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Dissertation
vorgelegt zur Erlangung des Grades eines Doktors an der Fakultät für Chemie der
Ruhr-Universität Bochum
Untersuchung von spezifischen Protein-
Protein-Interaktionen am Beispiel von
hGBP1 und
strukturelle Charakterisierung von
proteinresistenten Peptidthiolen
von
Andreas Kerstan
angefertigt am Lehrstuhl
Physikalische Chemie I (Fakultät Chemie)
Betreuer: Prof. Dr.Wöll/ Prof. Dr. Herrmann
Abgabe: 15.10.10
Kapitel 0 Titel und Inhaltsverzeichnis
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Oktober 2006 bis Februar 2010 an der
Fakultät für Chemie und Biochemie an der Ruhr-Universität Bochum unter der Leitung
von Herrn Prof. Dr. Christof Wöll und Prof. Dr. Christian Herrmann angefertigt.
Referent: Prof. Dr. Christof Wöll
Koreferent: Prof. Dr. Christian Herrmann
Kapitel 0 Titel und Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ............................................................................................................................ 1
1.1 Die ursprüngliche Idee dieser Arbeit: Die Anwendung der Oberflächenanalytik auf
Protein-Protein-Interaktionen ............................................................................................... 1
1.2 Maßgeschneiderte Oberflächen- die Bedeutung der Biosensorik am Beispiel der
Funktionsweise von hGBP1 ................................................................................................. 2
1.3 Proteinresistente (Bio-)Oberflächen ..................................................................................... 3
1.4 Zielsetzung ........................................................................................................................... 5
2 Theoretische Grundlagen .................................................................................................. 7
2.1 Spezifische und unspezifische (Protein-)Adsorption an Oberflächen bei der
Entwicklung von (Bio)sensoren ........................................................................................... 7
2.2 Allgemeine mechanistische Aspekte der Proteinadsorption an Festkörperoberflächen ...... 8
2.3 Bestimmende Faktoren der Proteinadsorption an Festkörper-oberflächen .......................... 9
2.4 Die Besonderheiten der Oligoethylenglykol(OEG)-SAM-Oberflächen ............................ 12
2.5 Herstellung von selbstorganisierenden Monolagen (SAMs) ............................................. 16
2.6 Peptidthiol-SAMs ............................................................................................................... 18
2.7 Die Verwendung des Biotin-Streptavidin-Systems als Immobilisierungs-Assay .............. 21
2.8 Das Immunprotein hGBP1- ein Vertreter aus der Dynamin Superfamilie ........................ 26
2.8.1 Interferone als Botenstoffe der Immunantwort ........................................................ 26
2.8.2 Gemeinsamkeiten GTP-bindender Protein ............................................................... 28
2.8.3 Die GBPs als Vertreter der Dynamin-verwandten Proteine ..................................... 29
2.8.4 Mx-Proteine als Vertreter der Dynamin Superfamilie mit antiviraler Aktivität ...... 31
2.8.5 Die Familie der Guanylat-bindenden Proteine ......................................................... 32
2.8.6 Das Humane Guanylat-bindende Protein 1- funktionelle und strukturelle
Aspekte ..................................................................................................................... 33
2.9 Kurzdarstellung anderer verwendeter Proteine .................................................................. 36
3 Material und Methoden ................................................................................................... 38
3.1 Materialien für Oberflächenanalytik .................................................................................. 38
3.1.1 Verwendete Substrate ............................................................................................... 38
3.1.2 Metalle für thermische Bedampfung im Vakuum .................................................... 38
3.1.3 Puffer und Lösungsmittel ......................................................................................... 38
Kapitel 0 Titel und Inhaltsverzeichnis
3.1.4 Thiolierte Reagenzien für Oberflächenmodifikation ............................................... 38
3.1.5 Verwendete Proteine ................................................................................................ 39
3.2 Methoden für die Oberflächenanalytik............................................................................... 39
3.2.1 Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie ........................................................ 39
3.2.1.1 Metallisierung der Substrate für die SPR-Messungen ................................... 44
3.2.1.2 Präparation der SAMs .................................................................................... 45
3.2.1.3 Oberflächenplasmonenresonanzmessungen zur Untersuchung
verschiedener hGBP1-Mutanten und ihres Dimerisierungsverhalten ............ 45
3.2.1.4 Überprüfung der Proteinresistenz von Peptidthiolen ..................................... 47
3.2.2 Rasterkraftmikroskopie ............................................................................................ 48
3.2.2.1 Kontakt- und Tapping-Modus ........................................................................ 50
