software importiert und eine
Messung ausgewählt, welche als Referenz fungierte. Für die Wahl des Referenzlaufs war eine geringe
Anzahl von Störsignalen (z.B. Polymeren) sowie ein möglichst vollständiges Signalmuster, gute
Signalintensitäten und gute Trennung in beiden Ebenen entscheidend. Die anderen Läufe wurden im
Anschluss an diesen Lauf mit der „automatic alignment“-Funktion der Software angeglichen und das
Ergebnis manuell überprüft und Fehler gegebenenfalls durch Setzen manueller Vektoren korrigiert.
Für die darauf folgende automatische Detektion der Peptidsignale sowie Normalisierung und
Quantifizierung wurden die Bereiche, in denen das HPLC-System gewaschen und equilibriert wurde
sowie einfach geladene Feature ausgeschlossen. Anschließend wurden die Messungen den zu
vergleichenden Gruppen (Kurzzeitüberlebende wt, Langzeitüberlebende wt, Langzeitüberlebende
IDH1mut) zugeordnet und die Ergebnisse der Datenbanksuche importiert. Die Kriterien für eine
Kapitel 3: Material und Methoden
41
differentielle Expression eines Proteins waren ein p-value ≤0,05 sowie ein Unterschied in der
Abundanz von ≥1,5. Außerdem musste die Quantifizierung über mehr als ein Peptid erfolgt sein.
3.2.6.1. Softwaregestütze Auswertung der Array-Scans
Für die weitere Auswertung der ProtoArray Daten wurde die Software ProtoArray Prospector
eingesetzt. Hierbei werden im Wesentlichen drei Schritte durchlaufen. Zunächst werden für jeden
einzelnen Array die Z-Werte, die CIP-Werte und Variationskoeffizienten für alle Spots berechnet. Der
Z-Wert wird durch die Signalintensität eines Spots minus der mittleren Signalintensität aller humanen
Spots auf dem Array, geteilt durch die Standardabweichung der Signalintensitäten aller humanen
Spots auf dem Array, errechnet. Der CIP-Wert gibt eine Aussage über die Wahrscheinlichkeit, dass es
sich tatsächlich um ein positives Signal handelt, indem er die Signalstärke eines Spots in Relation zu
den negativ Kontrollen setzt. Der Variationskoeffizient evaluiert die Standardabweichung zwischen
den Duplikaten. Ein Spot musste folgende Kriterien erfüllen, um für die weitere Auswertung
berücksichtigt zu werden: Z-Wert ≥3, CIP-Wert ≤0,05 und ein Variationskoeffizient (CV) ≤0,5. In
einem zweiten Schritt wurden die zu vergleichenden Gruppen gebildet und die Signale der einzelnen
Proteine über alle Proben in einer Gruppe angeglichen und die Intensitäten normalisiert. Hierfür
wurde die quantile Normalisierung ausgewählt. Im letzten Schritt wurden Differenzen zwischen den
gebildeten Gruppen mittels der im Programm integrierten M-Statistik ermittelt (Love und Predki
2007). Für die weitere Auswertung wurden die Proteine als mögliche Kandidaten berücksichtigt,
deren p-Wert ≤0,01 war.
3.2.6.1. Anreicherungs-Analysen
Um zu untersuchen, ob bestimmte Prozesse, Zellkompartimente oder enzymatische Funktionen
angereichert sind, wurden verschiedene Strategien eingesetzt.
Zum einen wurde das Programm String (http://string-db.org; Version 9.1; (Snel et al. 2000)) und zum
anderen DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)
(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp; Version 6.7; (Huang da et al. 2009b; Huang da et al. 2009a))
eingesetzt, um innerhalb der Gruppe der differentiellen Proteine Anreicherungen zu detektieren. Bei
der Verwendung von DAVID wurde als Hintergrund die Gesamtheit der quantifizierten Proteine bzw.
bei der Analyse der ProtoArray Daten alle auf dem Chip existierenden Proteine (ohne Kontrollen)
verwendet. Ein Prozess wurde als angereichert berücksichtigt, wenn der Wert für den nach Benjamini
korrigierten p-Wert ≤0,001 war.
Kapitel 3: Material und Methoden
42
Für die globalen Proteinexpressions-Analysen, welche in Kooperation mit dem Institut für
Medizinische Informatik, Statistik und Epidemiologie in Leipzig durchgeführt wurden, wurden die
normalisierten Abundanzen aller quantifizierten Proteine der markierungsfreien quantitativen
Analyse wie folgt prozessiert: Zunächst wurden die Daten von all denjenigen Proteinen bereinigt, bei
denen fehlende Abundanzen existierten. Anschließend wurden die Werte log10 transformiert und
über den Mittelwert aller Proben zentriert. Die Proteinexpression wurde dann mittels selbst-
organisierender Karten (SOM) analysiert (Wirth et al. 2011). Kollektiv exprimierte Proteine wurden
entweder in sogenannten Spot Modulen zusammengefasst oder aber auch Genset-Anreicherungs-
Analysen zur funktionellen Interpretation basierend auf der Expression einzelner Proteine
durchgeführt. Hierbei wurde der Genset-Anreicherungs-Wert (GSZ) herangezogen, welcher die
Signifikanz einer differentiellen Expression von Mitgliedern eines Gensets im Vergleich zu der
mittleren Expression aller Gene einer Probe abschätzt. Die Gensets wurden anhand der Standard
Gene Ontology (GO) Kategorien oder basierend auf ausgewählten Publikationen definiert. Alle
Analysen wurden mit dem R-Programm oposSOM durchgeführt (Wirth et al. 2012).
Kapitel 4: Ergebnisse
43
4. Ergebnisse
Die Gesamtüberlebensdauer eines Glioblastompatienten liegt im Schnitt bei lediglich etwas mehr als
einem Jahr (Johnson und O'Neill 2012; Ronning et al. 2012). Verantwortlich hierfür sind unter
anderem die hohe Proliferationsrate des Tumors und das invasive Wachstum. Dennoch gibt es eine
geringe Anzahl von Patienten, Langzeitüberlebenden genannt, deren Gesamtüberlebensdauer
deutlich über dem Durchschnitt liegt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Faktoren
hinsichtlich ihres Einflusses auf die Gesamtüberlebenszeit untersucht. So wurden die Proteome von
Tumoren von Langzeit- (LTS) und Kurzzeitüberlebenden (STS) mit verschiedenen
proteomanalytischen Methoden charakterisiert und differentiell analysiert. Da neben dem Tumor
selbst auch systemische Effekte den klinischen Verlauf beeinflussen, wurde auch nach
Veränderungen im Immunsystem von Glioblastompatienten gesucht. Hier wurde eine Studie
durchgeführt, in der das Vorkommen tumorassoziierter Autoantikörper im Plasma direkt nach
Diagnosestellung sowie mehrere Jahre danach untersucht wurde. Außerdem wurden vier
Gliomstammzellmodelle hinsichtlich ihrer Eignung zur Untersuchung der Entwicklung von
Resistenzen bei der Chemotherapie von Glioblastompatienten mit proteomanalytischen Methoden
analysiert.
Differentielle Proteomstudie von Proteinüberständen 4.1.
extrahierter Glioblastome
Um differentiell exprimierte Proteine zwischen LTS und STS Patienten zu detektieren, wurde eine 2D-
DIGE Studie mit Tumorgewebe durchgeführt. Da es sich vor allem bei Gewebe von
Langzeitüberlebenden um sehr wertvolles Material handelt, wurde ein von (Grzendowski et al. 2009)
entwickelter Ansatz gewählt, der es ermöglicht, mit einem Gewebestück sowohl DNA- und RNA- als
auch Proteinanalytik zu betreiben. Hierbei werden die Proteinüberstände, welche bei der
Aufarbeitung von DNA/RNA mittels Ultrazentrifugation entstehen, für die Proteomanalyse
eingesetzt.
4.1.1. 2D-DIGE Experiment
Für diese differentielle Studie wurden 11 Proteinüberstände von Langzeitüberlebenden des
Glioblastoms sowie dieselbe Anzahl von Kurzzeitüberlebenden aus der Gewebesammlung des
deutschen Gliomnetzes (GGN) verwendet. Die Patientenproben waren entsprechend ihrem Alter,
Kapitel 4: Ergebnisse
44
Geschlecht, Resektionsausmaß gepaart worden (siehe Tabelle 4.1). Der IDH1 Status der Patienten
war zu diesem Zeitpunkt nicht bekannt und wurde daher bei der Paarung auch nicht berücksichtigt.
Die Proben wurden nach dem etablierten Protokoll für die Behandlung von Proteinfraktionen
aufgearbeitet und anschließend eine Proteinbestimmung nach Bradford durchgeführt. Insgesamt
wurden 14 gepaarte Patientenproben von LTS (>36 Monate) und STS (>6 Monate) mittels 20x30 cm
2D-DIGE analysiert und ausgewertet.
Tabelle 4.1 Für die differentielle Studie eingesetzte LTS und STS Proben inklusive der verwendeten Paarungskriterien.
Status Geschlecht Alter bei Diagnose Resektionsausmaß IDH1-Status
LTS männlich 52.0 total wt
LTS weiblich 48.4 total mut
LTS weiblich 24.1 partial mut
LTS männlich 45.1 subtotal mut
LTS weiblich 56.0 subtotal mut
LTS weiblich 42.8 keine OP wt
LTS männlich 62.1 total wt
STS männlich 56.8 total wt
STS männlich 37.9 total wt
STS weiblich 69.0 total wt
STS männlich 70.6 total wt
STS weiblich 82.5 subtotal wt
STS männlich 57.4 subtotal wt
STS männlich 66.7 total wt
Auf jedes Gel wurden 50 µg Protein der LTS-Probe und 50 µg Protein der gepaarten STS-Probe
aufgetragen. Um farbstoffbedingte Effekte im Laufverhalten und daraus resultierende Differenzen
zwischen den beiden Gruppen zu vermeiden, wurde darauf geachtet, die Farbstoffe zwischen beiden
Gruppen zu wechseln. Zusätzlich wurde ein aus allen Proben erstellter interner Standard, welcher
stets mit dem Farbstoff Cy2 markiert wurde, aufgetragen. Im Folgenden ist ein Gel aus der Studie
exemplarisch gezeigt (Abbildung 4.1).
Kapitel 4: Ergebnisse
45
Abbildung 4.1: Proteinexpressionsmuster von Glioblastomproben von Patienten mit langer bzw. kurzer
Überlebensdauer. Die 2D-Gele zeigen deutliche Unterschiede im Proteinmuster. Aufgetragen wurden 50 µg mit Cy3
markierte Probe eines LTS (links, grün) und 50 µg mit Cy5 markierte Probe eines STS (rechts, rot). Gleiche
Signalintensitäten werden in der Überlagerung der Gelbilder (Mitte) in gelb dargestellt. Der interne Standard,
markiert mit Cy2, ist nicht gezeigt.
Die Auswertung der differentiellen Studie mittels der Bildanalyse Software DeCyder ließ die
Detektion von durchschnittlich 3000 Proteinspots pro Gel zu. Von diesen wiesen 32 Proteinspots
einen Abundanzunterschied ≥ ±1,5 und einen Wert für den t-Test ≤ 0,05 auf und wurden somit als
differentiell eingestuft. Insgesamt wurden 23 Proteinspots gefunden, die bei Langzeitüberlebenden
einen erhöhten Expressionsfaktor aufwiesen, und neun Proteinspots, die bei den
Kurzzeitüberlebenden einen erhöhten Expressionsfaktor gegenüber den Langzeitüberlebenden
zeigten (Abbildung 4.2). Geringe zur Verfügung stehende Proteinmengen machten für die
Identifizierung das Heranziehen eines Referenzproteoms notwendig. Aufgrund der relativ
dominanten Signale von Blutbestandteilen (Albumin, Hämoglobin) wurde auf die Nutzung eines
Gewebeaufschlusses als Referenzproteom verzichtet und Glioblastomzelllinien (siehe Tabelle 3.2)
hinsichtlich ihrer Eignung als Referenzproteom untersucht. Die Zelllinien T98G und A172 zeigten eine
gute Übereinstimmung, insbesondere in den relevanten Bereichen mit dem Standard der
differentiellen Studie und wurden daher für die Identifizierung der als differentiell abundant
ermittelten Spots als Referenzproteom ausgewählt.
LTS STS
170 kDa
130 kDa
100 kDa
70 kDa
55 kDa
40 kDa
35 kDa
25 kDa
15 kDa
10 kDa
Overlay
Kapitel 4: Ergebnisse
46
Abbildung 4.2: Position der differentiellen Proteinspots im 2D-Gel. Die 32 zwischen Tumorgewebe von LTS und
STS differentiellen Proteinspots verteilen sich auf den gesamten mittels 2D-PAGE zugänglichen Molekulargewichts
(ca. 10-200 kDa) - und pI-Bereich (ca. 4-8). Einige der differentiellen Spots weisen ein regelmäßiges
Perlenkettenmuster auf, was auf verschiedene Isoformen eines Proteins hinweist.
Im Rahmen der massenspektrometrischen Analysen der Proteinspots mittels nanoHPLC-ESI MS
wurden 31 Proteine identifiziert, was 23 nicht redundanten Proteinen entsprach (Tabelle 4.2). Wie
aus Abbildung 4.2 ersichtlich, waren in einigen Fällen ganze Spotketten differentiell reguliert. Hierbei
handelt es sich vermutlich um verschiedene Varianten desselben Proteins, wodurch der Anteil
redundanter Proteine bei der Identifizierung erklärt werden kann.
170 kDa
130 kDa
100 kDa
70 kDa
55 kDa
40 kDa
35 kDa
25 kDa
15 kDa
10 kDa
5 6 7 8
442
584
525
752
982
1953
2639
3909 3970 3888
2899
2768
3273
2550
1540
708-762
594-598 555 545
838
1113
565-571
Kapitel 4: Ergebnisse
47
Tabelle 4.2: Differentielle Proteinspots aus der 2D-DIGE -Analyse
Protein Name Gen Name Spot Nr, T-test Expressions-
faktor
Gruppe erhöhter
Abundanz
Heat shock 70 kDa protein 4 HSPA4 442 0,011 -2,0 LTS
Major vault protein MVP 525 0,014 -2,8 LTS 2-oxoglutarate dehydrogenase, mitochondrial
OGDH 545 0,0034 -1,8 LTS
tRNA (cytosine-5-)-methyltransferase NSUN2 555 0,0055 -1,7 LTS Isoform Long of Splicing factor, proline- and glutamine-rich
SFPQ 565 0,0035 -1,8 LTS
Isoform Long of Splicing factor, proline- and glutamine-rich
SFPQ 570 0,011 -2,6 LTS
Isoform Long of Splicing factor, proline- and glutamine-rich
SFPQ 571 0,035 -2,0 LTS
Transitional endoplasmic reticulum ATPase
VCP 584 0,014 -1,8 LTS
C-1-tetrahydrofolate synthase, cytoplasmic MTHFD1 594 0,0025 -2,1 LTS
C-1-tetrahydrofolate synthase, cytoplasmic MTHFD1 595 0,012 -2,2 LTS
C-1-tetrahydrofolate synthase, cytoplasmic MTHFD1 598 0,00076 -2,0 LTS
Aconitase 2 ACO2 708 0,00071 -2,4 LTS
Aconitase 2 ACO2 713 0,000017 -2,7 LTS
Aconitase 2 ACO2 714 0,00003 -2,9 LTS
Aconitase 2 ACO2 715 0,000041 -3,0 LTS
ATP-dependent RNA helicase DDX1 DDX1 719 0,00086 -2,1 LTS Aconitase 2/ ATP-dependent RNA helicase DDX11
ACO2/DDX1 725 0,0017 -2,3 LTS
Isoform 2B of Cytoplasmic dynein 1 intermediate chain 2
DYNC 1│2 752 0,0003 -1,7 LTS
Nicht identifiziert Nicht
identifiziert 762 0,00025 -2,3 LTS
Serotransferrin TF 838 0,046 -1,9 LTS Isoform 1 of Heat shock cognate 71 kDa protein
HSPA9 982 0,019 -1,5 LTS
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L/ Deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase
HNRNPL, SAMHD1
1113 0,021 -2,0 LTS
Nicht identifiziert Nicht
identifiziert 1540 0,037 -1,6 LTS
Macrophage-capping protein CAPG 1953 0,0046 3,0 STS
cDNA FLJ38699 fis 2550 0,0031 2,4 STS
Prohibitin PHB 2639 0,011 2,1 STS
26 kDa protein MRPL46 2768 0,043 1,7 STS Isoform 2 of Heat shock cognate 71 kDa protein
HSPB1 2899 0,028 3,1 STS
Peroxiredoxin-1 PRDX1 3273 0,041 2,0 STS
Nicht identifiziert Nicht
identifiziert 3888 0,039 2,9 STS
Galectin-1 LGALS1 3909 0,038 1,7 STS
Nicht identifiziert Nicht
identifiziert 3970 0,044 2,0 STS
4.1.2. Validierung differentieller Kandidatenproteine mittels
Proteinblotting und Transkriptomdaten
Zur unabhängigen Überprüfung der Abundanzunterschiede in den Tumoren von LTS und STS
Patienten wurden zwei Kandidatenproteine, das SFPQ Protein und das Macrophage-capping protein,
ausgewählt (siehe Abbildung 4.3).
Kapitel 4: Ergebnisse
48
A
B
Abbildung 4.3: Boxplot Darstellung der Abundanzen der zur weiteren Validierung mittels Proteinblot
ausgewählten Kandidatenproteine. Das Macrophage-capping protein (A) zeigt gegenüber den Tumorproben von
LTS in Tumorproben von STS eine dreifach erhöhte Expression. Die Proteinmenge des SFPQ Proteins (B) ist hingegen
gegenüber den Tumorproben von STS in Tumorproben von LTS um 2,6-fach erhöht. Für die Boxplot Darstellung sind
die normalisierten Spotvolumina verwendet worden. 50% der Werte befinden sich innerhalb der Box, die Whiskers
geben das Minimum und Maximum der erhaltenen Signalintensitäten an. Der Median wird durch ⎕ repräsentiert.
0.E+00
1.E+05
2.E+05
3.E+05
4.E+05
5.E+05
6.E+05
7.E+05
8.E+05
LTS STS
No
rma
lisie
rte
s S
po
tvo
lum
en
Macrophage-capping protein
0.E+00
2.E+04
4.E+04
6.E+04
8.E+04
1.E+05
1.E+05
1.E+05
2.E+05
2.E+05
2.E+05
LTS STS
Norm
alis
iert
es S
po
tvo
lum
en
SFPQ Protein
LTS STS
LTS STS
Kapitel 4: Ergebnisse
49
Die Validierung erfolgte mittels Proteinblotting und anschließender Immundetektion (Abbildung 4.4).
Die Auswahl begründete sich auf einer Kombination aus dokumentierter tumorrelevanter Funktion,
hohen Regulationsfaktoren sowie der Verfügbarkeit geeigneter Antikörper. Hierfür wurden weitere
Proben von den klinischen Zentren zur Verfügung gestellt.
A Macrophage-capping protein
B SFPQ Protein
Abbildung 4.4: Proteinblots zur Validierung von differentiellen Kandidatenproteinen aus der 2D-DIGE Studie.
Die in der 2D-Gelstudie beobachtete erhöhte Proteinmenge von Macrophage-capping protein in STS kann im Blot
bestätigt werden. Die zu erwartende Bande wurde bei 38 kDa detektiert (A). Der Nachweis des SFPQ Proteins liefert
kein eindeutiges Ergebnis hinsichtlich unterschiedlicher Mengen von SFPQ zwischen den beiden Patientengruppen.
Zusätzlich zu der zu erwartenden Bande bei 115 kDa in der Gruppe der STS kann jedoch eine zweite Bande bei
geringerem Molekulargewicht detektiert werden (B). Aufgetragen wurden je 20 µg Gesamtprotein von 7 LTS und 5
STS-Proben. Zur Ladekontrolle wurde die Blotmembran mit India Ink angefärbt.
Für den ersten Kandidaten Macrophage-capping protein lässt sich die im 2D-Experiment beobachtete
differentielle Proteinexpression bestätigen. Für das SFPQ Protein ließen sich keine
Abundanzunterschiede zwischen den beiden beobachteten Gruppen im Proteinblottingexperiment
zeigen. Auffällig war hier jedoch, dass in einigen der STS-Proben eine zusätzliche Bande unterhalb des
zu erwartenden Molekulargewichtes von 115 kDa detektiert wurde.
Zur zusätzlichen Validierung der Daten aus der 2D-DIGE Studie wurden die Ergebnisse mit den Daten
aus der ebenfalls mit diesem Material durchgeführten Transkriptomstudie (Reifenberger et al. 2014)
verglichen. Hierbei zeigte sich, dass von den 23 differentiellen Kandidatenproteinen lediglich zu 14
38 kDa
LTS STS
LTS STS
115 kDa
Kapitel 4: Ergebnisse
50
auch Transkriptomdaten vorlagen und von diesen nur das Macrophage-capping protein eine
signifikant differentielle Regulation in dieselbe Richtung auf Ebene der Transkription aufwies.
4.1.3. Erweiterte Analyse der verwendeten Tumorproben hinsichtlich
einer Mutation im Gen der IDH1
Nach Abschluss der 2D-DIGE Studie sowie der nachfolgenden Validierung mittels Westernblot wurde,
begründet durch die Ergebnisse von Parsons et al. (2008), der IDH1-Status der verwendeten
Patientenproben bestimmt. Hierbei stellte sich heraus, dass in der Gruppe der LTS der 2D-DIGE
Studie vier von sieben Patienten eine Mutation im IDH1-Gen aufwiesen, in der Gruppe der STS
Patienten aber ausschließlich IDH1wt Tumoren vorlagen. Daher muss davon ausgegangen werden,
dass detektierte Unterschiede in der Proteinexpression möglicherweise bedingt durch die Mutation
im IDH1 Gen waren.
Differentielle Proteomstudie von mikrodissektierten 4.2.
Glioblastomen
Ziel dieser Arbeit war, ein möglichst umfassendes Bild des Proteoms von Glioblastomgewebe zu
erhalten, um neue Erkenntnisse über die biologischen Prozesse, die bei Langzeitüberleben eine Rolle
spielen, gewinnen zu können. Daher wurden weitere Gewebeproben mittels markierungsfreier
Massenspektrometrie analysiert, welche die parallele Identifizierung und Quantifizierung mehrerer
tausend Proteine erlaubt.
4.2.1. Etablierung der Mikrodissektion für Glioblastomproben
Im Rahmen der gelbasierten Gewebestudie zeigte sich, dass bei der Verwendung von
Proteinüberständen von Gewebestücken in der Proteomanalyse häufig hochabundante
Blutbestandteile detektiert werden. Das heterogene Erscheinungsbild dieser Tumorentität legt nahe,
dass diese nicht durch die Tumorzellen exprimiert, sondern durch Einblutungen im Gewebe
hervorgerufen werden. Um eine besonders hohe Spezifität für Tumorzellen zu erzielen und
Kontaminationen durch umliegendes Gewebe oder Gefäße auf ein Minimum zu reduzieren, wurde
für die Analyse von soliden Tumoren im weiteren Verlauf die Laser Mikrodissektion gewählt
(Abbildung 4.5).
Kapitel 4: Ergebnisse
51
Dafür musste zunächst ein Verfahren etabliert werden, das die Gewinnung von Tumorzellen aus
Gefrierschnitten und den anschließenden Einsatz markierungsfreier quantitativer
Massenspektrometrie erlaubte.
Abbildung 4.5: Mikroskopische Aufnahmen von Glioblastomgewebe vor und nach der Mikrodissektion. Mittels
Lasermikrodissektion lassen sich selektiv bestimmten Zelltypen isolieren. Nekrotische Bereiche, gesundes Gewebe
oder Blutgefäße (Pfeil) können ausgespart werden, um so eine hohe Selektivität für den gewünschten Zelltyp zu
erzielen. Für die Lasermikrodissektion wurde jeweils ein Referenzschnitt mit Hämatoxilin/ Eosin angefärbt und
tumorhaltige Bereiche von Dr. Jörg Felsberg, einem erfahrenen Neuropathologen, angezeichnet. Für die Gewinnung
der Proben für die Proteomanalysen wurden dann, in Abhängigkeit von der Gewebegröße, 5-7 konsekutive Schnitte
desselben Tumors mikrodissektiert und vereinigt. Es wurde versucht von jedem Tumor mindestens 10 mm2
mikrodissektiertes Material für die markierungsfreie Quantifizierung mittels Massenspektrometrie zu erhalten.
Hierfür wurden zunächst Systeme von zwei Herstellern (Arcturus und Leica) mit unterschiedlichen
Funktionsprinzipien hinsichtlich Ihrer Eignung für den Einsatz in der Proteomanalyse anhand von
7 µm Gewebeschnitten von Glioblastomen getestet. Bei dem System der Firma Arcturus wird der
mikrodissektierte Gewebebereich mit der Membran eines aufgesetzten Caps verschmolzen. Das
System der Firma Leica verwendet spezielle Objektträger, deren Membran samt Gewebe nach dem
Schneiden mittels Gravitation in das Probengefäß fällt.
Für markierungsfreie Proteomanalysen werden lediglich wenige Mikrogramm Gesamtprotein
benötigt, was eine gute Voraussetzung für die Kombination mit der Laser Mikrodissektion ist. Da die
bei der Mikrodissektion entstehenden Proteinmengen zu gering für einen Nachweis mittels Bradford-
Proteinbestimmung sind, wurde die aus einer bestimmten Fläche Tumorgewebe erhaltenen
Proteinmengen über den Vergleich mit definierten Mengen an Marker bzw. Zelllysat aus
Zellkulturproben im 1D-Experiment abgeschätzt (siehe Abbildung 4.6).
Kapitel 4: Ergebnisse
52
A B
Abbildung 4.6: 1D-PAGE zur Abschätzung des Proteingehalts in mikrodissektierten Proben. A: Mikrodissektion
mit einem Gerät der Firma Arcturus (fluoreszenzmarkiert). B: Mikrodissektion von GBM-Gewebe mit einem Gerät der
Firma Leica (silbergefärbt). Anhand der Signalintensitäten kann die erhaltene Menge Protein aus vergleichbaren
Flächen Gewebes aus der Laser-Mikrodissektion mit den zwei unterschiedlichen Gerätetypen auf ca. 0,25 µg
(Arcturus) und 5 µg (Leica) abgeschätzt werden.
Aus dem 1D-Gel ergab sich, dass bei der Verwendung des Laser Capture Mikroskops der Firma
Arcturus eine Fläche von ca. 5 mm2 ungefähr 0,25 µg Protein entspricht. Die erhaltene Menge war
hierbei so gering, dass eine Silberfärbung nicht möglich war und auf Fluoreszenzmarkierung für die
Bestimmung der Proteinmenge zurückgegriffen werden musste. Bei der Verwendung eines
Mikroskops der Firma Leica konnten ca. 5 µg Gesamtprotein aus 5 mm2 gelasertem Gewebe
gewonnen werden. Darüber hinaus zeigte sich, dass bei Verwendung höherer Laserintensitäten,
welche zuweilen für ein vollständiges Verschmelzen der Membran mit dem Gewebe beim Gerätetyp
des Hersteller Arcturus notwendig war, Artefakte bei der Trennung im 2D-Gel zu erkennen waren
(Abbildung 4.7). Eine gleichbleibende Probenqualität konnte somit mit diesem Gerätetyp nicht
gewährleistet werden.
5 m
m2 P
rob
e au
s
Mik
rod
isse
ktio
n (
Arc
turu
s)
2,5
µg
A1
72 Z
ellly
sat
1 µ
g
A17
2 Z
ellly
sat
0,7
5µ
g A
17
2 Z
ellly
sat
0,5
µg
A1
72 Z
ellly
sat
0,2
5µ
g A
17
2 Z
ellly
sat
Ref
eren
z, 5
µg
Ges
amtp
rote
in
5 m
m2 P
rob
e au
s M
ikro
dis
sekt
ion
(Le
ica)
Kapitel 4: Ergebnisse
53
Abbildung 4.7: 2D-PAGE zur qualitativen Kontrolle von mikrodissektiertem Tumorgewebe. Für die Etablierung
der Lasermikrodissektion wurden Gerätetypen von zwei unterschiedlichen Herstellern getestet. Bei dem Gerät der
Firma Arcturus sind Artefakte im Proteinmuster in der 2D-PAGE in Abhängigkeit von der Laserintensität zu
beobachten. Links höhere Laserintensität (45 V), rechts niedrigere Laserintensität (65 V). Es wurden 7 µm dicke
Kryosektionen von Glioblastomen eingesetzt. Für die anschließende 2D-PAGE wurden die Proben mit
Fluoreszenzfarbstoffen markiert.
Die deutlich bessere Proteinausbeute sowie reproduzierbarere Probenqualität führten zu dem
Einsatz des Gerätes der Firma Leica für die Probenvorbereitung im Rahmen der markierungsfreien
Quantifizierung mittels Massenspektrometrie. Tumorhaltige Bereiche wurden jeweils auf einem
gefärbten Referenzschnitt von einem Neuropathologen (Dr. J. Felsberg) angezeichnet und dann in
Abhängigkeit von der Gewebegröße 5-7 konsekutive Schnitte desselben Tumors mikrodissektiert und
vereinigt. Insgesamt wurden so Proben von acht Tumoren von LTS mit (LTSmut) bzw. neun Tumoren
ohne Mutation im IDH1-Gen (LTSwt) und zehn Proben von Tumoren von STS ohne IDH1 Mutation
(STSwt) generiert (siehe Tabelle 4.3). Durchschnittlich wurden pro Lauf rund 27.000
Fragmentspektren aufgezeichnet, wovon jeweils etwas mehr als 10.000 Spektren (37 %) identifiziert
wurden. Dies führte im Schnitt zur Identifizierung von ca. 1.350 Proteingruppen je Probe (siehe
Tabelle 4.4). Der Variationskoeffizient lag hierbei stets bei etwa 30 %. Insgesamt konnten über alle 27
Messungen hinweg 3556 Protein-Gruppen identifiziert werden.
Kapitel 4: Ergebnisse
54
Tabelle 4.3: Übersicht der mikrodissektierten Tumorproben für die markierungsfreie Quantifizierung
Status IDH1 Gesamt mm2
Geschlecht Alter bei Diagnose
Resektions-ausmaß
KPS
LTS mut 15,62 männlich 45 total 80
LTS mut 15,80 weiblich 40 partial 100
LTS mut 11,13 weiblich 39 partial 90
LTS mut 28,81 weiblich 33 total 80
LTS mut 16,38 weiblich 34 total unbekannt
LTS mut 9,38 weiblich 50 total 80
LTS mut 10,16 männlich 35 partial 100
LTS mut 10,03 weiblich 42 total 100
LTS wt 18,04 männlich 45 subtotal 90
LTS wt 10,17 weiblich 46 total 70
LTS wt 13,14 männlich 46 unbekannt 90
LTS wt 7,53 weiblich 59 subtotal 80
LTS wt 12,94 männlich 65 total 80
LTS wt 7,18 männlich 50 total 100
LTS wt 10,32 weiblich 54 subtotal 80
LTS wt 6,54 weiblich 51 total 80
LTS wt 9,84 weiblich 49 total 80
STS wt 22,90 männlich 51 partial 70
STS wt 16,43 weiblich 43 total 90
STS wt 18,94 männlich 52 total 80
STS wt 11,61 männlich 42 partial 50
STS wt 14,93 männlich 47 total 90
STS wt 14,19 weiblich 59 partial 90
STS wt 24,48 weiblich 46 subtotal 80
STS wt 30,32 weiblich 38 total 80
STS wt 21,23 männlich 57 subtotal 80
STS wt 3,03 weiblich 57 subtotal 100
Tabelle 4.4: Übersicht der in 27 Messungen von mikrodissektierten Tumoren durchschnittlich aufgenommenen und identifizierten Spektren sowie die resultierende Anzahl an Peptid- und Proteinidentifikationen.
Statistische Größe
Anzahl aufgenommener
MS/MS- Spektren
Anzahl identifizierter
Spektren
Anzahl identifizierter
Peptide
Anzahl identifizierter
Protein Gruppen
Mittelwert 27.027 10.474 7.071 1.350
Standardabweichung 4.045 3.279 2.339 402
Variationskoeffizient 15 % 31 % 33 % 30 %
Kapitel 4: Ergebnisse
55
4.2.2. Differentielle Proteomanalyse von Wildtyp-Glioblastomen
Um Hinweise auf die Ursachen des unterschiedlichen klinischen Verlaufs von LTS und STS Patienten
ohne IDH1 Mutation zu gewinnen, wurden die zuvor gewonnenen mikrodissektierten Tumorproben
mittels markierungsfreier Massenspektrometrie identifiziert und quantifiziert. So konnten für LTSwt
und STSwt 2417 bzw. 2903 Proteine identifiziert werden. Quantitative Daten konnten für 2755
Proteine erhoben werden. Der Vergleich zwischen 9 LTSwt und 10 STSwt ergab, dass 178 Proteine
zwischen LTS und STS (siehe Anhang, Tabelle 7.1) eine differentielle Proteinexpression zeigen.
Kriterien für eine differentielle Regulation waren hierbei ein Abundanzunterschied >1,5, ein p-Wert<
0,05 und eine Quantifizierung über mehr als ein Peptid. Kontaminanten laut (Keller et al. 2008)
wurden ebenfalls von der weiteren Auswertung ausgeschlossen. Von diesen 177 Proteinen zeigten
15 eine erhöhte Abundanz in den Tumoren der LTS und 162 Proteine eine erhöhte Abundanz in den
Tumoren von STS.
Weiterhin wurden die quantitativen Informationen der markierungsfreien Analyse genutzt, um zu
untersuchen, ob innerhalb einer Patientengruppe eine Anreicherung bestimmter Signalwege oder
Prozesse sowie anderer definierter Eigenschaften vorliegt. Hierfür wurden SOM-Analysen in
Kooperation mit dem Institut für Medizinische Informatik, Statistik und Epidemiologie in Leipzig
durchgeführt. Die Auswertung des Differenzbildes der beiden gemittelten Gruppenportraits zeigt,
dass einige Gensets eine differentielle Expression zwischen den beiden Patientengruppen aufweisen
(Abbildung 4.8). Hierbei wurde deutlich, dass besonders Proteine mit mitochondrialer Lokalisation
(Auflistung der im Genset „Mitochodrium“ enthaltenen Proteine siehe Anhang, Tabelle 7.2) in der
Gruppe der Kurzzeitüberlebenden stark angereichert sind. Weitere angereicherte Gensets innerhalb
der Gruppe der STS sind apoptotische Signalwege und die Biosynthese von Aminosäuren. In der
Gruppe der LTS finden sich Gensets zu Fibrinolyse sowie der Aggregation von Blutplättchen
überrepräsentiert.
Kapitel 4: Ergebnisse
56
Abbildung 4.8: SOM-Analyse der in LTSwt und STSwt exprimierten Proteine. Links: Die Metagen
Überexpressions-Profilmappe der 9 LTSwt und 10 STSwt Glioblastompatienten zeigt, dass zwischen den beiden
beobachteten Patientengruppen einige definierte Gensets angereichert sind. Die Überrepräsentations Mappe des
Gensets “Mitochondrien” zeigt eine Anreicherung mitochondrialer Proteine in der Gruppe der STS. Das Genset
beinhaltet 40 Gene, die Überrepräsentation der einzelnen Mosaikteile ist in Einheiten von log(pHG) unter Benutzung
einer hypergeometrischen Verteilung und farbkodiert (braun > rot > gelb > grün >blau) angegeben. In weißen
Bereichen sind Metagene lokalisiert, die nicht diesem Set angehören. Rechts: Gensetanreicherungs-Wert (GSZ) für das
Genset „Mitochondrium“ für die einzelnen Patienten.
Um festzustellen, ob die differentiellen Proteine interagieren und somit in einem
Funktionszusammenhang stehen, wurde mithilfe der Software String ein Interaktionsnetzwerk für die
178 Kandidatenproteine erstellt. Hierbei zeigte sich, dass für viele der differentiellen Proteine bereits
Interaktionen bekannt bzw. vermutet werden. Bei der Analyse von Bereichen, die einen besonders
hohen Vernetzungsgrad zeigten, fiel auf, dass es sich hierbei häufig um mitochondriale Proteine
handelte. Insgesamt kann 65 der differentiell in STS hochregulierte Proteinen eine Lokalisation in den
Mitochondrien zugeordnet werden (siehe Anhang, Tabelle 7.3).
LTSwt STSwt
Mitochondrium
Genset: Mitochondrium
Kapitel 4: Ergebnisse
57
Abbildung 4.9: Netzwerkanalyse der zwischen LTSwt und STSwt differentiell exprimierten Proteine. Ein
Großteil der differentiell exprimierten Proteine zeigt in der Netzwerkanalyse eine Verknüpfung untereinander. Die
Netzwerkanalyse wurde mit dem freiverfügbaren Online-Tool String durchgeführt. Eingegangen sind alle 178
Proteine, die im markierungsfreien Vergleich von mikrodissektiertem STSwt und LTSwt Gewebe von einen
Abundanzunterschied >1,5 und p-Wert <0,05 aufwiesen. Gezeigt ist der confidence view, stärkere Assoziationen
zwischen den einzelnen Proteinen werden durch dickere Linien repräsentiert.
Die Signalweg-Analyse mittels String (Abbildung 4.9) ergab zudem, dass die differentiellen Proteine
nicht nur auf einen speziellen mitochondrialen Signalweg oder funktionellen Komplex beschränkt
sind, sondern diversen mitochondrialen Prozessen wie z.B. der Atmungskette (z.B. UQCRC2), Citrat
Cyclus (Aconitase) sowie Transporter (OGCP) oder Proteine des Aminosäure-Katabolismus
(Glutaminase). zugeordnet werden können.
Zur Validierung dieser Beobachtung sowie zur Klärung, ob mit der Atmungskette eine definierte
Funktionseinheit der Mitochondrien in den Tumoren von Kurzzeitüberlebenden überexprimiert wird,
Kapitel 4: Ergebnisse
58
wurden Proteinblottingexperimente mit Antikörpern gegen Proteine der verschiedenen Komplexe
der Atmungskette durchgeführt (siehe Abbildung 4.11). Hierfür wurden Proteinüberstände von 10
LTSwt Patienten und 7 STSwt Patienten vom Deutschen Gliomnetz zur Verfügung gestellt. Die
verwendeten Antikörper richteten sich gegen NDUFB8 (Komplex I), SDHB (Komplex II), COXII
(Komplex IV), sowie UQCRC2 (Komplex III) und ATPA5 (Komplex V), von denen andere Untereinheiten
bereits in der markierungsfreien Studie als differentiell ermittelt wurden (siehe Abbildung 4.10).
Abbildung 4.10: Boxplotdarstellung der Abundanzen der als differentiell reguliert ermittelten Proteine der
Atmungskette. Die Proteine ATPA2 und UQCRC2 zeigen in der markierungsfreien Analyse eine erhöhte Abundanz in
den Tumoren von STSwt-Patienten gegenüber LTSwt Patienten. Für die Boxplot Darstellung sind die normalisierten
Spotvolumina aus der markierungsfreien Quantifizierung verwendet worden. 50% der Werte befinden sich innerhalb
der Box, die Whiskers geben das Minimum und Maximum der erhaltenen Signalintensitäten an. Der Median wird
durch ⎕ repräsentiert.
