Regulation!des !

Metabolismus !

und...!

Bakterielle Viren = Bacteriophagen !

Überblick!Transkription! ! !langsam (min)!Translation ! ! !langsam (min)!posttranslational ! !schnell (≤ sec)

Überblick!Transkription! ! !langsam (min)!

!Repression & Induktion durch DNA-Bindeproteine!!negative Kontrolle - Repressor!!positive Kontrolle - Aktivator!!Operon vs. Regulon!

Translation ! ! !langsam (min)!posttranslational ! !schnell (≤ sec)!

!kovalente & nicht-kovalente Enzymhemmung!! ! !(Rückkopplung)

(Maltose)

In E. coli , sind die Gene für Maltosemetabolismus über das Chromosom verteilt; jedes Gen ist reguliert vom Maltoseaktivatorprotein (REGULON)

Induktion des Maltose Operons in E. coli!Positive Kontrolle

Globale Regulationsmechanismen!= Reaktion auf veränderte Umweltbedingungen

!betrifft Regulation vieler verschiedener Gene!!Bsp:!!wenn E.coli mehrere Zucker gleichzeitig als C-Quelle zur !Verfügung hat, wird Glucose immer zuerst verbraucht!!reguliert durch Katabolitrepression:!verhindert Synthese von katabolischen Enzymen, die zur!Glucoseverwertung unnötig sind!!bei anderen Organismen andere Zucker von primärer Bedeutung!Sinn der Katabolitrepression:!beste C- und Energie-Quelle wird zuerst verbraucht

Katabolitrepression!Effekt: Diauxie!2 exponentielle Wachstums-!phasen bei 2 C-Quellen!!ß-Gal-Synthese von !Katabolitrepression reguliert!!

Katabolitrepression!Mechanismus:!RNA-Polymerase bindet nur dann an DNA, wenn !Katabolitaktivatorprotein (CAP) zuerst gebunden hat!!CAP = allosterisches Protein, bindet DNA nur in Gegenwart von!

!cAMP!!Glucose hemmt cAMP-Synthese und stimuliert cAMP-Transport!aus der Zelle!!Regulation betrifft lac-Operon, mal-Regulon, und!andere katabolische Operons in E. coli!!

Adenylat-Zyklase ATP cAMP + PPi

Zyklisches Adenosinmonophosphat (AMP)!

C-α trace

cAMP

Interaktion des cAMP-Bindeproteins (CAP) mit DNA!Positive Kontrolle

CAP kontrolliert 7 E. coli Operons. !CAP bindet DNA nur, wenn es cAMP gebunden hat. !

Transkript

– 35 Sequenz Pribnow-Box

Regulation des Lactose-Operons!

negative Kontrolle durch lac-Repressor, aufgehoben durch !!Lactose!

positive Kontrolle durch CAP, ausgelöst durch cAMP!

Die stringente Antwort!Übergang von aa-Überschuss zu aa-Mangel:!!Stop der Synthese von rRNA & tRNA!

!keine Ribosomenneusynthese, keine Translation!!

!hemmt Proteinbiosynthese & DNA-Synthese!!aktiviert aa-Biosynthese!

!reguliert durch Guanosintetraphosphat ppGpp!

! !und Guanosinpentaphosphat pppGpp!!

Guanosinetetraphosphat (ppGpp/pppGpp)

Guanosintetraphosphat ppGpp und !Guanosinpentaphosphat pppGpp (Alarmone)!!akkumulieren bei aa-Mangel!!gebildet von RelA!

Die stringente Antwort!

Die stringente Antwort!

Bindung nicht-beladener tRNA an translatierende Ribosomen führt zur Alarmon-Synthese durch RelA!

Die stringente Antwort!

TABLE 8.1 A few of the global control systems known in Escherichia colia System Signal Primary activity

of regulatory protein Number of genes regulated

Aerobic respiration Presence of O2 Repressor (ArcA) 50+ Anaerobic respiration Lack of O2

Activator (FNR) 70 +

Catabolite repression

Cyclic AMP concentration

Activator (CAP) 300+

Heat shock Temperature Alternative sigma (!32)

36

Nitrogen utilization NH3 limitation Activator (NRI) / alternative sigma (!54)

12+

Oxidative stress Oxidizing agent Activator (OxyR) 30+ SOS response Damaged DNA Repressor (LexA) 20+

Weitere globale Kontrollsysteme in E.coli!