3.2.2.2 Nanoshaving und Nanografting ..................................................................... 53
3.2.2.3 Mikrokontaktstempeln .................................................................................... 55
3.2.2.4 Experimenteller Teil ....................................................................................... 57
3.2.2.4.1 Metallisierung der Substrate für die AFM-Messungen ........................ 57
3.2.2.4.2 Herstellung lateral strukturierter Oberflächen ...................................... 57
3.2.3 Infrarotspektroskopie/-mikroskopie ......................................................................... 60
3.2.3.1 FT-IR Mikroskopie ......................................................................................... 61
3.2.3.2 Infrarotspektroskopie an Proteinen................................................................. 62
3.2.3.3 Experimenteller Teil ....................................................................................... 64
3.2.3.3.1 Attenuated total reflection (ATR)-FT-IR-Messungen .......................... 64
3.2.3.3.2 Messungen am IR-Mikroskop .............................................................. 65
3.2.3.3.3 Überprüfung der Peptidthiol-Monolage ............................................... 66
3.2.3.3.4 Einfluss von Trifluorethanol (TFE) auf die Sekundärstruktur des
Peptidthiols ........................................................................................... 66
3.2.3.3.5 Inkubation von Puffer in Abhängigkeit von der Zeit ........................... 67
3.2.3.3.6 IR-Messungen des Peptidthiols in Lösung ........................................... 67
3.2.4 Quartz Crystal Microbalance Dissipation (QCM-D) ............................................... 67
3.2.5 Experimenteller Teil ................................................................................................. 69
3.2.5.1 QCM-Messungen zur Untersuchung verschiedener hGBP1-Mutanten und
ihres Dimerisierungsverhaltens ...................................................................... 69
3.2.6 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie ......................................................................... 69
3.2.6.1 Experimenteller Teil ....................................................................................... 71
3.2.6.1.1 Herstellung fluoreszeinmarkierter Proteine .......................................... 71
Kapitel 0 Titel und Inhaltsverzeichnis
3.2.6.1.2 Messungen mit dem Fluoreszenzmikroskop ........................................ 71
3.3 Materialien für die molekularbiologischen und biophysikalischen Methoden .................. 72
3.3.1 Chemikalien .............................................................................................................. 72
3.3.2 Verbrauchsmaterialien .............................................................................................. 72
3.3.3 Reagenzienkits .......................................................................................................... 73
3.3.4 Enzyme und Marker ................................................................................................. 73
3.3.5 Säulenmaterialien ..................................................................................................... 73
3.3.6 Antibiotika ................................................................................................................ 73
3.3.7 Mikroorganismen ..................................................................................................... 74
3.3.8 Nährmedien .............................................................................................................. 74
3.3.9 Vektoren ................................................................................................................... 75
3.3.10 Mutationsprimer ...................................................................................................... 75
3.3.11 Sequenzierprimer .................................................................................................... 76
3.3.12 Puffer ....................................................................................................................... 77
3.4 Molekularbiologische Methoden ........................................................................................ 78
3.4.1 Isolierung von Plasmid-DNA ................................................................................... 78
3.4.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ........................................................................ 78
3.4.3 Sequenzierung .......................................................................................................... 79
3.4.4 Herstellung kompetenter Zellen ............................................................................... 79
3.4.5 Quick Change Site Directed Mutagenesis ................................................................ 80
3.4.6 Transformation ......................................................................................................... 80
3.4.7 Verdau von DNA mittels Restriktionsenzymen ....................................................... 81
3.4.8 Ligation .................................................................................................................... 81
3.5 Proteinbiochemische Methoden ......................................................................................... 81
3.5.1 Präparative Proteinexpression .................................................................................. 81