Eine generelle differentielle Proteinexpression von Proteinen der Atmungskette ließ sich im Rahmen
dieses Proteinblottingexperiments nicht beobachten. Der höhere Materialbedarf des
Proteinblottingexperiments machte die Verwendung von Proteinüberständen erneut notwendig,
daher kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine Bestätigung der Ergebnisse der
markierungsfreien Studie aufgrund unterschiedlichen verwendeten Materials nicht möglich war. Die
Validierung differentiell regulierter Kandidatenproteine mittels materialsparender SRM-Technologie
steht noch aus.
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
LTS STS
norm
alis
iert
es S
potv
olu
men
ATPA2
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
LTS STS
norm
alis
iert
es S
potv
olu
men
UQCRC2
Kapitel 4: Ergebnisse
59
Abbildung 4.11: Proteinblottingexperiment mit Antikörpern gegen Proteine aus den fünf verschiedenen
Komplexen der Atmungskette (NDUFB8 (Komplex I), SDHB (Komplex II), UQCRC2 (Komplex III), COXII (Komplex
IV) und ATPA5 (Komplex V)). Aufgetragen wurden jeweils 20 µg Gesamtprotein aus Überständen von 10 LTSwt
Tumoren und 7 STSwt Tumoren. Anhand des Proteinblot lässt sich keine differentielle Regulation eines
Atmungskettenkomplexes zwischen den Tumoren der beiden untersuchten Patientengruppen ableiten.
4.2.3. Differentielle Proteomanalyse von Glioblastomen in Abhängigkeit
von der IDH1 Mutation
Im Lauf des Projekts konnte gezeigt werden, dass die IDH1 Mutation eine wichtige Rolle in der
Tumorbiologie von Glioblastomen spielt. Insbesondere im Hinblick auf den klinischen Verlauf zeigt
sich, dass eine Mutation dieses Gens sich begünstigend auswirkt und mit einem längeren
Gesamtüberleben korreliert. Aus diesem Grund wurden die Tumoren langzeitüberlebender Patienten
in Abhängigkeit der IDH1 Mutation mittels markierungsfreier quantitativer Massenspektrometrie
untersucht.
Untersucht wurden Tumoren von 9 LTS Patienten mit nicht mutierter IDH1 und von 8 Patienten mit
mutiertem IDH1-Gen. In den 9 LTSwt Proben konnten insgesamt 2834, in den 8 LTSmut Proben 2417
Proteine identifiziert werden. Eine Quantifizierung war für 2755 Proteine möglich. Diese Daten
wurden zunächst mittels SOM-Analysen eingehender analysiert (Abbildung 4.12). Hier zeigten
mutierte Tumoren eine signifikante Anreicherung von Proteingruppen mit RNA spleißenden
Proteinen sowie eine Anreicherung von Proteingruppen, welche Proteine enthalten, die in die Zell-
Adhäsion involviert sind, gegenüber Wildtyp-Tumoren. In diesen ließ sich wiederum eine
Anreicherungen von Proteingruppen, welche Proteine, die in die Cytokin-vermittelten
LTS STS Mar
ker
Kapitel 4: Ergebnisse
60
Signaltransmission involviert sind, sowie Proteine welche an inflammatorischen Prozessen und
Immunantwort beteiligt sind, als hochreguliert gegenüber mutierten Tumoren beobachten.
Abbildung 4.12: SOM-Analyse der quantitativen Daten von in Glioblastomen exprimierten Proteinen. Die
Metagen Überexpressions-Profilmappe zeigt, dass zwischen den beiden beobachteten Patientengruppen
(LTSwt/LTSmut) einige definierte Gensets angereichert sind. Insbesondere in der Gruppe der LTSmut Tumoren
zeigen sich zwei Gensets (A: RNA Spleißen, E: Zell-Adhäsion) als besonders stark angereichert gegenüber der wt
Gruppe.
Nach Filtern der erhobenen quantitativen Daten hinsichtlich p-Wert < 0,01 und einem
Abundanzunterschied >1,5 sowie einer Quantifizierung über mindestens zwei unique Peptide zeigen
130 Proteine eine differentielle Regulation (siehe Anhang, Tabelle 7.4). Von den 130 differentiellen
Proteinen sind 85 in den mutierten Tumoren hochreguliert und 45 in den wt Tumoren erhöht. Die
auch für diese Studie durchgeführte Netzwerkanalyse mit den Programmen String (siehe Abbildung
4.13) und DAVID führte ebenfalls zu der Beobachtung, dass eine signifikante Anreicherung RNA und
DNA bindender Proteine bzw. bezogen auf den biologischen Prozess mRNA prozessierende Proteine
in den Tumoren mit einer Mutation im IDH1 Gen vorliegt (siehe Anhang,
Tabelle 7. 7.5). Insgesamt konnten 34 von 85 (40%) Proteinen der GO-Annotierung molecular
function: RNA binding (Tabelle 4.5) und 26 von 85 (31%) dem GO-Term biological process: mRNA
metabolic process zugeordnet werden. Im Gegenzug dazu konnte keine signifikante Anreicherung
innerhalb der in wt Tumoren hochregulierten Proteine beobachtet werden.
Kapitel 4: Ergebnisse
61
Abbildung 4.13: Netzwerkanalyse der in mutierten Tumoren differentiell hochregulierten Proteine. Die
Netzwerkanalyse zeigt, dass sich innerhalb der in IDH1 mutierten Tumoren hochregulierten Proteinen, eine Gruppe
stark vernetzter Proteine befindet. Hierbei handelt es sich hauptsächlich um Proteine aus der Gruppe der Serin-
/Argininreichen Spleißfaktoren und heterogene nukleäre Ribonukleoproteine. Für die Analyse wurden die 85
Proteine berücksichtigt, die im markierungsfreien Vergleich von mikrodissektiertem LTSwt und LTSmut Gewebe
einen Abundanzunterschied >1,5 und p-Wert <0,01 aufwiesen. Weiterhin musste die Quantifizierung durch mehr als
ein uniques Peptid erfolgt sein. Gezeigt ist der „confidence view“, stärkere Assoziationen zwischen den einzelnen
Proteinen werden durch dickere Linien repräsentiert.
Kapitel 4: Ergebnisse
62
Tabelle 4.5: Mittels DAVID als mRNA assoziiert klassifizierte Proteine
Swissprot ID
Gen Name Protein Name
Q15717 ELAVL1 ELAV (embryonic lethal, abnormal vision, Drosophila)-like 1 (Hu antigen R)
P26378 ELAVL4 ELAV (embryonic lethal, abnormal vision, Drosophila)-like 4 (Hu antigen D)
Q07666 SAM68 KH domain containing, RNA binding, signal transduction associated 1
P55769 NHP2L1 NHP2 non-histone chromosome protein 2-like 1 (S. cerevisiae)
Q96I25 RBM17 RNA binding motif protein 17
Q13148 TARDBP TAR DNA binding protein
Q14011 CIRBP cold inducible RNA binding protein
P38919 EIF4A3 eukaryotic translation initiation factor 4A, isoform 3
P35637 FUS fusion (involved in t(12;16) in malignant liposarcoma)
P22626 HNRNPA2B1
heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1
P07910 HNRNPC heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C (C1/C2)
Q14103 HNRNPD heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D (AU-rich element RNA binding protein 1, 37kDa)
O14979 HNRNPDL heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D-like
P31942 HNRNPH3 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H3 (2H9)
P61978 HNRNPK heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K
O43390 HNRNPR heterogeneous nuclear ribonucleoprotein R
Q00839 HNRNPU heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U (scaffold attachment factor A)
Q12906 ILF3 interleukin enhancer binding factor 3, 90kDa
Q8N1G4 LRRC47 leucine rich repeat containing 47
P43243 MATR3 matrin 3
Q9P2K5 MYEF2 myelin expression factor 2
P51513 NOVA1 neuro-oncological ventral antigen 1
P19338 NCL nucleolin
Q8WXF1 PSPC1 paraspeckle component 1; paraspeckle protein 1 pseudogene
Q9NSD9 FARSB phenylalanyl-tRNA synthetase, beta subunit
Q9UKA9 PTBP2 polypyrimidine tract binding protein 2
Q15424 SAFB scaffold attachment factor B
Q01844 EWSR1 similar to Ewing sarcoma breakpoint region 1; Ewing sarcoma breakpoint region 1
P08621 SNRNP70 small nuclear ribonucleoprotein 70kDa (U1)
P23246 SFPQ splicing factor proline/glutamine-rich (polypyrimidine tract binding protein associated)
P84103 SRSF3 splicing factor, arginine/serine-rich 3
Q13247 SRSF6 splicing factor, arginine/serine-rich 6; similar to arginine/serine-rich splicing factor 6
Q16629 SRSF7 splicing factor, arginine/serine-rich 7, 35kDa
Q13242 SRSF9 splicing factor, arginine/serine-rich 9
Kapitel 4: Ergebnisse
63
Proteomanalytische Charakterisierung von murinen 4.3.
Gliomstammzelllinien unter sphärenbildenden Bedingungen
Ein weiterer Faktor, der entscheidenden Einfluss auf das Gesamtüberleben der Patienten hat, ist die
Resistenz des Tumors gegenüber der Therapie. Diese Resistenzen werden häufig durch
Tumorstammzellen vermittelt. Um diese Resistenzmechanismen näher untersuchen zu können,
werden geeignete Zellkulturmodelle benötigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden vier murine
Gliomstammzelllinien, welche zur Sphärenbildung in der Lage sind, mittels proteomanalytischen
Methoden charakterisiert und hinsichtlich einer verstärkten Proteinexpression von
Stammzellmarkern nach Induktion der Sphärenbildung untersucht.
Die murinen Gliomstammzelllinien (NS) GL-261, SMA 497, SMA 540 und SMA 560 (Tabelle 3.2)
wurden durch Ändern der Kultivierungsbedingungen in Tumorsphären (SC) überführt. Für jede
Bedingung wurden insgesamt drei Replikate analysiert, lediglich für die SC der Linie GL-261 konnten
wegen technischer Probleme nur zwei Replikate vermessen werden. In der Folge konnten mittels
markierungsfreier Analyse 2699 Proteine quantifiziert werden. Die Auswertung der
massenspektrometrischen Analyse ergab, dass die Unterschiede zwischen den vier verwendeten
Zelllinien größer waren als die Unterschiede zwischen NS- und SC-Zellen innerhalb einer Linie.
Insbesondere die Zelllinie GL-261 unterscheidet sich deutlich in ihrem Proteinexpressionsmuster von
den drei SMA Zelllinien (Abbildung 4.14).
Abbildung 4.14: Hauptkomponentenanalyse der vier verwendeten Mausstammzelllinien. GL-261 in rosa, SMA
497 in blau, SMA 540 in lila und SMA 560 in orange. Ein deutlicher Unterschied basierend auf dem
Proteinexpressionsprofil ist nur zwischen der Zelllinie GL-261 und den drei anderen Zelllinien zu erkennen.
Kapitel 4: Ergebnisse
64
Das Hauptaugenmerk in dieser Studie lag auf dem Vergleich innerhalb der Zelllinien vor und nach der
Sphäreninduktion. Für die Zelllinie GL-261 konnten hier 38 differentielle Proteine (29 in SC
hochreguliert und 9 in SC herunterreguliert), für die Zelllinie SMA 560 insgesamt 150 differentielle
Proteine (92 in SC hochreguliert und 58 in SC herunterreguliert), für die Zelllinie SMA 540 insgesamt
220 differentielle Proteine (178 in SC hochreguliert und 42 in SC herunterreguliert) und für die
Zelllinie SMA 497 insgesamt 304 differentielle Proteine (253 in SC hochreguliert und 51 in SC
herunterreguliert) identifiziert werden. Die SOM-Analysen des Datensatzes zeigten, dass einige
ausgewählte Sets von humanen embryonischen Stammzellmarkern (hESC9, hESC10 und myc2) in SC
auf Proteinebene hochreguliert sind (siehe Abbildung 4.15).
Abbildung 4.15: Proteinexpressionsprofil ausgewählter Stammzellmarker (Wang 2011) in den vier
untersuchten Zelllinien. Die Gensets enthalten Gene, welche in hESC9 differentiell hochreguliert sind, abundant in
hESC vorkommen sowie Myc-regulierte Ziele. Diese Gensets zeigen in den SC-Zelllinien durchweg eine erhöhte
Expression gegenüber den NS-Zelllinien.
Darüber hinaus kann eine tendenziell erhöhte Expression nach Sphärenbildung bei den SMA-
Zelllinien auch für den Stammzellmarker 6-Integrin (Lathia et al. 2010) gezeigt werden (SMA-497
(FC=1,5; p=0,07), SMA-540 (FC=1,5; p=0,02) und SMA-560 (FC=1,8; p=0,03)) (siehe Abbildung 4.16,
A). Für den Stammzellmarker Nestin (Wang 2011) konnte keine signifikante Hochregulierung in SC
Zellen gezeigt werden (siehe Abbildung 4.16, B).
Gen
set
An
reic
her
un
gs-W
ert
SMA
-49
7_
NS
SMA
-54
0_
NS
SMA
-56
0 _
NS
GL-
26
1_N
S
SMA
-49
7_
SC
SMA
-54
0_
SC
SMA
-56
0_
SC
GL-
26
1_S
C
Set hESC9
Set hESC10
myc 2
Kapitel 4: Ergebnisse
65
A B
Abbildung 4.16: Boxplots der Stammzellmarker α6-Integrin und Nestin für die SMA-Zelllinien. Für die Boxplot
Darstellung sind die normalisierten Spotvolumina der markierungsfreien Quantifizierung verwendet worden. 50%
der Werte befinden sich innerhalb der Box, die Whiskers geben das Minimum und Maximum der erhaltenen
Signalintensitäten an. Der Median wird durch ⎕ repräsentiert. A: Für α6-Integrin kann in der markierungsfreien
Analyse eine erhöhte Abundanz in den SC-Zellen gezeigt werden. B: Der Stammzelllmarker Nestin zeigt keine
differentielle Regulation zwischen den beiden untersuchten Bedingungen.
Identifizierung von tumorassoziierten Autoantigenen 4.4.
Neben der Proteinexpression des Tumors muss auch das Immunsystem des Patienten als weiterer
möglicher Einflussfaktor auf den klinischen Verlauf berücksichtigt werden. Hierbei ist insbesondere
das Vorhandensein von Autoantikörpern im Plasma von Patienten gegen tumorassoziierter
Autoantigene (TAA) interessant. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher auch Plasma von
Glioblastompatienten untersucht und es wurden umfassende Autoantikörperprofile mithilfe der
Proteinarray Technologie erstellt.
4.4.1. Sammlung von Patientenplasma und Demographie
Für die Identifizierung von tumorassoziierten Autoantigenen bei Glioblastompatienten wurde im
Rahmen des deutschen Gliomnetzes die prospektive Sammlung von Plasma von
Glioblastompatienten initiiert. Hierfür wurde zunächst ein standardisiertes Protokoll zur
Probensammlung (Standard Operation Procedure, SOP; siehe 3.2.1.4) erstellt, wodurch gewährleistet
werden soll, dass die gesammelten Plasmaproben eine gleichbleibende Qualität aufweisen. Zur
qualitativen Kontrolle der erhaltenen Plasmen wurde eine 1D-PAGE durchgeführt und jeweils
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
5000000
SC NS
norm
alis
iert
es S
potv
olu
men
alpha6-Integrin
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
30000000
SC NS
norm
alis
iert
es S
potv
olu
men
Nestin
Kapitel 4: Ergebnisse
66
stichprobenartig Proben aus allen sammelnden Zentren hinsichtlich gleichbleibender Qualität
überprüft (siehe Abbildung 4.17).
Abbildung 4.17: 1D-PAGE zur qualitativen Kontrolle der gesammelten Plasmaproben aus den verschiedenen
klinischen Zentren des deutschen Gliomnetzes. Die gesammelten Plasmaproben wiesen untereinander eine gute
Reproduzierbarkeit hinsichtlich ihres Proteinbandenmusters im 1D-SDS-Gel auf. Die Trennung erfolgte im 4-20%
Acrylamidgel. Von jeder Probe wurden 10 µg Protein eingesetzt, für die Detektion der Proteine wurde die
Silberfärbung nach Heukeshoven verwendet.
Im Rahmen des deutschen Gliomnetzes (GGN) konnten bis zum jetzigen Zeitpunkt (30.5.2014) 900
Plasmaproben aus den verschiedenen Zentren gesammelt und dokumentiert werden. Darunter
befinden sich über 30 Proben von Langzeitüberlebenden des Glioblastoms (Abbildung 4.18).
Abbildung 4.18: Prozentuale Verteilung der gesammelten Plasmaproben nach 5 Jahren Sammlung bezogen
auf die Überlebensdauer der Patienten. Insgesamt wurden 900 Proben von GBM Patienten nach einem
standardisierten Protokoll in den klinischen Zentren gesammelt.
58%
7%
10%
8%
12%
5%
Prozentuale Verteilung der gesammelten Plasmaproben nach fünf Jahren Sammlung bezogen auf die Überlebensdauer der Patienten
Abnahme bei Diagnosestellung
bis 5 Monate Überlebensdauer
6-11 Monate Überlebensdauer
12-23 Monate Überlebensdauer
24-35 Monate Überlebensdauer
Angaben unvollständig
1 Marker 2 Zentrum Dresden 3 Zentrum Dresden 4 Zentrum Bonn 5 Zentrum Bonn 6 Zentrum Hamburg 7 Zentrum Hamburg 8 Zentrum München 9 Zentrum München
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Kapitel 4: Ergebnisse
67
Für die geplante Analyse konnte somit auf Plasma von 20 GBM-Patienten zugegriffen und mittels
ProtoArray Technik hinsichtlich vorhandener Autoantikörper analysiert werden. Um Autoantigene
nachzuweisen, die GBM spezifisch sind, wurden diese mit Proben von 20 Nicht-Tumor-Patienten
(Gesundkontrollen) verglichen. Anschließend wurden Proben weiterer 20 Patienten mit einer
Gesamtüberlebensdauer von >22 Monaten analysiert, um das Auftreten tumorspezifischer
Autoantikörper mehrere Monate nach der Erkrankung zu untersuchen. Bei der Auswahl der Proben
wurde darauf geachtet, dass eine möglichst gute Übereinstimmung hinsichtlich Alter und Geschlecht
der Patienten vorlag (Tabelle 4.6). Zum Zeitpunkt der Analysen stand noch keine ausreichende Anzahl
von parallel zur Resektion gesammelten Plasmaproben von Langzeitüberlebenden zur Verfügung.
Tabelle 4.6: Übersicht der Patienten für die Analyse mittels Proteinarray
Gruppe Anzahl männlicher/
weiblicher Patienten
Durchschnittliches
Alter in Jahren
Nicht-Tumor-Patienten 7/13 59.8 (± 9.9)
Neu diagnostizierte GBM Patienten
13/7 63.0 (± 10.3)
Patienten mit einem Gesamtüberleben von >22 Monate
11/9 51.3 (± 12.8)
4.4.2. Detektion und differentielle Analyse von tumorspezifischen
Autoimmunreaktionen mittels Proteinarrays
Für die Detektion tumorassoziierter Autoantigene mithilfe des Nachweises von Autoantikörpern
wurden Protein Arrays zur Analyse von Patienten Plasma eingesetzt. Insgesamt umfasste der Array
9483 rekombinante Proteine was einer Anzahl von 8122 nicht redundanten Proteinen entspricht.
Nach der Inkubation der Arrays mit jeweils 10 µl Plasma/Serum konnten, nach Interaktion von
Autoantiköpern mit den auf dem Array aufgetragenen Proteinen, 876 Autoantikörper-Antigen
Reaktionen nachgewiesen werden, die einen signifikanten Unterschied zwischen neu
diagnostizierten Tumorpatienten und gesunden Patienten zeigten. Davon riefen 367 Antigene in
Tumorpatienten eine stärkere Antwort hervor, für 509 Antigene war in Tumorpatienten gegenüber
den Gesund-Kontrollen eine geringere Immunreaktion zu detektieren. Um innerhalb dieser
Kandidaten die korrespondierenden Antigene herauszufiltern, welche spezifisch für den Tumor sind,
wurden im weiteren Verlauf nur die Proteine berücksichtigt, die im Vergleich zu den Nicht-Tumor-
Kontrollen eine Antigen-Autoantikörper-Interaktion in mehr als 50% der Tumorpatienten aufzeigten.
Hierdurch konnten insgesamt 107 tumorassoziierten Kandidatenautoantigene identifiziert werden
(siehe Anhang, Tabelle 7.6)
Kapitel 4: Ergebnisse
68
4.4.3. Bioinformatische Analyse der tumorassoziierten Autoantigene
Für die nähere Charakterisierung der identifizierten potentiellen tumorassoziierten Autoantigene
wurde eine Anreicherungsanalyse durchgeführt. Mithilfe des Programms DAVID zeigt sich innerhalb
der 107 tumorassoziierten Kandidatenautoantigene eine signifikante Anreicherung von
zinkbindenden Proteinen (siehe Tabelle 4.7).
Tabelle 4.7: Tumorassoziierte Kandidaten-Autoantigene welche dem GO-Term “Zink-Ionen bindend” zugeordnet werden können.
Swissprot ID Protein Name
Q15057 ArfGAP with coiled-coil, ankyrin repeat and PH domains 2
Q9NZU5 LIM and cysteine-rich domains 1
Q9HBH9 MAP kinase interacting serine/threonine kinase 2
Q8IV61 RAS guanyl releasing protein 3 (calcium and DAG-regulated)
Q86UA6 RPA interacting protein
Q9BYM8 RanBP-type and C3HC4-type zinc finger containing 1
P53992 SEC24 family, member C (S. cerevisiae)
Q99469 SH3 and cysteine rich domain
Q12933 TNF receptor-associated factor 2
Q2QGD7 ZXD family zinc finger C
P11532 dystrophin
P11474 estrogen-related receptor alpha
Q13642 four and a half LIM domains 1
Q13643 four and a half LIM domains 3
Q8WW33 gametocyte specific factor 1
Q9H1H1 gametocyte specific factor 1-like
O14964 hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate
Q96JB3 hypermethylated in cancer 2
Q8N339 metallothionein 1M
Q9Y2Y1 polymerase (RNA) III (DNA directed) polypeptide K, 12.3 kDa
Q04759 protein kinase C, theta
Q96PM5 ring finger and CHY zinc finger domain containing 1
Q96DX4 ring finger and SPRY domain containing 1
Q969K3 ring finger protein 34
Q12874 splicing factor 3a, subunit 3, 60kDa
Q8TBC5 zinc finger and SCAN domain containing 18
Q96JL9 zinc finger protein 333
Q6GPI5, Q9NT83
zinc finger protein 839
Insgesamt konnten 28 (26%) der tumorassoziierten Kandidatenautoantigene als Zink-Ionen bindend
klassifiziert werden. Darunter befinden sich auch einige der Proteine, z.B. FHL1, FHL3 und LMCD1,
Kapitel 4: Ergebnisse
69
welche die höchste Prävalenz für GBM zeigten. Eine signifikante Anreicherung hinsichtlich zellulärer
Lokalisation oder biologischer Prozesse wurde nicht beobachtet.
4.4.4. Vergleich der Proteom- mit Transkriptomdaten
Um herauszufinden, ob die Abundanz der Antigene im Proteom des Glioblastoms eine Ursache für
die nachgewiesene Autoimmunreaktivität ist, wurden die tumorassoziierten Kandidatenautoantigene
mit den Proteinexpressionsdaten der vorangegangenen markierungsfreien Studie von Tumorgewebe
sowie einer publizierten Transkriptomstudie (Reifenberger et al. 2014) korreliert. Aus den
Transkriptomdaten ergab sich, dass 14617 Gene vom Tumor exprimiert werden. Für die
Proteomdaten wurden die Proteinidentifizierungen aus den Analysen von Gewebe der neun
Kurzzeitüberlebenden herangezogen.
Abbildung 4.19: Venn Diagramm der Daten aus Proteomanalyse, Transkriptomanalyse sowie auf dem Array
befindlichen rekombinanten Proteinen. Der Abgleich von den aus der Proteomanalyse von Tumorgewebe
erhaltenen Daten, Transkriptomdaten sowie den auf dem ProtoArray enthaltenen Proteinen ergibt, dass mindestens
73% der auf dem ProtoArray enthaltenen Proteine tatsächlich vom Tumor exprimiert werden. Bei 73 % konnte die
Expression von mRNA und bei 18 % das translatierte Protein per Massenspektrometrie in Glioblastomgewebe
nachgewiesen werden. Die restlichen 27 % der Proteine konnten weder auf Transkriptom- noch auf Proteomebene
detektiert werden.
Insgesamt konnte so, basierend auf der Anzahl identifizierter MS/MS Spektren, eine quantitative
Aussage für 2875 Proteine getroffen werden. Von den 8122 nicht redundanten Proteinen auf dem
Kapitel 4: Ergebnisse
70
ProtoArray wurden 5895 (72,6 %) auf mRNA Ebene in GBM Gewebe und 1441 (18 %) auf
Proteinebene mittels Massenspektrometrie nachgewiesen. Von 2193 (27 %) der gespotteten
Proteine konnte eine Expression in Glioblastomgewebe weder auf RNA- noch auf Protein-Ebene
gezeigt werden (Abbildung 4.19). Somit kann anhand der RNA- und Proteinexpressionsdaten gezeigt
werden, dass mindestens 73,0% (5929 Proteine) der auf dem ProtoArray als potentielle Antigene
befindlichen Proteine im Tumor exprimiert werden.
Anschließend wurden die 107 potentiellen tumorassoziierten Kandidatenautoantigene mit den
Transkriptom- und Proteomdaten verglichen. Hier konnte für insgesamt 22 (21%) Kandidaten die
Expression auf Proteom- bzw. für 82 (80%) auf Transkriptomebene nachgewiesen werden (Abbildung
4.20).
Abbildung 4.20: Venn Diagramm der Daten aus Proteomanalyse, Transkriptomanalyse und den 107
ermittelten potentiellen tumorassoziierten Autoantigenen. Von den 107 nicht-redundanten
Kandidatenautoantigenen konnte bei 80% die Expression von mRNA mittels Affymetrix-Chips und bei 21% das
translatierte Protein mittels Massenspektrometrie nachgewiesen werden. Bei lediglich 20 potentiellen tumor-
assoziierten Autoantigenen konnte mit keiner der beiden Methoden der Nachweis über eine tatsächliche Expression
im Tumorgewebe erbracht werden.
Zieht man die Anzahl identifizierter Spektren je Protein als quantitatives Maß heran, ergibt sich, dass
die 22 auf Proteinebene nachgewiesenen Kandidatenantigene annähernd den ganzen dynamischen
Bereich der Proteinidentifizierung abdecken. Es finden sich sowohl sehr niedrig konzentrierte (z.B.
Kapitel 4: Ergebnisse
71
Optineurin) als auch sehr hoch abundante Proteine (z.B. Moesin) (Abbildung 4.21). Eine generelle
Abhängigkeit der Immunreaktivität der potentiellen tumorassoziierten Autoantigene von ihrer
Konzentration im Tumorgewebe ließ sich somit nicht bestätigen.
Abbildung 4.21: Abundanzbereich der potentiellen tumorassoziierten Autoantigene anhand der
Proteomdaten. Die Kandidatenantigene überspannen einen dynamischen Bereich von mehreren Größenordnungen
von sehr niedrig bis hin zu hoch abundanten Proteinen. Für die relative Quantifizierung wurde die Anzahl
identifizierter MS/MS Spektren (spectral counts) der mittels nano HPLC-ESI/MS in Glioblastomgewebe identifizierten
Proteine zu Grunde gelegt. Zur besseren Übersicht wurde für die Darstellung der spectral counts eine logarithmierte
Skala gewählt.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
logP
SM
WARS, ACTN4, MSN, HSP90AA1
ERH, PRPSAP2, DIABLO, SF3A3, EGFR, T790M, EGFR(ErbB1), T790M, L858R, SF3B3, QARS, QARS, DBI, SNX1, CTNNA1, QKI, ANXA7, FHL1
OPTN, KIAA0513, IFIT3, SEC24C, HGS
Kapitel 4: Ergebnisse
72
4.4.5. Nachweis von tumorassoziierten Autoantikörpern im Plasma von
progressionsfreien, resektierten Glioblastompatienten mit mehr als
22 Monaten Gesamtüberleben
Mit der Identifizierung von tumorassoziierten Autoantikörpern im Plasma von neudiagnostizierten
Patienten stellte sich die Frage, inwieweit auch im Plasma von GBM Patienten, deren Resektion
schon mehrere Monate zurückliegt, diese tumorassoziierte Autoantikörper noch nachgewiesen
werden können.
Daher wurde ebenfalls Plasma von 20 GBM Patienten (siehe Tabelle 4.6), welches mindestens 22
Monate nach der Diagnose entnommen und die entweder eine vollständige (11 Patienten) oder
partielle (9 Patienten) Resektion hatten, analysiert und mit den nicht-tumor Kontrollen verglichen.
Unter der Anwendung derselben Kriterien wie in 4.4.2 beschrieben, konnten insgesamt 119
potentielle tumorassoziierte Autoantigene detektiert werden. Innerhalb dieser 119 potentiellen
Autoantigene fanden sich 48 Proteine wieder, die bereits beim Vergleich neu diagnostizierter
Patienten mit nicht-tumor Kontrollen identifiziert wurden (siehe 4.8).
Kapitel 4: Ergebnisse
73
Tabelle 4.8: Gemeinsame Tumor-assoziierte Autoantigene zwischen neu diagnostizierten Glioblastom Patienten und Patienten mehr als >22 Monaten nach Diagnosestellung.
Gen Symbol Swissprot ID Prävalenz in neu
diagnostizierten GBM Fällen
Prävalenz nach >22 Monaten
Im Transkriptom nachgewiesen
Anzahl identifizierter
Spektren
APOBEC3A A8MYU8 72.73% 63.64% nein 0 BNIP3L O60238 86.36% 86.36% ja 0 C10orf26 Q9NX94 54.55% 72.73% ja 0 C11orf30 Q7Z589 59.09% 59.09% ja 0 C12orf41 Q9H9L4 68.18% 72.73% ja 0 C14orf131 Q6GPI5 50.00% 95.46% nein 0 C20orf18 Q9BYM8 54.55% 68.18% ja 0 C9orf97 Q5T7W7 63.64% 86.36% ja 0 CCDC69 A6NI79 50.00% 86.36% ja 0 DIABLO Q9NR28 63.64% 81.82% ja 13 DMD P11532 54.55% 90.91% ja 0 EGFR(ErbB1), T790M,L858R
P00533 54.55% 81.82% ja 17
EGFR,T790M P00533 59.09% 81.82% ja 17 EIF4G3 O43432 59.09% 63.64% ja 0 EP400NL A8MSW4 54.55% 86.36% nein 0 ERBB2 P04626 68.18% 72.73% ja 0 FAM112A Q9H1H1 50.00% 72.73% ja 0 FHL1 Q13642 81.82% 95.46% ja 49 FHL3 Q13643 72.73% 95.46% ja 0 HSP90AA1 P07900 59.09% 86.36% ja 556 IL1B P01584 59.09% 68.18% ja 0 LMCD1 Q9NZU5 72.73% 90.91% ja 0 MAPK7 Q13164 50.00% 86.36% ja 0 MGC10334 A0A024R043 63.64% 95.46% nein 0 MGC39821 Q96RF0 68.18% 77.27% ja 0 MT1M Q8N339 50.00% 86.36% ja 0 N/A Q8N0T2 50.00% 90.91% nein 0 NIP30 Q9GZU8 54.55% 63.64% ja 0 OPTN Q96CV9 68.18% 95.46% ja 1 POLR3K Q9Y2Y1 50.00% 81.82% ja 0 PRPSAP2 O60256 59.09% 72.73% ja 13 RASGRP3 Q8IV61 54.55% 81.82% ja 0 RCHY1 Q96PM5 68.18% 86.36% ja 0 RETN Q9HD89 50.00% 72.73% nein 0 RNF34 Q969K3 50.00% 77.27% ja 0 RSPRY1 Q96DX4 50.00% 81.82% ja 0 SEC24C P53992 50.00% 90.91% ja 3 SMR3B P02814 50.00% 77.27% nein 0 SNAP23 O00161 68.18% 95.46% ja 0 SNX1 Q13596 59.09% 86.36% ja 31 STAC Q99469 63.64% 77.27% ja 0 TCOF1 Q13428 54.55% 77.27% ja 0 TNIP2 Q8NFZ5 50.00% 90.91% ja 0 WARS P23381 54.55% 68.18% ja 106 XTP3TPA Q9H773 50.00% 81.82% ja 0 ZNF333 Q96JL9 59.09% 68.18% ja 0 ZSCAN18 Q8TBC5 50.00% 81.82% ja 0 ZXDC Q2QGD7 50.00% 63.64% ja 0
Kapitel 4: Ergebnisse
74
4.4.6. Validierung von potentiellen tumorassoziierten Autoantigenen
Für die Validierung von potentiellen tumorassoziierten Autoantigenen wurden solche Proteine
ausgewählt, die eine hohe Spezifität für den Tumor (hohe Prävalenz in der Patienten- niedrige
Prävalenz in der Kontrollgruppe) aufwiesen, in einem interessanten biologischen Kontext (bereits
bekannte Überexpression in Tumoren, bekanntes Autoantigen etc.) standen und kommerziell
erhältlich waren.
Abbildung 4.22: Boxplot Darstellung der Signalintensitäten der zur weiteren Validierung mittels ELISA
ausgewählten Kandidatenautoantigene. Die Konzentration von Autoantikörpern gegen die Proteine FHL1, FHL3,
ERBB2, und EGFR ist im Blut von Glioblastompatienten gegenüber gesunden Menschen signifikant erhöht. In der
Boxplot Darstellung sind die normalisierten Signalintensitäten des Microarrayexperiments nach quantiler
Normalisation dargestellt. 50% der Werte befinden sich innerhalb der Box, die Whiskers geben das Minimum und
Maximum der erhaltenen Signalintensitäten an. Der Median wird durch ⎕ repräsentiert.
Die höchste Spezifität von allen Kandidaten konnte für das four and a half LIM domains protein 1
(FHL1) detektiert werden. Ein positives Signal wurde in 19 der 20 analysierten Patientenproben aber
nur in einer der Kontrollproben nachgewiesen. Dies entspricht 91% Prävalenz für den Tumor und
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
norm
alis
iert
e S
ignalin
tensität
Kontrolle GBM-Patienten
FHL1
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
norm
alis
iert
e S
ignalin
tensität
Kontrolle GBM-Patienten
FHL3
0.00
1000.00
2000.00
3000.00
4000.00
5000.00
6000.00
norm
alis
iert
e S
ignalin
tensität
Kontrolle GBM-Patienten
ERBB2
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
norm
alis
iert
e S
ignalin
tensität
Kontrolle GBM-Patienten
EGFR
Kapitel 4: Ergebnisse
75
weniger als 10% Prävalenz für die Kontrollgruppe (p-Wert: 2.91*10-09). Der Vergleich mit den
Expressionsdaten aus der Proteomstudie ergibt, dass FHL1 zu den 12% höchst abundanten Proteinen
gehört (Abbildung 4.21 und Abbildung 4.22).
Mit dem four and a half LIM domains-protein (FHL3) wurde ein weiteres Protein aus der Familie der
four and a half LIM domain Proteine für die Validierung ausgewählt. Es wies ebenfalls eine hohe
Prävalenz für GBM auf (Tumor Prävalenz: 86.36%; Kontroll Prävalenz: 13.64%; p-Wert 8.32*10-06)
(Abbildung 4.22). Die Expression von FHL3 konnte nur auf mRNA-Ebene nicht aber auf Proteom-
Ebene gezeigt werden.
Um sicher zu gehen, dass für die detektierte Antigenität der beiden Proteine FHL1 und FHL3 kein
gemeinsames Epitop aufgrund homologer Sequenzabschnitte verantwortlich ist, wurden die
Sequenzen verglichen (siehe Abbildung 4.23). Ein Alignment mit dem Online-Tool BLASTP (Altschul et
al. 1997; Altschul et al. 2005) ergab, dass 44% der Sequenzen beider Proteine identisch sind, aber nie
mehr als vier aufeinanderfolgende Aminosäuren identisch. Daher scheint ein gemeinsames Epitop
eher unwahrscheinlich.
Abbildung 4.23: Sequenz-Alignment von FHL1 und FHL3. Das Sequenz-Alignment mit BLASTP zeigt, dass FHL1
(Subject) und FHL3 (Query) lediglich 44% Sequenzidentität aufweisen und maximal 4 aufeinanderfolgende identische
Aminosäuren haben.
Die Rezeptor Tyrosin-Kinase erbB-2 (ERBB2) zeigte ebenfalls eine starke autoimmune Antwort in der
Patientengruppe (p=1.64*10-04). Seine Prävalenz für den Tumor liegt über 80% im Vergleich zu 14% in
der Kontrollgruppe (siehe Abbildung 4.22). ERBB2 konnte sowohl im Rahmen der Proteomstudie als
auch der Transkriptomstudie detektiert werden. Interessanter Weise wurden von ERBB2 zwei
Sequenzen auf dem Array gespottet, aber nur für eine Sequenz konnte eine signifikante autoimmune
Antwort in Tumorpatienten beobachtet werden. Ein Sequenzvergleich mit dem online Programm
BLASTP ergab, dass die nicht reaktive Sequenz komplett in der zweiten Sequenz enthalten ist, die
reaktive Sequenz aber noch zusätzliche Aminosäuren am N- und C-Terminus enthält (siehe Abbildung
Query 1 MAEKFDCHYCRDPLQGKKYVQKDGHHCCLKCFDKFCANTCVECRKPIGADSKEVHYKNRF 60 M+E FDC C + L G+KY+Q D C+ C+D ANTC EC++ IG DS+E+ Y++R Sbjct 1 MSESFDCAKCNESLYGRKYIQTDSGPYCVPCYDNTFANTCAECQQLIGHDSRELFYEDRH 60 Query 61 WHDTCFRCAKCLHPLANETFVAKDNKILCNKCTTREDSPKCKGCFKAIVAGDQNVEYKGT 120 +H+ CFRC +C LA+E F +D+++LCN C S +C C + ++ G + +EY G Sbjct 61 FHEGCFRCCRCQRSLADEPFTCQDSELLCNDCYCSAFSSQCSACGETVMPGSRKLEYGGQ 120 Query 121 VWHKDCFTCSNCKQVIGTGSFFPKGEDFYCVTCHETKFAKHCVKCNKAITSGGITYQDQP 180 WH+ CF CS C+Q +G+ SF P YCV C+E KFA C +C+K +T GG+TY+DQP Sbjct 121 TWHEHCFLCSGCEQPLGSRSFVPDKGAHYCVPCYENKFAPRCARCSKTLTQGGVTYRDQP 180 Query 181 WHADCFVCVTCSKKLAGQRFTAVEDQYYCVDCYKNFVAKKCAGCKNPITGFGKGSSVVAY 240 WH +C VC C LAGQ+FT+ ++ YCV C+ A KC+ CK PI G G G V++ Sbjct 181 WHRECLVCTGCQTPLAGQQFTSRDEDPYCVACFGELFAPKCSSCKRPIVGLG-GGKYVSF 239 Query 241 EGQSWHDYCFHCKKCSVNLANKRFVFHQEQVYCPDCAK 278 E + WH CF C +CS +L + FV +QV C C++ Sbjct 240 EDRHWHHNCFSCARCSTSLVGQGFVPDGDQVLCQGCSQ 277
Kapitel 4: Ergebnisse
76
4.24). Daher liegt die Schlussfolgerung nahe, dass die autoimmun reaktive Sequenz im N- oder C-
terminalen Bereich lokalisiert ist.
MLVPRGSPWIRNSKAYVDKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERAKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV
Abbildung 4.24: Sequenz-Alignment der zwei gespotteten Sequenzen von ERBB2. Der Vergleich der zwei
gespotteten Sequenzen von ERBB2 mit BLASTP zeigt, dass die Sequenz, bei der kein Antikörpersignal detektiert
werden konnte, vollständig innerhalb der Sequenz liegt, bei der ein Antikörpersignal beobachtet wurde (100%
Identity). Letztere weist aber zusätzlich N- und C-terminale Bereiche auf (grau hervorgehoben).
Mit ERBB1 zeigte darüber hinaus noch ein weiteres Protein der EGF-Rezeptor-Familie eine erhöhte
Immunantwort in dem Kollektiv der GBM Patienten. Bei vier der fünf auf dem Array gespotteten
ERBB1 Mutanten wurde eine signifikante Reaktion mit dem Plasma der Tumorpatienten detektiert (
Tabelle 4.9). Die stärksten Reaktionen zeigten sich mit der T790M Mutation. Die Expression von
ERBB1 konnte sowohl auf Proteom- als auch auf Transkriptomebene gezeigt werden.
Tabelle 4.9: Detektierte Immunantworten gegen die fünf verschiedenen, gespotteten Varianten von EGFR auf dem ProtoArray
Gen-Variante Prävalenz für Kontrollen
Prävalenz für neu diagnostizierte
Tumorpatienten
p-Wert
EGFR,T790M 22,73 % 81,82 % 1,64*10-04
EGFR(ErbB1), T790M,L858R 18,18 % 72,73 % 6,16*10-04
EGFR(ErbB1),L858R 18,18 % 63,64 % 1,53*10-04
EGFR 18,18 % 59,09 % 3,96*10-04
EGFR(ErbB1),L861Q 18,18 % 45,46 % 4,12*10-04
Eine Immunantwort gegen die häufigen tumorassoziierten Antigene p53 und cancer/testis antigen 1
ebenso wie gegen die kürzlich in Glioblastompatienten entdeckten Antigene PHF3, GLEA1 und GLEA2
konnten nicht detektiert bzw. bestätigt werden, da diese Proteine nicht auf dem Array vorhanden
waren.
Für die Validierung der Kandidaten an einem unabhängigen Probenkollektiv wurde das
antikörperbasierte Nachweisverfahren des Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ausgewählt.
Hierfür wurden rekombinant erworbene Kandidatenantigene adsorptiv an Mikrotiterplatten
Kapitel 4: Ergebnisse
77
gebunden und jeweils 20 Plasmaproben von Patienten und nicht tumorerkrankten Kontrollen
hinsichtlich einer Bindung von Autoantikörpern an das jeweilige Antigen untersucht. Zunächst
wurden die Proteine ERBB2 und FHL1 mittels ELISA validiert. Zusätzlich wurden mit MAPK1 und
FABP3 zwei Proteine als Negativkontrolle ausgewählt, welche keine differentielle Antikörperantwort
im Rahmen des Protein-Arrays zeigten. Für ERBB2 konnte ein signifikant differentielle Signal zwischen
den beiden untersuchten Gruppen beobachtet werden (t-Test 0,03), für FHL1 konnten die Ergebnisse
aus dem Protein-Array Experiment nicht bestätigt werden (t-Test 0,98). Die Negativkontrollen zeigten
erwartungsgemäß ebenfalls keine signifikanten Unterschiede (siehe Tabelle 4.10). Die Validierung
der zwei anderen Kandidaten, FHL3 und ERBB1, stehen noch aus.
Tabelle 4.10: Übersicht der Ergebnisse der Validierung von Kandidatenantigenen an einem unabhängigen Probenkollektiv mittels ELISA
Antigen Mittelwert der Signalintensität bei
Tumorpatienten
Mittelwert der Signalintensität bei
Kontrollen
Verhältnis der Signalintensität Tumor
zu Kontrolle
t-Test
ERBB2 0,81 0,44 1,84 0,03
FHL1 0,61 0,61 0,99 0,98
MAPK1 0,23 0,28 0,82 0,11
FABP3 0,25 0,26 0,97 0,79
Kapitel 5: Diskussion
78
5. Diskussion
Methodische Aspekte der proteomanalytischen 5.1.
Charakterisierung des Glioblastoms
Das Ziel dieser Arbeit war es, molekulare Ursachen für das Langzeitüberleben bei
Glioblastompatienten zu finden. Die Fragestellung des LTS ist mittlerweile in diversen Studien unter
Berücksichtigung zahlreicher Aspekte wie etwa demographische Daten von Patienten, schädliche
Umwelteinflüsse, klinische Parameter und Behandlungsstrategien adressiert worden. Im Rahmen
dieser Studien konnte bisher gezeigt werden, dass ein junges Alter bei Diagnosestellung und eine
gute allgemeine Konstitution den Krankheitsverlauf begünstigen (Curran et al. 1993). Darüber hinaus
gibt es erste Ansätze, die versuchen, das LTS auf molekulargenetischer Ebene zu charakterisieren. Bei
Arbeiten zur Analyse genetischer Veränderungen der Tumoren sowie der mRNA Expression (Krex et
al. 2007; Reifenberger et al. 2014) konnten Hinweise auf einen positiven Einfluss der MGMT
Promotormethylierung und IDH1 Mutation auf die Gesamtüberlebensdauer detektiert werden. Um
weitere Informationen über die klinische Gruppe der LTS zu erhalten, wurde in dieser Arbeit ein
proteomanalytischer Ansatz gewählt.
5.1.1. Klinische Proteomanalyse von Glioblastomen
Eine besondere Herausforderung bei der Aufklärung der molekularen Ursachen des klinisch
definierten Phänomens des Langzeitüberlebens mithilfe der Proteomanalyse ist, dass keine
Modelsysteme wie z.B. Zellkultur oder Tiermodelle etabliert sind, die in der Lage wären, dieses
komplexe systemische Bild darzustellen. Aus diesem Grund wurde bisher für molekulare Studien
ausschließlich auf die ex vivo Analyse von Tumormaterial gesetzt. Im Rahmen des deutschen
Gliomnetzwerks wurde hierfür eine prospektive Gewebe- und Plasmasammlung etabliert, welche
mittlerweile über 1800 Gewebeproben und 900 Plasmaproben umfasst.
Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit bzw. Eignung der klinischen Proben stellt sich für die
molekulare Analyse die Herausforderung, Methoden einzusetzen, die materialsparend sind, aber
dennoch eine umfassende Analyse erlauben. Bezogen auf die Materialverfügbarkeit ist Plasma
unproblematisch und gehört zu der Gruppe der leicht zugänglichen biologischen Proben. Allerdings
hat sich in der Vergangenheit gezeigt, dass die direkte molekulare Analyse von Plasma mit den
heutigen Methoden der Proteomanalyse nicht zielführend ist. Die hohe Konzentration weniger
Plasmaproteine wie z.B. Hämoglobin, Albumin und Bestandteile des Komplementsystems,
Kapitel 5: Diskussion
79
überdecken häufig die Signale gering konzentrierter Proteine und lassen nur bedingt Aussagen über
pathologische Signaturen zu (Anderson und Anderson 2002). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass
Plasma sehr gut geeignet ist, um die humorale Immunantwort zu untersuchen. Hier ermöglicht die
hohe Bindungsaffinität von (Auto-) Antikörpern das analytische Problem des hohen dynamischen
Konzentrationsbereichs von Proteinen in Plasma zu umgehen. So konnten z.B. Lennon et al. (2004)
im Blut von Multiple Sklerose Patienten, die unter Neuromyelitis optica litten, Antikörper gegen den
Wasserkanal Aquaporin 4 nachweisen (Lennon et al. 2004). Die Anwesenheit von Antikörpern gegen
Aquaporin 4 sind mittlerweile ein etablierter Biomarker für Neuromyelitis optica und ein
entscheidendes Kriterium für die Diagnosestellung.
Für die Analyse von klinischen Gewebeproben mittels Proteomanalyse existieren diverse gut
etablierte Methoden (Apweiler et al. 2009). Für eine besonders materialschonende Analyse von
Tumorgewebe wurde im Vorfeld dieser Arbeit eine Methode zur kombinierten Analyse von DNA/RNA
und Proteinen entwickelt (Grzendowski et al. 2009). Mit dieser Methode ist es möglich, die bei der
Aufarbeitung von DNA/RNA entstehenden Proteinfraktionen durch Entsalzungsschritte für die
quantitative Proteomanalyse einzusetzen. Diese Vorgehensweise wurde in dieser Arbeit für die
Analyse von GBM-Gewebe erfolgreich adaptiert. Die nachträgliche Analyse der im
Validierungsexperiment verwendeten Proben ergab hingegen, dass es sich ausschließlich um
Tumoren ohne Mutation im IDH1-Gen handelte. Da für die Transkriptomanalyse mögliche IDH1-
Mutationen bereits berücksichtigt wurden, waren sowohl Proteinblotting als auch der Abgleich mit
den Transkriptomdaten rückblickend für die Validierung der Ergebnisse der 2D-DIGE Studie nur
bedingt geeignet.
Für die Analyse bestimmter Zelltypen hat sich eine Kombination aus Mikrodissektion und
quantitativer Proteomanalyse bewährt. So konnte von der Arbeitsgruppe Stühler eine Methode zur
Analyse von 1000 mikrodissektierten Pankreaszellen mittels anschließender 2D-DIGE-Technik
etabliert werden (Sitek et al. 2005). Anders als bei der Zellsortierung fluoreszenz-markierter Zellen
durch Durchflusszytometrie, die den Einsatz von Frischgewebe erfordert, kann die Laser
Mikrodissektion auch an Kryoschnitten durchgeführt werden (Stingl et al. 2011). Dieser Umstand
erlaubte die erfolgreiche Adaption der Mikrodissektion von GBM Gewebe und ihre Übertragung auf
markierungsfreie Analysen im Rahmen dieser Arbeit. Hierdurch konnten bei der Analyse von 500 ng
Gesamtprotein, isoliert aus Kryoschnitten des GBM, rund 3500 Proteine mittels HPLC-MS/MS
identifiziert und quantifiziert werden. In einer Arbeit von Liu et al. (2013) wurden markierungsfreie
MS-Analysen an 0,5 mm2 mikrodissektiertem Brustkrebsgewebe durchgeführt, was ca. 200-400 ng
Gesamtprotein entspricht. Diese erlaubten die Identifizierung von 2337 Proteinen. Ferner konnten
mithilfe der Laser-Capture Mikrodissektion quantitative Proteomanalysen an 500 bis 3000
Kapitel 5: Diskussion
80
mikrodissektierten Kolonkarzinomzellen von Wisniewski et al. (2011) durchgeführt werden. Hier war
nach Fraktionierung eine Identifizierung von über 4000 Proteinen mittels Massenspektrometrie
möglich. Da die Zelldichte in verschiedenen Geweben sehr stark variieren kann, ist hier ein Vergleich
jedoch nur sehr bedingt möglich.
5.1.2. Quantitative Proteomanalyse von Glioblastomen
Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein möglichst umfassendes Bild des Proteoms von
Langzeitüberlebenden im Vergleich zu Kurzzeitüberlebenden erstellt werden. Aus diesem Grund
wurde zum einen die 2D-DIGE-Technik zum anderen die markierungsfreie Quantifizierung von
Proteinen mittels Massenspektrometrie eingesetzt. Vorteil der 2D-DIGE-Technik ist, dass eine
Analyse intakter Proteine (top down) möglich ist. Durch ihr sehr gutes Auflösungsvermögen wird die
Detektion posttranslationaler Modifikationen und Proteinisoformen ermöglicht. In dieser Arbeit
konnte gezeigt werden, dass durchschnittlich 3000 Proteinspots quantifiziert werden können. Zabel
und Klose (2009) konnten sogar eine Auftrennung von über 10.000 Proteinspots mittels 2D-
Gelelektrophorese erreichen. Allerdings muss berücksichtigt werden, dass bei dieser Methode die
Quantifizierung zunächst unabhängig von der Identifizierung der Proteine abläuft. Diese ist stark von
den Eigenschaften des betreffenden Proteins, seiner Abundanz in der Probe sowie dem verwendeten
Massenspektrometer abhängig. In der vorliegenden Arbeit lag die Identifizierungsrate bei etwa 90%.
Im Vergleich hierzu konnten mittels Massenspektrometrie basierter top-down-Analyse zu dem
damaligen Stand der Technik lediglich etwa 25 Proteine standardmäßig identifiziert werden (Parks et
al. 2007). Dennoch ist diese Methode sicherlich eine der vielversprechendsten im Bereich der
Analytik intakter Proteine. Die Zahl der identifizierten Proteine ist mit fortschreitenden technischen
Entwicklungen stetig angestiegen. So konnten im Jahr 2012 von Ahlf et al. (2012) 690 Proteine, im
Jahr 2013 von Catherman et al. (2013) bereits 1220 Proteine aus der humanen Zelllinie H1299 mittels
top-down Massenspektrometrie identifiziert werden. Momentan gilt für die Analyse von klinischen
Proben aber die peptidbasierte Analytik (bottom up) mittels Massenspektrometrie als Goldstandard
(Megger et al. 2013). Der entscheidende Vorteil dieser Methode liegt vor allem in der parallelen
Identifizierung und Quantifizierung der vermessenen Analyten. Aus diesem Grund wurde für diese
Arbeit die markierungsfreie Quantifizierung mittels Massenspektrometrie für die Analyse der
mikrodissektierten Proben gewählt. Markierungsfreie Analysen besitzen gegenüber
isotopenbasierten Methoden den Vorteil, dass jede Art von Probe ohne weitere Manipulation wie
z.B. der Inkorporation von schweren Aminosäuren im Falle von metabolischen Markierungsstrategien
(SILAC) oder chemischen Modifikationen des Analyten (z.B. bei iTRAQ oder der Dimethyl-Markierung)
und ohne Nachteile bzgl. des zur Verfügung stehenden dynamischen Bereichs der Quantifizierung
Kapitel 5: Diskussion
81
eingesetzt werden kann (Old et al. 2005). So sind metabolische Markierungen im Moment noch auf
Zellkultursysteme beschränkt. Die Analyse von humanem Gewebe ist nur unter Zuhilfenahme eines
markierten Zellkulturstandards möglich (Geiger et al. 2010). Darüber hinaus erfordern alle diese
Quantifizierungsstrategien, dass die jeweilige Markierungsreaktion vollständig und reproduzierbar
abläuft. Bei der markierungsfreien Quantifizierung wird auf eine Markierung der Proteine bzw.
Peptide gänzlich verzichtet. Sie kann daher ebenfalls für alle Arten von biologischen Proben
eingesetzt werden. Von entscheidender Bedeutung ist hierbei ein höchst reproduzierbares HPLC-MS
System. Im Gegensatz zu isobaren Markierungstechniken, bei der für die Quantifizierung die
Aufnahme eines Fragmentspektrums notwendig ist, ist die erfolgreiche Quantifizierung eines
Proteins bereits nach der Identifizierung mittels eines einzigen Peptidspektrums möglich. Darüber
hinaus wird die Komplexität der Probe nicht durch das Mischen der verschiedenen Proben zusätzlich
erhöht. Daraus resultiert unter anderem der sehr hohe dynamische Bereich dieser Methode, der
typischerweise höher liegt als der jener Methoden, die sich der Markierung mit stabilen Isotopen
bedienen (Old et al. 2005; Liu et al. 2013).
Im Rahmen dieser Studie war eine relative Quantifizierung für 2755 Proteine möglich. In einer
ähnlichen Arbeit von Liu et al. (2013), in der mikrodissektiertes Brustkrebsgewebe analysiert wurde,
konnten 1624 Proteine mittels markierungsfreier Quantifizierung analysiert werden. In einer
anderen, ebenfalls auf Mikrodissektion von Brustkrebsgewebe basierenden Studie von Cha et al.
(2010) konnten 1623 Proteine quantifiziert (2588 Proteine identifiziert) werden, wobei rund 18% als
differentiell ermittelt wurden. Somit konnten in der hier vorliegenden Arbeit trotz eines ähnlichen
Ansatzes eine etwas überdurchschnittliche Anzahl an Proteinen quantifiziert werden. In der Arbeit
von Liu et al. (2013) wird darüber hinaus der CV der Peptide mit 31,7 % angegeben, in der
vorliegenden Arbeit lag dieser bei 33 %. Variationskoeffizienten für Proteine werden in einer Arbeit
von Ijsselstijn et al. (2013) an hoch abundanten Serumproteinen zwischen 22,55 % und 43,22 %
angegeben, von Lai et al. (2011) zwischen 11,4 % und 63,4 % je nach betrachtetem Protein. Beide
Gruppen geben an, dass der CV in Abhängigkeit des betrachteten Proteins sehr stark schwanken
kann, so dass der über alle Proteinidentifizierungen gerechnete CV von 30 % in dieser Arbeit als
durchschnittlich anzusehen ist.
5.1.3. Proteinarrays zur Detektion zum Nachweis von Tumorantigenen
Zur Detektion Glioblastom-assoziierter Antikörper wurden in dieser Arbeit Protein Arrays eingesetzt,
die das parallele Screening von Autoantikörpern gegen rund 9000 potentielle Antigene ermöglichten.
Im Gegensatz zu der bisher für diese Fragestellungen häufig verwendeten Methode SEREX (Sahin et
al. 1997), die als Antigenquelle cDNA-Banken benutzt, handelt es sich bei den Protein Arrays um eine
Kapitel 5: Diskussion
82
alternative Methode, bei der rekombinante Proteine im Arrayformat gespottet werden (Sundaresh et
al. 2006). Obwohl die Verwendung von cDNA Banken eine sehr hohe Sensitivität und eine
ausgezeichnete Antigenabdeckung bietet, muss doch berücksichtigt werden, dass sich die
rekombinanten Antigene möglicherweise, z.B. durch das Fehlen von PTMs, von den tatsächlich im
Tumor exprimierten unterscheiden (Rauch und Gires 2008). Durch die Verwendung von Protein
Arrays, deren Antigene in Insektenzellen produziert werden, sollte hier auch dieser Sachverhalt
berücksichtigt werden. Im Vergleich mit den 9000 auf dem Array gespotteten Proteinen liegt die
Anzahl untersuchter Antigene in einem typischen SEREX-Experiment deutlich höher, da hier ganze
cDNA Banken mit mehreren hunderttausend Klonen getestet werden (Sahin et al. 1997; Rauch und
Gires 2008). Jedoch ist es unwahrscheinlich, dass die in der verwendeten cDNA Datenbank
enthaltenen Sequenzen allesamt auch tatsächlich in Proteine translatiert werden. Andere Methoden
wie PROTEOMEX (Klade et al. 2001; Unwin et al. 2003) oder AMIDA (Gires et al. 2004) verwenden
Tumorlysate als Antigenquelle. Bei beiden Methoden erfolgt die Identifizierung eines potentiellen
Antigens mittels Massenspektrometrie erst im Anschluss an die Signaldetektion und ist somit zum
einen von deren Güte abhängig, zum anderen auf eine wesentlich kleinere Anzahl analysierter
Antigene beschränkt. Bei der Verwendung von Array Plattformen werden sowohl die Anzahl als auch
die Herkunft der analysierbaren Antigene durch den Hersteller des Arrays vorgegeben. Daher wurde
bei der Auswahl des Arrays und im Rahmen der Auswertung durch den Vergleich mit den in dieser
Arbeit erstellten Proteinprofilen und mRNA Expressionsdaten von Glioblastomen darauf geachtet,
dass die potentiellen Antigene auch tatsächlich im Tumor exprimiert werden.
Bezogen auf die einzusetzende Menge an Patientenmaterial unterscheiden sich die verschiedenen
Techniken kaum. Wenige Mikroliter Plasma oder Serum reichen, da die Proben in der Regel stark
verdünnt (1:500-1:1000) eingesetzt werden (Sahin et al. 1997; Rauch und Gires 2008; Le Roux et al.
2010). Für autoimmunologische Screenings mit Hilfe von Protein Arrays kann grundsätzlich sowohl
Plasma oder Serum verwendet werden (Marina et al. 2008; Le Roux et al. 2010). Da die im Rahmen
dieser Arbeit gesammelten Proben auch für andere Studien und Experimente zur Verfügung stehen
sollten, wurde letztendlich die Entscheidung getroffen, Plasma zu sammeln. Vortests zu dieser Arbeit
zeigten, dass bei Verwendung von Serum und Plasma desselben Patienten keine signifikanten
Unterschiede im Immunprofil zu detektieren waren. Dies ermöglichte im Folgenden den Einschluss
von Arraydaten von Serumproben nicht-tumorerkrankter Patienten. Als kritisch erwies sich lediglich
die Verwendung von Arrays, welche zu unterschiedlichen Zeitpunkten produziert wurden. Daher
wurde darauf geachtet, dass alle eingesetzten Arrays derselben Produktionscharge entstammten.
Kapitel 5: Diskussion
83
Für die Validierung von Ergebnissen, die mittels Protein Array Technologie gewonnen wurden hat
sich der Enzyme-linked immunosorbent assay mittlerweile als Standardmethode durchgesetzt
(Querol et al. 2013; Kinloch et al. 2014). Diese stellt aufgrund der substantiellen Unterschiede in der
Art wie die Antigene präsentiert werden dennoch eine besondere Herausforderung dar (Querol et al.
2013). So konnten von Kinloch et al. (2014) einige der mittels ProtoArray gewonnenen Ergebnisse
nicht mittels ELISA bestätigt werden. Auch in dieser Arbeit konnte bisher nur eines der zwei bereits
getesteten Kandidatenantigene mittels ELISA validiert werden. Da seitens des Herstellers nur
unvollständige Mengenangaben zu den Antigenen vorlagen und darüber hinaus Autoantikörper sehr
unterschiedliche Sensitivitäten aufweisen können (Liu et al. 2014), ist es jedoch denkbar, dass die
eingesetzte Menge von Antigen in diesem Fall nicht ausreichend war und eine höhere Proteinmenge
eingesetzt werden muss (Querol et al. 2013; Liu et al. 2014).
Biologische Aspekte der proteomanalytischen 5.2.
Charakterisierung des Glioblastoms
Ziel dieser Arbeit war es, durch die proteomanalytische Untersuchung von Gewebe- und
Plasmaproben molekulare Signaturen zu identifizieren, die Aufschluss über die biologischen Prozesse
beim Langzeitüberleben von Glioblastompatienten geben. Wie oben bereits beschrieben, ist die
molekularbiologische Untersuchung von GBM LTS nur mithilfe von Patientenproben möglich und
sinnvoll. Daher sind jedoch, insbesondere im Hinblick auf die Gewebeproben, Aussagen über
Veränderungen gegenüber gesundem Gewebe nicht möglich, da dieses aus ethischen Gründen nicht
zur Verfügung stand. In der gewebebasierten Studie wurde sich daher darauf beschränkt,
Unterschiede zwischen den analysierten Tumorentitäten zu detektieren. Die Unterscheidung der
Tumoren fand nach ihrem klinischen Verlauf statt. Die Gruppe der LTS-Patienten umfasste Gewebe
von Patienten, die ein progressionsfreies Gesamtüberleben von mehr als 36 Monaten aufwiesen, in
der Gruppe der STS befanden sich nur Patienten, die innerhalb von 12 Monaten nach
Diagnosestellung verstarben. Im Rahmen der gewebebasierten Studie wurden dann sowohl LTS und
STS Patienten jeweils ohne Mutation im IDH1-Gen verglichen als auch ein Vergleich zwischen LTS mit
und ohne IDH1-Mutation durchgeführt.
Kapitel 5: Diskussion
84
5.2.1. Differentielle Proteomanalyse des Tumorgewebes von
Glioblastomen hinsichtlich des Langzeitüberleben
Das Langzeitüberleben von Glioblastompatienten wurde bisher überwiegend hinsichtlich eines
Einflusses genetischer Veränderungen sowie exogener Faktoren untersucht. Bisher sind lediglich zwei
Studien, die das LTS mithilfe der Proteomanalyse untersucht haben, publiziert. Park et al. (2009)
berichtete basierend auf einer 2D-PAGE-Studie dass das Protein Mangan-Superoxid-Dismutase (Mn-
SOD) hochreguliert in STS gegenüber LTS Patienten sei. Aufgrund der geringen Anzahl der
analysierten Patienten (2 LTS und 2 STS) wurde die notwendige Statistik in dieser Studie jedoch nicht
durchgeführt. Patel et al. (2013). untersuchten 2013 mit Hilfe von kombinatorischer Netzwerkanalyse
und anschließenden markierungsfreier Proteomik von 16 GBM Patienten ebenfalls Langzeitüberleben
und konnten zeigen, dass in LTS eine erhöhte Expression von DNM1 und MAPK1 sowie eine
verminderte Proteinexpression von HSPA9, PSMD3 und CANX zu beobachten war. In einer Studie von
Barbus et al. (2011), wurden die mRNA Profile von 11 LTS und 12 STS Patienten untersucht und
Unterschiede in Retinsäure abhängigen Signalwegen aufgedeckt. In einer ähnlichen, aber deutlich
umfangreicheren Studie von Reifenberger et al. (2014), in der die mRNA von insgesamt 94 Patienten,
davon 28 LTS und 20 STS, untersucht und in der auch der Einfluss der IDH1 Mutation berücksichtigt
wurde, konnten dann allerdings keine Unterschiede zwischen LTSwt und STSwt Patienten auf
Genexpressionsebene detektiert werden.
In dieser Arbeit konnten mithilfe der markierungsfreien Analyse entsprechende Proteinprofile von
Tumorgewebe von GBM LTS und GBM STS erstellt werden. So konnten für LTSwt und STSwt 2417
bzw. 2903 Proteine identifiziert werden, von denen 178 eine unterschiedliche Abundanz aufwiesen.
Die detaillierte Auswertung der 162 in GBM STS hochregulierten Proteine ergab, dass 64 Proteine
mitochondrialen Ursprungs sind. Diese signifikante Anreicherung innerhalb der differentiell in STS
hochregulierten Proteine lässt einen mitochondrialen Phänotyp postulieren.
Seit langem ist bekannt, dass das Mitochondrium bei der Tumorgenese eine wichtige Rolle spielt
(Warburg 1956). So wurde bereits 1924 von Otto Warburg bei Krebszellen ein Wechsel von der
oxidativen Phosphorylierung der Mitochondrien hin zur aeroben Glykolyse beschrieben. Hiermit kann
die Tumorzelle neben ATP auch wichtige Metabolite für die Synthese von Nukleotiden, Fettsäuren
usw. generieren und so einen proliferativen Phänotypen aufrechterhalten. Dieser Wechsel ist für
Gliome ebenfalls beschrieben und wird auch bei deren Diagnose ausgenutzt. So ermöglicht z.B. die
erhöhte Glukoseaufnahme im Tumor die Verwendung von 18F-markierter 2-Deoxyglukose bei der
Positronen Emissions Tomographie (PET) zur Unterscheidung von Tumor und gesunden oder
Kapitel 5: Diskussion
85
nekrotischen Regionen (Wienhard et al. 1989). Nicht-invasive Magnetresonanz Techniken wie z.B. die
H-MR Spektroskopie (MRS) des Gehirns machen sich ebenfalls die vermehrte aerobe Glykolyse von
Gliomen zu nutze. Hier werden die Zunahme von Cholin und Laktat sowie die Abnahme von N-Acetyl-
Aspartat als Marker für die Synthese von neuronenspezifischen Aminosäurederivaten gemessen.
Unter allen Gliomen zeigen Glioblastome hierbei die höchsten Level an Cholin und Laktat (Bulik et al.
2013).
Die erhöhte Abundanz mitochondrialer Proteine bei STS-Patienten könnte auf eine Rolle der
Mitochondrien bei der Tumorgenese von Glioblastomen hindeuten, welche Einfluss auf den
unterschiedlichen klinischen Verlauf von GBM Patienten mit verkürzter Gesamtüberlebenszeit
nimmt. Neben der erhöhten Proliferation von Tumorzellen muss sich eine Krebszelle auch gegenüber
antiapoptotischen Prozessen schützen. So wurde in diesem Zusammenhang vor kurzem ein Prozess
beschrieben, der die Tumorzelle durch Benutzung der Fettsäureoxidation und Erzeugung des
Reduktionsmittel NADPH vor oxidativen Stress schützt (Carracedo et al. 2013). Es konnte gezeigt
werden, dass sich Krebszellen durch die mitochondriale Fettsäureoxidation und den damit
verbundenen Anstieg der cytosolischen NADPH-Konzentration einen Überlebensvorteil verschaffen
und somit die Tumorigenität steigern. NADPH spielt zum einen eine wichtige Funktion als Co-Enzym
anaboler Enzyme, welche die Bausteine für das Wachstum der Krebszelle bereitstellen, zum anderen
hat es eine entscheidende Rolle beim Schutz der Zellen vor oxidativem Stress (Chiarugi et al. 2012). In
dieser Arbeit wurden sowohl die Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase, welche im Rahmen des
Pentose-Phosphat-Wegs NADPH generiert, als auch mit β-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase und
Enoyl-CoA Hydratase zwei Proteine der Fettsäure-Oxidation, welche indirekt über die Bereitstellung
von Substratvorläufern von IDH1/2 NADPH erzeugt, mit erhöhter Abundanz in STS-Patienten
nachgewiesen. Ein erhöhter NADPH-Level scheint in STS Patienten somit wahrscheinlich.
In einer Arbeit, bei der die Fettsäureoxidation mittels Ectomoxir in der Glioblastomzellinie SF188
inhibiert wurde, konnte gezeigt werden, dass das Absinken der NADPH Konzentration und der damit
verbundenen fehlende Schutz vor oxidativem Stress durch Glutathion zum Zelltod führt (Pike et al.
2011). Durch den zusätzlichen Einsatz des ROS senkenden Chelatbildners Tiron konnte außerdem der
Beweis geführt werden, dass die ATP-Produktion durch die mitochondriale Fettsäureoxidation nicht
ursächlich für den Zelltod war, sondern lediglich die NADPH-Konzentration darüber entscheidet, ob
die Krebszelle überlebt. Dieser Mechanismus verschafft den Krebszellen einen Überlebensvorteil
gegenüber anderen Zellen. Übertragen auf die hier untersuchte Fragestellung könnte dies bedeuten,
dass der klinische Verlauf von GBM Patienten mit kürzerer Überlebenszeit damit zu begründen ist,
dass diese Tumorzellen sich durch die Hochregulation der mitochondrialen Fettsäureoxidation und
Kapitel 5: Diskussion
86
die damit verbundene Produktion von NADPH einen Schutz vor oxidativen Stress verschaffen, wie er
durch die Chemo- und Strahlentherapie verursacht wird (Abbildung 5.1). So konnten mit der
Phospholipid-Hydroxyperoxid-Glutathion-Peroxidase und der Glutathion-S-Transferase zwei
Gluthathion-abhängige Proteine in STS als hochreguliert detektiert werden, welche die Zelle vor ROS
schützen und bei der Zellentgiftung eine wichtige Rolle spielen. Darüber hinaus zeigt mit DJ1 ein
weiteres Protein in STS Patienten eine erhöhte Proteinexpression, das Schutz vor oxidativem Stress
vermittelt.
Offen bleibt in diesem Zusammenhang die Frage, wie die Krebszelle die konkurrierenden Prozesse
Fettsäureoxidation und –synthese aufeinander abstimmt, um zum einen den „Survival-Phänotyp“
und zum anderen den proliferativen Phänotyp (Warburg-Effekt) zu ermöglichen. In einer Arbeit von
Jeon et al. (2012) konnte jedoch kürzlich gezeigt werden, dass Krebszellen je nach
Umweltbedingungen in der Lage sind, AMPK vermittelt alternativ Fettsäureoxidation oder –synthese
durchzuführen.
Abbildung 5.1: Möglicher Schutzmechanismus des Tumors vor ROS und Zellgifte durch erhöhte Fettsäureoxidation in Kurzzeitüberlebenden des Glioblastoms. Die β-Oxidation liefert mit Acetyl-CoA den Ausgangstoff für das Substrat der IDH1 und IDH2. Somit könnte eine erhöhte Abundanz, der an der β-Oxidation beteiligten Proteine sowie der ebenfalls NADPH erzeugenden G6PDH eine Erhöhung der intrazellulären NADPH-Konzentration zur Folge haben. Diese ist entscheidend für die Reduktion von Glutathion (GSH) durch die Glutathion Reduktase (GSR). Reduziertes Glutathion regeneriert wiederum diverse Proteine, die Schutz vor ROS und toxischen Substanzen vermitteln. Proteine und Prozesse, die in dieser Arbeit als in Kurzzeitüberlebenden hochreguliert gezeigt werden konnten, sind fett gezeichnet.
Kapitel 5: Diskussion
87
Interessanterweise könnte somit dem Phänotyp LTS bei Patienten mit fehlender IDH1 Mutation eine
ähnliche Ursache zu Grunde liegen, wie sie für die klinisch besser verlaufenden Patienten mit einer
IDH1-Mutation diskutiert wird. IDH1 ist neben Glukose-6-Phosphatdehydrogenase (G6PD) und 6-
Phosphoglukonolaktone Dehydrogenase (6PGLDH) sowie dem NADP+-abhängigen Malatenzym (ME1)
eines der vier wichtigen Enzyme zur Erhaltung der NADPH-Konzentration und der damit
verbundenen REDOX-Homöostase (Lee et al. 2002). Es ist bekannt, dass die IDH1-Mutation R132H zu
einer Änderung der enzymatischen Funktionalität des Enzyms führt, welches zur Folge hat, dass
neben α-Ketoglutarat nicht mehr NADPH produziert, sondern 2-Hydroxyglutarat gebildet wird und
NADPH verbraucht wird (Dang et al. 2009). Dies legt nahe, dass sich die Tumorzelle durch die IDH1
Mutation und der dadurch verringerten Konzentration von NADPH weniger gegen oxidativen Stress
und der damit einhergehenden vermehrten möglichen Schädigung der DNA schützen kann. Durch
oxidative Schäden an Lipiden und Proteinen können apoptoische Prozesse initiiert werden und die
Krebszellen dadurch eine verringerte Überlebenszeit und Tumorigenität aufweisen. Bisher ist der
Zusammenhang zwischen einer Mutation im IDH1-Gen und oxidativen Stress jedoch kaum belegt.
Lediglich durch Gilbert et al. (2014) wurde kürzlich gezeigt, dass die Überexpression von R132H IDH1
in der Glioblastomzelllinie U87MG zu oxidativen Stress, Apoptose und Autophagie führt.
Die von Park et al. (2009) und Patel et al. (2013) als differentiell zwischen LTS und STS Patienten
ermittelten Proteine SOD2, DNM1, MAPK1, HSPA9, PSMD3 und CANX wurden in dieser Arbeit
durchweg detektiert, zeigten aber keine signifikanten Unterschiede in der Proteinexpression
zwischen den beiden Gruppen. Ursache hierfür könnten zum einen das gewählte Patientenkollektiv
oder zum anderen die gewählten Methoden sein. So wurde in keiner der Arbeiten die IDH1
Mutation, die zu 34 % bei den LTS auftritt, berücksichtigt. Ferner wurde keine spezifische Isolation
von Tumorzellen durchgeführt. Bemerkenswert ist jedoch, dass es sich bei der in STS-Patienten als
hochreguliert beschriebenen Mn-SOD ebenfalls um ein Protein handelt, welches der Zelle beim
Schutz vor ROS hilft (Sato et al. 1995) und steht somit im Einklang mit der hier aufgestellten
Hypothese.
5.2.1.1 Fazit
Die erhöhte Abundanz mitochondrialer Proteine und der daraus abgeleitete tumorbiologische
Kontext deuten auf einen, durch vermehrte Fettsäureoxidation initiierten Schutz der Tumorzellen
von Kurzzeitüberlebenden vor oxidativem Stress hin. Dieser Schutz wird vermutlich maßgeblich durch
einen erhöhten Level von NADPH, welches in der Lage ist, Glutathion-abhängig protektive Proteine
zu regenerieren, vermittelt.
Kapitel 5: Diskussion
88
5.2.2. Differentielle Proteomanalyse des Tumorgewebes von
Glioblastomen in Abhängigkeit von der IDH1 Mutation
Während der Laufzeit des Projekts wurde durch die Identifizierung der IDH1-Mutation eine wichtige
Entdeckung gemacht (Parsons et al. 2008), die in der Folge einen direkten Einfluss auf die weitere
Experimentplanung hatte. Es zeigte sich, dass sie bei einem Großteil (50-90%) adulter Astrozytome,
Oligodendrogliomen des WHO Typs II und III und sekundären Glioblastomen auftritt. Bei den
primären Glioblastomen tragen lediglich 3-16% eine IDH1 Mutation. Allerdings tritt die IDH1-
Mutation mit 34% gehäuft in Tumoren von primären GBM LTS-Patienten auf (Parsons et al. 2008;
Weller et al. 2009). Durch Hartmann et al. (2013) konnte kürzlich gezeigt werden, dass das
molekulare Profil von IDH1 mutierten primären LTS Tumoren eher dem von sekundären
Glioblastomen entspricht und durch TP53 Mutationen und fehlende EGFR Amplifikationen
gekennzeichnet sind.
Dieser Aspekt hatte insbesondere für die Auswertung der 2D-DIGE-Studie zur Folge, dass die zuvor
erstellte Gruppierung unter Berücksichtigung der IDH1 Mutation korrigiert werden musste. In diesem
Zusammenhang wurde eine Schwäche der 2D-DIGE offensichtlich und zwar führte die erneute
Bildauswertung zu neuen Kandidatenspots, für die eine neue Identifizierung per MS hätte
durchgeführt werden müssen. Da allerdings nicht ausreichend Material zur Verfügung stand, wurde
auf die erneute Auswertung verzichtet und die Aspekte der IDH1-Mutation bei der nachfolgenden
quantitativen Proteomanalyse mittels Massenspektrometrie berücksichtigt. Die bereits
identifizierten Proteine werden hier zusammen mit den Ergebnissen der markierungsfreien
quantitativen Analyse diskutiert.
