aerobe atmung und abbau. organismus des tages pseudomonas aeruginosa systematik klasseklasse:...

Aerobe Atmung und Abbau

Organismus des TagesPseudomonas aeruginosa

Systematik

Klasse: Gammaproteobacteria

Ordnung: Pseudomonadales

Familie: Pseudomonadaceae

Gattung: Pseudomonas

Art: Pseudomonas aeruginosa

Aerugo: griechisch Grünspan,

-Glänzt auf Agar metallisch-grün

-Speziesname bezieht sich auf die blau-grüne Färbung des Eiters in Wunden

The uncultured majority

• Black: 12 original Phyla (Woese 1987)many pure cultures

• White: 14 new phyla since 1987some isolates

• Gray: 26 candidate phylano isolates

Rappé & Giovannoni (Annu Rev Microbiol, 2003)Keller & Zengler (Nat Rev Microbiol, 2004)

What are they all doing ?

1205

1367

220

1808

91

8

4

9

13

1124

25

n = published species

Eigenschaften• Aerobes Bakterium, teilweise anaerob• Ein bedeutender nosokomialer Keim.• Definition: Unter einer nosokomialen Infektion (Krankenhausinfektion)

wird jede durch Mikroorganismen hervorgerufene Infektion verstanden, die im zeitlichen Zusammenhang (48 h) mit einem Krankenhausaufenthalt oder einem Aufenthalt in einer anderen medizinischen Einrichtung steht, unabhängig davon, ob Krankheitssymptome bestehen oder nicht. „Nosokomien“ hießen die Räumlichkeiten in den Heilstätten im alten Griechenland (z.B. in Epidauros), in denen Patienten mittels eines Heilschlafes behandelt wurden.

• Wächst in und verwertet Detergenzien• Es verursacht z. B. nach Verbrennungen auf Wunden Infektionen, • bei zystischer Fibrose oft Pneumonien, v. a. bei Immunsupprimierten

und AIDS-Patienten. • Harnwegsinfekte, Enterocolitis, Meningitis. • Zur Hämolyse fähig und produziert Toxine.• In der Tiermedizin ist P. aeruginosa an lokalen eitrigen

Infektionskrankheiten beteiligt; der Speziesname bezieht sich auf die blau-grüne Färbung des Eiters.

P. aeruginosa ist besonders häufig bei Cystic Fibrosis Patienten

• CF-Patienten: Defekt in Chlorid Kanälen• Wenig Flüssigkeit und geringe Effizienz,

Organismen auszuhusten• Chronische Infektionen über Jahrzehnte

– P.ae. Biofilme schützen sich gegen Entzündungsreaktionen. Ev. Rolle von Homoserinlactonen zur Imunrepression

– Schutz gegen Antibiotika– Hohe Resistenzraten und Mutatorstämme

Eigenschaften

• Degradation of n-alkanes in diesel oil by Pseudomonas aeruginosa strain WatG (WatG) was verified in soil microcosms.

• bioavailability of phenanthrene (PHE) enhanced in the presence of rhamnolipid biosurfactant and/or a biosurfactant-producing bacterium, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027.

• Kann Detergentien wie SDS abbauen• others

• Generelle Darstellung der aeroben Atmungskette

FMN

1) NADH-Dehydrogenase

NADH + H+

NAD+

2e- + 2H+

[4Fe4S]

[2Fe2S]2e-

4 H+

4 H+

Q

2 H+

QH2

2 H+

2 H+

3) Ubichinol-Cytochrom-C-oxidoreduktase

Cyt-C ox/red

[FexSx]

2 H+

2 H+

Cyt b Cyt c1

2e-

Cyt a/a3

[3 Cu]

2e-

½ O22 H+

2 H+H2O

4) Cytochrom-C-oxidase

2) Succinat dehydrogenase

CN-, CO, N3

-

Antimycin A

z.B. Amytal

Cytoplasma

Periplasma

Alternative aerobe Atmungsketten

1) Bei niedrigen O2-Partialdrücken Feinanpassung

• Keine Cytochrom-c-Oxidase (Endoxidase, Oxidase negativ)

• Kein Cytochrom bc1 complex• Chinoloxidasen oxidieren direkt das Ubichinon entweder

mit (Häm 0) oder ohne (Häm d) Protonenpumpe• NADH-Dehydrogenase II Expression (keine

