4 7 4 Kurze wissenschaftIiehe Mitteilungen. Klinisclle Wochensehrift

K U R Z E w i S S E N S C H A F T L

~BER DIE CHOLINESTERASE DER PLACENTA UND DES BLUTES V0N SCHWANGEREN.

Von E. ~Vm~LE und ~V. HARTI~'IANN.

Aus dem Laborator ium des Ctfirurgiseh-Klinischen Inst i tutes der Universit~t Mflnchen.

(Eingegangen am 27. Februar 1952.)

Naeh dem Eintr i t t einer Schwangersehaft wird die Kon- zentration einer Reihe yon Enzymen im Blutplasma erh6ht. Dies gilt in besonderem Mafle ffir die Diaminoxydase ~-~ und ffir Fermente, welehe die Hormone des Hypophysenhinter- lappens zu inaktivieren vermSgen, also fiir die Oxytocinase ~-10 Vasopressinase n ned fiir das Adiuretin-inaktivierende Fer- menta l • Die Konzentration des Enzyms, welches das Hormon des Hypophysenzwisehenlappens, das Melanophorenhormon, angreift, ist erst post partum erhSht ~3'~a. Line geringe Akti- vitatszunahme wurde fiir die Angiotonase ~, die alkalische Phosphatase 1~, die Protamiuase ~v und die GIueuronidase Zest- gestellt ~s. Die Aktivitaten der Diaminoxydase und der Oxyto- cinase, die normalerweise sehr niedrig bzw. kaum mel~bar sind, steigen im Verlauf der Schwangerschaft auf das 100- bzw. 1000fache der urspriinglichen Werte an and dieser Umstand er- mSglicht es, eine Schwangerschaft an Hand yon Aktivitatsbe- stimmungen dieser Fermente in friihen Stadien zu erkennen ~-". Die Bestimmungen der Vasopressinaseaktivit~t sind in diesem Zusammenhang von begrenztem Weft, well die Konzentration des Fermentes sehon normalerweise gr6Beren Sehwankungen unterliegt n.

Soweit untersucht, entstammen die im Blur stark ver- mehrt oder neu auftretenden Fermente der P lacen ta l Die in der Placenta nachgewiesene 19-22 sehr labile Monaminoxydase t r i t t im Blur der Schwangeren nieht auf 1~,~°. Ob die Chotin- esterase der Placenta ins Blntplasma yon Sehwangeren ge- langt, war bisher nicht untersucht. Bei der Cholinesterase der Placenta e3 handelt es sieh um die spezifische, die bevorzugt Aeetyleholin spaltet, und daher als Acetylcholin-Esterase e~ bezeichnet wird, bei der des BIutplasmas um die sog. unspe- zifisehe, die Propionyt- und Butyl~qehotin rascher spaltet ats Acetyleholin ~4.

Wir haben nun festgestellt, dal~ die Acetylcholin-Esterase der Placenta wie die der Nerven und der Erythrocyten lest an der Struktur der Zelten verankert ist und dal~ sic nicht in das Plasma der Schwangeren fiber~ritt. Die Acetylcholin- Esterase-Aktivit~t der Erythrocyten der Schwangeren ist gegeniiber der yon Mi~nnern oder nichtschwangeren Frauen nieht erhSht. Sie unterliegt naeh unseren Messungen schon normalerweise yon Person zu Person, aber aueh beim gleichen Individuum starken Schwankungen, die nicht auf Anderungen der Erythrocytenmenge oder des F~rbeindex oder auf irgend- welche Cholinesterase-I-Iemmstoffe im Plasma zuriickzufiihren sled.

Methodisches. Die Acetylcholin-Esterase-Aktivit~t des Schwangerenblutes und des Retroplacentarserums wurde Each AMY~ON ~s mit der Warburg:Appar~tur gemessen. Blur und Serum wurde mit l%inger-30-L6sung 1:5 verdiinnt, mit Car- bogengas (95% O~, 5% CO~) durchper]t ned so auf p~ 7,4 ein- gestellt. Als Substrat wurden jeweils 1,5 em ~ einer l%igen Aeetylcholinchtorid- bzw. Acetyl-fl-methylcholinchloridlSsung verwendet. In den Nikolai-Trog wurden 1,5 cm s Substrat- 15sung and 0,5 cm ~ des verdfinnten Sermns gegeben. Die CO~- Entwicklung wurde alle 10 rain, 1 Std lang abgelesen. Die elektive Erfassung der Acetyleholin-Esterase-Aktivit//t ira Btut war dutch Verwendung yon Acetyl-fi-methylcholinchlorid, einem spezifischen Substrat des Fermentes, oder dutch selek- t i r e Hcmmung der Cholinesterase mit Coffein mSglich. Die Aeetylcholin-Esterase gewaschener Erythrocyten wurde dutch 3 mg Coffein je Ansatz fast vSllig gehemmt. In gleicher ~Veise wurde die Acetylcholin-Esterase-~Cktivitat im wal~rigen Extrakt und in der Suspension yon Placentagewebe untersucht. Durch Coffein wurde das Ferment vollst/h~dig gehemmt. Unter den angegebenen Versuchsbedingungen wurden durch 1 g frisches Placentagewebe in der Stunde z. B. 390 mm ~ CO~ entwickelt*.