Um den Einfluss der IDH1 Mutation bei GBM LTS zu untersuchen, wurden ebenfalls Gewebeproben
nach Mikrodissektion mittels markierungsfreier Analyse untersucht. Ergänzend muss angemerkt
werden, dass eine Untersuchung von STS mit IDH1 Mutation nicht möglich war, da diese Fälle nur
sehr selten auftreten und daher keine ausreichende Zahl von Fällen akquiriert werden konnte.
Mithilfe der markierungsfreien Analyse konnte für 10 GBM LTS mit IDH1-Mutation erfolgreich ein
Proteinprofil, welches 2834 Proteine enthält, erstellt werden. Der Vergleich der Gruppe LTSmut mit
LTSwt ergab, dass 130 Proteine einen signifikanten Abundanzunterschied aufwiesen. Von diesen
Proteinen waren in der Gruppe der mutierten Tumoren 85 hoch- und 45 herunterreguliert. Eine
Studie, die versucht die Unterschiede zwischen IDH1 mutierten und IDH1 Wildtyp-Glioblastomen mit
proteomanalytischen Methoden zu adressieren, wurde bisher noch nicht durchgeführt. Lediglich von
Oligodendrogliomen wurde von Thirant et al. (2011) eine 2D-gelbasierte Studie zu IDH1 mutierten
Kapitel 5: Diskussion
89
Tumoren durchgeführt und führte zu einer Identifizierung von insgesamt 42 differentiellen
Proteinen.
Die bioinformatische Analyse konnte zeigen, dass in der Gruppe der 85 in den mutierten Tumoren
hochregulierten Proteine eine signifikante Anreicherung von Proteinen existiert, die in Verbindung
mit der mRNA-Prozessierung und hier insbesondere mit dem Spleißen von mRNA stehen.
Insbesondere das alternative Spleißen stellt eine der wichtigsten Ebenen der Genregulation dar und
spielt eine wichtige Rolle bei Differenzierungsvorgängen in höheren Organismen. Es ermöglicht, dass
Gene in eine Vielzahl von Isoformen exprimiert werden können. Darüber hinaus ist das alternative
Spleißen auch eine integrale Komponente von Signaltransduktionskaskaden und in der Lage, auf
posttranskriptionaler Ebene Signale zu verstärken und weiterzuleiten. Auf diese Weise ermöglicht
das alternative Spleißen der Zelle Adaption als Reaktion auf Stimuli und Stressbedingungen durch die
Verknüpfung von Signalwegen und epigenetische Mechanismen (Biamonti et al. 2014).
Defekte im Spleißmechanismus sind mittlerweile bei einer Vielzahl von Krankheiten als Ursache oder
Verstärker bekannt. Durch das vermehrte Auffinden von mit Krebs assoziierten gespleißten
Proteinisoformen gibt es auch zunehmend Hinweise darauf, dass deregulierte Spleißmuster eng mit
der Tumorigenese verknüpft sein könnten. So konnten mittlerweile für diverse Tumorentitäten, wie
z.B. Brustkrebs, verschiedene alternative Spleißprodukte als Progressionsmarker ausfindig gemacht
werden (Venables et al. 2009; Brown et al. 2011). Für Gliome wird in diversen Arbeiten das Auftreten
bestimmter Spleißisoformen beschrieben, welche mit den diversen Aspekten der Gliomgenese, wie
z.B. onkogene Suppression (Chunduru et al. 2002; Tchirkov et al. 2010), Apoptose-Evasion (Yamada
et al. 2003), Proliferation (Camacho-Vanegas et al. 2007; Yu et al. 2007), Metabolismus (Clower et al.
2010; David et al. 2010) und Migration/Invasion (Yu et al. 2007; Cheung et al. 2009; Lo et al. 2009), in
Verbindung gebracht werden können. Demgegenüber steht jedoch eine Studie von Cheung et al.
(2008) die ausführt, dass gliomspezifische alternative Spleißprozesse eine eher untergeordnete Rolle
bei der Gliomgenese zu spielen scheinen.
Die Regulation alternativer Spleißprozesse findet zum einen durch die intrinisische Stärke der
Spleißseiten (cis-regulatorische Elemente) und zum anderen durch die kombinatorische Kontrolle
einer Reihe von trans-aktivierenden Faktoren statt. Bei Letzteren handelt es sich vornehmlich um
Proteine aus der Gruppe der Serin-/Argininreichen Spleißfaktoren (SR Proteine) oder Proteine aus
der Gruppe heterogener nukleärer Ribonukleoproteine (Martinez-Contreras et al. 2007; Long und
Caceres 2009). Verschiedene Vertreter (HNRNP-A2B1, -C, -D, -D-like, -H3, -K, -R und –U sowie SRSF 3,
Kapitel 5: Diskussion
90
6, 7, und 9 ) beider Gruppen wurden im Rahmen dieser Arbeit als hochreguliert in IDH1 mutierten
Tumoren gegenüber Wildtyp-Tumoren ermittelt.
Veränderungen im Spleißprozess entstehen häufig durch Variationen der relativen Menge oder der
Aktivität dieser regulatorischen Spleißfaktoren und obwohl ein kausaler Zusammenhang in vielen
Fällen noch bewiesen werden muss, scheint klar, dass die Expression spezifischer Spleißvarianten
vieler Krebs-assoziierter Gene direkt zu einem onkogenen Phänotyp beitragen und häufig in die
Tumorgenese und die Entwicklung von Resistenzen involviert sind (Ghigna et al. 2008). So konnte z.B.
durch Karni et al. (2007) gezeigt werden, dass der Spleißfaktor SF2/ASF in Folge der Amplifikation
seines Gens SRSF1 häufig in Tumoren überexprimiert wird und in Folge dessen onkogene
Eigenschaften erhält. SF2/ASF zeigten auch in dieser Arbeit eine höhere Abundanz (1,87) in
mutierten Tumoren, lediglich der p-Wert war mit 0,0103 knapp oberhalb des gesetzten Schwellwerts
von 0,01, um als differentiell berücksichtigt zu werden.
Weiterhin konnten in dieser Arbeit die beiden als „Spleiß–Hubs“ bezeichneten Faktoren hnRNPK und
SAM68 bei GBM LTS mit Mutation mit erhöhter Abundanz nachgewiesen werden. Für hnRNP K
konnte gezeigt werden, dass es an prä-mRNA Spleiß-Verstärker binden kann und Phosphorylierung
durch die Src-Kinase, Protein Kinase C (PKC), ERK1/2 und JNK seine Protein-Protein und Protein-RNA
Bindungseigenschaften verändern (Bomsztyk et al. 2004). Eine mögliche Phosphorylierung von
hnRNP K bzw. Phosphorylierungen im Allgemeinen wurden im Rahmen dieser Arbeit nicht analysiert,
da hierfür eine gezielte Anreicherung von Phosphopeptiden im Vorfeld der
massenspektrometrischen Analysen unter deutlich höherem Materialeinsatz notwendig gewesen
wäre.
In ähnlicher Weise bindet auch SAM68 Elemente innerhalb der prä-mRNA und kann durch Kinasen
wie z.B. ERK phosphoryliert werden (Matter et al. 2002). Spleiß-Hubs, wie Sam68 und hnRNP K, sind
in mehrfacher Hinsicht an der Krebspathologie beteiligt. Nicht nur werden häufig veränderte
Expressionsniveaus beobachtet (Wen et al. 2010; Hope und Murray 2011), auch können durch
veränderte vorgeschaltete Signale in Krebszellen posttranslationale Modifikationen verändert und in
dessen Folge die Lokalisierung und Aktivität von Spleißfaktoren beeinflusst werden. Sowohl hnRNP K
(Lewis et al. 2000) als auch Sam68 (Matter et al. 2002) sind Ziele von ERK, einer Komponente des Ras
/ MAPK-Signalwegs, welcher in Glioblastomen häufig eine verstärkte Aktivität zeigt (Guha et al. 1997;
Feldkamp et al. 1999). Über diesen Signalweg wird z.B. in Melanomen das Verhältnis des
Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktors MITF (-) zugunsten der gespleißten Isoform MITF
(+) verschoben (Primot et al. 2010). Mit Bezug auf die pro-proliferative Aktivität der MITF (-)-Isoform
Kapitel 5: Diskussion
91
schlagen Galibert und Kollegen vor, dass die Hochregulierung von MEK in Melanomen, welche zu der
veränderten Expression der Spleißvarianten von MITF führt, Teil eines Mechanismus ist, mit dem die
Tumorzellen eine erhöhte Proliferation erzielen (Primot et al. 2010). Darüber hinaus können die
veränderte Expression und Aktivität der Spleiß-Faktoren hnRNP K und Sam68 das normale
Spleißmuster ihrer Ziele stören. Für Sam68 sind z.B. CD44, welches in den Zellen an Migration,
Invasion und Proliferation beteiligt ist und Cyclin D1, beteiligt bei der Regulation des Zellzyklus, und
BCL-X, beteiligt an der Apoptose, interessante Ziele (Bielli et al. 2011). Für Sam68 konnte von Modem
et al. (2011) gezeigt werden, dass seine Überexpression in Glioblastomen zu vermehrter Proliferation
der Zellen führte. Eine besondere Rolle von hnRNP K bei Glioblastomen konnte bisher nicht belegt
werden.
Dass die Überexpression bestimmter Spleißfaktoren direkten Einfluss auf die Tumorbiologie haben
kann, wurde ebenfalls für die in dieser Arbeit als in IDH1 mutierten Tumoren hochregulierte
Spleißfaktoren hnRNPA2 und PTB gezeigt. So spielt ihre vermehrte Expression in Tumoren eine
entscheidende Schlüsselrolle für die Umschaltung von oxidativer Phosphorylierung zu aerober
Glykolyse (David et al. 2010). Durch Christofk et al. (2008) konnte gezeigt werden, dass die
ausschließlich in Tumorzellen exprimierte embryonale Isoform 2 der Pyruvatkinase durch Austausch
gegen die Isoform 1 in Tumorzellen zu einer Umkehrung des Warbug-Effekts, einhergehend mit
verminderter Laktat Produktion und vermehrtem Sauerstoffverbrauch, führt. In der Folge führte dies
zu verminderter Tumorbildung in Maus Xenotransplantaten. Auch in dieser Arbeit konnte
ausschließlich PKM2 detektiert werden. Peptide, die auf die PKM1-Isoform hinweisen, wurden nicht
gefunden. Die Isoformen der PKM sind ein Produkt alternativen Spleißens, bei dem entweder das
Exon 9 (PKM1) oder Exon 10 (PKM2) translatiert werden. David et al. (2010) zeigten, dass drei
Proteine aus der Gruppe der heterogenen nukleären Ribonukleoproteine (hnRNPA1, hnRNPA2 und
PTB) durch ihre repressive Bindung in der Nähe von Exon 9 den Einschluß von Exon 10 und damit die
Expression der PKM2 bewirken. Verantwortlich für die Überexpression dieser Spleißfaktoren ist
hierbei die Überexpression des onkogenen Transkriptionsfaktors c-Myc. Die Überexpression dieses
Transkriptionsfaktors sowie der drei Spleißfaktoren wurde von David et al. (2010) ebenfalls in
humanen Gliomen belegt.
Mit dem Spleißfaktor hnRNPH wurde im Rahmen dieser Arbeit in IDH1 mutierten Tumoren weiterhin
ein Spleißfaktor hoch reguliert gefunden, welcher bereits in Glioblastomen als überrepräsentiert
beschrieben wurde (Lefave et al. 2011). Eine Erniedrigung der Konzentration von hnRNPH führt zu
verändertem Spleißen und in Folge zu erhöhten Leveln der nicht-tumorgenen Varianten von MADD
Kapitel 5: Diskussion
92
und RON. Somit scheint hnRNPH durch die Inhibition von Apoptose und vermehrter Invasion einen
direkten Einfluss auf die Malignität von Glioblastomen zu haben (Lefave et al. 2011).
Ob neben dem gehäuften Auftreten von mit Spleißen assoziierten Proteinen in IDH1 mutierten
Tumoren auch vermehrt Produkte alternativen Spleißens vorkommen, konnte im Rahmen dieser
Arbeit nicht adressiert werden. Bei der bottom-up Proteomanalyse, die hier verwendet wurde, findet
die Identifizierung eines Proteins nur anhand eines kleinen, repräsentativen Teils der Proteinsequenz
statt. Informationen über bestimmte Isoformen von Proteinen sind daher meist nicht vorhanden.
Inwieweit die IDH1 Mutation in Verbindung mit dem alternativen Spleißen steht, ist bisher nicht
belegt. Der Zusammenhang könnte sich möglicherweise durch den Einfluss der IDH1-Mutation auf
die Epigenetik ergeben. So konnte gezeigt werden, dass der von mutierten IDH1 erzeugte Metabolit
2HG diverse Dioxygenasen inhibiert, die eine Rolle in der DNA-und Histon-Methylierung spielen. So
führt die Inhibition von TET2 durch 2HG zur Hypermethylierung von DNA. Folgender Mechanismus
wurde für dieses Phänomen vorgeschlagen: Der größte Teil der DNA Methylierungsstellen beim
Menschen sind 5-Methylcytosine (5mC) an CpG Dinukleotiden. TET 2 spielt eine wichtige Rolle bei
der Regulierung der Methylierung der DNA durch die Konversion von 5mC zu 5-
Hydroxymethylcytosin (5hmC), welches als intermediäres Produkt der DNA-Demethylierung
betrachtet wird. Weil TET2 ebenfalls eine α-Ketoglutarat abhängige Dioxygenase ist, ist es denkbar,
dass dieser Demethylierungsprozess durch die Anwesenheit des von der mutierten IDH1 Variante
erzeugten 2HG inhibiert wird und es in Folge dessen zu einer globalen Hypermethylierung der DNA
kommt (Xu et al. 2011).
In diesem Kontext spielt möglicherweise ein weiterer Aspekt der 2HG-vermittelen Inhibition von
Dioxygenasen eine wichtige Rolle. So ist bekannt, dass auch eine Vielzahl von Histon-Demethylasen,
welche ebenfalls zur Familie der Dioxygenasen gehören, durch die Anwesenheit von 2HG inhibiert
werden. Daraus resultiert in der Folge eine Veränderung des Methylierungsstatus der Lysinreste in
Histonen (Xu et al. 2011). Durch Lu et al. (2012), konnte gezeigt werden, dass ein erhöhter Level von
H3K9 Trimethylierungen in immortalisierten Astrozyten, welche die mutierte IDH1 Form exprimieren,
bereits nach Passage 12 nach der Transduktion mit IDH1 detektiert werden konnte. Eine erhöhte
DNA Methylierung wurde hingegen erst nach Passage 22 beobachtet (Lu et al. 2012). Dies lässt
vermuten, dass eine veränderte Histon Methylierung möglicherweise einer DNA Methylierung
vorangeht und eventuell auch unabhängig von dieser auftritt (Ichimura 2012).
Kapitel 5: Diskussion
93
Der mögliche Funktionszusammenhang könnte sich nun daraus ergeben, dass gezeigt werden
konnte, dass die Methylierung von Exonen Einfluss auf die Positionierung der Nucleosomen und
somit auch auf das alternative Spleißen hat. So konnte mittels bioinfomatorischen und genomweiten
Analysen gezeigt werden, dass eine Anreicherung von 5mC und Nucleosomen auf Exons relativ zu
den Introns bevorzugt an den Grenzen der Exons stattfindet (Schwartz et al. 2009). Diese
Positionierung der Nucleosomen hat einen senkenden Effekt auf die Elongationsrate der RNA Pol II
(Schwartz et al. 2009). Die reduzierte RNA-Syntheserate ermöglicht wiederum die Benutzung von
schwachen anstatt starken Spleißseiten (Kornblihtt 2007). Somit kann die Hypothese aufgestellt
werden, dass IDH1 Mutationen zur Tumorgenese durch eine epigenetische Deregulation beitragen,
welche durch die inhibierte Demethylierung von 5mC und Histonen initiiert wird. Diese IDH1-
assozierten Veränderungen des Methylierungsmusters und der damit verbundene Einfluss auf das
alternative Spleißen könnten in der Folge zu einem veränderten Expressionsmuster der
Spleißfaktoren führen. Inwieweit es sich hierbei um verstärkende oder abschwächende Effekte in
Hinsicht auf die Tumorbiologie handelt, kann derzeit nicht abschließend entschieden werden.
Generell lässt das experimentelle Design dieser Studie (Vergleich zweier LTS-Gruppen), aber nur sehr
bedingt Aussagen über eine prognostische Bedeutung zu. Erwähnenswert in diesem Zusammenhang
scheint jedoch die Tatsache, dass unter den bei GBM LTS mit IDH1 Mutation am stärksten
hochregulierten Kandidatenproteinen mit SMARCC2 und SMCE1 auch zwei Untereinheiten des
SWI/SNF-Komplexes gefunden wurden. SWI/SNF ist in diversen Tumorentitäten ein bekannter
Tumorsuppressor (Versteege et al. 1998; Varela et al. 2011; Shain et al. 2012). Ähnlich der
positionierten Nucleosome stellt die Brm Untereinheit von SWI/SNF eine Schnittstelle zwischen
Transkription und RNA Prozessierung dar, indem sie die Elongationsrate der RNA Pol II moduliert und
dadurch die Rekrutierung der Spleißmaschinerie zu Exonen mit suboptimalen Spleißseiten erleichtern
kann (Batsche et al. 2006). Die Überexpression des Tumorsuppressors SWI/SNF könnte somit einen
Hinweis auf einen Zusammenhang zwischen dem beobachteten aberranten Spleißen und der
besseren Prognose von Patienten mit mutierter IDH1 schaffen.
5.2.2.1 Fazit
Die Ergebnisse dieser Studie bestätigen die Hypothese, dass es sich bei IDH1 mutierten Tumoren um
eine klar von nicht mutierten GBM differenzierbare Tumorgruppe handelt. In dieser Arbeit konnte
nun zum ersten Mal auch auf Proteinebene gezeigt werden, dass sich die Proteinexpressionsprofile
der beiden Tumorgruppen deutlich voneinander unterscheiden. So scheint die Mutation im IDH1
Gen, möglicherweise durch veränderte Methylierungsmuster, zu weitreichenden Veränderungen im
gesamten Spleißaparat führen. Diese Beobachtung lässt sich gut mit dem in der Literatur
beschriebenen gehäuften Auftreten tumorspezifischer Spleißisoformen übereinbringen. Die
Kapitel 5: Diskussion
94
betroffenen Proteine sind häufig in zentralen Signaltransduktionswegen integriert, so dass
weitreichende Auswirkungen auf die Tumorbiologie der Krebszelle wahrscheinlich sind.
5.2.3. Differentielle Proteomanalyse von Mausstammzellen
Obwohl viele Tumoren monoklonalen Ursprungs sind, ist ihre Zusammensetzung meist heterogen.
Dieser Umstand trifft auch in hohem Ausmaß auf Glioblastome zu. Hinsichtlich des hier untersuchten
Phänomens „Langzeitüberleben“, ist besonders eine bestimmte Subpopulation, die so genannten
Gliomstammzellen, von großem Interesse. Von verschiedenen Gruppen wurde die Hypothese
vorgeschlagen, dass diese Stammzellen in die Vermittlung von Therapieresistenzen und
Tumorprogression involviert sind (Ignatova et al. 2002; Singh et al. 2003; Galli et al. 2004). So sind sie
nicht nur in der Lage, weitere differenzierte Tumorzellen innerhalb des Tumors zu generieren,
sondern exprimieren vermutlich auch spezielle DNA-Reparatur- und Drug-Efflux-Proteine als Antwort
auf Radio- und Chemotherapie (Bao et al. 2006; Eramo et al. 2006; Liu et al. 2006). Somit könnten
Gliomstammzellen nicht nur interessante Ziele für neue Therapiestrategien sein, sondern auch ein
weiterer Aspekt, der zur Gesamtüberlebensdauer von Glioblastompatienten beiträgt.
Um einen besseren Einblick in die Tumorbiologie der potentiell resistenzvermittelnden
Gliomstammzellen zu bekommen, wurden im Rahmen dieser Arbeit vier verschiedene
Mausstammzelllinien proteomanalytisch charakterisiert. Ziel war es, ein möglichst vollständiges
Proteom der Gliomstammzellen zu erhalten sowie Unterschiede hinsichtlich möglicher
Resistenzmechanismen zwischen den verschiedenen Zelllinien zu untersuchen.
Insgesamt konnten mittels markierungsfreier Analyse 2699 Proteine quantifiziert werden. Generell
konnte beobachtet werden, dass interindividuelle Unterschiede zwischen den vier verwendeten
Zelllinien größer waren als der intraindividiuelle Unterschied innerhalb der NS- und SC-Typen
innerhalb einer Linie. Insbesondere die Zellinie GL-261 unterscheidet sich deutlich in ihrem
Proteinexpressionsprofil von den drei SMA Zelllinien (Abbildung 4.14). Im Gegensatz dazu zeigen
lichtmikroskopische Aufnahmen der verschiedenen Zelltypen durch (Ahmad et al. 2014) stärkere
morphologische Unterschiede zwischen NS und SC Zelltypen.
Kapitel 5: Diskussion
95
Abbildung 5.2: Lichtmikroskopische Aufnahmen der eingesetzten Zelllinien SMA-497, SMA-540, SMA-560 und GL-261 unter NS und SC Bedingungen. Im Vergleich zu den normalen Kulturbedingungen ist unter SC-Bedingungen eine deutliche Sphärenbildung zu beobachten (Ahmad et al. 2014).
Die detaillierte Analyse der 155 in SC differentiell hochreguliert gefunden Proteine zeigt, dass
insbesondere Prozesse, die mit dem Metabolismus von Kohlenhydraten assoziiert sind, verstärkt in
SC-Zellen exprimiert sind. Eine ähnliche Beobachtung konnten auch (Morfouace et al. 2012) machen,
die Gliomstammzellen von Ratten und neurale Stammzellen verglichen. In einer 2D-Gel basierten
Studie von (Thirant et al. 2012) wurden humane Gliomstammzellen mit Tumorgewebe verglichen.
Hier konnte ebenfalls gezeigt werden, dass sich Gliomstammzellen und Ursprungszellen in ihrem
Proteinexpressionsprofilen deutlich unterscheiden. Wie auch in der vorliegenden Arbeit wurden von
Thirant et al. (2012) Proteine des Proteasoms (PSME1 und PSME2) sowie Proteine der 14-3-3
Proteinfamilie (YWHAG) als in Gliomstammzellen hoch exprimiert beschrieben.
Darüber hinaus zeigt ein Vergleich mit Genset-Anreicherungs Analysen von Transkriptomdaten
derselben Zelllinien (siehe Abbildung 5.3), dass die SC-Zellen sowohl auf Transkriptom als auch auf
Proteinebene vermehrt Gene exprimieren, die spezifisch für Stammzellen sind (Wang 2011). Hierbei
zeigten die SMA-Zelllinien stärkere Stammzelleigenschaften als die GL-Zelllinie (Ahmad et al. 2014).
Kapitel 5: Diskussion
96
Abbildung 5.3: Genexpressionsrate und Proteinexpressionsprofil ausgewählter Stammzellmarker (Wang, 2011) in den vier untersuchten Zelllinien. Die Gensets enthalten Gene, welche differentiell hochreguliert in hESC9 sind (A, set hESC9), abundant in hESC vorkommen (B, set hESC10) sowie Myc-regulierte Ziele (C, myc2) (Ahmad et al. 2014).
GFAP, Tubulin β-3 und CNPase, die bekannte Marker für astrozytäre, neuronale und
oligodendrogliale Differenzierung sind (Reifenberger et al. 1987; Scherer et al. 1994), konnten jedoch
in dieser Studie nicht generell als differentiell exprimiert zwischen NS und SC-Bedingungen ermittelt
werden. Für GFAP und CNPase war keine Identifizierung möglich, für Tubulin β-3 wurde eine erhöhte
Expression unter SC Bedingungen beobachtet, jedoch war diese nur in der Zelllinie SMA560
signifikant.
5.2.4. Fazit
Im Rahmen dieser Studie konnte das Proteom vier verschiedener muriner Gliomstammzelllinien
sowohl unter normalen als auch unter SC-Bedingungen umfassend charakterisiert werden. Es konnte
gezeigt werden, dass trotz deutlicher morphologischer Veränderungen, die Unterschiede in der
Proteinexpression zwischen den vier verschiedenen Zelllinien größer sind als die zwischen den
Kulturbedingungen. Zudem konnte eine verstärkte Proteinexpression von spezifischen
Stammzellproteinen unter sphärenbildenden Bedingungen nachgewiesen werden.
mRNA Protein
SMA
-49
7_N
S
SMA
-54
0_N
S
SMA
-56
0 _
NS
GL-
26
1_N
S
SMA
-49
7_S
C
SMA
-54
0_S
C
SMA
-56
0_S
C
GL-
26
1_
SC
SMA
-49
7_N
S
SMA
-54
0_N
S
SMA
-56
0_N
S
GL-
26
1_N
S
SMA
-49
7_S
C
SMA
-54
0_S
C
SMA
-56
0_S
C
GL-
26
1_
SC
Gen
set
An
reic
her
un
gs-W
ert
A
B
C
Kapitel 5: Diskussion
97
5.2.5. Identifizierung von tumorassoziierten Autoantigenen des
Glioblastoms
Ein weiterer Mechanismus, der als Ursache für Langzeitüberleben bei GBM-Patienten diskutiert wird,
sind mögliche Unterschiede in der Immunogenität des Tumors. So ist zum einen bekannt, dass
Tumoren eine klassische Immunantwort auslösen, welche u.a. durch die Produktion von
Autoantikörpern gekennzeichnet ist (Soussi 2000), zum anderen aber auch in der Lage sind, eine
Immunantwort zu unterdrücken. Auch Glioblastompatienten zeigen eine unterdrückte zelluläre
Immunantwort sowohl innerhalb der Mikroumgebung des Tumors als auch die humorale Antwort
betreffend (Dix et al. 1999; Gomez und Kruse 2006; Waziri 2010). So konnte für maligne Gliome
bereits gezeigt werden, dass diese unterschiedliche Mengen tumorinfiltrierender Immunzellen
enthalten, deren Anzahl mit der Überlebenszeit der Patienten korreliert (Dunn et al. 2007). Weiterhin
konnte nachgewiesen werden, dass Glioblastome immunmodulatorische Substanzen wie PGE2, TGF-
beta2 und IL-10 sekretieren können, welche z.B. die zytotoxische Aktivität von tumorinfiltrierender
Immunzellen hemmen und zusätzlich die Zahl Lymphokin-aktivierter-Killerzellen reduzieren (Fontana
et al. 1982; Fontana et al. 1984; Castelli et al. 1989). Darüber hinaus können dennoch tumor-
spezifische T-Zellen im Kreislauf von Glioblastompatienten (Dunn et al. 2007) gefunden werden.
Bereits 1983 konnte durch Kornblith et al. gezeigt werden, dass Gliompatienten zytotoxische
Antikörper gegen ihre eigenen Tumorzellen aufweisen, wobei Glioblastompatienten die schwächste
Immunantwort innerhalb der untersuchten Gruppe von 42 Patienten aufwiesen. Darüber hinaus
wurde gezeigt, dass eine Korrelation zwischen dem Vorliegen einer Immunantwort gegen die eigenen
Tumorzellen und der Überlebensdauer vorlag (Kornblith et al. 1983). Verschiedene Faktoren werden
als Ursache für die Immunogenität von Antigenen diskutiert. So gelten Mutationen (Winter et al.
1992), alternatives Spleißen (Ng et al. 2004; Yang et al. 2006), die Expression fetaler Proteine in
adultem Gewebe (Chen et al. 1997), posttranslationale Modifikationen, Überexpression, veränderte
Apoptose und Nekrose, Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), spezifische Sequenz Motive und
veränderte zelluläre Lokalisation (Anderson und LaBaer 2005; Tan et al. 2009) als mögliche Ursache
für das Hervorrufen einer humoralen Immunantwort.
Ziel dieser Arbeit war es, durch das Erstellen von Autoantikörperprofilen von GBM Patienten
tumorspezifische immunreaktive Antigene zu identifizieren. Diese Kandidatenantigene sollen später
mit den klinischen Verläufen der Patienten korreliert werden, um Informationen zu generieren, in
wie weit der Immunstatus der Patienten als mögliche Ursache für Langzeitüberleben in Frage kommt.
Für die Erstellung der Autoantikörperprofile von Tumorpatienten wurde Plasma von Patienten kurz
nach der Diagnosestellung sowie von nicht tumorerkrankten Kontrollpersonen entnommen. Darüber
Kapitel 5: Diskussion
98
hinaus wurde zur Erstellung von Langzeit-Antikörperprofilen auch Plasma von Patienten, deren
Diagnose mindestens drei Jahre zurück lag, analysiert. Hierdurch sollten unter anderem auch erste
Hinweise erhalten werden, ob sich die Immunogenität der klinischen Entitäten LTS und STS
unterscheiden, da die Bereitstellung der Plasmaproben von LTS Patienten im Projektezeitraum nicht
vorgenommen werden konnte.
Immunreaktive Autoantigene von GBM wurden bereits in verschiedenen Arbeiten untersucht, wovon
der Großteil auf die Identifizierung von Antigenen, welche vom Tumor exprimiert werden, abzielte.
Jedoch konnte nur in wenigen dieser Arbeiten das Auftreten von Autoantikörpern gegen bestimmte
TAAs auch mit einer besseren Prognose in Korrelation gebracht werden. Lediglich Glioblastom
Patienten mit Autoantikörpern gegen GLEA1, GLEA2 und PHF3 (Fischer et al. 2001; Struss et al. 2001;
Pallasch et al. 2005) sowie bei Patienten mit niedriggradigen Gliomen gegen SH3GLB1 (Matsutani et
al. 2012) wiesen ein längeres progressionsfreies Gesamtüberleben auf.
Diese Arbeiten basieren allesamt auf SEREX als Methode zur Detektion für Autoantigene. Arbeiten,
bei denen Proteinarrays zur Detektion von Glioblastom TAAs eingesetzt wurden, existieren bisher
ebenso wenig wie ein gezielter Vergleich von Autoantikörperprofilen von LTS und STS Patienten.
Hier konnten mittels Protein Arrays 367 signifikante differentielle Signale von Autoantikörpern gegen
potentielle TAA nachgewiesen werden, wovon 107 eine hohe Prävalenz für GBM zeigen. Für diese
107 Kandidatenautoantigene wurde untersucht, ob eine Anreicherung bestimmter biologischer
Prozesse, Strukturmotive und zellulärer Lokalisationen vorliegt. Diese detaillierte Analyse ergab, dass
innerhalb der Kandidaten zinkbindende Proteine signifikant angereichert sind. Auffällig ist, dass es
sich auch bei den drei bereits publizierten TAAs GLEA1, GLEA 2 und PHF3, welche mit einer besseren
Prognose von GBM Patienten in Verbindung gebracht werden können, ebenfalls um
Zinkfingerproteine handelt. Backes et al. (2011) konnten durch Metaanalysen zeigen, dass
sequenzbasierte Eigenschaften wie coiled-coil Motive, ELR Motive aber auch Zinkfinger Motive sehr
häufig bei bereits bekannten TAA anzutreffen sind. Für einige dieser Eigenschaften, z.B. coiled-coil
Domänen oder Granzym B Schnittstellen, gibt es Theorien, nach denen sie für eine erhöhte
Immunogenität von Autoantigenen verantwortlich sein könnten (Dohlman et al. 1993; Niland et al.
2010). So wird davon ausgegangen, dass coiled-coil Strukturen eine größere Oberfläche aufweisen
und dadurch mehr Ladung präsentieren können, was die Erkennung durch einen Antikörper
erleichtert (Dohlman et al. 1993). Zinkfingerproteine existieren in vielen strukturellen Varianten und
können ebenso viele unterschiedliche Funktionen übernehmen. Besonders häufig sind sie in die
Bindung von DNA und RNA oder die Vermittlung von Protein-Protein Interaktionen involviert (Klug
1999; Hall 2005; Gamsjaeger et al. 2007). In dieser Arbeit konnte ebenfalls ein nicht unerheblicher
Kapitel 5: Diskussion
99
Teil der zinkbindenden Proteine als Transkriptionsfaktoren eingeordnet werden. Ähnliche
Beobachtungen wurden ebenfalls von Backes et al. (2011) gemacht, in der im Rahmen einer in-silico
Studie bekannte Autoantigene hinsichtlich häufig auftretender struktureller und funktioneller
Eigenschaften untersucht wurden. Möglicherweise fungieren auch hier die polaren Bereiche, die für
die Nukleinsäure-Interaktion notwendig sind, als besonders geeignete Epitope. Für die weitere
Validierung wurde sich auf die TAAs fokussiert, die eine hohe Prävalenz in GBM Patienten aufwiesen.
Die höchste Spezifität für den Tumor unter allen detektierten Proteinen hatte das zinkbindende four
and a half LIM domain protein 1 (FHL1). Für FHL1 konnte kürzlich gezeigt werden, dass es, neben
seiner Rolle im skelettalen und kardialen Muskelwachstum (McGrath et al. 2003), ebenfalls in die
Karzinogenese involviert ist und als Tumorsuppressor fungiert. Durch Shen et al. (2006) konnte
gezeigt werden, dass FHL1 in Mäusen abwärts von SRC und CAS das Krebszellwachstum und die
Migration blockiert. Damit übereinstimmend ist die Expression von FHL1 in vielen Tumorentitäten
wie z.B. Lungenkrebs (Niu et al. 2012), Brustkrebs (Ding et al. 2011) oder auch Blasenkrebs
(Matsumoto et al. 2010), herunterreguliert. Der Vergleich mit Expressionsdaten aus dem
Proteomexperiment ergab, dass FHL1 zu den abundantesten 12 % der Proteine gehört, laut dem
Human Proteinatlas wird es aber im Gewebe des zentralen Nervensystems kaum exprimiert (Uhlen
et al. 2010). Ein weiteres Protein aus der Familie der FHL-Proteine, FHL3, zeigte ebenfalls eine
deutlich erhöhte Immunantwort in den Tumorpatienten. Dem Proteinatlas zufolge wird FHL3
allerdings nur in etwa 18% der analysierten Gliome exprimiert und ließ sich auch im Rahmen dieser
Arbeit nicht auf Proteomebene nachweisen (Uhlen et al. 2010).
In diesem Zusammenhang konnte in dieser Arbeit durch den Vergleich von Proteom- und
Transkriptomdaten gezeigt werden, dass das Auftreten der potentiellen Autoantikörper generell
nicht direkt von der Konzentration des jeweiligen Antigens bzw. dessen mRNA-Level abhängt. Zudem
konnte im Gegensatz zu einer Arbeit von Backes et al. (2011), in der gezeigt wurde, dass es sich bei
Antigenen vorwiegend um sekretierte oder extrazellulär lokalisierte Proteine handelt, die
vorwiegend in Signalwegen des Immunsystems involviert sind, in dieser Arbeit keine Anreicherung
innerhalb der potentiellen TAAs hinsichtlich einer zellulären Lokalisation detektiert werden.
Dass TAAs eine wichtige Rolle innerhalb der Tumorbiologie spielen, ist eine häufige Beobachtung.
Durch Taylor et al. (2008) wurde kürzlich vorgeschlagen, dass Autoantikörper-Signaturen genutzt
werden könnten um Hinweise auf deregulierte Signalwege in Tumoren zu bekommen. So wird eine
humorale Immunantwort, z.B. in Prostatakarzinomen, häufig durch im Tumor überexprimierte oder
modifizierte Antigene hervorgerufen (McNeel et al. 2000; Sreekumar et al. 2004).
Kapitel 5: Diskussion
100
Auch in dieser Arbeit fanden sich unter den potentiell tumorassoziierten Antigenen weitere Proteine,
welche bekannten tumorbiologischen Prozessen zugeordnet werden. So zeigt z.B. ERBB2 (Her2neu)
ein Mitglied der EGFR/ErbB Familie eine signifikante Prävalenz für STS Patienten. Es handelt sich bei
ERBB2 um eine Plasmamembran-gebundene Rezeptor-Tyrosinkinase, welche in verschiedenen
Rezeptorkomplexen der Zelloberfläche assembliert ist und so eine wichtige Rolle in verschiedenen
Signalwegen wie z.B. dem MAP-Kinase-, dem Phosphoinositid 3-Kinase- (PI3K/Akt) oder dem STAT-
Signalweg (Grant et al. 2002) einnimmt. Eine Überexpression von ERBB2 konnte für diverse Tumore,
wie z.B. Brustkrebs, oder papilläre urotheliale Karzinome gezeigt werden und korreliert häufig mit
einer schlechten Prognose (Bitran et al. 1996; Schneider et al. 2014). Erhöhte Expression von ERBB2
bzw. c-ERBB2 konnte auch in Astrozytomen gezeigt werden und wird auch hier mit einer
schlechteren Prognose für die Patienten in Verbindung gebracht (Shiras et al. 2003; Gulati et al.
2010; Fang et al. 2012). Mit ERBB1 zeigte darüber hinaus ein weiteres Protein der EGF Rezeptor-
Familie eine differentielle Antwort. Die Amplifikation des EGFR Gens gehört zu den häufigsten
genetischen Aberrationen in Glioblastomen (Ekstrand et al. 1991) und tritt häufig zusammen mit der
Expression des mutierten EGFRvIII Gens auf (Wikstrand et al. 1997). Diese Variante weist durch die
Deletion der Exone 2-7 eine trunkierte extrazelluläre Domäne auf und zeigt eine liganden-
unabhängige konstitutive Aktivität auf (Ekstrand et al. 1994). Man geht davon aus, dass sowohl
ERBB2 als auch EGFR entscheidende Rollen bei der Gliomgenese spielen (Fang et al. 2012). Die
Inaktivierung von ERBB2 durch therapeutische Antikörper (Trastuzumab) ist nicht nur eine gängige
Immuntherapie im Kampf gegen Brustkrebs, auch konnten bereits Autoantikörper gegen ERBB2 im
Blut von Brustkrebspatientinnen detektiert werden (Disis et al. 1994; Lu et al. 2008).
Der Vergleich mit den Autoantikörperprofilen von Patienten, bei denen die Tumorerkrankung bereits
mindestens zwei Jahre zurückliegt, ergab, dass rund 40% der tumorassoziierten Autoantigene,
darunter auch die für die Validierung ausgewählten Kandidaten FHL1, FHL2, ERBB2 und EGFR, von
neu diagnostizierten GBM Patienten auch im Plasma von LTS nach mehr als drei Jahren noch
differentiell im Plasma gegenüber der Kontrollgruppe nachzuweisen sind. Vergleichbare Arbeiten, die
gezielt Antikörpertiter gegen bekannte TAAs in Langzeitstudien untersuchten, existieren zum
momentanen Zeitpunkt noch nicht. Nichtsdestotrotz schließt diese Arbeit die Möglichkeit mit ein,
dass erhöhte Antikörpertiter gegen Tumorantigene einen positiven Einfluss auf den Krankheitsverlauf
haben und so das Entstehen von Rezidiven verzögern.