Protonenpumpe) anstatt NADH-DH I

Grundschemata der Elektronentransportkette in den Membranender Mitochondrien und vieler Bakterien

a)NADH + H+

NAD+

NADH-Dehydrogenase IFMN FeS

Ubichinol-Cytochrom-c-OxidoreduktaseCyt bc1 FeS

Cytochrom-c-OxidaseCyt aa3 Cu

Q

Cyt c

O2

4 H+

2 H+

2 H+

2 H+

Grundschemata der Elektronentransportkette in Paracoccus denitrificans

Substrat-2H-Q-Reduktase

Ubichinol-Cytochrom-c-OxidoreduktaseCyt bc1 FeS

Cytochrom-c-OxidaseCyt aa3 Cu

Cytochrom-c-OxidaseCyt o

Substrat

Q

Cyt c

O2 O2

Chinol-Oxidase

Cyt c

Cyt o

O2

b)

4 H+

2 H+

2 H+

2 H+

4 H+

2 H+

2 H+

2 H+

Grundschemata der Elektronentransportkette in Escherichia coli

Substrat-2H-Q-Reduktase

Substrat

O2 O2

Chinol-Oxidase

Cyt bCu

Cyt o

c)

Q

Chinol-Oxidase

Cyt b

Cyt d

4 H+

2 H+

2 H+

2 H+

4 H+

2 H+

2 H+

2 H+

Geringe Affinität für O2, KM ca. 3 µM Hohe Affinität für O2, KM ca. 0,1 µM

NADH + H+

NAD+

NADH-DehydrogenaseFMN FeS

Ubichinol-Cytochrom-c-OxidoreduktaseCyt bc1 FeS

Cytochrom-c-OxidaseCyt aa3 Cu

Q

Cyt c

O2

Substrat-2H-Q-Reduktase

Ubichinol-Cytochrom-c-OxidoreduktaseCyt bc1 FeS

Cytochrom-c-OxidaseCyt aa3 Cu

Cytochrom-c-OxidaseCyt o

Substrat

Q

Cyt c

O2 O2

Chinol-Oxidase

Cyt c

Cyt o

O2

Substrat-2H-Q-Reduktase

Substrat

O2 O2

Chinol-Oxidase

Cyt bCu

Cyt o

Q

Chinol-Oxidase

Cyt b

Cyt d

Grundschemata der Elektronentransportkette in den Membranender Mitochondrien und vieler Bakterien

a) Mitochondrien und viele Bakterien b) Paracoccus denitrificans c) E. coli

Berechnung der freien Enthalpie mit realen Konzentrationen

C2H3O2- + SO4

2- ↔ 2 HCO3- + HS-

1) Bestimmen der Änderung der freien Enthalpie einer Reaktion unter Standardbedingungen (alle Reaktanden in 1 M Konzentration, 300 K und pH = 7 ergibt ∆G0‘

2) Bestimmen der Änderung der freien Enthalpie unter realen Konzentrationen

Angenommene Reaktion mit aA + bB ↔ pP + qQ (T= 300 K)

∆G = ∆G0‘ + RT ln (cP)p x (cQ)q

(cA)a x (cB)b

Hier Rechenbeispiel mit den freien Energien für Acetat und SO4

2-

Tabellen austeilen mit freien Bildungsenthalpien

Berechnung mit realen Konzentrationen

• Angenommene Reaktion mit aA + bB ↔ pP + qQ• ∆G0‘ für Acetatoxidation mit Sulfat ist?

– C2H3O2- + SO4

2- ↔ 2 HCO3- + HS-

– Produkte minus Edukte– = 2 x (- 586,85) + (+ 12,05) – (- 369,41 + (- 744,63))

= - 1161,2 + 1114,04 = - 47,16 kJ/mol

• ∆G = ∆G0‘ + RT ln (cP)p x (cQ)q

• (cA)a x (cB)b

1) ∆G = - 47,16 kJ/mol + 2,5 kJ/mol 2,3 log (0,010 HCO3-)2 x (0,001 HS-)1

(0,010 Acetat)1 x (0,010 Sulfat)1

• = - 47,16 kJ/mol + 5,75 kJ/mol log 0,001 = - 47,16 kJ/mol – 17,25 kJ/mol •

• = - 47,16 kJ/mol – 17,25 kJ/mol = - 64,41 kJ/mol (Wieviel ATP entspricht das?)

Ausgangswerte die wir normalerweise für Kultivierung verwenden:

1) Acetat 10 mM, 1 mM HS-,

10 mM Bicarbonat, 10 mM Sulfat

Merke!

• Tabellenwerte sind schon auf wässrige Lösungen berechnet. D.h. für Wasser wird nicht 55,5 M eingesetzt sondern 1.