Weitere globale Kontrollsysteme in E.coli!Operon!Regulon!!globale Kontrollsysteme bewirken Regulation von mehr als!einem Regulon!!Modulon: Gengruppe, die vom gleichen regulatorischen Protein!

! reguliert wird, aber zu verschiedenen Regulons!! gehört!

!Stimulon: Gengruppe, die auf das gleiche Umweltsignal reagiert !

! !

Weitere globale Kontrollsysteme in E.coli:!alternative Sigma Faktoren!

Sigma Faktor = Untereinheit der RNA Polymerase, die für !! ! Promotorerkennung verantwortlich ist!

Konzentration in der Zelle reguliert durch Transkription/Translation!!und Abbau !

Aktivität reguliert durch Anti-Sigma-Faktoren!

Weitere globale Kontrollsysteme in E.coli:!Hitzeschockantwort!

Sigma Faktor 32 instabil, t1/2 = 30 sec!T Anstieg hemmt Sigma Faktor 32 Abbau!hohe [Sigma Faktor 32] aktiviert Transkription von!

!Hitzeschockgenen!!Hitzeschockproteine:!

!auch induziert durch Chemikalien & Strahlung!!3 Hauptklassen in E.coli: Hsp70, Hsp60, Hsp10!!DnaK = Hsp70; verhindert Proteinaggregation!!GroEL, GroES = Hsp60 & Hsp10, !! ! ! propagieren Proteinfaltung!!ausserdem Proteasen, die denaturierte Protein abbauen!!meist hoch konserviert!

bei T-Senkung inaktiviert DnaK Sigma 32!

Weitere globale Kontrollsysteme in E.coli:!Kälteschockantwort!

ausgelöst durch verlangsamte Proteinbiosynthese!!Kälteschockproteine: !

!Helicasen, Nucleasen, ribosomengebun-!!dene Proteine, reduzieren Synthese von Makromolekülen!!!

ausserdem: Synthese kompatibler löslicher Stoffe als!! ! !Gefrierschutz!

Quorum Sensing!= regulatorische Wege, die von der Dichte der Zellen der ! eigenen Art kontrolliert werden!!stellt sicher, dass eine ausreichende Mengen Zellen einer !Spezies vorliegt, bevor eine bestimmte biologische Antwort!ausgelöst wird!!verbreitet bei gram- Bakterien!!Mechanismus:!Zellen synthetisieren und sezernieren !

!acyliertes Homoserinlacton (AHL)!Konzentration in der Umgebung nur dann hoch, wenn viele!

!Zellen AHL ausscheiden!hohe [AHL] führt zur Bindung an Transkriptionaktivator für!

!spezifische Gene!

Quorum Sensing!wichtig für!Virulenzfaktoren (e.g.Toxine)!Biofilmbildung!Biolumineszenz !

Biolumineszenter Vibrio fischeri (produziert Luziferase)

Quorum Sensing!

Quorum Sensing: andere Beispiele!Krankheitserreger: !!

!Pseudomonas aeruginosa!Quorum sensing führt zu Wachstum als Biofilm auf sezernierten!Polysacchariden; steigert Pathogenität & verhindert Eindringen!von Antibiotika!!

!Staphylococcus aureus!sezerniert Peptide, die Wirtszellen & Immunsystem schädigen !!auch in Archaea!

Attenuation!Regulation durch Kontrolle der Transkription nach deren Initiation!d. h. kontrolliert wird die Anzahl vollständiger Transkripte (mRNAs)!!häufig bei Aminosäure-Biosynthese in gram- Bakterien!!!Bsp Tryptophan Operon in E. coli:!!- Promoter & Operator für negative Kontrolle durch Rückkopplung!!- zusätzlich am 5’ Beginn des Operons: Leadersequenz!!-  diese kodiert Leaderpeptid, das 2 Tryptophan Codons enthält & ! als Attenuator wirkt!

stop

Translated leader sequence

Attenuation am Bsp Tryptophan Operon!

+ Trp: Leaderpeptid wird synthetisiert, Transkription des!!restlichen Operons terminiert!

- Trp: Leaderpeptid wird nicht synthetisiert, Transkription des! restlichen Operons findet statt!

Attenuation: Mechanismus -i!in Prokaryoten finden Transkription & Translation gleichzeitig statt!Attenuation findet statt, wenn die mRNA einen stem-loop bilden!

!kann, der mit der RNA-Polymerase interferiert!!

Attenuation: Mechanismus -ii!in Prokaryoten finden Transkription & Translation gleichzeitig statt.!Attenuation findet nicht statt, wenn die mRNA einen stem-loop bildet, der nicht mit der RNA-Polymerase interferiert!!