Bereits bekannte Gliom TAAs wie z.B. GFAP, Calnexin (Schmits et al. 2002), bekannte C-T Antigene
wie z.B. MAGE (van der Bruggen et al. 1991) oder mutierte Varianten von p53 (Winter et al. 1992)
konnten hier nicht detektiert werden, da sie auf dem Proteinarray nicht vorhanden waren. Auch eine
Bestätigung der bereits bekannten TAAs GLEA 1 und 2 sowie PHF3 konnte aus diesem Grund nicht
Kapitel 5: Diskussion
101
vorgenommen werden. Darüber hinaus gibt es Theorien, nach denen insbesondere tumorspezifische
Spleißvarianten eine erhöhte Immunogenität besitzen (Yang et al. 2006). So wurde durch Ng et al.
(2004) ein Mechanismus vorgeschlagen, bei dem alternatives Spleißen die strukturelle Basis liefert,
die bei verschiedenen Tumoren zu immunreaktiven Proteinisoformen führt (Ng et al. 2004).
Allerdings konnte eine potentiell erhöhte Immunogenität von Spleißisoformen im Rahmen dieser
Methode nicht adressiert werden, da auf dem Array nur in seltenen Fällen unterschiedliche
Isoformen, häufig sogar nur kurze Teilsequenzen, eines Proteins aufgebracht sind. Dennoch liefert
diese Theorie eine mögliche Erklärung zwischen den Beobachtungen aus der gewebebasierten Studie
von IDH1 mutierten und wt Glioblastomen und den vermuteten protektiven Eigenschaften von
Autoantikörpern bei Glioblastompatienten. So könnte die hier nachgewiesene Überrepräsentation
von mit Spleißen assoziierten Proteinen ein gehäuftes Vorkommen von Spleißisoformen zur Folge
haben, was, ausgelöst durch deren erhöhte Immunogenität, wiederum in einer stärkeren Antwort
des körpereigenen Immunsystems resultiert.
5.2.6. Fazit
Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die erstellten Antikörperprofile Unterscheide
sowohl zwischen neu diagnostizierten als auch progressionsfreien Glioblastompatienten und nicht
tumorerkrankten Kontrollen aufweisen. Innerhalb der Gruppe der immunreaktiven Antigene war
keine Abundanzabhängigkeit, wohl aber eine Anreicherung von zinkbindenden Motiven zu
beobachten. Darüber hinaus zeigte sich, dass eine Immunantwort häufig durch Proteine ausgelöst
wird, die tumorbiologisch relevant sind.
Kapitel 5: Diskussion
102
5.2.7. Ausblick
Mithilfe der Proteomanalyse und anschließender eingehender bioinformatorischer Analyse ist es
gelungen, einen tieferen Einblick in die molekularen Prozesse beim Langzeitüberleben des
Glioblastoms zu erhalten. Diese im Zusammenhang mit dem Langzeitüberleben bei
Glioblastompatienten unbekannten Prozesse sollen in weiteren Experimenten untersucht werden.
Hierbei ist zu beachten, dass für die funktionelle Validierung überwiegend auf Patientenmaterial,
welches zum jetzigen Zeitpunkt der Arbeit nicht in ausreichender Anzahl und Menge zur Verfügung
steht, zurückgegriffen werden muss. Entsprechende in vitro Modelle des Langzeitüberlebens stehen
nicht zur Verfügung. Dies gilt ebenfalls für die Untersuchung vor dem Hintergrund der IDH1
Mutation. Auch hier stehen keine in vitro Modelle zur Verfügung (Piaskowski et al. 2011). Um die
identifizierten Prozesse zu validieren, kommen folgende Experimente in Frage.
Für die Validierung der in STSwt hochregulierten mitochondrialen Proteine kommen
immunhistochemische Experimente in Frage. Hierbei steht der Fokus u.a. auf der Untersuchung der
hier aufgestellten Hypothese einer erhöhten Konzentration des Coenzyms NADPH in Tumoren von
STS Patienten im Vergleich zu LTS Patienten an einem unabhängigen Gewebekollektiv. Weiterhin
können auch die hier postulierten, erhöhten ROS-Konzentrationen im Rahmen weiterer
proteomanalytischer Analysen, z.B. durch den massenspektrometrischen Nachweis von
Tyrosinnitrierung, untersucht werden (Hemnani und Parihar 1998).
Die Beobachtung der vermehrt auftretenden RNA-bindenden Proteine und hier insbesondere die
Spleißfaktoren in IDH1-mutierten Glioblastomproben kann ebenfalls durch einen
massenspektrometriebasierten Ansatz untersucht werden. Ausgehend von den zur Verfügung
stehenden MS-Daten können Proteindatenbanken, welche zusätzliche Informationen über
Spleißvarianten enthalten, durchsucht werden. Hierbei können neben der Identifizierung von
Spleißvarianten auch mögliche quantitative Unterschiede zwischen den zwei Patientengruppen (IDH1
wt und IDH1 mut) detektiert werden. Veränderte Spleißvarianten könnten dann weitere
Informationen zum Verständnis der Tumorbiologie des Glioblastoms und ferner eine mögliche
Erklärungen für Immunreaktionen gegen einige der in dieser Arbeit detektierten tumorspezifische
Antigene liefern. Deren prognostische Relevanz ließe sich mit einem glioblastomspezifischen
Proteinarrays überprüfen, der für die Untersuchung der mittlerweile rund 1000 Plasmaproben
innerhalb des Deutschen Gliomnetzes einsetzbar wäre. Hierbei könnte dann ganz gezielt der
Vergleich von Autoantikörperprofilen neu diagnostizierter Patienten, deren progressionsfreies
Gesamtüberleben bei über drei Jahren lag, mit Profilen von Patienten, die innerhalb des ersten
Jahres nach der initialen Blutabnahme verstarben, durchgeführt werden. Die Entnahme von Plasma
Kapitel 5: Diskussion
103
zu mehreren Zeitpunkten, bei den in die Studie eingeschlossenen Patienten erlaubt zudem
Konzentrationen von Autoantikörpern gegen hier ermittelte Kandidatenautoantigene im Plasma von
GBM Patienten über längere Zeiträume hinweg zu untersuchen. Diese Verlaufsdaten wären
besonders unter dem Aspekt der klinischen Anwendung relevant, da eine Eignung eines oder
mehrerer Autoantikörper als Biomarker für die Frühdiagnose von Glioblastomen bzw. Therapie
unterstützend als Verlaufskontrolle denkbar wäre.
Diese Arbeit legt somit die Grundlage für eine Vielzahl von weiteren Studien zur Aufklärung der
molekularen Prozesse beim Langzeitüberleben von Glioblastompatienten.
Kapitel 6: Literatur
104
6. Literatur
Ahlf, D. R., P. D. Compton, et al. (2012). "Evaluation of the compact high-field orbitrap for top-down
proteomics of human cells." J Proteome Res 11(8): 4308-4314. Ahmad, M., K. Frei, et al. (2014). "How Stemlike Are Sphere Cultures From Long-term Cancer Cell
Lines? Lessons From Mouse Glioma Models." J Neuropathol Exp Neurol 73(11): 1062-1077. Al-Hajj, M., M. S. Wicha, et al. (2003). "Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells."
Proc Natl Acad Sci U S A 100(7): 3983-3988. Altschul, S. F., T. L. Madden, et al. (1997). "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein
database search programs." Nucleic Acids Res 25(17): 3389-3402. Altschul, S. F., J. C. Wootton, et al. (2005). "Protein database searches using compositionally adjusted
substitution matrices." FEBS J 272(20): 5101-5109. Anderson, K. S. and J. LaBaer (2005). "The sentinel within: exploiting the immune system for cancer
biomarkers." J Proteome Res 4(4): 1123-1133. Anderson, L. and C. L. Hunter (2006). "Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring
assays for major plasma proteins." Mol Cell Proteomics 5(4): 573-588. Anderson, N. G. and N. L. Anderson (1996). "Twenty years of two-dimensional electrophoresis: past,
present and future." Electrophoresis 17(3): 443-453. Anderson, N. L. and N. G. Anderson (2002). "The human plasma proteome: history, character, and
diagnostic prospects." Mol Cell Proteomics 1(11): 845-867. Apweiler, R., C. Aslanidis, et al. (2009). "Approaching clinical proteomics: current state and future
fields of application in cellular proteomics." Cytometry A 75(10): 816-832. Ausman, J. I., W. R. Shapiro, et al. (1970). "Studies on the chemotherapy of experimental brain
tumors: development of an experimental model." Cancer Res 30(9): 2394-2400. Backes, C., N. Ludwig, et al. (2011). "Immunogenicity of autoantigens." BMC Genomics 12: 340. Bailey, P. and H. Cushing (1926). "Tumors of the Glioma Group " JB Lippincott Balss, J., J. Meyer, et al. (2008). "Analysis of the IDH1 codon 132 mutation in brain tumors." Acta
Neuropathol 116(6): 597-602. Bao, S., Q. Wu, et al. (2006). "Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of
the DNA damage response." Nature 444(7120): 756-760. Barbus, S., B. Tews, et al. (2011). "Differential retinoic acid signaling in tumors of long- and short-
term glioblastoma survivors." J Natl Cancer Inst 103(7): 598-606. Batsche, E., M. Yaniv, et al. (2006). "The human SWI/SNF subunit Brm is a regulator of alternative
splicing." Nat Struct Mol Biol 13(1): 22-29. Ben-Mahrez, K., I. Sorokine, et al. (1990). "Circulating antibodies against c-myc oncogene product in
sera of colorectal cancer patients." Int J Cancer 46(1): 35-38. Beroukhim, R., G. Getz, et al. (2007). "Assessing the significance of chromosomal aberrations in
cancer: methodology and application to glioma." Proc Natl Acad Sci U S A 104(50): 20007-20012.
Biamonti, G., M. Catillo, et al. (2014). "The alternative splicing side of cancer." Semin Cell Dev Biol 32: 30-36.
Bielli, P., R. Busa, et al. (2011). "The RNA-binding protein Sam68 is a multifunctional player in human cancer." Endocr Relat Cancer 18(4): R91-R102.
Bitran, J. D., B. Samuels, et al. (1996). "Her2/neu overexpression is associated with treatment failure in women with high-risk stage II and stage IIIA breast cancer (>10 involved lymph nodes) treated with high-dose chemotherapy and autologous hematopoietic progenitor cell support following standard-dose adjuvant chemotherapy." Clin Cancer Res 2(9): 1509-1513.
Boker, D. K., R. Kalff, et al. (1984). "Mononuclear infiltrates in human intracranial tumors as a prognostic factor. Influence of preoperative steroid treatment. I. Glioblastoma." Clin Neuropathol 3(4): 143-147.
Kapitel 6: Literatur
105
Bomsztyk, K., O. Denisenko, et al. (2004). "hnRNP K: one protein multiple processes." Bioessays 26(6): 629-638.
Boutell, J. M., D. J. Hart, et al. (2004). "Functional protein microarrays for parallel characterisation of p53 mutants." Proteomics 4(7): 1950-1958.
Braganza, M. Z., C. M. Kitahara, et al. (2012). "Ionizing radiation and the risk of brain and central nervous system tumors: a systematic review." Neuro Oncol 14(11): 1316-1324.
Brass, N., D. Heckel, et al. (1997). "Translation initiation factor eIF-4gamma is encoded by an amplified gene and induces an immune response in squamous cell lung carcinoma." Hum Mol Genet 6(1): 33-39.
Brooks, W. H., W. R. Markesbery, et al. (1978). "Relationship of lymphocyte invasion and survival of brain tumor patients." Ann Neurol 4(3): 219-224.
Brown, R. L., L. M. Reinke, et al. (2011). "CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression." J Clin Invest 121(3): 1064-1074.
Bulik, M., R. Jancalek, et al. (2013). "Potential of MR spectroscopy for assessment of glioma grading." Clin Neurol Neurosurg 115(2): 146-153.
Cairncross, G., B. Berkey, et al. (2006). "Phase III trial of chemotherapy plus radiotherapy compared with radiotherapy alone for pure and mixed anaplastic oligodendroglioma: Intergroup Radiation Therapy Oncology Group Trial 9402." J Clin Oncol 24(18): 2707-2714.
Cairns, R. A. and T. W. Mak (2013). "Oncogenic isocitrate dehydrogenase mutations: mechanisms, models, and clinical opportunities." Cancer Discov 3(7): 730-741.
Camacho-Vanegas, O., G. Narla, et al. (2007). "Functional inactivation of the KLF6 tumor suppressor gene by loss of heterozygosity and increased alternative splicing in glioblastoma." Int J Cancer 121(6): 1390-1395.
Carracedo, A., L. C. Cantley, et al. (2013). "Cancer metabolism: fatty acid oxidation in the limelight." Nat Rev Cancer 13(4): 227-232.
Castelli, M. G., C. Chiabrando, et al. (1989). "Prostaglandin and thromboxane synthesis by human intracranial tumors." Cancer Res 49(6): 1505-1508.
Catherman, A. D., K. R. Durbin, et al. (2013). "Large-scale top-down proteomics of the human proteome: membrane proteins, mitochondria, and senescence." Mol Cell Proteomics 12(12): 3465-3473.
Cha, S., M. B. Imielinski, et al. (2010). "In situ proteomic analysis of human breast cancer epithelial cells using laser capture microdissection: annotation by protein set enrichment analysis and gene ontology." Mol Cell Proteomics 9(11): 2529-2544.
Chen, Y. T., M. J. Scanlan, et al. (1997). "A testicular antigen aberrantly expressed in human cancers detected by autologous antibody screening." Proc Natl Acad Sci U S A 94(5): 1914-1918.
Cheung, H. C., K. A. Baggerly, et al. (2008). "Global analysis of aberrant pre-mRNA splicing in glioblastoma using exon expression arrays." BMC Genomics 9: 216.
Cheung, H. C., T. Hai, et al. (2009). "Splicing factors PTBP1 and PTBP2 promote proliferation and migration of glioma cell lines." Brain 132(Pt 8): 2277-2288.
Chiarugi, A., C. Dolle, et al. (2012). "The NAD metabolome--a key determinant of cancer cell biology." Nat Rev Cancer 12(11): 741-752.
Christofk, H. R., M. G. Vander Heiden, et al. (2008). "The M2 splice isoform of pyruvate kinase is important for cancer metabolism and tumour growth." Nature 452(7184): 230-233.
Chunduru, S., H. Kawami, et al. (2002). "Identification of an alternatively spliced RNA for the Ras suppressor RSU-1 in human gliomas." J Neurooncol 60(3): 201-211.
Clower, C. V., D. Chatterjee, et al. (2010). "The alternative splicing repressors hnRNP A1/A2 and PTB influence pyruvate kinase isoform expression and cell metabolism." Proc Natl Acad Sci U S A 107(5): 1894-1899.
Curran, W. J., Jr., C. B. Scott, et al. (1993). "Recursive partitioning analysis of prognostic factors in three Radiation Therapy Oncology Group malignant glioma trials." J Natl Cancer Inst 85(9): 704-710.
Kapitel 6: Literatur
106
Dang, L., D. W. White, et al. (2009). "Cancer-associated IDH1 mutations produce 2-hydroxyglutarate." Nature 462(7274): 739-744.
David, C. J., M. Chen, et al. (2010). "HnRNP proteins controlled by c-Myc deregulate pyruvate kinase mRNA splicing in cancer." Nature 463(7279): 364-368.
DeAngelis, L. M. (2001). "Brain tumors." N Engl J Med 344(2): 114-123. DeBerardinis, R. J., J. J. Lum, et al. (2008). "The biology of cancer: metabolic reprogramming fuels cell
growth and proliferation." Cell Metab 7(1): 11-20. Ding, L., C. Niu, et al. (2011). "FHL1 interacts with oestrogen receptors and regulates breast cancer
cell growth." J Cell Mol Med 15(1): 72-85. Disis, M. L., E. Calenoff, et al. (1994). "Existent T-cell and antibody immunity to HER-2/neu protein in
patients with breast cancer." Cancer Res 54(1): 16-20. Dix, A. R., W. H. Brooks, et al. (1999). "Immune defects observed in patients with primary malignant
brain tumors." J Neuroimmunol 100(1-2): 216-232. Dohlman, J. G., A. Lupas, et al. (1993). "Long charge-rich alpha-helices in systemic autoantigens."
Biochem Biophys Res Commun 195(2): 686-696. Dolecek, T. A., J. M. Propp, et al. (2012). "CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous
system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009." Neuro Oncol 14 Suppl 5: v1-49. Dunn, G. P., I. F. Dunn, et al. (2007). "Focus on TILs: Prognostic significance of tumor infiltrating
lymphocytes in human glioma." Cancer Immun 7: 12. Ekstrand, A. J., C. D. James, et al. (1991). "Genes for epidermal growth factor receptor, transforming
growth factor alpha, and epidermal growth factor and their expression in human gliomas in vivo." Cancer Res 51(8): 2164-2172.
Ekstrand, A. J., N. Longo, et al. (1994). "Functional characterization of an EGF receptor with a truncated extracellular domain expressed in glioblastomas with EGFR gene amplification." Oncogene 9(8): 2313-2320.
Eramo, A., L. Ricci-Vitiani, et al. (2006). "Chemotherapy resistance of glioblastoma stem cells." Cell Death Differ 13(7): 1238-1241.
Fang, X., C. Wang, et al. (2012). "Targeted tissue proteomic analysis of human astrocytomas." J Proteome Res 11(8): 3937-3946.
Feldkamp, M. M., P. Lala, et al. (1999). "Expression of activated epidermal growth factor receptors, Ras-guanosine triphosphate, and mitogen-activated protein kinase in human glioblastoma multiforme specimens." Neurosurgery 45(6): 1442-1453.
Figueroa, M. E., O. Abdel-Wahab, et al. (2010). "Leukemic IDH1 and IDH2 mutations result in a hypermethylation phenotype, disrupt TET2 function, and impair hematopoietic differentiation." Cancer Cell 18(6): 553-567.
Fischer, U., A. K. Struss, et al. (2001). "Glioma-expressed antigen 2 (GLEA2): a novel protein that can elicit immune responses in glioblastoma patients and some controls." Clin Exp Immunol 126(2): 206-213.
Fontana, A., H. Hengartner, et al. (1984). "Glioblastoma cells release interleukin 1 and factors inhibiting interleukin 2-mediated effects." J Immunol 132(4): 1837-1844.
Fontana, A., F. Kristensen, et al. (1982). "Production of prostaglandin E and an interleukin-1 like factor by cultured astrocytes and C6 glioma cells." J Immunol 129(6): 2413-2419.
Freije, W. A., F. E. Castro-Vargas, et al. (2004). "Gene expression profiling of gliomas strongly predicts survival." Cancer Res 64(18): 6503-6510.
Furnari, F. B., T. Fenton, et al. (2007). "Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment." Genes Dev 21(21): 2683-2710.
Galanis, E., J. Buckner, et al. (1998). "Gene amplification as a prognostic factor in primary and secondary high-grade malignant gliomas." Int J Oncol 13(4): 717-724.
Galli, R., E. Binda, et al. (2004). "Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma." Cancer Res 64(19): 7011-7021.
Gamsjaeger, R., C. K. Liew, et al. (2007). "Sticky fingers: zinc-fingers as protein-recognition motifs." Trends Biochem Sci 32(2): 63-70.
Kapitel 6: Literatur
107
Gay, D., T. Saunders, et al. (1993). "Receptor editing: an approach by autoreactive B cells to escape tolerance." J Exp Med 177(4): 999-1008.
Geiger, T., J. Cox, et al. (2010). "Super-SILAC mix for quantitative proteomics of human tumor tissue." Nat Methods 7(5): 383-385.
Geisbrecht, B. V. and S. J. Gould (1999). "The human PICD gene encodes a cytoplasmic and peroxisomal NADP(+)-dependent isocitrate dehydrogenase." J Biol Chem 274(43): 30527-30533.
Ghigna, C., C. Valacca, et al. (2008). "Alternative splicing and tumor progression." Curr Genomics 9(8): 556-570.
Giard, D. J., S. A. Aaronson, et al. (1973). "In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors." J Natl Cancer Inst 51(5): 1417-1423.
Gilbert, M. R., Y. Liu, et al. (2014). "Autophagy and oxidative stress in gliomas with IDH1 mutations." Acta Neuropathol 127(2): 221-233.
Gires, O., M. Munz, et al. (2004). "Profile identification of disease-associated humoral antigens using AMIDA, a novel proteomics-based technology." Cell Mol Life Sci 61(10): 1198-1207.
Gomez, G. G. and C. A. Kruse (2006). "Mechanisms of malignant glioma immune resistance and sources of immunosuppression." Gene Ther Mol Biol 10(A): 133-146.
Grant, S., L. Qiao, et al. (2002). "Roles of ERBB family receptor tyrosine kinases, and downstream signaling pathways, in the control of cell growth and survival." Front Biosci 7: d376-389.
Grzendowski, M., M. J. Riemenschneider, et al. (2009). "Simultaneous extraction of nucleic acids and proteins from tissue specimens by ultracentrifugation: A protocol using the high-salt protein fraction for quantitative proteome analysis." Proteomics 9(21): 4985-4990.
Guha, A., M. M. Feldkamp, et al. (1997). "Proliferation of human malignant astrocytomas is dependent on Ras activation." Oncogene 15(23): 2755-2765.
Gulati, S., B. Ytterhus, et al. (2010). "Overexpression of c-erbB2 is a negative prognostic factor in anaplastic astrocytomas." Diagn Pathol 5: 18.
Gygi, S. P., Y. Rochon, et al. (1999). "Correlation between protein and mRNA abundance in yeast." Mol Cell Biol 19(3): 1720-1730.
Hall, T. M. (2005). "Multiple modes of RNA recognition by zinc finger proteins." Curr Opin Struct Biol 15(3): 367-373.
Hamilton, S. R., B. Liu, et al. (1995). "The molecular basis of Turcot's syndrome." N Engl J Med 332(13): 839-847.
Hanahan, D. and R. A. Weinberg (2011). "Hallmarks of cancer: the next generation." Cell 144(5): 646-674.
Hartmann, C., B. Hentschel, et al. (2013). "Long-term survival in primary glioblastoma with versus without isocitrate dehydrogenase mutations." Clin Cancer Res 19(18): 5146-5157.
He, Q. Y. and J. F. Chiu (2003). "Proteomics in biomarker discovery and drug development." J Cell Biochem 89(5): 868-886.
Hegi, M. E., A. C. Diserens, et al. (2005). "MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma." N Engl J Med 352(10): 997-1003.
Heimberger, A. B., R. Hlatky, et al. (2005). "Prognostic effect of epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma multiforme patients." Clin Cancer Res 11(4): 1462-1466.
Hemnani, T. and M. S. Parihar (1998). "Reactive oxygen species and oxidative DNA damage." Indian J Physiol Pharmacol 42(4): 440-452.
Heukeshoven, J. and R. Dernick (1988). "Improved silver staining procedure for fast staining in PhastSystem Development Unit. I. Staining of sodium dodecyl sulfate gels." Electrophoresis 9(1): 28-32.
Hitosugi, T., L. Zhou, et al. (2012). "Phosphoglycerate mutase 1 coordinates glycolysis and biosynthesis to promote tumor growth." Cancer Cell 22(5): 585-600.
Holmgren, A. (1977). "Bovine thioredoxin system. Purification of thioredoxin reductase from calf liver and thymus and studies of its function in disulfide reduction." J Biol Chem 252(13): 4600-4606.
Kapitel 6: Literatur
108
Hope, N. R. and G. I. Murray (2011). "The expression profile of RNA-binding proteins in primary and metastatic colorectal cancer: relationship of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins with prognosis." Hum Pathol 42(3): 393-402.
Houillier, C., J. Lejeune, et al. (2006). "Prognostic impact of molecular markers in a series of 220 primary glioblastomas." Cancer 106(10): 2218-2223.
Hsu, P. P. and D. M. Sabatini (2008). "Cancer cell metabolism: Warburg and beyond." Cell 134(5): 703-707.
Huang da, W., B. T. Sherman, et al. (2009a). "Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists." Nucleic Acids Res 37(1): 1-13.
Huang da, W., B. T. Sherman, et al. (2009b). "Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources." Nat Protoc 4(1): 44-57.
Ichimura, K. (2012). "Molecular pathogenesis of IDH mutations in gliomas." Brain Tumor Pathol 29(3): 131-139.
Ignatova, T. N., V. G. Kukekov, et al. (2002). "Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro." Glia 39(3): 193-206.
Ijsselstijn, L., M. P. Stoop, et al. (2013). "Comparative study of targeted and label-free mass spectrometry methods for protein quantification." J Proteome Res 12(4): 2005-2011.
Ino, Y., M. C. Zlatescu, et al. (2000). "Long survival and therapeutic responses in patients with histologically disparate high-grade gliomas demonstrating chromosome 1p loss." J Neurosurg 92(6): 983-990.
Inskip, P. D., R. E. Tarone, et al. (2001). "Cellular-telephone use and brain tumors." N Engl J Med 344(2): 79-86.
Jeon, S. M., N. S. Chandel, et al. (2012). "AMPK regulates NADPH homeostasis to promote tumour cell survival during energy stress." Nature 485(7400): 661-665.
Johannessen, T. C. and R. Bjerkvig (2012). "Molecular mechanisms of temozolomide resistance in glioblastoma multiforme." Expert Rev Anticancer Ther 12(5): 635-642.
Johnson, D. R. and B. P. O'Neill (2012). "Glioblastoma survival in the United States before and during the temozolomide era." J Neurooncol 107(2): 359-364.
Kaatsch, P., C. Spix, et al. (2013). Krebs in Deutschland 2009/2010, Robert Koch-Institut und die Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V. (Hrsg).
Karni, R., E. de Stanchina, et al. (2007). "The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene." Nat Struct Mol Biol 14(3): 185-193.
Keller, B. O., J. Sui, et al. (2008). "Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry." Anal Chim Acta 627(1): 71-81.
Kinloch, A. J., A. Chang, et al. (2014). "Vimentin is a dominant target of in situ humoral immunity in human lupus tubulointerstitial nephritis." Arthritis Rheumatol 66(12): 3359-3370.
Klade, C. S., T. Voss, et al. (2001). "Identification of tumor antigens in renal cell carcinoma by serological proteome analysis." Proteomics 1(7): 890-898.
Kleihues, P., B. Schauble, et al. (1997). "Tumors associated with p53 germline mutations: a synopsis of 91 families." Am J Pathol 150(1): 1-13.
Klose, J. and U. Kobalz (1995). "Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome." Electrophoresis 16(6): 1034-1059.
Klug, A. (1999). "Zinc finger peptides for the regulation of gene expression." J Mol Biol 293(2): 215-218.
Kornblihtt, A. R. (2007). "Coupling transcription and alternative splicing." Adv Exp Med Biol 623: 175-189.
Kornblith, P. L., H. B. Coakham, et al. (1983). "Autologous serologic responses in glioma patients. Correlation with tumor grade and survival." Cancer 52(12): 2230-2235.
Krex, D., B. Klink, et al. (2007). "Long-term survival with glioblastoma multiforme." Brain 130(Pt 10): 2596-2606.
Kumble, K. D. (2003). "Protein microarrays: new tools for pharmaceutical development." Anal Bioanal Chem 377(5): 812-819.
Kapitel 6: Literatur
109
Lai, X., L. Wang, et al. (2011). "A novel alignment method and multiple filters for exclusion of unqualified peptides to enhance label-free quantification using peptide intensity in LC-MS/MS." J Proteome Res 10(10): 4799-4812.
Lalive, P. H., T. Menge, et al. (2006). "Identification of new serum autoantibodies in neuromyelitis optica using protein microarrays." Neurology 67(1): 176-177.
Lapidot, T., C. Sirard, et al. (1994). "A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice." Nature 367(6464): 645-648.
Lathia, J. D., J. Gallagher, et al. (2010). "Integrin alpha 6 regulates glioblastoma stem cells." Cell Stem Cell 6(5): 421-432.
Le Roux, S., A. Devys, et al. (2010). "Biomarkers for the diagnosis of the stable kidney transplant and chronic transplant injury using the ProtoArray(R) technology." Transplant Proc 42(9): 3475-3481.
Lee, M., M. Wrensch, et al. (1997). "Dietary and tobacco risk factors for adult onset glioma in the San Francisco Bay Area (California, USA)." Cancer Causes Control 8(1): 13-24.
Lee, S. M., H. J. Koh, et al. (2002). "Cytosolic NADP(+)-dependent isocitrate dehydrogenase status modulates oxidative damage to cells." Free Radic Biol Med 32(11): 1185-1196.
Lefave, C. V., M. Squatrito, et al. (2011). "Splicing factor hnRNPH drives an oncogenic splicing switch in gliomas." EMBO J 30(19): 4084-4097.
Lennon, V. A., D. M. Wingerchuk, et al. (2004). "A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica: distinction from multiple sclerosis." Lancet 364(9451): 2106-2112.
Lewis, T. S., J. B. Hunt, et al. (2000). "Identification of novel MAP kinase pathway signaling targets by functional proteomics and mass spectrometry." Mol Cell 6(6): 1343-1354.
Liang, Y., M. Diehn, et al. (2005). "Gene expression profiling reveals molecularly and clinically distinct subtypes of glioblastoma multiforme." Proc Natl Acad Sci U S A 102(16): 5814-5819.
Liu, G., X. Yuan, et al. (2006). "Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma." Mol Cancer 5: 67.
Liu, H., R. G. Sadygov, et al. (2004). "A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics." Anal Chem 76(14): 4193-4201.
Liu, N. Q., L. J. Dekker, et al. (2013). "Quantitative proteomic analysis of microdissected breast cancer tissues: comparison of label-free and SILAC-based quantification with shotgun, directed, and targeted MS approaches." J Proteome Res 12(10): 4627-4641.
Liu, W., I. G. De La Torre, et al. (2014). "Detection of autoantibodies to multiple tumor-associated antigens (TAAs) in the immunodiagnosis of breast cancer." Tumour Biol.
Lo, H. W., H. Zhu, et al. (2009). "A novel splice variant of GLI1 that promotes glioblastoma cell migration and invasion." Cancer Res 69(17): 6790-6798.
Long, J. C. and J. F. Caceres (2009). "The SR protein family of splicing factors: master regulators of gene expression." Biochem J 417(1): 15-27.
Louis, D. N., H. Ohgaki, et al. (2007). "The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system." Acta Neuropathol 114(2): 97-109.
Love, B. and P. F. Predki (2007). Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. USA, CRC Press. Lu, C., P. S. Ward, et al. (2012). "IDH mutation impairs histone demethylation and results in a block to
cell differentiation." Nature 483(7390): 474-478. Lu, H., V. Goodell, et al. (2008). "Humoral immunity directed against tumor-associated antigens as
potential biomarkers for the early diagnosis of cancer." J Proteome Res 7(4): 1388-1394. Lubomirski, M., M. R. D'Andrea, et al. (2007). "A consolidated approach to analyzing data from high-
throughput protein microarrays with an application to immune response profiling in humans." J Comput Biol 14(3): 350-359.
MacBeath, G. and S. L. Schreiber (2000). "Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination." Science 289(5485): 1760-1763.
Maher, E. A., F. B. Furnari, et al. (2001). "Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter." Genes Dev 15(11): 1311-1333.
Kapitel 6: Literatur
110
Marina, O., M. A. Biernacki, et al. (2008). "A concentration-dependent analysis method for high density protein microarrays." J Proteome Res 7(5): 2059-2068.
Martinez-Contreras, R., P. Cloutier, et al. (2007). "hnRNP proteins and splicing control." Adv Exp Med Biol 623: 123-147.
Martinez-Pinna, R., A. Gonzalez de Peredo, et al. (2014). "Label-free quantitative proteomic analysis of human plasma-derived microvesicles to find protein signatures of abdominal aortic aneurysms." Proteomics Clin Appl 8(7-8): 620-625.
Matsumoto, M., K. Kawakami, et al. (2010). "CpG hypermethylation of human four-and-a-half LIM domains 1 contributes to migration and invasion activity of human bladder cancer." Int J Mol Med 26(2): 241-247.
Matsutani, T., T. Hiwasa, et al. (2012). "Autologous antibody to src-homology 3-domain GRB2-like 1 specifically increases in the sera of patients with low-grade gliomas." J Exp Clin Cancer Res 31: 85.
Matter, N., P. Herrlich, et al. (2002). "Signal-dependent regulation of splicing via phosphorylation of Sam68." Nature 420(6916): 691-695.
McGrath, M. J., C. A. Mitchell, et al. (2003). "Skeletal muscle LIM protein 1 (SLIM1/FHL1) induces alpha 5 beta 1-integrin-dependent myocyte elongation." Am J Physiol Cell Physiol 285(6): C1513-1526.
McNeel, D. G., L. D. Nguyen, et al. (2000). "Antibody immunity to prostate cancer associated antigens can be detected in the serum of patients with prostate cancer." J Urol 164(5): 1825-1829.
Megger, D. A., T. Bracht, et al. (2013). "Label-free quantification in clinical proteomics." Biochim Biophys Acta 1834(8): 1581-1590.
Michaud, G. A., M. Salcius, et al. (2003). "Analyzing antibody specificity with whole proteome microarrays." Nat Biotechnol 21(12): 1509-1512.
Mischel, P. S., R. Shai, et al. (2003). "Identification of molecular subtypes of glioblastoma by gene expression profiling." Oncogene 22(15): 2361-2373.
Missler, M. and T. C. Sudhof (1998). "Neurexins: three genes and 1001 products." Trends Genet 14(1): 20-26.
Modem, S., K. Chinnakannu, et al. (2011). "Hsp22 (HspB8/H11) knockdown induces Sam68 expression and stimulates proliferation of glioblastoma cells." J Cell Physiol 226(11): 2747-2751.
Morfouace, M., L. Lalier, et al. (2012). "Comparison of spheroids formed by rat glioma stem cells and neural stem cells reveals differences in glucose metabolism and promising therapeutic applications." J Biol Chem 287(40): 33664-33674.
Muto, J., T. Imai, et al. (2012). "RNA-binding protein Musashi1 modulates glioma cell growth through the post-transcriptional regulation of Notch and PI3 kinase/Akt signaling pathways." PLoS One 7(3): e33431.
Newcomb, E. W., H. Cohen, et al. (1998). "Survival of patients with glioblastoma multiforme is not influenced by altered expression of p16, p53, EGFR, MDM2 or Bcl-2 genes." Brain Pathol 8(4): 655-667.
Ng, B., F. Yang, et al. (2004). "Increased noncanonical splicing of autoantigen transcripts provides the structural basis for expression of untolerized epitopes." J Allergy Clin Immunol 114(6): 1463-1470.
Niland, B., G. Miklossy, et al. (2010). "Cleavage of transaldolase by granzyme B causes the loss of enzymatic activity with retention of antigenicity for multiple sclerosis patients." J Immunol 184(7): 4025-4032.
Niu, C., C. Liang, et al. (2012). "Downregulation and growth inhibitory role of FHL1 in lung cancer." Int J Cancer 130(11): 2549-2556.
Nossal, G. J. (1989). "Immunologic tolerance: collaboration between antigen and lymphokines." Science 245(4914): 147-153.
Noushmehr, H., D. J. Weisenberger, et al. (2010). "Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma." Cancer Cell 17(5): 510-522.
Kapitel 6: Literatur
111
Old, W. M., K. Meyer-Arendt, et al. (2005). "Comparison of label-free methods for quantifying human proteins by shotgun proteomics." Mol Cell Proteomics 4(10): 1487-1502.
Omuro, A. and L. M. DeAngelis (2013). "Glioblastoma and other malignant gliomas: a clinical review." JAMA 310(17): 1842-1850.
Ong, S. E., B. Blagoev, et al. (2002). "Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics." Mol Cell Proteomics 1(5): 376-386.
Ostrom, Q. T., H. Gittleman, et al. (2013). "CBTRUS statistical report: Primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006-2010." Neuro Oncol 15 Suppl 2: ii1-56.
Oudard, S., L. Miccoli, et al. (1996). "Glycolytic profile in normal brain tissue and gliomas determined by a micro-method analysis." Oncol Rep 3(1): 165-170.
Pallasch, C. P., A. K. Struss, et al. (2005). "Autoantibodies against GLEA2 and PHF3 in glioblastoma: tumor-associated autoantibodies correlated with prolonged survival." Int J Cancer 117(3): 456-459.
Park, C. K., J. H. Jung, et al. (2009). "Tissue expression of manganese superoxide dismutase is a candidate prognostic marker for glioblastoma." Oncology 77(3-4): 178-181.
Parks, B. A., L. Jiang, et al. (2007). "Top-down proteomics on a chromatographic time scale using linear ion trap fourier transform hybrid mass spectrometers." Anal Chem 79(21): 7984-7991.
Parsons, D. W., S. Jones, et al. (2008). "An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme." Science 321(5897): 1807-1812.
Patel, V. N., G. Gokulrangan, et al. (2013). "Network signatures of survival in glioblastoma multiforme." PLoS Comput Biol 9(9): e1003237.
Pellegatta, S., P. L. Poliani, et al. (2006). "Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas." Cancer Res 66(21): 10247-10252.
Piaskowski, S., M. Bienkowski, et al. (2011). "Glioma cells showing IDH1 mutation cannot be propagated in standard cell culture conditions." Br J Cancer 104(6): 968-970.
Pike, L. S., A. L. Smift, et al. (2011). "Inhibition of fatty acid oxidation by etomoxir impairs NADPH production and increases reactive oxygen species resulting in ATP depletion and cell death in human glioblastoma cells." Biochim Biophys Acta 1807(6): 726-734.
Piura, E. and B. Piura (2010). "Autoantibodies to tumor-associated antigens in breast carcinoma." J Oncol 2010: 264926.
Polednak, A. P. and J. T. Flannery (1995). "Brain, other central nervous system, and eye cancer." Cancer 75(1 Suppl): 330-337.
Predki, P. F., D. Mattoon, et al. (2005). "Protein microarrays: a new tool for profiling antibody cross-reactivity." Hum Antibodies 14(1-2): 7-15.
Primot, A., A. Mogha, et al. (2010). "ERK-regulated differential expression of the Mitf 6a/b splicing isoforms in melanoma." Pigment Cell Melanoma Res 23(1): 93-102.
Purow, B. and D. Schiff (2009). "Advances in the genetics of glioblastoma: are we reaching critical mass?" Nat Rev Neurol 5(8): 419-426.
Pusch, S., F. Sahm, et al. (2011). "Glioma IDH1 mutation patterns off the beaten track." Neuropathol Appl Neurobiol 37(4): 428-430.
Qiang, L., Y. Yang, et al. (2009). "Isolation and characterization of cancer stem like cells in human glioblastoma cell lines." Cancer Lett 279(1): 13-21.
Querol, L., P. L. Clark, et al. (2013). "Protein array-based profiling of CSF identifies RBPJ as an autoantigen in multiple sclerosis." Neurology 81(11): 956-963.
Rauch, J. and O. Gires (2008). "SEREX, Proteomex, AMIDA, and beyond: Serological screening technologies for target identification." Proteomics Clin Appl 2(3): 355-371.
Reifenberger, G., J. Szymas, et al. (1987). "Differential expression of glial- and neuronal-associated antigens in human tumors of the central and peripheral nervous system." Acta Neuropathol 74(2): 105-123.
Kapitel 6: Literatur
112
Reifenberger, G., R. G. Weber, et al. (2014). "Molecular characterization of long-term survivors of glioblastoma using genome- and transcriptome-wide profiling." Int J Cancer 135(8): 1822-1831.
