Überexpression von proteinen und affinitätschromatographie blockpraktikum molekularbiologische...
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Überexpression von Proteinen und Affinitätschromatographie
Blockpraktikum Molekularbiologische ArbeitstechnikenWS 2004/2005
Bianca Löhr
Übersicht
Einführung Probleme und Lösungsmöglichkeiten Möglichkeiten der Überexpression Expressionssysteme in E.coli Affinitätschromatographie
Einführung
In der Molekularbiologie werden oft größere Mengen an nativem Protein benötigt Analyse der Funktion, Struktur etc.
Überexpression bedeutet erhöhte Expressions- bzw. Transkriptionsrate eines Gens
Auch verwendet für: vermehrte Bildung eines bestimmten Proteins über die natürliche Konzentration hinaus
Einführung
Homologe Genexpression
Expression im endogenen Wirt Heterologe Genexpression
Expression in fremden Wirtssystemen
Einführung
Natürlich auftretende Überexpression als Antwort auf unterschiedliche Milieubedingungen
Nahrung, Temperatur etc. Immer induzierbare Expressionssysteme Künstliche Überexpression Nutzung von regulierbaren Promotoren aber auch
von konstitutiven Systemen Es existieren viele Expressionssysteme für z.B.
Bakterien, Pilze, Hefen, Höhere Pflanzen und Tiere
Probleme und Lösungsmöglichkeiten
Bei der Überexpression können Probleme auftreten die durch das jeweilige Protein bedingt sind
Proteine wirken teilweise toxisch Proteine werden abgebaut Proteolyse Es treten niedrige Expressionsraten, Lyse und
Absterben der Zellen auf Verminderung dieser Auswirkungen durch: Niedrige Kultivierungstemperaturen, kurze
Induktionszeiten Einsatz proteasedefizienter Wirtsstämme Veränderungen des N-Terminus
Probleme und Lösungsmöglichkeiten
Codonverteilung: Die Codonverteilung in unterschiedlichen
Organismen ist verschieden Die Bevorzugung best. Triplettkombinationen führt zu
unterschiedlichen Konzentrationen der zugehörigen tRNAs
Die Translation eines fremden Gens mit anderen Codons ist erschwert
Anpassung der Codons an die des Wirtes durch Mutagenese
Co-Überexpression bestimmter tRNAs
Probleme und Lösungsmöglichkeiten
Posttranslationale Modifizierung eykaryontischer Proteine
Glycosilierung, Phosphorylierung, etc. Modifizierung ist im Wirtssystem verändert oder fehlt
Nutzung von möglichst nah verwandten Expressionssystemen
Probleme und Lösungsmöglichkeiten
Bildung von Disulfidbrücken Bei Prokaryonten extracellulär bzw. im Periplasma Bei Eukaryonten im ER, nicht im reduzierenden
Cytoplasma Eukaryontische Gene aggregieren bei cytosolischer
Expression Transport in ein oxidierendes Zellkompartiment muss
gewährleistet sein
Probleme und Lösungsmöglichkeiten
Aggregation und Bildung von Inclusion Bodies bei Überexpression von hydrophoben Proteinen
Proteine liegen nicht mehr in nativer Form vor Verminderung durch:
Limitierte Induktion, niedrige Temperatur, Gabe von nicht-metabolisierbaren Glucose-Homologon, Fusionsprotein, Überexpression von Hitzeschock-Proteinen
Möglichkeiten der Überexpression
Überexpression als Inclusion-Body-Protein Nur bei guter Renaturierung des Proteins Vorteile: hohe Konzentrationen möglich (bis 50% des
Gesamtzellproteins) und einfache Aufreinigung
Möglichkeiten der Überexpression
Überexpression als Fusionsprotein Fusion mit Proteinen bzw. Proteindomänen Fusion mit kurzen, endständigen Peptiden: tags Vorteile: Verringerung von Toxizität, Proteolyse,
Aggregation, Effiziente Aufreinigung mit Affinitätschromatographie
Möglichkeiten der Überexpression
Häufig verwendete Fusionspartner-Proteine und Tags
Möglichkeiten der Überexpression
Reinigungsschema für GST-Fusion
Möglichkeiten der Überexpression
Spaltung der Fusionspartner Chemisch: Hydrolyse der Peptidbindung Enzymatisch: z.B. durch den Xa-Faktor
Expressionssysteme in E.coli
Eine hohe konstitutive Expression beeinträchtigt meist den Zellmetabolismus
Daher Anwendung von induzierbaren Expressionssystemen
Promotor-Operator-System Induktion durch Metabolitzugabe, Entfernen best.
Kohlenstoffquellen, Temperaturveränderungen
Expressionssysteme in E.coli
Häufig genutzte Promotoren in E.coli
Affinitätschromatographie
Prinzip: Spezifische und reversible Adsorption eines Moleküls
an einen individuellen, matrixgebundenen Bindungspartner
Selektive Adsorption aus einer komplexen Mischung
Affinitätschromatographie
Schema Affinitätschromatographie
Affinitätschromatographie
Durchführung: Adsorption der Probe: Bindungskonstante des
Proteins von 10-5 bis 10-7 M Waschen: Entfernung unspezifisch gebundener
Komponenten durch erhöhte Ionenstärke Desorption: spezifisch oder unspezifisch Regeneration der Matrix: richtet sich nach der
Verunreinigung der Ausgangsprobe
Affinitätschromatographie
Schema Matrix
Affinitätschromatographie
IMAC = immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie
Basiert nicht auf biospezifischen Erkennungsmechanismen
Affinitätschromatographie
Prinzip: Metall-chelatierte Gruppe ( bei uns NTA) ist am
Säulenmaterial immobilisiert Ein multivalentes Übergangsmetall-Ion (bei uns
Nickel) bindet an das NTA Interaktion mit den Histidinresten des His-tags Desorption durch Gradientenelution mittels Imidiazol
kompetetive Verdrängung
Affinitätschromatographie
Bindung von zwei Histidinresten an die Ni-NTA-Gruppe