Attenuation: Mechanismus!in Prokaryoten finden Transkription & Translation gleichzeitig!

!statt!Attenuation findet nur statt, wenn die mRNA einen stem-loop

!bildet, der mit der RNA-Polymerase interferiert!!

Isoleucin

Attenuation: andere Beispiele!

bitte lernen Sie die 3-Buchstaben Abkürzungen für Aminosäuren!!(z. B. auf der letzten Seite von Alberts et al., Molekulare !Zellbiologie; in jedem Biochemie-Lehrbuch)

Attenuation: the movie!

Signaltransduktion != Weiterleitung von Signalen aus der Umwelt in der Zelle über Sensor in der Cytoplasmamembran an regulatorische !Maschinerie in der Zelle!!meist 2-Komponenten-Systeme:!Sensorkinase in der Zellmembran + Response-Regulatorprotein!!Sensorkinase:!hochkonserviert!detektiert Umweltsignal!Autophosphorylierung an His!Übertragung des Phosphats auf Response-Regulator!!Response-Regulator:!DNA-Bindeprotein, das Transkription reguliert!

Signaltransduktion !Regulation über Rückkopplung beteiligt: Phophatase, die Response-Regulator dephosphoryliert!!die Sensorkinase kann auch Phosphatase-Aktivität haben;!alternativ Dephosphorylierung durch zusätzliches Protein!!Dephosphorylierung läuft mit konstanter Geschwindigkeit!langsamer als Phosphorylierung!konstitutiv!

autokatalytisch

Repressor

(O2, pH, T, Licht, Nährstoffe)

1

2

Signaltransduktion: 2-Komponenten-System !

TABLE 8.3 Some two-component regulatory systems from Escherichia coli that regulate transcription System Environmental

signal Sensor kinase

Response regulator

Activity of response regulatora

Arc System O2 ArcB ArcA Repressor/Activator Nitrate and nitrite

Nitrate and nitrite

NarX and NarQ

NarL Activator/Repressor

anaerobic regulation(Nar)

NarP Activator/Repressor

Nitrogen utilization (Ntr)

NH4+ NRII, the

product of glnL

NRI, the product of glnG

Activates RNA polymerase at promoters requiring !54.

Pho regulon Inorganic phosphate

PhoR PhoB Activator

Porin regulation

Osmotic pessure

EnvZ OmpR Activator/Repressor

In E. coli ~ 50 verschiedene Zweikomponentensysteme nur wenige in Archaea keine in parasitären Bakterien gibt es auch in mikrobiellen Eukaryoten (S. cerevisiae)

Beispiele für 2-Komponenten-Systeme !

Chemotaxis in E. coli!

Bakterien sind zu klein, um Konzentrations-Gradienten entlang einer Zelle zu erkennen; deshalb: !- Detektion von zeitlichen Gradienten beim Schwimmen!- in Richtung Chemo-Attractant nimmt Taumeln ab, Geraden zu!- Chemorezeptoren an der Zytoplasmamembran kontrollieren!

!Flagellenrotation!

Regulation der Chemotaxis !Picture?! Schreckstoff!

(Repellent)!MCP=!Methylakzeptor-!Chemotaxisprotein!

5 MCPs in E. coli; jedes erkennt andere Verbindungen!CheW ist die Sensorkinase!anziehende Stoffe verringern CheA-P, abstossende erhöhen CheA-P!

Regulation der Chemotaxis !Picture?! Schreckstoff!

(Repellent)!MCP=!Methylakzeptor-!Chemotaxisprotein!

- CheA-P überträgt P auf Response-Regulator CheY, der Geisselrotation steuert!- CheY-P bindet an Geisselmotor und induziert Taumeln!- CheZ dephosphoryliert CheY-P (konstitutiv)!

Regulation der Chemotaxis !Picture?! Schreckstoff!

(Repellent)!MCP=!Methylakzeptor-!Chemotaxisprotein!

Anpassung:!- CheR methyliert MCP (konstitutiv), CheB-P demethyliert MCP!- CheA-P überträgt P auf CheB (langsam)!- methyliertes MCP bindet nicht an anziehende Stoffe, besser an Schreckstoffe!

Regulation der Chemotaxis !