Robinson, W. H., C. DiGennaro, et al. (2002). "Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses." Nat Med 8(3): 295-301.
Ronning, P. A., E. Helseth, et al. (2012). "A population-based study on the effect of temozolomide in the treatment of glioblastoma multiforme." Neuro Oncol 14(9): 1178-1184.
Ruano, Y., M. Mollejo, et al. (2006). "Identification of novel candidate target genes in amplicons of Glioblastoma multiforme tumors detected by expression and CGH microarray profiling." Mol Cancer 5: 39.
Safdari, H., F. H. Hochberg, et al. (1985). "Prognostic value of round cell (lymphocyte) infiltration in malignant gliomas." Surg Neurol 23(3): 221-226.
Sahin, U., O. Tureci, et al. (1997). "Serological identification of human tumor antigens." Curr Opin Immunol 9(5): 709-716.
Sato, M., M. Sasaki, et al. (1995). "Antioxidative roles of metallothionein and manganese superoxide dismutase induced by tumor necrosis factor-alpha and interleukin-6." Arch Biochem Biophys 316(2): 738-744.
Schafer, Z. T., A. R. Grassian, et al. (2009). "Antioxidant and oncogene rescue of metabolic defects caused by loss of matrix attachment." Nature 461(7260): 109-113.
Scherer, S. S., P. E. Braun, et al. (1994). "Differential regulation of the 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase gene during oligodendrocyte development." Neuron 12(6): 1363-1375.
Schiffer, D., D. Cavicchioli, et al. (1979). "Analysis of some factors effecting survival in malignant gliomas." Tumori 65(1): 119-125.
Schlehofer, B., M. Blettner, et al. (1999). "Role of medical history in brain tumour development. Results from the international adult brain tumour study." Int J Cancer 82(2): 155-160.
Schlehofer, B., I. Hettinger, et al. (2005). "Occupational risk factors for low grade and high grade glioma: results from an international case control study of adult brain tumours." Int J Cancer 113(1): 116-125.
Schmits, R., B. Cochlovius, et al. (2002). "Analysis of the antibody repertoire of astrocytoma patients against antigens expressed by gliomas." Int J Cancer 98(1): 73-77.
Schneider, S. A., W. R. Sukov, et al. (2014). "Outcome of patients with micropapillary urothelial carcinoma following radical cystectomy: ERBB2 (HER2) amplification identifies patients with poor outcome." Mod Pathol 27(5): 758-764.
Schwartz, S., E. Meshorer, et al. (2009). "Chromatin organization marks exon-intron structure." Nat Struct Mol Biol 16(9): 990-995.
Serano, R. D., C. N. Pegram, et al. (1980). "Tumorigenic cell culture lines from a spontaneous VM/Dk murine astrocytoma (SMA)." Acta Neuropathol 51(1): 53-64.
Shain, A. H., C. P. Giacomini, et al. (2012). "Convergent structural alterations define SWItch/Sucrose NonFermentable (SWI/SNF) chromatin remodeler as a central tumor suppressive complex in pancreatic cancer." Proc Natl Acad Sci U S A 109(5): E252-259.
Shapiro, J. P., S. Biswas, et al. (2012). "A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry." J Proteomics 77: 433-440.
Shen, G., F. Shen, et al. (2008). "Identification of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line and the limitation of current identification methods." In Vitro Cell Dev Biol Anim 44(7): 280-289.
Shen, Y., Z. Jia, et al. (2006). "SRC uses Cas to suppress Fhl1 in order to promote nonanchored growth and migration of tumor cells." Cancer Res 66(3): 1543-1552.
Shiras, A., A. Bhosale, et al. (2003). "A unique model system for tumor progression in GBM comprising two developed human neuro-epithelial cell lines with differential transforming potential and coexpressing neuronal and glial markers." Neoplasia 5(6): 520-532.
Silva, J. C., R. Denny, et al. (2005). "Quantitative proteomic analysis by accurate mass retention time pairs." Anal Chem 77(7): 2187-2200.
Kapitel 6: Literatur
113
Singh, S. K., I. D. Clarke, et al. (2003). "Identification of a cancer stem cell in human brain tumors." Cancer Res 63(18): 5821-5828.
Sitek, B., J. Luttges, et al. (2005). "Application of fluorescence difference gel electrophoresis saturation labelling for the analysis of microdissected precursor lesions of pancreatic ductal adenocarcinoma." Proteomics 5(10): 2665-2679.
Snel, B., G. Lehmann, et al. (2000). "STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene." Nucleic Acids Res 28(18): 3442-3444.
Sorokine, I., K. Ben-Mahrez, et al. (1991). "Presence of circulating anti-c-myb oncogene product antibodies in human sera." Int J Cancer 47(5): 665-669.
Soussi, T. (2000). "p53 Antibodies in the sera of patients with various types of cancer: a review." Cancer Res 60(7): 1777-1788.
Sreekumar, A., B. Laxman, et al. (2004). "Humoral immune response to alpha-methylacyl-CoA racemase and prostate cancer." J Natl Cancer Inst 96(11): 834-843.
Stein, G. H. (1979). "T98G: an anchorage-independent human tumor cell line that exhibits stationary phase G1 arrest in vitro." J Cell Physiol 99(1): 43-54.
Stingl, C., F. G. van Vilsteren, et al. (2011). "Reproducibility of protein identification of selected cell types in Barrett's esophagus analyzed by combining laser-capture microdissection and mass spectrometry." J Proteome Res 10(1): 288-298.
Struss, A. K., B. F. Romeike, et al. (2001). "PHF3-specific antibody responses in over 60% of patients with glioblastoma multiforme." Oncogene 20(31): 4107-4114.
Stupp, R., W. P. Mason, et al. (2005). "Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma." N Engl J Med 352(10): 987-996.
Sundaresh, S., D. L. Doolan, et al. (2006). "Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques." Bioinformatics 22(14): 1760-1766.
Sunderkotter, C., K. Steinbrink, et al. (1994). "Macrophages and angiogenesis." J Leukoc Biol 55(3): 410-422.
Tan, H. T., J. Low, et al. (2009). "Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection." FEBS J 276(23): 6880-6904.
Taylor, B. S., M. Pal, et al. (2008). "Humoral response profiling reveals pathways to prostate cancer progression." Mol Cell Proteomics 7(3): 600-611.
Tchirkov, A., V. Sapin, et al. (2010). "Increased expression of the oncogenic KLF6-SV1 transcript in human glioblastoma." Clin Chem Lab Med 48(8): 1167-1170.
Tennant, D. A., R. V. Duran, et al. (2010). "Targeting metabolic transformation for cancer therapy." Nat Rev Cancer 10(4): 267-277.
Theriault, G., M. Goldberg, et al. (1994). "Cancer risks associated with occupational exposure to magnetic fields among electric utility workers in Ontario and Quebec, Canada, and France: 1970-1989." Am J Epidemiol 139(6): 550-572.
Thirant, C., E. M. Galan-Moya, et al. (2012). "Differential proteomic analysis of human glioblastoma and neural stem cells reveals HDGF as a novel angiogenic secreted factor." Stem Cells 30(5): 845-853.
Thirant, C., P. Varlet, et al. (2011). "Proteomic analysis of oligodendrogliomas expressing a mutant isocitrate dehydrogenase-1." Proteomics 11(21): 4139-4154.
Tiegs, S. L., D. M. Russell, et al. (1993). "Receptor editing in self-reactive bone marrow B cells." J Exp Med 177(4): 1009-1020.
Turcan, S., D. Rohle, et al. (2012). "IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype." Nature 483(7390): 479-483.
Uhlen, M., P. Oksvold, et al. (2010). "Towards a knowledge-based Human Protein Atlas." Nat Biotechnol 28(12): 1248-1250.
Unwin, R. D., P. Harnden, et al. (2003). "Serological and proteomic evaluation of antibody responses in the identification of tumor antigens in renal cell carcinoma." Proteomics 3(1): 45-55.
Kapitel 6: Literatur
114
van der Bruggen, P., C. Traversari, et al. (1991). "A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma." Science 254(5038): 1643-1647.
van der Bruggen, P. and B. Van den Eynde (1992). "Molecular definition of tumor antigens recognized by T lymphocytes." Curr Opin Immunol 4(5): 608-612.
Vander Heiden, M. G., L. C. Cantley, et al. (2009). "Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation." Science 324(5930): 1029-1033.
Vander Heiden, M. G., J. W. Locasale, et al. (2010). "Evidence for an alternative glycolytic pathway in rapidly proliferating cells." Science 329(5998): 1492-1499.
Varela, I., P. Tarpey, et al. (2011). "Exome sequencing identifies frequent mutation of the SWI/SNF complex gene PBRM1 in renal carcinoma." Nature 469(7331): 539-542.
Venables, J. P., R. Klinck, et al. (2009). "Cancer-associated regulation of alternative splicing." Nat Struct Mol Biol 16(6): 670-676.
Verhaak, R. G., K. A. Hoadley, et al. (2010). "Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1." Cancer Cell 17(1): 98-110.
Versteege, I., N. Sevenet, et al. (1998). "Truncating mutations of hSNF5/INI1 in aggressive paediatric cancer." Nature 394(6689): 203-206.
Vilchez, R. A. and J. S. Butel (2003). "SV40 in human brain cancers and non-Hodgkin's lymphoma." Oncogene 22(33): 5164-5172.
Vogel, R., H. Wiesinger, et al. (1999). "The regeneration of reduced glutathione in rat forebrain mitochondria identifies metabolic pathways providing the NADPH required." Neurosci Lett 275(2): 97-100.
Waha, A., A. Baumann, et al. (1996). "Lack of prognostic relevance of alterations in the epidermal growth factor receptor-transforming growth factor-alpha pathway in human astrocytic gliomas." J Neurosurg 85(4): 634-641.
Wang, X. (2011). "Computational analysis of expression of human embryonic stem cell-associated signatures in tumors." BMC Res Notes 4: 471.
Warburg, O. (1956). "On respiratory impairment in cancer cells." Science 124(3215): 269-270. Waziri, A. (2010). "Glioblastoma-derived mechanisms of systemic immunosuppression." Neurosurg
Clin N Am 21(1): 31-42. Wei, P., W. Zhang, et al. (2013). "Serum GFAP autoantibody as an ELISA-detectable glioma marker."
Tumour Biol 34(4): 2283-2292. Weller, M., J. Felsberg, et al. (2009). "Molecular predictors of progression-free and overall survival in
patients with newly diagnosed glioblastoma: a prospective translational study of the German Glioma Network." J Clin Oncol 27(34): 5743-5750.
Wen, F., A. Shen, et al. (2010). "Higher expression of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein k in melanoma." Ann Surg Oncol 17(10): 2619-2627.
Wiemels, J. L., J. K. Wiencke, et al. (2002). "History of allergies among adults with glioma and controls." Int J Cancer 98(4): 609-615.
Wienhard, K., R. Wagner, et al. (1989). PET : Grundlagen und Anwendungen der Positronen-Emissions-Tomographie Berlin ; Heidelberg ; New York ; London ; Paris ; Tokyo Springer.
Wikstrand, C. J., R. E. McLendon, et al. (1997). "Cell surface localization and density of the tumor-associated variant of the epidermal growth factor receptor, EGFRvIII." Cancer Res 57(18): 4130-4140.
Wilson, T. A., M. A. Karajannis, et al. (2014). "Glioblastoma multiforme: State of the art and future therapeutics." Surg Neurol Int 5: 64.
Winter, S. F., J. D. Minna, et al. (1992). "Development of antibodies against p53 in lung cancer patients appears to be dependent on the type of p53 mutation." Cancer Res 52(15): 4168-4174.
Wirth, H., M. Loffler, et al. (2011). "Expression cartography of human tissues using self organizing maps." BMC Bioinformatics 12: 306.
Kapitel 6: Literatur
115
Wirth, H., M. von Bergen, et al. (2012). "Mining SOM expression portraits: feature selection and integrating concepts of molecular function." BioData Min 5(1): 18.
Wisniewski, J. R., P. Ostasiewicz, et al. (2011). "High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers." J Proteome Res 10(7): 3040-3049.
Wu, A., S. Oh, et al. (2008). "Persistence of CD133+ cells in human and mouse glioma cell lines: detailed characterization of GL261 glioma cells with cancer stem cell-like properties." Stem Cells Dev 17(1): 173-184.
Xu, W., H. Yang, et al. (2011). "Oncometabolite 2-hydroxyglutarate is a competitive inhibitor of alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenases." Cancer Cell 19(1): 17-30.
Yamada, Y., T. Kuroiwa, et al. (2003). "Transcriptional expression of survivin and its splice variants in brain tumors in humans." J Neurosurg 99(4): 738-745.
Yang, F., I. H. Chen, et al. (2006). "Model of stimulation-responsive splicing and strategies in identification of immunogenic isoforms of tumor antigens and autoantigens." Clin Immunol 121(2): 121-133.
Yu, Y., X. Jiang, et al. (2007). "Aberrant splicing of cyclin-dependent kinase-associated protein phosphatase KAP increases proliferation and migration in glioblastoma." Cancer Res 67(1): 130-138.
Zabel, C. and J. Klose (2009). "High-resolution large-gel 2DE." Methods Mol Biol 519: 311-338. Zheng, T., K. P. Cantor, et al. (2001). "Risk of brain glioma not associated with cigarette smoking or
use of other tobacco products in Iowa." Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 10(4): 413-414. Zhou, X. D., X. Y. Wang, et al. (2009). "Detection of cancer stem cells from the C6 glioma cell line." J
Int Med Res 37(2): 503-510. Zhu, H., M. Bilgin, et al. (2001). "Global analysis of protein activities using proteome chips." Science
293(5537): 2101-2105. Zuo, X., L. Echan, et al. (2001). "Towards global analysis of mammalian proteomes using sample
prefractionation prior to narrow pH range two-dimensional gels and using one-dimensional gels for insoluble and large proteins." Electrophoresis 22(9): 1603-1615.
Anhang A
116
Anhang
A. Tabellen Tabelle 7.1: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSwt und STSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,05; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (wird fortgesetzt).
Proteinbeschreibung Uniprot-ID p-Wert Abundanz-
unterschied
Gruppe mit höherer
Abundanz
Gruppe mit niedrigerer Abundanz
14 kDa phosphohistidine phosphatase OS=Homo sapiens GN=PHPT1 PE=1 SV=1 - [PHP14_HUMAN] Q9NRX4 0,0455 235 STS wt LTS wt
14-3-3 protein theta OS=Homo sapiens GN=YWHAQ PE=1 SV=1 - [1433T_HUMAN] P27348 0,0145 1,59 STS wt LTS wt
26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 11 OS=Homo sapiens GN=PSMD11 PE=1 SV=3 - [PSD11_HUMAN] O00231
0,0132 1,56 STS wt LTS wt
2-oxoglutarate dehydrogenase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=OGDH PE=1 SV=3 - [ODO1_HUMAN] Q02218
0,0493 1,92 STS wt LTS wt
3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 OS=Homo sapiens GN=HSD17B10 PE=1 SV=3 - [HCD2_HUMAN] Q99714
0,0275 1,72 STS wt LTS wt
4-aminobutyrate aminotransferase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ABAT PE=1 SV=3 - [GABT_HUMAN] P80404
0,0327 2,26 STS wt LTS wt
6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating OS=Homo sapiens GN=PGD PE=1 SV=3 - [6PGD_HUMAN] P52209
0,0184 1,74 STS wt LTS wt
Abhydrolase domain-containing protein 10, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ABHD10 PE=1 SV=1 - [ABHDA_HUMAN] Q9NUJ1
0,00383 2,81 STS wt LTS wt
Abhydrolase domain-containing protein 11 OS=Homo sapiens GN=ABHD11 PE=1 SV=1 - [ABHDB_HUMAN] Q8NFV4
0,0334 1,63 STS wt LTS wt
Acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic OS=Homo sapiens GN=ACAT2 PE=1 SV=2 - [THIC_HUMAN] Q9BWD1 0,0317 1,77 STS wt LTS wt
Acetyl-CoA acetyltransferase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ACAT1 PE=1 SV=1 - [THIL_HUMAN] P24752 0,0297 1,84 STS wt LTS wt
Aconitate hydratase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ACO2 PE=1 SV=2 - [ACON_HUMAN] Q99798 0,00344 1,63 STS wt LTS wt
Actin, alpha cardiac muscle 1 OS=Homo sapiens GN=ACTC1 PE=1 SV=1 - [ACTC_HUMAN] P68032 0,0169 2,52 STS wt LTS wt
Actin-related protein 2 OS=Homo sapiens GN=ACTR2 PE=1 SV=1 - [ARP2_HUMAN] P61160 0,0478 1,71 STS wt LTS wt
Actin-related protein 2/3 complex subunit 2 OS=Homo sapiens GN=ARPC2 PE=1 SV=1 - [ARPC2_HUMAN] O15144 0,0349 1,61 STS wt LTS wt
Actin-related protein 2/3 complex subunit 3 OS=Homo sapiens GN=ARPC3 PE=1 SV=3 - [ARPC3_HUMAN] O15145 0,0336 1,58 STS wt LTS wt
Acylglycerol kinase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=AGK PE=1 SV=2 - [AGK_HUMAN] Q53H12 0,0285 5,23 STS wt LTS wt
Anhang A
117
Tabelle 7.1: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSwt und STSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,05; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot-ID p-Wert Abundanz-
unterschied
Gruppe mit höherer
Abundanz
Gruppe mit niedrigerer Abundanz
Acylpyruvase FAHD1, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=FAHD1 PE=1 SV=2 - [FAHD1_HUMAN] Q6P587 0,0465 2,57 STS wt LTS wt
Adenylyl cyclase-associated protein 1 OS=Homo sapiens GN=CAP1 PE=1 SV=5 - [CAP1_HUMAN] Q01518 0,0204 1,68 STS wt LTS wt
ADP/ATP translocase 1 OS=Homo sapiens GN=SLC25A4 PE=1 SV=4 - [ADT1_HUMAN] P12235 0,0162 3,07 STS wt LTS wt
ADP/ATP translocase 2 OS=Homo sapiens GN=SLC25A5 PE=1 SV=7 - [ADT2_HUMAN] P05141 0,0247 1,59 STS wt LTS wt
Aflatoxin B1 aldehyde reductase member 2 OS=Homo sapiens GN=AKR7A2 PE=1 SV=3 - [ARK72_HUMAN] O43488
0,0158 1,59 STS wt LTS wt
Alcohol dehydrogenase class-3 OS=Homo sapiens GN=ADH5 PE=1 SV=4 - [ADHX_HUMAN] P11766 0,0169 1,75 STS wt LTS wt
Alpha-centractin OS=Homo sapiens GN=ACTR1A PE=1 SV=1 - [ACTZ_HUMAN] P61163 0,00669 2,44 STS wt LTS wt
Alpha-enolase OS=Homo sapiens GN=ENO1 PE=1 SV=2 - [ENOA_HUMAN] P06733 0,0271 1,7 STS wt LTS wt
Angiotensinogen OS=Homo sapiens GN=AGT PE=1 SV=1 - [ANGT_HUMAN] P01019 0,0243 2,24 STS wt LTS wt
Annexin A6 OS=Homo sapiens GN=ANXA6 PE=1 SV=3 - [ANXA6_HUMAN] P08133 0,0321 1,76 STS wt LTS wt
AP-2 complex subunit beta OS=Homo sapiens GN=AP2B1 PE=1 SV=1 - [AP2B1_HUMAN] P63010 0,00506 1,89 STS wt LTS wt
Arfaptin-1 OS=Homo sapiens GN=ARFIP1 PE=1 SV=2 - [ARFP1_HUMAN] P53367 0,0102 2,27 LTS wt STS wt
Arf-GAP domain and FG repeat-containing protein 1 OS=Homo sapiens GN=AGFG1 PE=1 SV=2 - [AGFG1_HUMAN] P52594
0,0442 1,78 LTS wt STS wt
Aspartate aminotransferase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=GOT2 PE=1 SV=3 - [AATM_HUMAN] P00505 0,00547 2,01 STS wt LTS wt
Ataxin-10 OS=Homo sapiens GN=ATXN10 PE=1 SV=1 - [ATX10_HUMAN] Q9UBB4 0,00107 2,86 STS wt LTS wt
ATP synthase subunit alpha, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ATP5A1 PE=1 SV=1 - [ATPA_HUMAN] P25705 0,032 1,74 STS wt LTS wt
ATP synthase subunit f, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ATP5J2 PE=1 SV=3 - [ATPK_HUMAN] P56134 0,00644 2,56 STS wt LTS wt
ATP synthase subunit gamma, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ATP5C1 PE=1 SV=1 - [ATPG_HUMAN] P36542
0,0253 2,18 STS wt LTS wt
ATPase family AAA domain-containing protein 3A OS=Homo sapiens GN=ATAD3A PE=1 SV=2 - [ATD3A_HUMAN] Q9NVI7
0,00607 2,24 STS wt LTS wt
Beta-centractin OS=Homo sapiens GN=ACTR1B PE=1 SV=1 - [ACTY_HUMAN] P42025 0,043 2,06 STS wt LTS wt
Anhang A
118
Tabelle 7.1: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSwt und STSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,05; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot-ID p-Wert Abundanz-
unterschied
Gruppe mit höherer
Abundanz
Gruppe mit niedrigerer Abundanz
BRO1 domain-containing protein BROX OS=Homo sapiens GN=BROX PE=1 SV=1 - [BROX_HUMAN] Q5VW32 0,0353 1,6 STS wt LTS wt
Calcyclin-binding protein OS=Homo sapiens GN=CACYBP PE=1 SV=2 - [CYBP_HUMAN] Q9HB71 0,0178 1,54 STS wt LTS wt
cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha OS=Homo sapiens GN=PRKACA PE=1 SV=2 - [KAPCA_HUMAN] P17612
0,0262 2,46 STS wt LTS wt
Carbonic anhydrase 2 OS=Homo sapiens GN=CA2 PE=1 SV=2 - [CAH2_HUMAN] P00918 0,0122 1,95 STS wt LTS wt
CB1 cannabinoid receptor-interacting protein 1 OS=Homo sapiens GN=CNRIP1 PE=1 SV=1 - [CNRP1_HUMAN] Q96F85
0,039 2,57 STS wt LTS wt
CD166 antigen OS=Homo sapiens GN=ALCAM PE=1 SV=2 - [CD166_HUMAN] Q13740 0,017 3,92 STS wt LTS wt
Clathrin interactor 1 OS=Homo sapiens GN=CLINT1 PE=1 SV=1 - [EPN4_HUMAN] Q14677 0,0137 3,83 STS wt LTS wt
Cleavage stimulation factor subunit 2 OS=Homo sapiens GN=CSTF2 PE=1 SV=1 - [CSTF2_HUMAN] P33240 0,0121 2,24 LTS wt STS wt
Coactosin-like protein OS=Homo sapiens GN=COTL1 PE=1 SV=3 - [COTL1_HUMAN] Q14019 0,00237 2,35 STS wt LTS wt
Cystatin-B OS=Homo sapiens GN=CSTB PE=1 SV=2 - [CYTB_HUMAN] P04080 0,0319 1,54 STS wt LTS wt
Cysteine and glycine-rich protein 1 OS=Homo sapiens GN=CSRP1 PE=1 SV=3 - [CSRP1_HUMAN] P21291 0,05 1,82 STS wt LTS wt
Cytochrome b-c1 complex subunit 1, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=UQCRC1 PE=1 SV=3 - [QCR1_HUMAN] P31930
0,0264 1,57 STS wt LTS wt
Cytochrome b-c1 complex subunit 2, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=UQCRC2 PE=1 SV=3 - [QCR2_HUMAN] P22695
0,00189 1,97 STS wt LTS wt
Cytochrome b-c1 complex subunit Rieske, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=UQCRFS1 PE=1 SV=2 - [UCRI_HUMAN] P47985
0,0337 2,42 STS wt LTS wt
Cytochrome c oxidase subunit 2 OS=Homo sapiens GN=MT-CO2 PE=1 SV=1 - [COX2_HUMAN] P00403 0,0281 2,53 STS wt LTS wt
Cytosolic acyl coenzyme A thioester hydrolase OS=Homo sapiens GN=ACOT7 PE=1 SV=3 - [BACH_HUMAN] O00154
0,0398 2,07 STS wt LTS wt
Dihydrolipoyl dehydrogenase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=DLD PE=1 SV=2 - [DLDH_HUMAN] P09622 0,0478 1,86 STS wt LTS wt
Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=DLST PE=1 SV=4 - [ODO2_HUMAN] P36957
0,00825 1,67 STS wt LTS wt
Dual specificity protein phosphatase 3 OS=Homo sapiens GN=DUSP3 PE=1 SV=1 - [DUS3_HUMAN] P51452 0,00136 1,62 STS wt LTS wt
Dynactin subunit 1 OS=Homo sapiens GN=DCTN1 PE=1 SV=3 - [DCTN1_HUMAN] Q14203 0,0301 1,99 STS wt LTS wt
Dynamin-1-like protein OS=Homo sapiens GN=DNM1L PE=1 SV=2 - [DNM1L_HUMAN] O00429 0,00119 2,01 STS wt LTS wt
Anhang A
119
Tabelle 7.1: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSwt und STSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,05; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot-ID p-Wert Abundanz-
unterschied
Gruppe mit höherer
Abundanz
Gruppe mit niedrigerer Abundanz
Dynein light chain 2, cytoplasmic OS=Homo sapiens GN=DYNLL2 PE=1 SV=1 - [DYL2_HUMAN] Q96FJ2 0,0282 2,83 STS wt LTS wt
Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 6 OS=Homo sapiens GN=ENPP6 PE=1 SV=2 - [ENPP6_HUMAN] Q6UWR7
0,0284 4,95 STS wt LTS wt
EF-hand domain-containing protein D2 OS=Homo sapiens GN=EFHD2 PE=1 SV=1 - [EFHD2_HUMAN] Q96C19 0,000337 2,64 STS wt LTS wt
Electron transfer flavoprotein subunit alpha, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ETFA PE=1 SV=1 - [ETFA_HUMAN] P13804
0,0442 1,57 STS wt LTS wt
Endophilin-B2 OS=Homo sapiens GN=SH3GLB2 PE=1 SV=1 - [SHLB2_HUMAN] Q9NR46 0,00717 3,76 STS wt LTS wt
Enoyl-CoA delta isomerase 1, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ECI1 PE=1 SV=1 - [ECI1_HUMAN] P42126 0,0215 2,35 STS wt LTS wt
Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ECHS1 PE=1 SV=4 - [ECHM_HUMAN] P30084 0,00531 2,11 STS wt LTS wt
Estradiol 17-beta-dehydrogenase 12 OS=Homo sapiens GN=HSD17B12 PE=1 SV=2 - [DHB12_HUMAN] Q53GQ0 0,0433 2,64 STS wt LTS wt
Eukaryotic initiation factor 4A-I OS=Homo sapiens GN=EIF4A1 PE=1 SV=1 - [IF4A1_HUMAN] P60842 0,0419 2,13 STS wt LTS wt
Eukaryotic translation initiation factor 5A-1 OS=Homo sapiens GN=EIF5A PE=1 SV=2 - [IF5A1_HUMAN] P63241 0,00623 1,95 STS wt LTS wt
Flavin reductase (NADPH) OS=Homo sapiens GN=BLVRB PE=1 SV=3 - [BLVRB_HUMAN] P30043 0,022 2,46 STS wt LTS wt
Fumarate hydratase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=FH PE=1 SV=3 - [FUMH_HUMAN] P07954 0,000912 2,08 STS wt LTS wt
Galactocerebrosidase OS=Homo sapiens GN=GALC PE=1 SV=2 - [GALC_HUMAN] P54803 0,0196 2,92 STS wt LTS wt
Galectin-1 OS=Homo sapiens GN=LGALS1 PE=1 SV=2 - [LEG1_HUMAN] P09382 0,00518 1,97 STS wt LTS wt
Gamma-adducin OS=Homo sapiens GN=ADD3 PE=1 SV=1 - [ADDG_HUMAN] Q9UEY8 0,0229 2,29 STS wt LTS wt
Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase OS=Homo sapiens GN=G6PD PE=1 SV=4 - [G6PD_HUMAN] P11413 0,0159 1,91 STS wt LTS wt
Glutaminase kidney isoform, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=GLS PE=1 SV=1 - [GLSK_HUMAN] O94925 0,0307 2,29 STS wt LTS wt
Glutathione S-transferase Mu 3 OS=Homo sapiens GN=GSTM3 PE=1 SV=3 - [GSTM3_HUMAN] P21266 0,00355 2,15 STS wt LTS wt
Glyoxylate reductase/hydroxypyruvate reductase OS=Homo sapiens GN=GRHPR PE=1 SV=1 - [GRHPR_HUMAN] Q9UBQ7
0,0238 1,74 STS wt LTS wt
Guanine nucleotide-binding protein G(i) subunit alpha-1 OS=Homo sapiens GN=GNAI1 PE=1 SV=2 - [GNAI1_HUMAN] P63096
0,00281 9,53 STS wt LTS wt
Heat shock protein 105 kDa OS=Homo sapiens GN=HSPH1 PE=1 SV=1 - [HS105_HUMAN] Q92598 0,0444 1,51 STS wt LTS wt
Heat shock protein HSP 90-alpha OS=Homo sapiens GN=HSP90AA1 PE=1 SV=5 - [HS90A_HUMAN] P07900 0,0316 1,5 STS wt LTS wt
Anhang A
120
Tabelle 7.1: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSwt und STSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,05; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot-ID p-Wert Abundanz-
unterschied
Gruppe mit höherer
Abundanz
Gruppe mit niedrigerer Abundanz
Hemoglobin subunit gamma-1 OS=Homo sapiens GN=HBG1 PE=1 SV=2 - [HBG1_HUMAN] P69891 0,024 3,81 STS wt LTS wt
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2 OS=Homo sapiens GN=HNRNPH2 PE=1 SV=1 - [HNRH2_HUMAN] P55795
0,0278 1,93 STS wt LTS wt
Histone H2B type 2-E OS=Homo sapiens GN=HIST2H2BE PE=1 SV=3 - [H2B2E_HUMAN] Q16778 0,0156 2 STS wt LTS wt
Hydroxyacylglutathione hydrolase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=HAGH PE=1 SV=2 - [GLO2_HUMAN] Q16775
0,00964 2,6 STS wt LTS wt
Immunoglobulin superfamily member 8 OS=Homo sapiens GN=IGSF8 PE=1 SV=1 - [IGSF8_HUMAN] Q969P0 0,0315 4,52 STS wt LTS wt
Importin subunit alpha-4 OS=Homo sapiens GN=KPNA4 PE=1 SV=1 - [IMA4_HUMAN] O00629 0,0227 2,44 STS wt LTS wt
Importin-5 OS=Homo sapiens GN=IPO5 PE=1 SV=4 - [IPO5_HUMAN] O00410 0,0303 2,46 STS wt LTS wt
Inositol polyphosphate 1-phosphatase OS=Homo sapiens GN=INPP1 PE=1 SV=1 - [INPP_HUMAN] P49441 0,0224 1,91 STS wt LTS wt
Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit alpha, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=IDH3A PE=1 SV=1 - [IDH3A_HUMAN] P50213
0,00623 2,14 STS wt LTS wt
Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit beta, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=IDH3B PE=1 SV=2 - [IDH3B_HUMAN] O43837
0,0186 4,66 STS wt LTS wt
Keratin, type II cytoskeletal 5 OS=Homo sapiens GN=KRT5 PE=1 SV=3 - [K2C5_HUMAN] P13647 0,0106 2,24 LTS wt STS wt
Keratinocyte proline-rich protein OS=Homo sapiens GN=KPRP PE=1 SV=1 - [KPRP_HUMAN] Q5T749 0,00000206 4508340,13 LTS wt STS wt
Kynurenine--oxoglutarate transaminase 3 OS=Homo sapiens GN=CCBL2 PE=1 SV=1 - [KAT3_HUMAN] Q6YP21 0,00805 2,29 STS wt LTS wt
L-lactate dehydrogenase B chain OS=Homo sapiens GN=LDHB PE=1 SV=2 - [LDHB_HUMAN] P07195 0,00529 1,76 STS wt LTS wt
Malate dehydrogenase, cytoplasmic OS=Homo sapiens GN=MDH1 PE=1 SV=4 - [MDHC_HUMAN] P40925 0,0445 1,51 STS wt LTS wt
Malate dehydrogenase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=MDH2 PE=1 SV=3 - [MDHM_HUMAN] P40926 0,0127 1,71 STS wt LTS wt
Malignant T-cell-amplified sequence 1 OS=Homo sapiens GN=MCTS1 PE=1 SV=1 - [MCTS1_HUMAN] Q9ULC4 0,0102 2,47 STS wt LTS wt
Methylosome protein 50 OS=Homo sapiens GN=WDR77 PE=1 SV=1 - [MEP50_HUMAN] Q9BQA1 0,0301 1,79 STS wt LTS wt
Microtubule-associated protein 6 OS=Homo sapiens GN=MAP6 PE=1 SV=2 - [MAP6_HUMAN] Q96JE9 0,0316 3,87 STS wt LTS wt
Mitochondrial 2-oxoglutarate/malate carrier protein OS=Homo sapiens GN=SLC25A11 PE=1 SV=3 - [M2OM_HUMAN] Q02978
0,0213 2,45 STS wt LTS wt
Mitochondrial fission 1 protein OS=Homo sapiens GN=FIS1 PE=1 SV=2 - [FIS1_HUMAN] Q9Y3D6 0,0327 1,99 STS wt LTS wt
Mitochondrial import receptor subunit TOM22 homolog OS=Homo sapiens GN=TOMM22 PE=1 SV=3 - Q9NS69 0,0309 3,14 STS wt LTS wt
Anhang A
121
Tabelle 7.1: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSwt und STSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,05; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot-ID p-Wert Abundanz-
unterschied
Gruppe mit höherer
Abundanz
Gruppe mit niedrigerer Abundanz
[TOM22_HUMAN]
NAD(P)H-hydrate epimerase OS=Homo sapiens GN=APOA1BP PE=1 SV=2 - [NNRE_HUMAN] Q8NCW5 0,0301 1,8 STS wt LTS wt
NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-2 OS=Homo sapiens GN=SIRT2 PE=1 SV=2 - [SIR2_HUMAN] Q8IXJ6 0,0114 3,17 STS wt LTS wt
NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 9, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=NDUFA9 PE=1 SV=2 - [NDUA9_HUMAN] Q16795
0,0348 4,15 STS wt LTS wt
NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 3 OS=Homo sapiens GN=NDUFB3 PE=1 SV=3 - [NDUB3_HUMAN] O43676
0,0454 1,73 STS wt LTS wt
NADH-cytochrome b5 reductase 3 OS=Homo sapiens GN=CYB5R3 PE=1 SV=3 - [NB5R3_HUMAN] P00387 0,00945 2,36 STS wt LTS wt
NADH-ubiquinone oxidoreductase 75 kDa subunit, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=NDUFS1 PE=1 SV=3 - [NDUS1_HUMAN] P28331
0,00533 2,29 STS wt LTS wt
Neuroblast differentiation-associated protein AHNAK OS=Homo sapiens GN=AHNAK PE=1 SV=2 - [AHNK_HUMAN] Q09666
0,017 2,26 STS wt LTS wt
Neurochondrin OS=Homo sapiens GN=NCDN PE=1 SV=1 - [NCDN_HUMAN] Q9UBB6 0,0315 2,23 STS wt LTS wt
Neurotrimin OS=Homo sapiens GN=NTM PE=1 SV=1 - [NTRI_HUMAN] Q9P121 0,0363 9,68 STS wt LTS wt
Neutrophil collagenase OS=Homo sapiens GN=MMP8 PE=1 SV=1 - [MMP8_HUMAN] P22894 0,037 2,59 LTS wt STS wt
Nuclear pore complex protein Nup93 OS=Homo sapiens GN=NUP93 PE=1 SV=2 - [NUP93_HUMAN] Q8N1F7 0,00963 5,36 STS wt LTS wt
OCIA domain-containing protein 2 OS=Homo sapiens GN=OCIAD2 PE=1 SV=1 - [OCAD2_HUMAN] Q56VL3 0,0485 4,25 LTS wt STS wt
PDZ domain-containing protein GIPC1 OS=Homo sapiens GN=GIPC1 PE=1 SV=2 - [GIPC1_HUMAN] O14908 0,0153 1,94 STS wt LTS wt
Peroxiredoxin-1 OS=Homo sapiens GN=PRDX1 PE=1 SV=1 - [PRDX1_HUMAN] Q06830 0,0227 1,85 STS wt LTS wt