• Das gleiche gilt für Protonen, solange wir mit den G0‘ Werten für pH 7.0 rechnen.

• Bei Gasen wird wegen der geringen Löslichkeit der Partialdruck angegeben.

Berechnung der freien Enthalpie mit realen Konzentrationen

C2H3O2-+ 2 O2 ↔ 2 HCO3

- + H+

1) Bestimmen der Änderung der freien Enthalpie einer Reaktion unter Standardbedingungen (alle Reaktanden in 1 M Konzentration, 300 K und pH = 7 ergibt ∆G0‘

2) Bestimmen der Änderung der freien Enthalpie unter realen Konzentrationen

Angenommene Reaktion mit aA + bB ↔ pP + qQ

∆G = ∆G0‘ + RT ln (cP)p x (cQ)q

(cA)a x (cB)b

Hier Rechenbeispiel mit den freien Energien für Acetat und Sauerstoff

Tabellen austeilen mit freien Bildungsenthalpien

Berechnung mit realen Konzentrationen

• Angenommene Reaktion mit aA + bB ↔ pP + qQ• ∆G0‘ für Acetatoxidation mit Sauerstoff ist?

– C2H3O2- + 2 O2 ↔ 2 HCO3

- + H+

– Produkte minus Edukte– = 2 x (- 586,85) + (- 39,9) – (- 369,4 – 2 x 0)

= - 1213,6 + 369,4 = - 844,2 kJ/mol

• ∆G = ∆G0‘ + RT ln (cP)p x (cQ)q

• (cA)a x (cB)b

1) ∆G = - 844,2 kJ/mol + 2,5 kJ/mol 2,3 log (0,010 HCO3-)2

(0,010 Acetat)1 x (0,23 O2)2

• = - 844,2 kJ/mol + 5,75 kJ/mol log (10-2) - log (0,0529)• = - 844,2 kJ/mol + 5,75 kJ/mol (-2 + 1,28)• = - 844,2 kJ/mol + 5,75 kJ/mol (- 0,72)• = - 844,2 kJ/mol – 4,14 kJ/mol• = - 840,06 kJ/mol

Ausgangswerte die wir normalerweise für Kultivierung verwenden (geschlossenes Gefäß):

1) Acetat 10mM, 23 % O2,

10 mM Bicarbonat, pH 7,0

Berechnung mit realen Konzentrationen

• Angenommene Reaktion mit aA + bB ↔ pP + qQ• ∆G0‘ für Acetatoxidation mit Sauerstoff ist?

– C2H3O2- + 2 O2 ↔ 2 HCO3

- + H+

– Produkte minus Edukte– = 2 x (- 586,85) + (- 39,9) – (- 369,4 - 0)

= - 1213,6 + 369,4 = - 844,2 kJ/mol

• ∆G = ∆G0‘ + RT ln (cP)p x (cQ)q

• (cA)a x (cB)b

2) ∆G = - 844,2 kJ/mol + 2,5 kJ/mol 2,3 log (0,01 HCO3-)2

(0,0001 Acetat)1 x (0,01 O2)2

• = - 844,2 kJ/mol + 5,75 kJ/mol (log 104)• = - 844,2 kJ/mol + 5,75 kJ/mol (4)• = - 844,2 kJ/mol + 23 kJ/mol• = - 821,2 kJ/mol Gegenüber – 840,06 kJ/mol bei 23 %

Ausgangswerte die wir normalerweise für Kultivierung verwenden (geschlossenes Gefäß):

2) Acetat 0,1 mM, 1 % O2,

10 mM Bicarbonat, pH 7,0

Kurzes Rechenbeispiel wieviel Protonen über die Membran bei Acetat.

Denksportaufgabe Minigruppe

• Wieviele Protonen pumpt das Mitochondrium pro Acetat über die Membran?

• Wieviel Energie ergibt das und wieviel ist das im Vergleich zur Standardenergie der Reaktion? Was bedeuted das?

Warum alternative Wege der aeroben Atmungskette?

1) Die Energetik alleine kann also nicht der Grund sein, dass bei Sauerstoffmangel andere Endoxidasen mit weniger Energiegewinn genutzt werden.

2) Es ist die Affinität der Enzyme zum Sauerstoff, die hier entscheidend wird.