Komplexe aus mehreren !spezifischen Rezeptoren in IM, !His-Kinase CheA, Adaptor CheW!!Effektor diffundiert ins Periplasma,!bindet Rezeptor (direkt oder BP)!!Output: !Menge von P-CheY!bindet an Flagellenmotor, !induziert CW Rotation (= Taumeln)

Sourjik & Wingreen, Curr Op Cell Biol, 2012

Regulatorische RNAs !Regulation durch kleine RNAs (sRNAs)!40-400 Nukleotide!1.  sRNA im Signalerkennungspartikel!2.  sRNAs binden an mRNA durch komplementäre Basenpaarung = Antisense-RNAs, verhindern Translation, Abbau der mRNA!!

Antisense-RNAs!

sRNAs ~40-400 Nukleotide

Regulatorische RNAs !Regulation durch kleine RNAs (sRNAs)!40-400 Nukleotide!1.  sRNA im Signalerkennungspartikel!2.  sRNAs binden an mRNA durch komplementäre Basenpaarung = Antisense-RNAs, verhindern Translation, Abbau der mRNA!3. Riboswitches:! am 5’-Ende von mRNAs! können kleine Moleküle binden Bindung verhindert Translation!!= Rückkopplungsmechanismus, z.B. in der Thiamin-Synthese!

!

Regulatory RNAs: riboswitches!

(Vitamine)

Regulatorische RNAs !Regulation durch kleine RNAs (sRNAs)!40-400 Nukleotide!1.  sRNA im Signalerkennungspartikel!2.  sRNAs binden an mRNA durch komplementäre Basenpaarung = Antisense-RNAs, verhindern Translation, Abbau der mRNA!3. Riboswitches:! am 5’-Ende von mRNAs! können kleine Moleküle binden Bindung verhindert Translation!!= Rückkopplungsmechanismus, z.B. in der Thiamin-Synthese!

4. CRISPR als antivirales Verteidigungssystem (Brock, S. 328)!!

Viruses infecting a cell of Rhodobacter sphaeroides Duchrow, M., G. W. Kohring and F. Giffhorn. 1985. Virulence as a consequence of genome instability of a novel temperate bacteriophage RsG1, of Rhodobacter sphaeroides Arch. Microbiol. 142, 141-147.

φRsG1

Bakterielle Viren !

Virus Klassifikation

1. Anhand der Wirtszellen: Bakterien, Pflanze, Tier 2. Anhand des Genoms im Viruspartikel (Virion) 3. Es gibt ein formales System der Virusklassifikation, das Viren in verschiedene Taxa einordnet (Ordnungen, Familien, Gattung/

Art), Virusfamilien haben das Suffix –viridae (Polioviridae)

Das Nucleocapsid von φ6 ist von einer Membran umgeben.

Haupttypen von Bakterienviren (Bacteriophagen)!

Bestimmung von Phagentitern!

Bacteriophagen !2 prinzipielle Lebenszyklen:!!virulent: lysieren Wirte nach Infektion!!temperent: Phagengenom wird zusammen mit Wirtsgenom!! ! !repliziert, ohne den Wirt zu töten!

Replikationszyklus ! virulenter Phage!

Phagen: 20-60 min!Animal viruses: 8-40 h!!

Virulente Bacteriophagen, Bsp T4!> 25 Strukturproteine! ds DNA Genom!ringförmig permutiert, d.h. lineare DNA wird verpackt, !entstanden durch Öffnung eines Rings, an verschiedenen Stellen!am Ende der DNA: 3-6 kb terminale Wiederholungssequenzen!!Replikation:!zuerst Replikation injizierter, linearer DNA, dann!Concatemerbildung durch Rekombination an den Enden!Verpackung durch Schneiden mit Endonuclease!“ein Kopf voll” DNA wird verpackt!!

Restriktionsenzyme

Virulente Bacteriophagen, Bsp T4!

5-Hydroxymethylcytosin gibt es nur in DNA geradezahligen T-Phagen!

Glykosylierung von Hydroxymethylcytosin verhindert!Schneiden durch Wirts-Endonucleasen!

Zeitverlauf einer in T4 Infektion !

Virulente Bacteriophagen, Bsp T4!

Temperente Bacteriophagen!Lysogenie:!!die meisten Virusgene werden nicht exprimiert!Virusgenom (‘Prophage’) wird mit Wirtsgenom repliziert und an!

!Tochterzellen weitergegeben!unter spezifischen Bedingungen wird Virusbildung induziert!!Lysogene sind immun gegen Infektion vom selben Phagentyp!

Temperente !Bacteriophagen!

Head diameter ~ 65 nm

Temperente Bacteriophagen, Bsp Lambda!