Peroxiredoxin-5, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PRDX5 PE=1 SV=4 - [PRDX5_HUMAN] P30044 0,0297 1,74 STS wt LTS wt
Peroxiredoxin-6 OS=Homo sapiens GN=PRDX6 PE=1 SV=3 - [PRDX6_HUMAN] P30041 0,0377 1,66 STS wt LTS wt
Peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase 1 OS=Homo sapiens GN=ACOX1 PE=1 SV=3 - [ACOX1_HUMAN] Q15067 0,0485 1,89 STS wt LTS wt
Phosphatidylethanolamine-binding protein 1 OS=Homo sapiens GN=PEBP1 PE=1 SV=3 - [PEBP1_HUMAN] P30086
0,0148 2,27 STS wt LTS wt
Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=GPX4 PE=1 SV=3 - [GPX4_HUMAN] P36969
0,00567 1,52 STS wt LTS wt
PITH domain-containing protein 1 OS=Homo sapiens GN=PITHD1 PE=1 SV=1 - [PITH1_HUMAN] Q9GZP4 0,0109 1,76 STS wt LTS wt
Anhang A
122
Tabelle 7.1: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSwt und STSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,05; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot-ID p-Wert Abundanz-
unterschied
Gruppe mit höherer
Abundanz
Gruppe mit niedrigerer Abundanz
Platelet-activating factor acetylhydrolase IB subunit alpha OS=Homo sapiens GN=PAFAH1B1 PE=1 SV=2 - [LIS1_HUMAN] P43034
0,0496 1,62 STS wt LTS wt
Prenylcysteine oxidase 1 OS=Homo sapiens GN=PCYOX1 PE=1 SV=3 - [PCYOX_HUMAN] Q9UHG3 0,0287 1,54 STS wt LTS wt
Propionyl-CoA carboxylase alpha chain, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PCCA PE=1 SV=4 - [PCCA_HUMAN] P05165
0,0043 5,25 STS wt LTS wt
Prostaglandin reductase 1 OS=Homo sapiens GN=PTGR1 PE=1 SV=2 - [PTGR1_HUMAN] Q14914 0,0306 1,53 STS wt LTS wt
Proteasome subunit beta type-1 OS=Homo sapiens GN=PSMB1 PE=1 SV=2 - [PSB1_HUMAN] P20618 0,0421 1,63 STS wt LTS wt
Proteasome subunit beta type-2 OS=Homo sapiens GN=PSMB2 PE=1 SV=1 - [PSB2_HUMAN] P49721 0,0203 1,51 STS wt LTS wt
Proteasome subunit beta type-3 OS=Homo sapiens GN=PSMB3 PE=1 SV=2 - [PSB3_HUMAN] P49720 0,0376 1,72 STS wt LTS wt
Protein CDV3 homolog OS=Homo sapiens GN=CDV3 PE=1 SV=1 - [CDV3_HUMAN] Q9UKY7 0,042 2,68 LTS wt STS wt
Protein DJ-1 OS=Homo sapiens GN=PARK7 PE=1 SV=2 - [PARK7_HUMAN] Q99497 0,00407 2,43 STS wt LTS wt
Protein QIL1 OS=Homo sapiens GN=QIL1 PE=1 SV=1 - [QIL1_HUMAN] Q5XKP0 0,0255 3,08 STS wt LTS wt
Purine nucleoside phosphorylase OS=Homo sapiens GN=PNP PE=1 SV=2 - [PNPH_HUMAN] P00491 0,00703 2,64 STS wt LTS wt
Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha, somatic form, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PDHA1 PE=1 SV=3 - [ODPA_HUMAN] P08559
0,00336 2,82 STS wt LTS wt
Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PDHB PE=1 SV=3 - [ODPB_HUMAN] P11177
0,00084 2,04 STS wt LTS wt
Quinone oxidoreductase OS=Homo sapiens GN=CRYZ PE=1 SV=1 - [QOR_HUMAN] Q08257 0,00839 1,96 STS wt LTS wt
Rab GDP dissociation inhibitor alpha OS=Homo sapiens GN=GDI1 PE=1 SV=2 - [GDIA_HUMAN] P31150 0,00711 1,86 STS wt LTS wt
Rab GDP dissociation inhibitor beta OS=Homo sapiens GN=GDI2 PE=1 SV=2 - [GDIB_HUMAN] P50395 0,00772 1,85 STS wt LTS wt
Ras-related protein Rab-18 OS=Homo sapiens GN=RAB18 PE=1 SV=1 - [RAB18_HUMAN] Q9NP72 0,035 1,92 STS wt LTS wt
Ras-related protein Rab-1B OS=Homo sapiens GN=RAB1B PE=1 SV=1 - [RAB1B_HUMAN] Q9H0U4 0,00935 2,64 STS wt LTS wt
Ras-related protein Rab-2A OS=Homo sapiens GN=RAB2A PE=1 SV=1 - [RAB2A_HUMAN] P61019 0,0117 2,57 STS wt LTS wt
Ras-related protein Rab-7a OS=Homo sapiens GN=RAB7A PE=1 SV=1 - [RAB7A_HUMAN] P51149 0,0163 1,65 STS wt LTS wt
Ras-related protein Ral-A OS=Homo sapiens GN=RALA PE=1 SV=1 - [RALA_HUMAN] P11233 0,0204 3,2 STS wt LTS wt
Septin-8 OS=Homo sapiens GN=SEPT8 PE=1 SV=4 - [SEPT8_HUMAN] Q92599 0,0407 1,89 STS wt LTS wt
Anhang A
123
Tabelle 7.1: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSwt und STSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,05; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot-ID p-Wert Abundanz-
unterschied
Gruppe mit höherer
Abundanz
Gruppe mit niedrigerer Abundanz
Serine/threonine-protein phosphatase 2B catalytic subunit alpha isoform OS=Homo sapiens GN=PPP3CA PE=1 SV=1 - [PP2BA_HUMAN] Q08209
0,0387 2,45 STS wt LTS wt
Sex hormone-binding globulin OS=Homo sapiens GN=SHBG PE=1 SV=2 - [SHBG_HUMAN] P04278 0,0145 6,63 STS wt LTS wt
SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein 2 OS=Homo sapiens GN=SH3BGRL2 PE=1 SV=2 - [SH3L2_HUMAN] Q9UJC5
0,0228 6,49 STS wt LTS wt
SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein OS=Homo sapiens GN=SH3BGRL PE=1 SV=1 - [SH3L1_HUMAN] O75368
0,0201 2,02 STS wt LTS wt
Sideroflexin-1 OS=Homo sapiens GN=SFXN1 PE=1 SV=4 - [SFXN1_HUMAN] Q9H9B4 0,00861 1,82 STS wt LTS wt
Sorbitol dehydrogenase OS=Homo sapiens GN=SORD PE=1 SV=4 - [DHSO_HUMAN] Q00796 0,00642 3,23 STS wt LTS wt
Spectrin alpha chain, brain OS=Homo sapiens GN=SPTAN1 PE=1 SV=3 - [SPTA2_HUMAN] Q13813 0,00909 1,6 STS wt LTS wt
Structural maintenance of chromosomes protein 3 OS=Homo sapiens GN=SMC3 PE=1 SV=2 - [SMC3_HUMAN] Q9UQE7
0,00303 3,67 LTS wt STS wt
Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=SUCLA2 PE=1 SV=3 - [SUCB1_HUMAN] Q9P2R7
0,0453 1,9 STS wt LTS wt
Sulfide:quinone oxidoreductase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=SQRDL PE=1 SV=1 - [SQRD_HUMAN] Q9Y6N5
0,00424 3,06 STS wt LTS wt
Synaptobrevin homolog YKT6 OS=Homo sapiens GN=YKT6 PE=1 SV=1 - [YKT6_HUMAN] O15498 0,0193 2,55 STS wt LTS wt
Synemin OS=Homo sapiens GN=SYNM PE=1 SV=2 - [SYNEM_HUMAN] O15061 0,0257 1,97 LTS wt STS wt
Thioredoxin OS=Homo sapiens GN=TXN PE=1 SV=3 - [THIO_HUMAN] P10599 0,0398 1,93 STS wt LTS wt
Thioredoxin-dependent peroxide reductase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PRDX3 PE=1 SV=3 - [PRDX3_HUMAN] P30048
0,00976 2,33 STS wt LTS wt
Thymidine phosphorylase OS=Homo sapiens GN=TYMP PE=1 SV=2 - [TYPH_HUMAN] P19971 0,0472 2,01 LTS wt STS wt
Transforming protein RhoA OS=Homo sapiens GN=RHOA PE=1 SV=1 - [RHOA_HUMAN] P61586 0,0302 3,72 STS wt LTS wt
Transmembrane emp24 domain-containing protein 2 OS=Homo sapiens GN=TMED2 PE=1 SV=1 - [TMED2_HUMAN] Q15363
0,0499 2,12 STS wt LTS wt
Tropomyosin alpha-4 chain OS=Homo sapiens GN=TPM4 PE=1 SV=3 - [TPM4_HUMAN] P67936 0,00962 2,41 LTS wt STS wt
TSC22 domain family protein 4 OS=Homo sapiens GN=TSC22D4 PE=1 SV=2 - [T22D4_HUMAN] Q9Y3Q8 0,0259 1,75 LTS wt STS wt
Tubulin alpha-4A chain OS=Homo sapiens GN=TUBA4A PE=1 SV=1 - [TBA4A_HUMAN] P68366 0,0309 3 STS wt LTS wt
Anhang A
124
Tabelle 7.1: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSwt und STSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,05; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot-ID p-Wert Abundanz-
unterschied
Gruppe mit höherer
Abundanz
Gruppe mit niedrigerer Abundanz
Tumor protein D54 OS=Homo sapiens GN=TPD52L2 PE=1 SV=2 - [TPD54_HUMAN] O43399 0,00558 4,27 LTS wt STS wt
Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11 OS=Homo sapiens GN=PTPN11 PE=1 SV=2 - [PTN11_HUMAN] Q06124
0,0169 2,34 STS wt LTS wt
Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 14 OS=Homo sapiens GN=USP14 PE=1 SV=3 - [UBP14_HUMAN] P54578 0,0163 1,55 STS wt LTS wt
Ubiquitin-associated protein 2-like OS=Homo sapiens GN=UBAP2L PE=1 SV=2 - [UBP2L_HUMAN] Q14157 0,0198 2,12 LTS wt STS wt
Up-regulated during skeletal muscle growth protein 5 OS=Homo sapiens GN=USMG5 PE=1 SV=1 - [USMG5_HUMAN] Q96IX5
0,0179 2,57 STS wt LTS wt
Vacuolar protein sorting-associated protein 26A OS=Homo sapiens GN=VPS26A PE=1 SV=2 - [VP26A_HUMAN] O75436
0,00195 3,42 STS wt LTS wt
Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 OS=Homo sapiens GN=VDAC1 PE=1 SV=2 - [VDAC1_HUMAN] P21796
0,00602 1,72 STS wt LTS wt
Voltage-dependent anion-selective channel protein 3 OS=Homo sapiens GN=VDAC3 PE=1 SV=1 - [VDAC3_HUMAN] Q9Y277
0,00563 2,03 STS wt LTS wt
V-type proton ATPase subunit B, brain isoform OS=Homo sapiens GN=ATP6V1B2 PE=1 SV=3 - [VATB2_HUMAN] P21281
0,0197 1,8 STS wt LTS wt
V-type proton ATPase subunit C 1 OS=Homo sapiens GN=ATP6V1C1 PE=1 SV=4 - [VATC1_HUMAN] P21283 0,0315 1,72 STS wt LTS wt
V-type proton ATPase subunit E 1 OS=Homo sapiens GN=ATP6V1E1 PE=1 SV=1 - [VATE1_HUMAN] P36543 0,00493 2,45 STS wt LTS wt
V-type proton ATPase subunit H OS=Homo sapiens GN=ATP6V1H PE=1 SV=1 - [VATH_HUMAN] Q9UI12 0,00364 4,95 STS wt LTS wt
V-type proton ATPase subunit S1 OS=Homo sapiens GN=ATP6AP1 PE=1 SV=2 - [VAS1_HUMAN] Q15904 0,0273 3,03 STS wt LTS wt
Anhang A
125
Tabelle 7.2: Genset mitochondriale Proteine für SOM-Analysen (wird fortgesetzt)
Proteinbeschreibung Uniprot-ID Rang Abundanz-
unterschied STS/LTS
p-Wert
abhydrolase domain containing 10 [Source:HGNC Symbol;Acc:25656] Q9NUJ1 92 3,71 0,025375
acyl-CoA thioesterase 7 [Source:HGNC Symbol;Acc:24157] O00154 574 1,97 0,22052896
ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial Fo complex, subunit F2 [Source:HGNC Symbol;Acc:848] P56134 89 3,80 0,0242358
ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial Fo complex, subunit G [Source:HGNC Symbol;Acc:14247] O75964 648 1,94 0,25271117
carbohydrate kinase domain containing [Source:HGNC Symbol;Acc:25576] Q8IW45 650 1,99 0,25298477
cathepsin A [Source:HGNC Symbol;Acc:9251] P10619 156 4,32 0,0502
chromosome 19 open reading frame 70 [Source:HGNC Symbol;Acc:33702] Q5XKP0 83 4,11 0,02346333
cytochrome b5 type A (microsomal) [Source:HGNC Symbol;Acc:2570] P00167 41 5,49 0,00860011
cytochrome c oxidase subunit VIc [Source:HGNC Symbol;Acc:2285] P09669 311 2,67 0,12001089
dihydroorotate dehydrogenase (quinone) [Source:HGNC Symbol;Acc:2867] Q02127 453 2,43 0,17354125
dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1 [Source:HGNC Symbol;Acc:2715] O94760 709 1,72 0,27374214
dynamin 3 [Source:HGNC Symbol;Acc:29125] Q9UQ16 28 6,82 0,00310705
galactosylceramidase [Source:HGNC Symbol;Acc:4115] P54803 223 3,06 0,08451885
histidine triad nucleotide binding protein 3 [Source:HGNC Symbol;Acc:18468] Q9NQE9 530 2,30 0,20478666
mitochondrial pyruvate carrier 2 [Source:HGNC Symbol;Acc:24515] O95563 77 6,13 0,02056085
mitochondrial ribosomal protein S23 [Source:HGNC Symbol;Acc:14509] Q9Y3D9 64 6,91 0,01448438
mitochondrially encoded ATP synthase 6 [Source:HGNC Symbol;Acc:7414] P00846 418 2,62 0,15929575
monoamine oxidase B [Source:HGNC Symbol;Acc:6834] P27338 1630 1,31 0,61709278
NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 12 [Source:HGNC Symbol;Acc:23987] Q9UI09 148 3,50 0,04863466
NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 13 [Source:HGNC Symbol;Acc:17194] Q9P0J0 1383 1,42 0,52618321
NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 6, 14kDa [Source:HGNC Symbol;Acc:7690] P56556 362 2,62 0,13801353
NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 8, 19kDa [Source:HGNC Symbol;Acc:7692] P51970 545 1,97 0,21070772
NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 4, 18kDa (NADH-coenzyme Q reductase) [Source:HGNC Symbol;Acc:7711] O43181 327 2,72 0,12514471
N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein, gamma [Source:HGNC Symbol;Acc:7642] Q99747 1286 1,59 0,49506766
NFS1 nitrogen fixation 1 homolog (S. cerevisiae) [Source:HGNC Symbol;Acc:15910] Q9Y697 479 2,98 0,18447989
prohibitin 2 [Source:HGNC Symbol;Acc:30306] Q99623 1001 1,57 0,38390266
prostaglandin E synthase 2 [Source:HGNC Symbol;Acc:17822] Q9H7Z7 529 1,99 0,20469818
protein tyrosine phosphatase, mitochondrial 1 [Source:HGNC Symbol;Acc:26965] Q8WUK0 620 2,31 0,23933121
pterin-4 alpha-carbinolamine dehydratase/dimerization cofactor of hepatocyte nuclear factor 1 alpha (TCF1) 2 [Source:HGNC Symbol;Acc:24474]
Q9H0N5 1255 1,63 0,48042243
Anhang A
126
Tabelle 7.2: Genset mitochondriale Proteine für SOM-Analysen (Fortsetzung)
Proteinbeschreibung Uniprot-ID Rang Abundanz-
unterschied STS/LTS
p-Wert
pyruvate dehydrogenase complex, component X [Source:HGNC Symbol;Acc:21350] O00330 1000 1,88 0,38364459
quinoid dihydropteridine reductase [Source:HGNC Symbol;Acc:9752] P09417 532 1,98 0,20542787
RAB1B, member RAS oncogene family [Source:HGNC Symbol;Acc:18370] Q9H0U4 182 3,08 0,05828872
ras homolog family member A [Source:HGNC Symbol;Acc:667] P61586 108 3,71 0,03130816
ribosomal protein S15a [Source:HGNC Symbol;Acc:10389] P62244 252 2,76 0,09449992
solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; adenine nucleotide translocator), member 4 [Source:HGNC Symbol;Acc:10990] P12235 21 8,85 0,00183946
solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; oxoglutarate carrier), member 11 [Source:HGNC Symbol;Acc:10981] Q02978 123 3,16 0,0370303
translocase of inner mitochondrial membrane 13 homolog (yeast) [Source:HGNC Symbol;Acc:11816] Q9Y5L4 283 3,10 0,11057395
ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein [Source:HGNC Symbol;Acc:12582] P14927 900 1,64 0,34613443
ubiquinol-cytochrome c reductase, complex III subunit X [Source:HGNC Symbol;Acc:30863] Q9UDW1 187 3,90 0,05923736
zinc binding alcohol dehydrogenase domain containing 2 [Source:HGNC Symbol;Acc:28697] Q8N4Q0 804 1,67 0,30788195
Anhang A
127
Tabelle 7.3 Proteine mit mitochondrialer Lokalisation aus der Gruppe der in STSwt differentiell hochregulierten Proteine (Filterkriterien: p-Wert<0,05; Abundanzunterschied>1,5; mind. 1 quantifizierte Peptide) (wird fortgesetzt).
Proteinbeschreibung Uniprot-
ID p-Wert
Abundanz-unterschied
2-oxoglutarate dehydrogenase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=OGDH PE=1 SV=3 - [ODO1_HUMAN] Q02218 0,0493185 1,92
3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 OS=Homo sapiens GN=HSD17B10 PE=1 SV=3 - [HCD2_HUMAN] Q99714 0,02750335 1,72
4-aminobutyrate aminotransferase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ABAT PE=1 SV=3 - [GABT_HUMAN] P80404 0,03269914 2,26
Abhydrolase domain-containing protein 10, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ABHD10 PE=1 SV=1 - [ABHDA_HUMAN] Q9NUJ1 0,00383425 2,81
Acetyl-CoA acetyltransferase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ACAT1 PE=1 SV=1 - [THIL_HUMAN] P24752 0,02968135 1,84
Acetyl-coenzyme A synthetase 2-like, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ACSS1 PE=1 SV=2 - [ACS2L_HUMAN] Q9NUB1 0,02911815 6,59
Aconitate hydratase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ACO2 PE=1 SV=2 - [ACON_HUMAN] Q99798 0,0034399 1,63
Acylglycerol kinase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=AGK PE=1 SV=2 - [AGK_HUMAN] Q53H12 0,02849418 5,23
Acylpyruvase FAHD1, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=FAHD1 PE=1 SV=2 - [FAHD1_HUMAN] Q6P587 0,04646738 2,57
ADP/ATP translocase 1 OS=Homo sapiens GN=SLC25A4 PE=1 SV=4 - [ADT1_HUMAN] P12235 0,01620438 3,07
ADP/ATP translocase 2 OS=Homo sapiens GN=SLC25A5 PE=1 SV=7 - [ADT2_HUMAN] P05141 0,0246712 1,59
ADP/ATP translocase 3 OS=Homo sapiens GN=SLC25A6 PE=1 SV=4 - [ADT3_HUMAN] P12236 0,01731176 2,72
Aflatoxin B1 aldehyde reductase member 2 OS=Homo sapiens GN=AKR7A2 PE=1 SV=3 - [ARK72_HUMAN] O43488 0,01577238 1,59
Aspartate aminotransferase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=GOT2 PE=1 SV=3 - [AATM_HUMAN] P00505 0,00547246 2,01
ATP synthase subunit alpha, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ATP5A1 PE=1 SV=1 - [ATPA_HUMAN] P25705 0,03198815 1,74
ATP synthase subunit f, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ATP5J2 PE=1 SV=3 - [ATPK_HUMAN] P56134 0,00644263 2,56
ATP synthase subunit gamma, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ATP5C1 PE=1 SV=1 - [ATPG_HUMAN] P36542 0,02527186 2,18
ATP synthase subunit s, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ATP5S PE=1 SV=3 - [ATP5S_HUMAN] Q99766 0,00316216 3,89
ATP-binding cassette sub-family E member 1 OS=Homo sapiens GN=ABCE1 PE=1 SV=1 - [ABCE1_HUMAN] P61221 0,04779007 1,9
Bcl-2-like protein 13 OS=Homo sapiens GN=BCL2L13 PE=1 SV=1 - [B2L13_HUMAN] Q9BXK5 0,00528076 3,32
cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha OS=Homo sapiens GN=PRKACA PE=1 SV=2 - [KAPCA_HUMAN] P17612 0,02618255 2,46
Cytochrome b5 OS=Homo sapiens GN=CYB5A PE=1 SV=2 - [CYB5_HUMAN] P00167 0,03570398 5,67
Cytochrome b-c1 complex subunit 1, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=UQCRC1 PE=1 SV=3 - [QCR1_HUMAN] P31930 0,02637675 1,57
Cytochrome b-c1 complex subunit 2, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=UQCRC2 PE=1 SV=3 - [QCR2_HUMAN] P22695 0,00188887 1,97
Cytochrome b-c1 complex subunit 9 OS=Homo sapiens GN=UQCR10 PE=1 SV=3 - [QCR9_HUMAN] Q9UDW1 0,04984692 12,51
Cytochrome b-c1 complex subunit Rieske, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=UQCRFS1 PE=1 SV=2 - [UCRI_HUMAN] P47985 0,03370207 2,42
Cytochrome c oxidase subunit 2 OS=Homo sapiens GN=MT-CO2 PE=1 SV=1 - [COX2_HUMAN] P00403 0,02805793 2,53
Anhang A
128
Tabelle 7.3: Proteine mit mitochondrialer Lokalisation aus der Gruppe der in STSwt differentiell hochregulierten Proteine (Filterkriterien: p-Wert<0,05; Abundanzunterschied>1,5; mind. 1 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot-
ID p-Wert
Abundanz-unterschied
Cytosolic acyl coenzyme A thioester hydrolase OS=Homo sapiens GN=ACOT7 PE=1 SV=3 - [BACH_HUMAN] O00154 0,03984679 2,07
Dihydrolipoyl dehydrogenase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=DLD PE=1 SV=2 - [DLDH_HUMAN] P09622 0,04779886 1,86
Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=DLST PE=1 SV=4 - [ODO2_HUMAN]
P36957 0,00825042 1,67
Dynamin-1-like protein OS=Homo sapiens GN=DNM1L PE=1 SV=2 - [DNM1L_HUMAN] O00429 0,00118562 2,01
Electron transfer flavoprotein subunit alpha, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ETFA PE=1 SV=1 - [ETFA_HUMAN] P13804 0,04424481 1,57
Enoyl-CoA delta isomerase 1, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ECI1 PE=1 SV=1 - [ECI1_HUMAN] P42126 0,02153966 2,35
Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ECHS1 PE=1 SV=4 - [ECHM_HUMAN] P30084 0,00530987 2,11
Fumarate hydratase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=FH PE=1 SV=3 - [FUMH_HUMAN] P07954 0,00091211 2,08
Glutaminase kidney isoform, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=GLS PE=1 SV=1 - [GLSK_HUMAN] O94925 0,03070775 2,29
Hydroxyacylglutathione hydrolase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=HAGH PE=1 SV=2 - [GLO2_HUMAN] Q16775 0,00963593 2,6
Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit alpha, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=IDH3A PE=1 SV=1 - [IDH3A_HUMAN] P50213 0,00622604 2,14
Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit beta, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=IDH3B PE=1 SV=2 - [IDH3B_HUMAN] O43837 0,01863346 4,66
Malate dehydrogenase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=MDH2 PE=1 SV=3 - [MDHM_HUMAN] P40926 0,01267695 1,71
Mitochondrial 2-oxoglutarate/malate carrier protein OS=Homo sapiens GN=SLC25A11 PE=1 SV=3 - [M2OM_HUMAN] Q02978 0,02134188 2,45
Mitochondrial fission 1 protein OS=Homo sapiens GN=FIS1 PE=1 SV=2 - [FIS1_HUMAN] Q9Y3D6 0,03274604 1,99
Mitochondrial import receptor subunit TOM22 homolog OS=Homo sapiens GN=TOMM22 PE=1 SV=3 - [TOM22_HUMAN] Q9NS69 0,03093709 3,14
Mitochondrial pyruvate carrier 2 OS=Homo sapiens GN=MPC2 PE=1 SV=1 - [MPC2_HUMAN] O95563 0,0289065 10,42
NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 9, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=NDUFA9 PE=1 SV=2 - [NDUA9_HUMAN]
Q16795 0,03475121 4,15
NADH-cytochrome b5 reductase 3 OS=Homo sapiens GN=CYB5R3 PE=1 SV=3 - [NB5R3_HUMAN] P00387 0,00945441 2,36
Peroxiredoxin-5, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PRDX5 PE=1 SV=4 - [PRDX5_HUMAN] P30044 0,02967725 1,74
Peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase 1 OS=Homo sapiens GN=ACOX1 PE=1 SV=3 - [ACOX1_HUMAN] Q15067 0,04848902 1,89
Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=GPX4 PE=1 SV=3 - [GPX4_HUMAN] P36969 0,00567358 1,52
Protein DJ-1 OS=Homo sapiens GN=PARK7 PE=1 SV=2 - [PARK7_HUMAN] Q99497 0,00407046 2,43
Protein-tyrosine phosphatase mitochondrial 1 OS=Homo sapiens GN=PTPMT1 PE=1 SV=1 - [PTPM1_HUMAN] Q8WUK0 0,03238109 3,98
Anhang A
129
Tabelle 7.3: Proteine mit mitochondrialer Lokalisation aus der Gruppe der in STSwt differentiell hochregulierten Proteine (Filterkriterien: p-Wert<0,05; Abundanzunterschied>1,5; mind. 1 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot-
ID p-Wert
Abundanz-unterschied
Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha, somatic form, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PDHA1 PE=1 SV=3 - [ODPA_HUMAN]
P08559 0,00336152 2,82
Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PDHB PE=1 SV=3 - [ODPB_HUMAN] P11177 0,00084003 2,04
Serine/threonine-protein phosphatase 2B catalytic subunit alpha isoform OS=Homo sapiens GN=PPP3CA PE=1 SV=1 - [PP2BA_HUMAN] Q08209 0,03872187 2,45
Sideroflexin-1 OS=Homo sapiens GN=SFXN1 PE=1 SV=4 - [SFXN1_HUMAN] Q9H9B4 0,008614 1,82
Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=SUCLA2 PE=1 SV=3 - [SUCB1_HUMAN] Q9P2R7 0,04527218 1,9
Thioredoxin-dependent peroxide reductase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PRDX3 PE=1 SV=3 - [PRDX3_HUMAN] P30048 0,00976133 2,33
Tricarboxylate transport protein, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=SLC25A1 PE=1 SV=2 - [TXTP_HUMAN] P53007 0,0197129 3,64
Tyrosine-protein kinase Lyn OS=Homo sapiens GN=LYN PE=1 SV=3 - [LYN_HUMAN] P07948 0,00909144 5,19
Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11 OS=Homo sapiens GN=PTPN11 PE=1 SV=2 - [PTN11_HUMAN] Q06124 0,01686089 2,34
Up-regulated during skeletal muscle growth protein 5 OS=Homo sapiens GN=USMG5 PE=1 SV=1 - [USMG5_HUMAN] Q96IX5 0,01792869 2,57
Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 OS=Homo sapiens GN=VDAC1 PE=1 SV=2 - [VDAC1_HUMAN] P21796 0,00601559 1,72
Voltage-dependent anion-selective channel protein 3 OS=Homo sapiens GN=VDAC3 PE=1 SV=1 - [VDAC3_HUMAN] Q9Y277 0,00562827 2,03
V-type proton ATPase subunit E 1 OS=Homo sapiens GN=ATP6V1E1 PE=1 SV=1 - [VATE1_HUMAN] P36543 0,00493257 2,45
Anhang A
130
Tabelle 7.4: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSmut und LTSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,01; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (wird fortgesetzt).
Proteinbeschreibung Uniprot
ID p-Wert
Abundanz-unterschied
Gruppe mit höherer
Abundanz
Gruppe mit niedrigerer Abundanz
14-3-3 protein theta OS=Homo sapiens GN=YWHAQ PE=1 SV=1 - [1433T_HUMAN] P27348 0,00223 2,05 LTS mut LTS wt
26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 11 OS=Homo sapiens GN=PSMD11 PE=1 SV=3 - [PSD11_HUMAN]
O00231 0,00188 2,02 LTS mut LTS wt
Abl interactor 1 OS=Homo sapiens GN=ABI1 PE=1 SV=4 - [ABI1_HUMAN] Q8IZP0 0,000543 3,29 LTS mut LTS wt
Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A OS=Homo sapiens GN=ANP32A PE=1 SV=1 - [AN32A_HUMAN]
P39687 0,00659 2,3 LTS mut LTS wt
Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member E OS=Homo sapiens GN=ANP32E PE=1 SV=1 - [AN32E_HUMAN]
Q9BTT0 0,00663 5,05 LTS mut LTS wt
Alpha-actinin-1 OS=Homo sapiens GN=ACTN1 PE=1 SV=2 - [ACTN1_HUMAN] P12814 0,0014 2,23 LTS wt LTS mut
Annexin A1 OS=Homo sapiens GN=ANXA1 PE=1 SV=2 - [ANXA1_HUMAN] P04083 0,00000736 7,04 LTS wt LTS mut
Annexin A2 OS=Homo sapiens GN=ANXA2 PE=1 SV=2 - [ANXA2_HUMAN] P07355 0,0000179 4,19 LTS wt LTS mut
Annexin A5 OS=Homo sapiens GN=ANXA5 PE=1 SV=2 - [ANXA5_HUMAN] P08758 0,00641 1,91 LTS wt LTS mut
Apolipoprotein L2 OS=Homo sapiens GN=APOL2 PE=1 SV=1 - [APOL2_HUMAN] Q9BQE5 0,00852 2,69 LTS wt LTS mut
Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD OS=Homo sapiens GN=PYCARD PE=1 SV=2 - [ASC_HUMAN]
Q9ULZ3 0,000101 21,75 LTS wt LTS mut
Ataxin-10 OS=Homo sapiens GN=ATXN10 PE=1 SV=1 - [ATX10_HUMAN] Q9UBB4 0,0078 4,35 LTS mut LTS wt
ATP synthase subunit beta, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ATP5B PE=1 SV=3 - [ATPB_HUMAN] P06576 0,00236 2,25 LTS mut LTS wt
Beta-adducin OS=Homo sapiens GN=ADD2 PE=1 SV=3 - [ADDB_HUMAN] P35612 0,00247 2,7 LTS mut LTS wt
Brevican core protein OS=Homo sapiens GN=BCAN PE=1 SV=2 - [PGCB_HUMAN] Q96GW7 0,00643 5,64 LTS mut LTS wt
BTB/POZ domain-containing protein KCTD12 OS=Homo sapiens GN=KCTD12 PE=1 SV=1 - [KCD12_HUMAN] Q96CX2 0,00502 1,86 LTS wt LTS mut
Carbonyl reductase [NADPH] 1 OS=Homo sapiens GN=CBR1 PE=1 SV=3 - [CBR1_HUMAN] P16152 0,00000799 4,76 LTS wt LTS mut
Carboxypeptidase Q OS=Homo sapiens GN=CPQ PE=1 SV=1 - [CBPQ_HUMAN] Q9Y646 0,000536 3,63 LTS wt LTS mut
Casein kinase II subunit beta OS=Homo sapiens GN=CSNK2B PE=1 SV=1 - [CSK2B_HUMAN] P67870 0,00676 2,06 LTS mut LTS wt
CD166 antigen OS=Homo sapiens GN=ALCAM PE=1 SV=2 - [CD166_HUMAN] Q13740 0,000311 8,71 LTS mut LTS wt
CD44 antigen OS=Homo sapiens GN=CD44 PE=1 SV=3 - [CD44_HUMAN] P16070 0,00607 4,89 LTS wt LTS mut
Chitinase-3-like protein 1 OS=Homo sapiens GN=CHI3L1 PE=1 SV=2 - [CH3L1_HUMAN] P36222 0,00031 11,24 LTS wt LTS mut
Anhang A
131
Tabelle 7.4: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSmut und LTSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,01; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot
ID p-Wert
Abundanz-unterschied
Gruppe mit höherer
Abundanz
Gruppe mit niedrigerer Abundanz
Chloride intracellular channel protein 1 OS=Homo sapiens GN=CLIC1 PE=1 SV=4 - [CLIC1_HUMAN] O00299 0,00000185 3,41 LTS wt LTS mut
Chromobox protein homolog 1 OS=Homo sapiens GN=CBX1 PE=1 SV=1 - [CBX1_HUMAN] P83916 0,00718 3,7 LTS mut LTS wt
Chromobox protein homolog 3 OS=Homo sapiens GN=CBX3 PE=1 SV=4 - [CBX3_HUMAN] Q13185 0,00354 2,25 LTS mut LTS wt
Cold-inducible RNA-binding protein OS=Homo sapiens GN=CIRBP PE=1 SV=1 - [CIRBP_HUMAN] Q14011 0,00879 2,57 LTS mut LTS wt
Core histone macro-H2A,1 OS=Homo sapiens GN=H2AFY PE=1 SV=4 - [H2AY_HUMAN] O75367 0,00479 2,2 LTS mut LTS wt
Core histone macro-H2A,2 OS=Homo sapiens GN=H2AFY2 PE=1 SV=3 - [H2AW_HUMAN] Q9P0M6 0,000815 6,71 LTS mut LTS wt
C-terminal-binding protein 1 OS=Homo sapiens GN=CTBP1 PE=1 SV=2 - [CTBP1_HUMAN] Q13363 0,00306 3,4 LTS mut LTS wt
Cysteine and glycine-rich protein 1 OS=Homo sapiens GN=CSRP1 PE=1 SV=3 - [CSRP1_HUMAN] P21291 0,00732 1,74 LTS wt LTS mut
Cytochrome c1, heme protein, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=CYC1 PE=1 SV=3 - [CY1_HUMAN] P08574 0,0061 2,46 LTS mut LTS wt
Cytoplasmic dynein 1 light intermediate chain 1 OS=Homo sapiens GN=DYNC1LI1 PE=1 SV=3 - [DC1L1_HUMAN]
Q9Y6G9 0,00247 3,7 LTS mut LTS wt
Cytosol aminopeptidase OS=Homo sapiens GN=LAP3 PE=1 SV=3 - [AMPL_HUMAN] P28838 0,00524 2,06 LTS wt LTS mut
DBIRD complex subunit KIAA1967 OS=Homo sapiens GN=KIAA1967 PE=1 SV=2 - [K1967_HUMAN] Q8N163 0,00803 2,72 LTS mut LTS wt
Delta(3,5)-Delta(2,4)-dienoyl-CoA isomerase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ECH1 PE=1 SV=2 - [ECH1_HUMAN]
Q13011 0,00877 2,42 LTS mut LTS wt
DnaJ homolog subfamily C member 8 OS=Homo sapiens GN=DNAJC8 PE=1 SV=2 - [DNJC8_HUMAN] O75937 0,00361 2,26 LTS mut LTS wt
Drebrin OS=Homo sapiens GN=DBN1 PE=1 SV=4 - [DREB_HUMAN] Q16643 0,00101 3,8 LTS mut LTS wt
Dynactin subunit 2 OS=Homo sapiens GN=DCTN2 PE=1 SV=4 - [DCTN2_HUMAN] Q13561 0,00825 2,14 LTS mut LTS wt
Dynamin-1-like protein OS=Homo sapiens GN=DNM1L PE=1 SV=2 - [DNM1L_HUMAN] O00429 0,00205 2,06 LTS mut LTS wt
Dynamin-3 OS=Homo sapiens GN=DNM3 PE=1 SV=4 - [DYN3_HUMAN] Q9UQ16 0,00814 9,23 LTS mut LTS wt
ELAV-like protein 1 OS=Homo sapiens GN=ELAVL1 PE=1 SV=2 - [ELAV1_HUMAN] Q15717 0,00948 2,07 LTS mut LTS wt
ELAV-like protein 4 OS=Homo sapiens GN=ELAVL4 PE=1 SV=2 - [ELAV4_HUMAN] P26378 0,00998 2,86 LTS mut LTS wt
Eukaryotic initiation factor 4A-III OS=Homo sapiens GN=EIF4A3 PE=1 SV=4 - [IF4A3_HUMAN] P38919 0,00323 2,27 LTS mut LTS wt
Anhang A
132
Tabelle 7.4: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSmut und LTSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,01; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot
ID p-Wert
Abundanz-unterschied
Gruppe mit höherer
Abundanz
Gruppe mit niedrigerer Abundanz
Filamin-A OS=Homo sapiens GN=FLNA PE=1 SV=4 - [FLNA_HUMAN] P21333 0,00463 3,12 LTS wt LTS mut
Galectin-1 OS=Homo sapiens GN=LGALS1 PE=1 SV=2 - [LEG1_HUMAN] P09382 0,00912 2,52 LTS wt LTS mut
Galectin-3 OS=Homo sapiens GN=LGALS3 PE=1 SV=5 - [LEG3_HUMAN] P17931 0,00000902 18,35 LTS wt LTS mut
Glutathione S-transferase Mu 1 OS=Homo sapiens GN=GSTM1 PE=1 SV=3 - [GSTM1_HUMAN] P09488 0,00299 11,88 LTS wt LTS mut
Glutathione synthetase OS=Homo sapiens GN=GSS PE=1 SV=1 - [GSHB_HUMAN] P48637 0,00311 2,28 LTS wt LTS mut
Glycogen phosphorylase, liver form OS=Homo sapiens GN=PYGL PE=1 SV=4 - [PYGL_HUMAN] P06737 0,00289 6,86 LTS wt LTS mut
Heat shock-related 70 kDa protein 2 OS=Homo sapiens GN=HSPA2 PE=1 SV=1 - [HSP72_HUMAN] P54652 0,00993 2,47 LTS wt LTS mut
Hemoglobin subunit alpha OS=Homo sapiens GN=HBA1 PE=1 SV=2 - [HBA_HUMAN] P69905 0,00969 3,72 LTS wt LTS mut
Heterochromatin protein 1-binding protein 3 OS=Homo sapiens GN=HP1BP3 PE=1 SV=1 - [HP1B3_HUMAN] Q5SSJ5 0,00847 2,38 LTS mut LTS wt
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D0 OS=Homo sapiens GN=HNRNPD PE=1 SV=1 - [HNRPD_HUMAN]
Q14103 0,00222 2,14 LTS mut LTS wt
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D-like OS=Homo sapiens GN=HNRPDL PE=1 SV=3 - [HNRDL_HUMAN]
O14979 0,0065 2,13 LTS mut LTS wt
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H3 OS=Homo sapiens GN=HNRNPH3 PE=1 SV=2 - [HNRH3_HUMAN]
P31942 0,000709 2,81 LTS mut LTS wt
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K OS=Homo sapiens GN=HNRNPK PE=1 SV=1 - [HNRPK_HUMAN] P61978 0,00263 2,65 LTS mut LTS wt
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein R OS=Homo sapiens GN=HNRNPR PE=1 SV=1 - [HNRPR_HUMAN] O43390 0,0062 2,61 LTS mut LTS wt