Zusammen]as,sung. Die Acctylcholin-Esterase der Placenta ist, wie in den Erythrocyten, in der Musku!atur und im Nerven- gcwebe strukturgebunden. Sie erscheint nicht im Serum yon Sehwangeren. Die Aktivi tat der Acetylcholin-Esterasc der

• Ausffihrliche ~ersuchsdaten siehe W. ~AI~.~IA~, Inauguraldisser- ta t ion der Medizinischen Fakult:~t. Mfinchen 1952.

I C H E M I T T E I L U N G E N .

Erythroeyten yon Sehwangeren liegt im Bereich der Aktivit~t der Erythrocyten yon M~nnern oder nichtschwangeren Frauen und unterliegt physiologischerweise gr51~eren Schwankungen.

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ZUR BESTIMMUNG DER 17-KETOSTEROIDE IM HARN.

Von KLAUS WALTER.

Aus der Medizinisehen Universit~tsklinik :Erlangen (Direktor: Prof. Dr. K. ~TTHES).

(Eingega'~en am 2. M~rz 1952.)

Die Bestimmung der 17-Ketosteroide wird meist mit Hilfe der Z I ~ - ~ E R ~ s c h e n Reaktion 1,2 vorgenommen. Mit ungereinigten Haruextraktrfickst~nden entsteht dabei bekanntlich, teilweise bedingt (lurch unspezifische chromogene Substanzen eine braunrote Fgrbung, deren Absorptionskurve* (Abb. 1, Kurve II) sich wesentlieh yon derjenigen der rot- violetterl Farbe unterscheidet, welche bei der ZIMME]aMANN- schen l~eaktion mit reinen 17-Ketosteroiden erhatten wird. Es wurden zahIreiche Versuehe unternommen die stSrende gelbbraune F~rbung auszuschalten. Mehrere Arbeitsmethoden (Girard-Trelmung 2, ~, MgO s und KohleabsorptionS), auf die i n diesem I~ahmen nieht n~her eingegangen werden kann, streben eine bessere Reinigung der Harnextrakte an. Auch Korrekturformehu werden zur Ausschaltung der st5renden F/~rbung verwendet 2' ~-~°.

Einen ganz anderen Weg verfo]gen die yon CAt~E~ und SALTER 11, sowie von ZIMMEI~MANI~ 12 bekanntgegebenen Me- thoden, bei denen der rote Anteil der nach Ausffihrung tier ZiM~]~R~nvNsehen Reaktion entstandenen Farbe mit einem organischen L(isungsmittcl extrahiert und damit yon den stSrer~den Pigmenten ~bgetrennt wird. Beim Arbeiten mit Chloroform wie es yon CAl3[Ei'ff u n d SALTEI¢ 11 vorgesch]agen wurde, entstehen schr leicht hartn~ckige Emutsionen, welche die photometrisehe l~Iessung der extrahierten Farbe beein- tr~chtigen. Die ZI~rME~AN~sehe 1Vfethode lz hat den Naehteil, dab mit dem leich~ fliichtigen J~ther quantitativ gearbeitet werden mul l Die extrahier~e Farbe verblaf~t hier, wie auch

* Die Absorpt~onskurven wurden ungefiihr mi t dem Putfrich-Stufen- photometer bestimmt.

Jg. 30, lteft 19/20 K u r z e w i s s e n s c h a f t l i c h e ,,~,oo ~ e~r;~%;~un-en. 475 15. Mai 1952