3) Irgendwann wird der Sauerstofffluss limitierend und die Konzentration wird zu klein um noch vernünftige Kinetiken zu erlauben (Michaelis Menten, Affinität)

Schutz vor Sauerstoff

• Obligat aerobe Organismen

• Fakultativ aerobe/fakultativ anaerobe

• Microaerophil

• Aerotolerante

• Obligat anaerobe

Schutz vor Sauerstoff

• Catalase 2 H2O2 → 2 H2O + O2

• Superoxiddismutase 2 O2

- + 2 H+ → H2O2 + O2

• Glutathion-Peroxidase H2O2 + 2 GSH → GSSG + 2 H2O

R-OOH + 2 GSH → GSSG + ROH + H2O

Aerobe Biochemie von Schadstoffabbau

• Monooxygenasen Alkane

• Dioxygenasen, Toluol, PAK

• Ringspaltende Dioxygenasen,

• Epoxyd-bildende Monoxygenase (Benzol)

Welche Schadstoffe sind wichtig?

Biodegradation pathways, aerobic

• Oxygen is special because it is needed as electron acceptor and co-substrate

• Oxygenase reactions for alkanes and aromatic hydrocarbons

Aerobic degradation of alkanes

Benzol, Phenol Abbau

OH

OH

H

H

OH

OH

O2

XH2X XH2

X

Benzolcis-1,2-Dihydro-

1,2-dihyroxy-benzol

Brenz-Catechin (Catechol)

Dioxygenase Dehydrogenase

OH

OH

OH

Phenol Brenzcatechin (Catechol)

O2 + XH2 H2O + X

Monooxygenase

Konvergente Abbauwege

Athracen

lyklA CHOH COOH CH2 CHNH2 COOH

Alkylbenzol Mandelat Phenylalanin

Naphthalin Benzoat Benzol Phenol Biphenyl

COOH OH

Phenanthren

Salicylat Brenzcatechin Anthranilat Tryptophan

COOH

OH

OH

OH

COOH

NH2

HN

Zu Protocatechuat führenden Abbauwege aromatischer Verbindungen

CH3

COOH

COOH

COOH

COOH

COOH

OH

COOH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

Alkyl

COOH

OH

OCH3

C

OH

3

OCH3

C3

O

On

Toluat

4-Hydroxy-benzoat

Alkylphenol

Shikimat Lignin

VanillatProtocatechuat3- Hydroxy-benzoat

Benzoat

O

O

OH

OH

C

C

OH

OH

O2

Dioxygenase

Brenzcatechin cis, cis- Muconat

ortho-Spaltung des aromatischen Ringes

Meta-Spaltung des aromatischen Ringes

OH

OHCOOH

CHO

OH

HOOC OH

OH

COOH OH

COOHCHO

Brenzcatechin 2-Hydroxy-muconat-

semialdehyd

Protocatechuat 2-Hydroxy-4-caroxymuconat-

semialdehyd

Metapyrocatechase(Catechol-2,3-Dioxygenase)

Protocatechuat-4,5-Dioxygenase

Ortho-Spaltung des aromatischen Ringes und 3-Oxoadipat-WegOH

OH

COOH

COOH

OCOOH

C O

OCOOH

C O OC

COOHO

HOOC

COOH

COOH

HOOC

OH

OH

HOOC

O COOH

COOH

O CO~SCoA

COOH

CO2

Brenz-catechin

cis,cis-Muconat

Mucono-lacton

4-Oxoadipat-enollacton

Proto-catechuat

3-Carboxy-cis,cis-muconat

4-Carboxy-muconolacton

3-Oxoadipat 3-Oxoadipyl-CoA

CoA

Succinat

Acetyl~CoA

CoA

Succinyl~CoA

1. Pyrocatechase

2. Muconat-Cycloisomerase

3. Muconolacton-Isomerase

4. Protocatechuat-3,4-Dioxygenase

5. 3-Carboxymuconat-

Cycloisomerase

6. 4-Carboxymuconolacton-

Decarboxylase

7. 4-Oxyoadipatenollacton-Hydrolase

8. 3-Oxoadipat-Succinyl-CoA-Transferase

9. 3-Oxoadipyl-CoA-Thiolase

1

2

3

4

5

6

78

9

Proposed pathway for the degradation of naphthalene

H

OHOH

H

HO

OH

OCOOHOH

OHHOOC

O

OH O

OH

OH

CHO

OH

COOH

OH

COOHOH

OH

OH

O2

2H+ + 2e-2H+ + 2e-

O2

H2O

CH3COCOOH

P fluorescens

RING FISSION

RING FISSION

Naphthalene cis – Naphthalene dihydrodiol

cis - o - Hydroxybenzal-pyruvic acid

1,2 - Dihydroxynaphthalene

Salicylic acid

Salicylaldehyde

Gentisic acid

Catechol

COOH