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U OS=Homo sapiens GN=HNRNPU PE=1 SV=6 - [HNRPU_HUMAN] Q00839 0,00332 2,36 LTS mut LTS wt
Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1 OS=Homo sapiens GN=HNRNPA2B1 PE=1 SV=2 - [ROA2_HUMAN]
P22626 0,000633 1,93 LTS mut LTS wt
Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins C1/C2 OS=Homo sapiens GN=HNRNPC PE=1 SV=4 - [HNRPC_HUMAN]
P07910 0,0024 2,52 LTS mut LTS wt
Histone H2A,Z OS=Homo sapiens GN=H2AFZ PE=1 SV=2 - [H2AZ_HUMAN] P0C0S5 0,00238 2,3 LTS mut LTS wt
HLA class II histocompatibility antigen, DR alpha chain OS=Homo sapiens GN=HLA-DRA PE=1 SV=1 - [DRA_HUMAN]
P01903 0,00498 3,17 LTS wt LTS mut
Host cell factor 1 OS=Homo sapiens GN=HCFC1 PE=1 SV=2 - [HCFC1_HUMAN] P51610 0,00663 2,97 LTS mut LTS wt
Interleukin enhancer-binding factor 3 OS=Homo sapiens GN=ILF3 PE=1 SV=3 - [ILF3_HUMAN] Q12906 0,0082 2,73 LTS mut LTS wt
Anhang A
133
Tabelle 7.4: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSmut und LTSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,01; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot
ID p-Wert
Abundanz-unterschied
Gruppe mit höherer
Abundanz
Gruppe mit niedrigerer Abundanz
KH domain-containing, RNA-binding, signal transduction-associated protein 1 OS=Homo sapiens GN=KHDRBS1 PE=1 SV=1 - [KHDR1_HUMAN]
Q07666 0,00485 2,83 LTS mut LTS wt
Lamin-B2 OS=Homo sapiens GN=LMNB2 PE=1 SV=3 - [LMNB2_HUMAN] Q03252 0,000481 1,97 LTS mut LTS wt
Leucine-rich repeat-containing protein 47 OS=Homo sapiens GN=LRRC47 PE=1 SV=1 - [LRC47_HUMAN] Q8N1G4 0,00487 3,47 LTS mut LTS wt
Leukocyte elastase inhibitor OS=Homo sapiens GN=SERPINB1 PE=1 SV=1 - [ILEU_HUMAN] P30740 0,000976 3,85 LTS wt LTS mut
Macrophage-capping protein OS=Homo sapiens GN=CAPG PE=1 SV=2 - [CAPG_HUMAN] P40121 0,0000243 3,71 LTS wt LTS mut
Major vault protein OS=Homo sapiens GN=MVP PE=1 SV=4 - [MVP_HUMAN] Q14764 0,00139 2,81 LTS wt LTS mut
Matrin-3 OS=Homo sapiens GN=MATR3 PE=1 SV=2 - [MATR3_HUMAN] P43243 0,00952 2,39 LTS mut LTS wt
Metalloproteinase inhibitor 1 OS=Homo sapiens GN=TIMP1 PE=1 SV=1 - [TIMP1_HUMAN] P01033 0,00201 28 LTS wt LTS mut
Microfibrillar-associated protein 1 OS=Homo sapiens GN=MFAP1 PE=1 SV=2 - [MFAP1_HUMAN] P55081 0,00178 3,08 LTS mut LTS wt
Microtubule-associated protein 2 OS=Homo sapiens GN=MAP2 PE=1 SV=4 - [MAP2_HUMAN] P11137 0,00000641 4,44 LTS mut LTS wt
Moesin OS=Homo sapiens GN=MSN PE=1 SV=3 - [MOES_HUMAN] P26038 0,00000502 3,29 LTS wt LTS mut
Myelin expression factor 2 OS=Homo sapiens GN=MYEF2 PE=1 SV=3 - [MYEF2_HUMAN] Q9P2K5 0,0000629 2,4 LTS mut LTS wt
Myosin light polypeptide 6 OS=Homo sapiens GN=MYL6 PE=1 SV=2 - [MYL6_HUMAN] P60660 0,000816 2,54 LTS wt LTS mut
Neural cell adhesion molecule 1 OS=Homo sapiens GN=NCAM1 PE=1 SV=3 - [NCAM1_HUMAN] P13591 0,00125 3,33 LTS mut LTS wt
NHP2-like protein 1 OS=Homo sapiens GN=NHP2L1 PE=1 SV=3 - [NH2L1_HUMAN] P55769 0,00443 2,64 LTS mut LTS wt
Nicotinamide phosphoribosyltransferase OS=Homo sapiens GN=NAMPT PE=1 SV=1 - [NAMPT_HUMAN] P43490 0,0000111 5,75 LTS wt LTS mut
Nuclear autoantigenic sperm protein OS=Homo sapiens GN=NASP PE=1 SV=2 - [NASP_HUMAN] P49321 0,00872 2,81 LTS mut LTS wt
Nuclear mitotic apparatus protein 1 OS=Homo sapiens GN=NUMA1 PE=1 SV=2 - [NUMA1_HUMAN] Q14980 0,00597 3,05 LTS mut LTS wt
Nuclear transcription factor Y subunit gamma OS=Homo sapiens GN=NFYC PE=1 SV=3 - [NFYC_HUMAN] Q13952 0,00605 2,24 LTS mut LTS wt
Nucleolin OS=Homo sapiens GN=NCL PE=1 SV=3 - [NUCL_HUMAN] P19338 0,00828 2,19 LTS mut LTS wt
Paraspeckle component 1 OS=Homo sapiens GN=PSPC1 PE=1 SV=1 - [PSPC1_HUMAN] Q8WXF1 0,000543 2,98 LTS mut LTS wt
PDZ and LIM domain protein 4 OS=Homo sapiens GN=PDLIM4 PE=1 SV=2 - [PDLI4_HUMAN] P50479 0,0000292 7,5 LTS wt LTS mut
Phenylalanine--tRNA ligase beta subunit OS=Homo sapiens GN=FARSB PE=1 SV=3 - [SYFB_HUMAN] Q9NSD9 0,00767 2,13 LTS mut LTS wt
Anhang A
134
Tabelle 7.4: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSmut und LTSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,01; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot
ID p-Wert
Abundanz-unterschied
Gruppe mit höherer
Abundanz
Gruppe mit niedrigerer Abundanz
Plastin-2 OS=Homo sapiens GN=LCP1 PE=1 SV=6 - [PLSL_HUMAN] P13796 0,00798 4,63 LTS wt LTS mut
Polypyrimidine tract-binding protein 2 OS=Homo sapiens GN=PTBP2 PE=1 SV=1 - [PTBP2_HUMAN] Q9UKA9 0,00177 4,12 LTS mut LTS wt
Prelamin-A/C OS=Homo sapiens GN=LMNA PE=1 SV=1 - [LMNA_HUMAN] P02545 0,00308 1,78 LTS wt LTS mut
Pre-mRNA-processing factor 19 OS=Homo sapiens GN=PRPF19 PE=1 SV=1 - [PRP19_HUMAN] Q9UMS4 0,00732 2,25 LTS mut LTS wt
Prohibitin OS=Homo sapiens GN=PHB PE=1 SV=1 - [PHB_HUMAN] P35232 0,00798 1,94 LTS mut LTS wt
Propionyl-CoA carboxylase beta chain, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PCCB PE=1 SV=3 - [PCCB_HUMAN]
P05166 0,00373 3,87 LTS mut LTS wt
Protein enabled homolog OS=Homo sapiens GN=ENAH PE=1 SV=2 - [ENAH_HUMAN] Q8N8S7 0,00211 3,44 LTS mut LTS wt
Protein NipSnap homolog 3A OS=Homo sapiens GN=NIPSNAP3A PE=1 SV=2 - [NPS3A_HUMAN] Q9UFN0 0,009 2,93 LTS wt LTS mut
Protein S100-A11 OS=Homo sapiens GN=S100A11 PE=1 SV=2 - [S10AB_HUMAN] P31949 0,000105 4,47 LTS wt LTS mut
Ras GTPase-activating-like protein IQGAP1 OS=Homo sapiens GN=IQGAP1 PE=1 SV=1 - [IQGA1_HUMAN] P46940 0,0000208 3,1 LTS wt LTS mut
Retinol-binding protein 4 OS=Homo sapiens GN=RBP4 PE=1 SV=3 - [RET4_HUMAN] P02753 0,00425 3,11 LTS wt LTS mut
Rho GDP-dissociation inhibitor 2 OS=Homo sapiens GN=ARHGDIB PE=1 SV=3 - [GDIR2_HUMAN] P52566 0,00898 1,7 LTS wt LTS mut
Ribosome-binding protein 1 OS=Homo sapiens GN=RRBP1 PE=1 SV=4 - [RRBP1_HUMAN] Q9P2E9 0,000218 3,7 LTS wt LTS mut
RNA-binding protein EWS OS=Homo sapiens GN=EWSR1 PE=1 SV=1 - [EWS_HUMAN] Q01844 0,00393 2,23 LTS mut LTS wt
RNA-binding protein FUS OS=Homo sapiens GN=FUS PE=1 SV=1 - [FUS_HUMAN] P35637 0,00535 3 LTS mut LTS wt
RNA-binding protein Nova-1 OS=Homo sapiens GN=NOVA1 PE=1 SV=1 - [NOVA1_HUMAN] P51513 0,00302 3,54 LTS mut LTS wt
Scaffold attachment factor B1 OS=Homo sapiens GN=SAFB PE=1 SV=4 - [SAFB1_HUMAN] Q15424 0,00497 3,97 LTS mut LTS wt
Scavenger receptor cysteine-rich type 1 protein M130 OS=Homo sapiens GN=CD163 PE=1 SV=2 - [C163A_HUMAN]
Q86VB7 0,00527 8,51 LTS wt LTS mut
Selenide, water dikinase 1 OS=Homo sapiens GN=SEPHS1 PE=1 SV=2 - [SPS1_HUMAN] P49903 0,000706 2,85 LTS mut LTS wt
Serine/arginine-rich splicing factor 3 OS=Homo sapiens GN=SRSF3 PE=1 SV=1 - [SRSF3_HUMAN] P84103 0,00769 2,62 LTS mut LTS wt
Serine/arginine-rich splicing factor 6 OS=Homo sapiens GN=SRSF6 PE=1 SV=2 - [SRSF6_HUMAN] Q13247 0,00198 2,85 LTS mut LTS wt
Serine/arginine-rich splicing factor 7 OS=Homo sapiens GN=SRSF7 PE=1 SV=1 - [SRSF7_HUMAN] Q16629 0,00844 2,65 LTS mut LTS wt
Serine/arginine-rich splicing factor 9 OS=Homo sapiens GN=SRSF9 PE=1 SV=1 - [SRSF9_HUMAN] Q13242 0,00789 2,45 LTS mut LTS wt
Anhang A
135
Tabelle 7.4: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSmut und LTSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,01; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot
ID p-Wert
Abundanz-unterschied
Gruppe mit höherer
Abundanz
Gruppe mit niedrigerer Abundanz
SPARC-related modular calcium-binding protein 1 OS=Homo sapiens GN=SMOC1 PE=1 SV=1 - [SMOC1_HUMAN]
Q9H4F8 0,000469 14,37 LTS mut LTS wt
Spermidine synthase OS=Homo sapiens GN=SRM PE=1 SV=1 - [SPEE_HUMAN] P19623 0,00939 3,15 LTS mut LTS wt
Splicing factor 3A subunit 3 OS=Homo sapiens GN=SF3A3 PE=1 SV=1 - [SF3A3_HUMAN] Q12874 0,00197 5,91 LTS mut LTS wt
Splicing factor 45 OS=Homo sapiens GN=RBM17 PE=1 SV=1 - [SPF45_HUMAN] Q96I25 0,0000376 4,74 LTS mut LTS wt
Splicing factor, proline- and glutamine-rich OS=Homo sapiens GN=SFPQ PE=1 SV=2 - [SFPQ_HUMAN] P23246 0,0086 2,05 LTS mut LTS wt
Stathmin OS=Homo sapiens GN=STMN1 PE=1 SV=3 - [STMN1_HUMAN] P16949 0,000242 3,95 LTS mut LTS wt
SUMO-activating enzyme subunit 2 OS=Homo sapiens GN=UBA2 PE=1 SV=2 - [SAE2_HUMAN] Q9UBT2 0,00826 2,95 LTS mut LTS wt
Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial OS=Homo sapiens GN=SOD2 PE=1 SV=2 - [SODM_HUMAN] P04179 0,000146 3,99 LTS wt LTS mut
SWI/SNF complex subunit SMARCC2 OS=Homo sapiens GN=SMARCC2 PE=1 SV=1 - [SMRC2_HUMAN] Q8TAQ2 0,0000664 3,36 LTS mut LTS wt
SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily E member 1 OS=Homo sapiens GN=SMARCE1 PE=1 SV=2 - [SMCE1_HUMAN]
Q969G3 0,00303 3,47 LTS mut LTS wt
TAR DNA-binding protein 43 OS=Homo sapiens GN=TARDBP PE=1 SV=1 - [TADBP_HUMAN] Q13148 0,00433 2,69 LTS mut LTS wt
Thymidine phosphorylase OS=Homo sapiens GN=TYMP PE=1 SV=2 - [TYPH_HUMAN] P19971 0,000272 4,98 LTS wt LTS mut
Thyroid hormone receptor-associated protein 3 OS=Homo sapiens GN=THRAP3 PE=1 SV=2 - [TR150_HUMAN]
Q9Y2W1 0,00411 3,32 LTS mut LTS wt
Tubulin beta chain OS=Homo sapiens GN=TUBB PE=1 SV=2 - [TBB5_HUMAN] P07437 0,00537 2,01 LTS mut LTS wt
Tubulin polymerization-promoting protein family member 3 OS=Homo sapiens GN=TPPP3 PE=1 SV=1 - [TPPP3_HUMAN]
Q9BW30 0,00297 3,2 LTS wt LTS mut
U1 small nuclear ribonucleoprotein 70 kDa OS=Homo sapiens GN=SNRNP70 PE=1 SV=2 - [RU17_HUMAN] P08621 0,00571 3,2 LTS mut LTS wt
Ubiquitin-conjugating enzyme E2 E2 OS=Homo sapiens GN=UBE2E2 PE=1 SV=1 - [UB2E2_HUMAN] Q96LR5 0,00679 5,46 LTS mut LTS wt
Uncharacterized protein C1orf198 OS=Homo sapiens GN=C1orf198 PE=1 SV=1 - [CA198_HUMAN] Q9H425 0,0000649 6,31 LTS mut LTS wt
UPF0553 protein C9orf64 OS=Homo sapiens GN=C9orf64 PE=1 SV=1 - [CI064_HUMAN] Q5T6V5 0,0021 13,28 LTS wt LTS mut
V-set and immunoglobulin domain-containing protein 4 OS=Homo sapiens GN=VSIG4 PE=1 SV=1 - [VSIG4_HUMAN]
Q9Y279 0,00434 6,42 LTS wt LTS mut
Anhang A
136
Tabelle 7.5: Differentiell in LTS mut Tumoren angereicherte Prozesse, Funktionen und Lokalisation laut Anreicherungsanalyse mit der Software DAVID (Filterkriterium: FDR ≤0,001)
Kategorie Term Count Anreicherungs-
faktor FDR
BiologischerProzess GO:0016071~mRNA metabolic process 26 5,17 0,000000000799
BiologischerProzess GO:0006397~mRNA processing 25 5,37 0,000000000552
Molekulare Funktion GO:0003723~RNA binding 34 3,64 0,000000000449
BiologischerProzess GO:0008380~RNA splicing 23 5,33 0,00000000489
BiologischerProzess GO:0006396~RNA processing 26 4,28 0,0000000165
Molekulare Funktion GO:0003677~DNA binding 24 3,8 0,000000771
BiologischerProzess GO:0000398~nuclear mRNA splicing, via spliceosome 17 5,44 0,00000225
BiologischerProzess GO:0000377~RNA splicing, via transesterification reactions with bulged adenosine as nucleophile 17 5,44 0,00000225
BiologischerProzess GO:0000375~RNA splicing, via transesterification reactions 17 5,44 0,00000225
Zellkompartiment GO:0031981~nuclear lumen 28 2,93 0,0000144
Molekulare Funktion GO:0000166~nucleotide binding 39 1,94 0,000252
Zellkompartiment GO:0030530~heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex 7 12,99 0,000655
Zellkompartiment GO:0005681~spliceosome 11 5,88 0,000526
Zellkompartiment GO:0005654~nucleoplasm 18 3,21 0,00074
Zellkompartiment GO:0070013~intracellular organelle lumen 31 2,11 0,000593
Anhang A
137
Tabelle 7.6: Antigene die in mehr als 50 % der Tumorpatienten im Vergleich zu den nicht tumorerkrankten Kontrollen im ProteinArray-Experiment eine Immunantwort hervorriefen und einen p-Wert ≤0,01 aufwiesen (wird fortgesetzt).
Proteinbeschreibung Uniprot ID Gen Symbol Kontrolle Prävalenz
Tumor Prävalenz
p-Wert Im Transkriptom
detektiert
Im Proteom detektiert [Anzahl identifizierter
Spektren]
AHNAK nucleoprotein (AHNAK), transcript variant 2 A1A586 AHNAK 27,27% 77,27% 0,00477 nein 0
coiled-coil domain containing 69 (CCDC69) A6NI79 CCDC69 9,09% 59,09% 0,000216 ja 0
thyroid hormone receptor interactor 10 (TRIP10) A7VJC9 TRIP10 27,27% 81,82% 0,000532 nein 0
cell division cycle 25 homolog A (S, pombe) (CDC25A), transcript variant 2
A8K3D9 CDC25A 40,91% 90,91% 0,000624 nein 0
Rab9 effector protein with kelch motifs (RABEPK) A8K403 RABEPK 18,18% 77,27% 0,000616 nein 0
rabphilin 3A-like (without C2 domains) (RPH3AL) A8K7D5 RPH3AL 40,91% 90,91% 0,00983 nein 0
EP400 N-terminal like (EP400NL) A8MSW4 EP400NL 18,18% 72,73% 0,000164 nein 0
apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3A (APOBEC3A)
A8MYU8 APOBEC3A 9,09% 72,73% 0,0000343 nein 0
hypothetical protein MGC10334 (MGC10334) NA MGC10334 22,73% 86,36% 0,00000832 nein 0
synaptosomal-associated protein, 23kDa (SNAP23), transcript variant 1
O00161 SNAP23 18,18% 86,36% 0,0000343 ja 0
interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3 (IFIT3)
O14879 IFIT3 18,18% 72,73% 0,000164 ja 3
hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate (HGS)
O14964 HGS 13,64% 72,73% 0,0000343 ja 8
eukaryotic translation initiation factor 4 gamma, 3 (EIF4G3) O43432 EIF4G3 13,64% 72,73% 0,000164 ja 0
actinin, alpha 4 (ACTN4) O43707 ACTN4 9,09% 77,27% 0,0000011 ja 308
BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like (BNIP3L)
O60238 BNIP3L 36,36% 86,36% 0,00287 ja 0
phosphoribosyl pyrophosphate synthetase-associated protein 2 (PRPSAP2)
O60256 PRPSAP2 4,55% 63,64% 0,00000644 ja 13
KIAA0513 (KIAA0513) O60268 KIAA0513 4,55% 54,55% 0,000624 ja 3
Exocyst complex component 3 O60645 EXOC3 18,18% 68,18% 0,00519 ja 0
STARD3 N-terminal like (STARD3NL) O95772 STARD3NL 18,18% 90,91% 0,000624 ja 0
cyclin E2 (CCNE2) O96020 CCNE2 40,91% 95,46% 0,000218 ja 0
epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v-erb-b) oncogene homolog, avian) (EGFR); see catalog number for detailed information on wild-type or point mutant status
P00533 EGFR,T790M 22,73% 81,82% 0,000164 ja 17
Anhang A
138
Tabelle 7.6: Antigene die in mehr als 50 % der Tumorpatienten im Vergleich zu den nicht tumorerkrankten Kontrollen im ProteinArray-Experiment eine Immunantwort hervorriefen und einen p-Wert ≤0,01 aufwiesen (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot ID Gen Symbol Kontrolle Prävalenz
Tumor Prävalenz
p-Wert Im Transkriptom
detektiert
Im Proteom detektiert [Anzahl identifizierter
Spektren]
epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v-erb-b) oncogene homolog, avian) (EGFR); see catalog number for detailed information on wild-type or point mutant status
P00533 EGFR(ErbB1), T790M,L858R
18,18% 72,73% 0,000616 ja 17
interleukin 1, beta (IL1B) P01584 IL1B 13,64% 72,73% 0,0000343 ja 0
submaxillary gland androgen regulated protein 3 homolog B (mouse) (SMR3B)
P02814 SMR3B 22,73% 72,73% 0,000616 nein 0
v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2, neuro/glioblastoma derived oncogene homolog (avian) (ERBB2), transcript variant 2
P04626 ERBB2 13,64% 81,82% 0,000164 ja 0
diazepam binding inhibitor (GABA receptor modulator, acyl-Coenzyme A binding protein) (DBI), transcript variant 1
P07108 DBI 13,64% 63,64% 0,00153 ja 23
Heat shock protein HSP 90-alpha P07900 HSP90AA1 22,73% 81,82% 0,00935 ja 556
estrogen-related receptor alpha (ESRRA) P11474 ESRRA 9,09% 63,64% 0,00153 ja 0
dystrophin (muscular dystrophy, Duchenne and Becker types) (DMD), transcript variant Dp71b
P11532 DMD 22,73% 77,27% 0,00018 ja 0
annexin A7 (ANXA7), transcript variant 1 P20073 ANXA7 18,18% 68,18% 0,00519 ja 49
small proline-rich protein 1B (cornifin) (SPRR1B) P22528 SPRR1B 45,46% 95,46% 0,000218 nein 0
tryptophanyl-tRNA synthetase (WARS), transcript variant 3 P23381 WARS 22,73% 77,27% 0,00182 ja 106
Tryptophanyl-tRNA synthetase, cytoplasmic P23381 WARS 22,73% 77,27% 0,00018 ja 106
moesin (MSN) P26038 MSN 27,27% 81,82% 0,00153 ja 443
catenin (cadherin-associated protein), alpha 1, 102kDa (CTNNA1)
P35221 CTNNA1 18,18% 68,18% 0,00182 ja 33
choline kinase alpha (CHKA), transcript variant 1 P35790 CHKA 22,73% 72,73% 0,000616 ja 0
Glutaminyl-tRNA synthetase P47897 QARS 31,82% 86,36% 0,000386 ja 21
Glutaminyl-tRNA synthetase P47897 QARS 31,82% 81,82% 0,000532 ja 21
SEC24 related gene family, member C (S, cerevisiae) (SEC24C), transcript variant 1
P53992 SEC24C 31,82% 81,82% 0,00153 ja 3
enhancer of rudimentary homolog (Drosophila) (ERH) P84090 ERH 45,46% 95,46% 0,0000727 ja 10
protein kinase C, theta (PRKCQ) Q04759 PRKCQ 31,82% 81,82% 0,00935 ja 0
splicing factor 3a, subunit 3, 60kDa (SF3A3) Q12874 SF3A3 18,18% 68,18% 0,000532 ja 17
TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) Q12933 TRAF2 36,36% 86,36% 0,0011 ja 0
mitogen-activated protein kinase 7 (MAPK7), transcript Q13164 MAPK7 36,36% 86,36% 0,000386 ja 0
Anhang A
139
Tabelle 7.6: Antigene die in mehr als 50 % der Tumorpatienten im Vergleich zu den nicht tumorerkrankten Kontrollen im ProteinArray-Experiment eine Immunantwort hervorriefen und einen p-Wert ≤0,01 aufwiesen (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot ID Gen Symbol Kontrolle Prävalenz
Tumor Prävalenz
p-Wert Im Transkriptom
detektiert
Im Proteom detektiert [Anzahl identifizierter
Spektren]
variant 3
Treacher Collins-Franceschetti syndrome 1 (TCOF1), transcript variant 3
Q13428 TCOF1 36,36% 90,91% 0,00167 ja 0
sorting nexin 1 (SNX1), transcript variant 1 Q13596 SNX1 27,27% 86,36% 0,0000343 ja 31
four and a half LIM domains 1 (FHL1) Q13642 FHL1 9,09% 90,91% 0,00000000291 ja 49
Four and a half LIM domains protein 3 Q13643 FHL3 13,64% 86,36% 0,00000832 ja 0
DR1-associated protein 1 (negative cofactor 2 alpha) (DRAP1)
Q14919 DRAP1 13,64% 63,64% 0,00477 ja 0
centaurin, beta 2 (CENTB2) Q15057 CENTB2 27,27% 77,27% 0,00477 ja 0
splicing factor 3b, subunit 3, 130kDa (SF3B3) Q15393 SF3B3 36,36% 86,36% 0,00287 ja 18
SMAD family member 1 (SMAD1), transcript variant 1 Q15797 SMAD1 27,27% 77,27% 0,00182 ja 0
Cytoplasmic polyadenylation element-binding protein 4 Q17RY0 CPEB4 31,82% 86,36% 0,00691 ja 0
Zinc finger protein ZXDC Q2QGD7 ZXDC 13,64% 63,64% 0,000386 ja 0
Protein BEAN Q3B7T3 BEAN 9,09% 59,09% 0,00396 ja 0
chromosome 9 open reading frame 97 (C9orf97) Q5T7W7 C9orf97 31,82% 95,46% 0,00000644 ja 0
chromosome 14 open reading frame 131 (C14orf131) Q6GPI5 C14orf131 31,82% 81,82% 0,00153 nein 0
SH3 domain and tetratricopeptide repeats 1 (SH3TC1) Q6NVH2 SH3TC1 22,73% 81,82% 0,00153 nein 0
chromosome 10 open reading frame 118 (C10orf118) Q7Z3E2 C10orf118 36,36% 90,91% 0,0000685 ja 0
chromosome 11 open reading frame 30 (C11orf30) Q7Z589 C11orf30 22,73% 81,82% 0,0000438 ja 0
paxillin (PXN) Q7Z7K5 hCG_1778014 22,73% 81,82% 0,000164 nein 0
RPA interacting protein (RPAIN) Q86UA6 RPAIN 9,09% 59,09% 0,000216 ja 0
calcium/calmodulin-dependent protein kinase ID (CAMK1D), transcript variant 2
Q8IU85 CAMK1D 27,27% 77,27% 0,00477 ja 0
RAS guanyl releasing protein 3 (calcium and DAG-regulated) (RASGRP3)
Q8IV61 RASGRP3 13,64% 68,18% 0,000122 ja 0
family with sequence similarity 80, member A (FAM80A) Q8IXN7 FAM80A 36,36% 90,91% 0,000216 ja 0
cDNA clone MGC:25008 IMAGE:4453355, complete cds Q8N0T2 N/A 40,91% 90,91% 0,000216 nein 0
cDNA clone MGC:35221 IMAGE:5172092, complete cds Q8N2W8 N/A 4,55% 59,09% 0,0000225 nein 0
metallothionein 1M (MT1M) Q8N339 MT1M 45,46% 95,46% 0,00164 ja 0
sterile alpha motif domain containing 3 (SAMD3), transcript variant 2
Q8N6K7 SAMD3 27,27% 81,82% 0,00153 ja 0
EF-hand calcium binding protein 1 (EFCBP1) Q8N987 EFCBP1 9,09% 59,09% 0,000216 nein 0
Anhang A
140
Tabelle 7.6: Antigene die in mehr als 50 % der Tumorpatienten im Vergleich zu den nicht tumorerkrankten Kontrollen im ProteinArray-Experiment eine Immunantwort hervorriefen und einen p-Wert ≤0,01 aufwiesen (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot ID Gen Symbol Kontrolle Prävalenz
Tumor Prävalenz
p-Wert Im Transkriptom
detektiert
Im Proteom detektiert [Anzahl identifizierter
Spektren]
TNFAIP3-interacting protein 2 Q8NFZ5 TNIP2 36,36% 86,36% 0,000386 ja 0
zinc finger and SCAN domain containing 18 (ZSCAN18) Q8TBC5 ZSCAN18 36,36% 86,36% 0,0011 ja 0
RAB3A interacting protein (rabin3)-like 1 (RAB3IL1) Q8TBN0 RAB3IL1 9,09% 77,27% 0,0000011 ja 0
Guanine nucleotide exchange factor for Rab3A Q8TBN0 RAB3IL1 22,73% 77,27% 0,000616 ja 0
actin filament associated protein 1-like 1 (AFAP1L1) Q8TED9 AFAP1L1 36,36% 90,91% 0,000624 ja 0
lectin, mannose-binding, 1 like (LMAN1L) Q8WVH0 CPLX3 9,09% 63,64% 0,00153 ja 0
family with sequence similarity 112, member B (FAM112B) Q8WW33 FAM (GTSF1) 22,73% 90,91% 0,0000011 nein 0
naked cuticle homolog 2 (Drosophila) (NKD2) Q969F2 NKD2 18,18% 81,82% 0,000164 ja 0
ring finger protein 34 (RNF34), transcript variant 1 Q969K3 RNF34 45,46% 95,46% 0,000614 ja 0
Optineurin Q96CV9 OPTN 22,73% 90,91% 0,00000501 ja 1
chromosome 10 open reading frame 35 (C10orf35) Q96D05 C10orf35 13,64% 68,18% 0,00182 ja 0
ring finger and SPRY domain containing 1 (RSPRY1) Q96DX4 RSPRY1 9,09% 59,09% 0,0011 ja 0
Hypermethylated in cancer 2 protein Q96JB3 HIC2 40,91% 95,46% 0,000218 ja 0
zinc finger protein 333 (ZNF333) Q96JL9 ZNF333 27,27% 86,36% 0,0011 ja 0
ubiquitin specific peptidase 47 (USP47) Q96K76 USP47 31,82% 81,82% 0,00153 ja 0
ring finger and CHY zinc finger domain containing 1 (RCHY1) Q96PM5 RCHY1 27,27% 95,46% 0,00164 ja 0
RING finger and CHY zinc finger domain-containing protein 1 Q96PM5 RCHY1 27,27% 81,82% 0,00396 ja 0
quaking homolog, KH domain RNA binding (mouse) (QKI), transcript variant 4
Q96PU8 QKI 36,36% 86,36% 0,00287 ja 36
Sorting nexin-18 Q96RF0 MGC39821 22,73% 90,91% 0,0000197 ja 0
SH3 and cysteine rich domain (STAC) Q99469 STAC 18,18% 81,82% 0,0000438 ja 0
four and a half LIM domains 3 (FHL3) Q9BVA2 FHL3 22,73% 72,73% 0,000616 nein 0
RanBP-type and C3HC4-type zinc finger-containing protein 1 Q9BYM8 C20orf18 40,91% 95,46% 0,000218 ja 0
serine/threonine kinase 33 (STK33) Q9BYT3 STK33 31,82% 86,36% 0,000122 ja 0
NEFA-interacting nuclear protein NIP30 (NIP30) Q9GZU8 NIP30 27,27% 81,82% 0,000532 ja 0
family with sequence similarity 112, member A (FAM112A), transcript variant 1
Q9H1H1 FAM112A 31,82% 81,82% 0,000532 ja 0
XTP3-transactivated protein A (XTP3TPA) Q9H773 XTP3TPA 27,27% 77,27% 0,00182 ja 0
chromosome 12 open reading frame 41 (C12orf41) Q9H9L4 C12orf41 27,27% 95,46% 0,00000644 ja 0
MAP kinase-interacting serine/threonine-protein kinase 2 Q9HBH9 MKNK2 13,64% 63,64% 0,00153 ja 0
resistin (RETN) Q9HD89 RETN 4,55% 54,55% 0,0000727 nein 0
diablo homolog (Drosophila) (DIABLO), nuclear gene Q9NR28 DIABLO 18,18% 81,82% 0,000532 ja 13
Anhang A
141
Tabelle 7.6: Antigene die in mehr als 50 % der Tumorpatienten im Vergleich zu den nicht tumorerkrankten Kontrollen im ProteinArray-Experiment eine Immunantwort hervorriefen und einen p-Wert ≤0,01 aufwiesen (Fortsetzung).
Proteinbeschreibung Uniprot ID Gen Symbol Kontrolle Prävalenz
Tumor Prävalenz
p-Wert Im Transkriptom
detektiert
Im Proteom detektiert [Anzahl identifizierter
Spektren]
encoding mitochondrial protein, transcript variant 2
chromosome 14 open reading frame 131 (C14orf131) Q9NT83 C14orf131 22,73% 72,73% 0,000616 nein 0
Pleckstrin homology domain-containing family J member 1 Q9NW61 PLEKHJ1 13,64% 63,64% 0,000386 ja 0
chromosome 10 open reading frame 26 (C10orf26), transcript variant 2
Q9NX94 C10orf26 18,18% 72,73% 0,000616 ja 0
LIM and cysteine-rich domains 1 (LMCD1) Q9NZU5 LMCD1 9,09% 81,82% 0,000000203 ja 0
Paladin Q9ULE6 KIAA1274 18,18% 86,36% 0,00000832 ja 0
glucosamine (UDP-N-acetyl)-2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase (GNE)
Q9Y223 GNE 36,36% 90,91% 0,000216 ja 0
polymerase (RNA) III (DNA directed) polypeptide K, 12,3 kDa (POLR3K)
Q9Y2Y1 POLR3K 13,64% 63,64% 0,000386 ja 0
Anhang B
142
B. Publikationen
Waldera-Lupa, D. M., Stefanski, A., Meyer, H. E., and Stühler, K. (2013) The fate of b-ions in
the two worlds of collision-induced dissociation. Biochimica et biophysica acta 1834, 2843-
2848.
Neise, D., Sohn, D., Stefanski, A., Goto, H., Inagaki, M., Wesselborg, S., Budach, W., Stühler,
K., and Janicke, R. U. (2013) The p90 ribosomal S6 kinase (RSK) inhibitor BI-D1870 prevents
gamma irradiation-induced apoptosis and mediates senescence via RSK- and p53-
independent accumulation of p21WAF1/CIP1. Cell death & disease 4, e859.
Erkelenz, S., Poschmann, G., Theiss, S., Stefanski, A., Hillebrand, F., Otte, M., Stühler, K., and
Schaal, H. (2013) Tra2-mediated recognition of HIV-1 5' splice site D3 as a key factor in the
processing of vpr mRNA. Journal of virology 87, 2721-2734.
Poulsen, C., Akhter, Y., Jeon, A. H., Schmitt-Ulms, G., Meyer, H. E., Stefanski, A., Stühler, K.,
Wilmanns, M., and Song, Y. H. (2010) Proteome-wide identification of mycobacterial
pupylation targets. Molecular systems biology 6, 386.
Grzendowski, M., Riemenschneider, M. J., Hawranke, E., Stefanski, A., Meyer, H. E.,
Reifenberger, G., and Stühler, K. (2009) Simultaneous extraction of nucleic acids and proteins
from tissue specimens by ultracentrifugation: A protocol using the high-salt protein fraction
for quantitative proteome analysis. Proteomics 9, 4985-4990.
Ahmad, M., Frei, K., Willscher, E., Stefanski, A., Kaulich, K., Roth, P., Stühler, K., Reifenberger,
G., Binder, H., and Weller, M., (2014) How Stemlike Are Sphere Cultures From Long-term
Cancer Cell Lines? Lessons From Mouse Glioma Models. Neuropathol Exp Neurol 73 (11),
1062-1077
Zur Veröffentlichung angenommen:
Poschmann, G., Grzendowski, M., Stefanski, A., Hawranke, E., Meyer, H.E., and Stühler, K.
(2014) Redox proteomics reveal stress responsive proteins linking peroxiredoxin-1 status in
glioma to chemosensitivity and oxidative stress. Biochimica et biophysica acta
Sonstiges
Gewinner des Nachwuchspreises „Proteinanalytik 2011“ der Arbeitstagung 2011
„Mikromethoden in der Proteinbiochemie“
Reisestipendium der Deutschen Gesellschaft für Proteomforschung für die „Proteomic
Summer School 2011“
Anhang C
143
C. Lebenslauf
Persönliche Daten
Name: Anja Stefanski
Anschrift: Düngelstr.25
44623 Herne
Geburtsdatum: 03.01.1982
Geburtsort : St. Avold (Frankreich)
Staatsangehörigkeit: deutsch
Familienstand: verheiratet
Schulische Ausbildung
08/1988 – 12/1990 Volksschule Nürnberg, Holzgartenstraße in Nürnberg
01/1991 – 07/1992 Grundschule Am Busch in Castrop-Rauxel
08/1992 – 07/1997 Ernst-Barlach-Gymnasium in Castrop-Rauxel
08/1997 – 06/2002 Pestalozzi-Gymnasium in Herne
Abschluss: allgemeine Hochschulreife
Studium
09/2002 – 04/2008 Ruhr-Universität Bochum
Studienfach: Biochemie
Abschluss: Master of Science
08/2008 –12/ 2014 Promotion zum Thema „Proteomanalytische Charakterisierung des
Glioblastoms im Hinblick auf das Langzeitüberleben“
Beruflicher Werdegang
08/2007 – 04/2008 Studentische Hilfskraft am Medizinischen Proteom-Center, AG
Neuroproteomics an der Ruhr-Universität Bochum
07/2008 – 12/2011 Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Medizinischen Proteom-Center,
AG Neuroproteomics an der Ruhr-Universität Bochum
seit 01/2012 Leiterin der Arbeitsgruppe „Quantitative Proteomics“ am Molecular
Proteomics Laboratory an der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
Anhang D
144
D. Danksagung
Mein erster Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Helmut E. Meyer für die Überlassung des
interessanten Themas, die hervorragende Infrastruktur während meiner Zeit am Medizinischen
Proteom-Center sowie den hilfreichen Diskussionen im Rahmen der Laborseminare.
Besonderer Dank gilt darüber hinaus Prof. Dr. Kai Stühler, der mich stets motiviert und inspiriert hat.
Ich bin unendlich dankbar für Deine wissenschaftlichen Ratschläge, die vielen lehrreichen
Diskussionen und Deine Unterstützung und Geduld während der gesamten Zeit meiner Arbeit.
Prof. Dr. Christian Herrmann möchte ich für die Übernahme des Zweitgutachtens herzlich danken.
Besonderer Dank geht auch an Eva Bruns für ihre großartige Unterstützung im Labor und (Klaus-)
Gereon Poschmann für die vielen wertvollen Ratschläge und Hilfestellungen, nicht nur bei
statistischen Problemen, aber natürlich auch an meine anderen Kollegen des Molecular Proteomics
Laboratory, Daniel Waldera, Mareike Brocksieper, Katrin Nau, Nina Quednow, Marzena Malek sowie
meinen ehemaligen Kollegen vom MPC. Ich bin mir bewusst, wie entscheidend das tolle
Arbeitsumfeld und die gute Teamarbeit zu dieser Arbeit beigetragen haben. Dafür bin ich Euch
wirklich sehr dankbar.
Ein Dankeschön gilt auch allen Mitgliedern des Deutschen Gliomnetzes für die erfolgreiche
Kooperation und die Bereitstellung des umfangreichen Probenmaterials sowie der Deutschen
Krebshilfe für die Förderung dieses Projektes.
Danken möchte ich auch all den Patienten, die durch Ihre Einwilligung zu einer Beteiligung an dieser
Studie diese Arbeit überhaupt erst möglich gemacht haben. Ich wünsche Ihnen und Ihren Familien
alles Gute!
Lieben Dank an meine Eltern und meine Geschwister. Euer Glaube an mich ist mein Halt und die
Quelle meiner Kraft. Eine Familie wie Euch zu haben ist wunderbar!
Bedanken möchte ich mich auch bei all meinen Freunden, aber besonders bei Sarah, Silvia, Ela,
Annika, Anna, Andy, Thor, Kibar, Daniel und Felix für unendliche viele schöne Stunden, viel Spaß und
die Gewissheit, dass richtig guten Freunden ein Doktortitel total egal ist.
Ein letztes, besonders herzliches und liebes Dankeschön gilt Marcel Stefanski für seine
bedingungslose Unterstützung und Zuneigung. Ich liebe Dich.
Anhang E
145
E. Erklärung
Hiermit bestätige ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel: „Proteomanalytische
Charakterisierung des Glioblastoms im Hinblick auf das Langzeitüberleben“ ohne unerlaubte
Hilfe ausgeführt und an keiner anderen Universität zur Erlangung eines akademischen Grades
eingereicht habe. Die Stellen der Arbeit, die anderen Werken dem Wortlaut oder dem Sinne
nach entnommen sind, wurden in jedem Fall unter Angabe der Quellen kenntlich gemacht.
Dies gilt auch für die beigegebenen Zeichnungen, bildlichen Darstellungen, Skizzen und
dergleichen.
Bochum, den 05.12.2014