bei Verwendung aller anderen Extraktionsmittel unter Licht- einwirkung. Ferner wird der naeh Filtration zun/~chst Mare Xtherextrakt h/~ufig im Laufe einiger Minuten triibe. Sorgt man jedoch dafiir, dab zwisehen Farbextraktion und Ablestmg am Photometer stets die gleiche, m6gliehst, kurz gehaltene Zeit verstreieh~, so lassen sieh na, eh dieser Methode brauehbare Ergeb.nisse erzielen. Wir untersuehten die Verwendbarkeit yon Athyl/~ther, Chloroform, Benzol, Butyl-, Amyl-, Oktyl- alkohol, Xylol und Tetraehlorkohlenstoff als Extrak~ions- mittel. Nach nnseren Versuchsergebnissen ist hierzu Benzol sehr gut geeignet. Feruer stellten wir lest, dab die Best/~ndig- keit tier extrahierten Farbe yon der Gegenwart geringer Mengen Alkali gfinstig beeinflugt wird und geben daher zum Benzolextrakt eine sehr schwache alkoholische Kali- lauge. Die erhaltene rotviolette Benzol-Alkoholl6sung zeigt mindestens 30 min lang, auch bei Beleuehtung im Stufen-

photometer, konstante Ab-

.~ ~,d

#aa 5oo goon~ kbb. I. Erl/~uterung der

Abbildung im Text.

sorptionswerte. Die hSchsten Extinktionen werden im Be- reich yon 530 m s gemessen. Wie aus der Abb. 1 ersehen werden kann, ist die Farbst~rke

des atherischcn Extraktes (Kurve IV) wesentlich grSBer als die des gleiehkonzentrierten Benzolauszuges (Kurve III), was dureh die Art des Extrak- tionsmittels bedingt ist. Ande- rerseits ist jedoch die Charak- teristik der beiden Ahsorp- tionskurven praktiseh identisch und gegentiber derjenigen der im vorliegenden FMle stark verunreinigten, niebt extrahier- ten Harasteroide deutlich ver- andert (Kurve II). Im einzelnen fiihren ~ r die ZI~ME~A~N- sche Reaktion nach folgender Arbeitsvorsehrift aus:

Reagentien. I. Alkohol. ab- solutus, ketonfrei, wie tiblich mit Phenylendiaminhydrochlo- rid gereinigt. - - II . m-Dinitro- benzollSsmag, 2 vol.-%ig, alko- holisch. Das m-Dinitrobenzol mull vor Herstellung der LS- sung entspreehend den in der

Literatur angegebenen Vorsehrif~en gereinigt werden. - - I IL 5n-KOI.I, w~t~rig. Genaue EinstelIung erfolgt durch Titration unter Verwendung yon Methylorange als Indicator. IV. KOH, w~]rig, 50 vol.-%ig. - - V. KMilauge, alkoholiseh, 0,125 Vol.- %. Zur HersteUung gibt man mit airier 0,1-era s- Pipette 0,05 cm s der Katilauge Nr. IV in ein 20-cmS-MeB- k61bchen und verdfinnt mit absotutem Alkohol (Nr. I) his zur }Lurke. Diese L6sung muB t~glieh unmitte]bar vor der Benzolextraktion frisch hcrgestellt warden (s. unten). - - VI. Benzol, pur. krystallisierbar.

Arbeitsvorgang. Der einer Harnmenge yon 5--10 ems entspreehende Extraktrfiekstand wird in 0,2 cm ~ absoluten Alkohol {Nr. I) gelSst in einem Reagensglas mit 0,2 cm s tier m-DinitrobenzollSsung (Nr. II) und 0,2 em ~ 5n-KOH (Nr. I II) versetzt. Nach dam Durehmischen wird das verschlossene 1%eagensglas auf die Dauer yon 80 rain in ein Wasserbad yon 270C unter LichtabsehluB gebraeht. Nach Ablauf dieser Zeit gibt man zu der nun rotgelbIich gefa, rbten LSsung 2 cm s Benzol (Nr. Vt) und extrahiert durah kraftiges Schtttteln des Reagensglases den roten Farbanteil. Nach (mSgliehst genau) 45 see, wenn sieh am Boden des Glases etwas gelbe Fltissigkeit abgesetzt hat, pipettiert man die fiberstehende, trfibe rote LSsung vorsiehtig und unter Kontrolle des Auges ab und gibt sie dureh ein kMnes welches Faltenfilter in ein 10-cmS-MeBk6Ibchen, in welehem sich 2 cm a der alkoholischen K O H (Nr. V) befinden. Durch seitliches Schwenken des KSlbehens sorgt man daftir, da$ das Fil trat m6glichst bald mit dem Alkali gemisaht wird. In gleicher Weise wie oben beschrieben wird dann der gelbe Rfiekstand in dem Reagens- gins noch 2mat mit je 2 cm a Benzol extrahiert und die tiber- stehende ~iissigkeit durah das Faltenfilter zu dam K61bchen- inhMt gegeben. Man fiillt hierauf das MeBkSlbchen bis zur Marke mit Benzol auf und miseht seinen Inhal t dureh Um- sahfitteln. Die erhaltene violettrote L6sung wird im Stufen- photometer mit Filter S 53 in 3 cm Schichtdieke gegen ein

Gemisch yon 2 cm s absolu~em Alkohol (Nr. I) und 8 cm ~ Benzol (Nr. VI) colorimetriert. Die erhaltene Extinktion wird mit Hiffe der Eiehknrve in Milligralnm Dehydroisoandro- steron umgewandelt. Die Ausffihrung yon Leerversuchen erfibrigt sieh. Die Eiehkurve wird hergestellt, indem man mit bek~nnten Dehydroisoandrosteronverdfinnungen die ZIM~ER- MA~Nsche 1%eaktion anstel]t und die entstandene Farbe wie oben besehrieben mit Benzol extrahiert und colorime~riert. Die Gfiltigkeit des LA~Bm~T-BEm~sehen Gesetzes bleibt erhMten. Mehrfaeh ausgeftihrte Doppelbestimmungen zeigten gut ttbereinstimmende gesnltate. Schwankungen der KOH- Konzentra.tion in der 0,125%igen Lauge beeinflussen ilmer- halb eines weiten Bereiches die Farbsi~rke des Ex4,raktes nicht.

Zusammen/assung. Es wird eine Extraktionsmethode ftir die bei der ZIMMEI~_a~I~schen Reaktion entstehende rote Farbe mit Benzol angegeben. Biases Verfahren ist gegeniiber den ahnliehen Arbeitsweisen yon C A I ~ und Mitarbeiter ~x und ZIM~IEI~MA~N ~ dadurch gekennzeichnet, dab 1. durch Ver- wendung eines relativ schwerer fltichtigen Extraktionsmittels Verdunstungsverluste vermieden werden, 2. durch Schaffung eines schwaeh alkalischen Milieus in der Extraktionsl6sung eine Farbkonstanz yon mindestens 30 rain garantiert ist und 3. innerhalb dieser Zeit in dam emuMonsfreien Ext rak t keine st5renden Trtibungen auftreten.

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UBER DIE MULLER-BALLUNGSREAKTION. Von

H. ANWANDEI~ und 1%. G. JANKE. Aus der UniversitgtskHnik fiir Geschleehts- und Haut,krankheiten in Wien

(Vorstand: :Prof. Dr. A. WI~D~iANN).

(Eingegangen am 11. Miirz 1952.)

Die ausgezeiehneten Erfolge, die mit dem Cardiolipin Antigen bei den verschiedenen Komplementbindungs- und Floekungsreaktionen erzielt wurden, veranlaBte uns bei der Mtiller-Ballungsreaktion I I m i t Cardiolipin-Antigen Versuehe anzustellen.

Die urspriingliehe Methode Mfiller-BatlungsreM~tion I wnrde yon M~LLER selbst vereinfacht und abge~ndert. Mi)L- L ~ gibt die Vorteile dieser Miiller-BMtungsreaktion I I m i t Einfaehheit, Rasehheit, gutem spezifisahen Verhatten bei gleiehbMbender Empfindlichkeit an.

Die Mfiller-Ballung I I ist mit einem hoehcholesterinisierten, eingeengten Rinderherzextrakt auszufiihren und stellt e i n e n langsam verlaufenden Flockungsvorgang dar.

Die positive Reaktion wird durch Ausbildung eines schwe- benden, kugeligen Gebildes angezeigt. MfdLL~R setbst gibt fotgende Besehreibung: ,e in Komplex yon weiBem oder gelbliehweiBem Aussehen mit meist diehterem, etwas dunkler gef~rbtem Kern und zarter, sehleierartiger Au~enpartie." Das mikroskopisehe Bild dieser BMlung l~Bt breite, an den Enden oft abgeplattete S~ulen erkennen.

Diese ffir das Auge zwar gut siehtbare BMlung ist yon ~uBerst geringem Gewicht; zahlreiche Bestimmungen ergaben ein Durchsehnittsgewicht yon 0,t mg je Ballung.

Zwecks n~herer Untersuchung wurde die Abtrennung aus dam Serum versucht; die spezifisehe Gleichheit mit dem Serum gestattet jedoch wader ein Abzentrifugieren noah ein Abdekantieren. Die Abtrennung yore Serum wurde noah am besten durch Absaugen fiber Glassinter-Nutsehe G 5/3 erreicht

Um alas begleitende Serum so welt als mSglich zu ent- fernen nnd dabei die Substanz vor Sehaden zu bewahren, wurde einige Mate mit physiologiseher KochsMzl6sung naeh- gewasehen und dann ansch]ieBend im Exsiceator fiber kon- zentrierter Schwefels~ure getrocknet.