3.5.2 Zellernte .................................................................................................................... 82
3.5.3 Zelllyse ..................................................................................................................... 82
3.5.4 Co2+
-NTA-Affinitätschromatographie ..................................................................... 82
3.5.5 Größenausschlusschromatographie .......................................................................... 83
3.5.6 Aufkonzentrierung über Ultrafiltration .................................................................... 84
3.5.7 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) ....... 84
3.5.8 Proteinkonzentrationsbestimmung nach Gill und von Hippel (1989) ...................... 85
3.5.9 Biotinylierung von Proteinen mit Maleimid-PEG11-Biotin ...................................... 85
Kapitel 0 Titel und Inhaltsverzeichnis
3.5.10 Quantifizierung der Biotinylierung von Proteinen ......................................... 86
3.6 Biophysikalische Methoden ............................................................................................... 87
3.6.1 Ermittlung von Nukleotidkonzentrationen ............................................................... 87
3.6.2 Analyse von Nukleotiden mittels reversed-phase HPLC ......................................... 87
3.6.3 Messungen der Nukleotidhydrolyse ......................................................................... 88
3.6.4 Zirkulardichroismus (Circular Dichroism, CD)-Spektroskopie .............................. 88
3.6.4.1 Experimenteller Teil ....................................................................................... 90
3.6.5 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-Time of Flight)......... 90
3.6.5.1 Experimenteller Teil ....................................................................................... 91
3.6.5.1.1 Überprüfung der Reinheit der Peptidproben ........................................ 91
3.6.5.1.2 Detektion verschiedener immobilisierter Proteine auf einer
Goldoberfläche ..................................................................................... 91
3.6.5.1.3 Detektion von Streptavidin und hGBP1 ............................................... 92
4 Das Streptavidin-hGBP1-System als Fallbeispiel für den Aufbau eines
Multikomponentensystems auf SAM-Oberflächen ...................................................... 93
4.1 Synthese und Aufreinigung von hGBP1 ............................................................................ 93
4.2 Biotinylierung von hGBP1 ................................................................................................. 95
4.2.1 Biotinylierung über einen lysinspezifischen Biotinamidocaproylanker .................. 95
4.2.2 Diskussion der Ergebnisse ........................................................................................ 98
4.2.3 Biotinylierung über einen cysteinspezifischen Biotinmaleinimidanker ................. 100
4.2.4 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse ................................................ 104
4.3 Oberflächenspektroskopische Untersuchungen des Streptavidin- hGBP1-Systems ........ 105
4.3.1 Massenspektrometrischer Nachweis des immobilisierten Streptavidin und
hGBP1 an der Biotin-SAM-Oberfläche ................................................................. 105
4.3.1.1 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse ...................................... 108
4.3.2 Oberflächenplasmonenresonanzmessungen ........................................................... 109
4.3.2.1 Einfluss der verwendeten Biotinthiolkonzentration auf die
Immobilisierung von hGBP1 ........................................................................ 109
4.3.2.2 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse ...................................... 112
4.3.2.3 Überprüfung der unspezifischen Adsorption von Streptavidin und hGBP1
auf einem reinen OH-Thiol-SAM ................................................................ 115
4.3.2.4 Kontrolle der Streptavidinbelegung ............................................................. 116
4.3.3 Schichtdickenbestimmung mittels AFM und QCM ............................................... 119
Kapitel 0 Titel und Inhaltsverzeichnis
4.3.3.1 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse ...................................... 125
4.3.4 Überprüfung der GTP-Hydrolyse Aktivität der hGBP1-Mutanten in Lösung
und an der Oberfläche ............................................................................................ 127
4.3.4.1 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse ...................................... 132
5 Dimerisierungsstudien von immobilisiertem hGBP1: Das Streptavidin-
hGBP1/hGBP1-System .................................................................................................. 137
5.1 Oberflächenspektroskopische Untersuchungen des Streptavidin-hGBP1/hGBP1-
Systems ............................................................................................................................. 137
5.1.1 SPR-Bindungsstudien von hGBP1 wt mit den immobilisierten hGBP1-
Mutanten ................................................................................................................. 137
5.1.2 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse ................................................ 140
5.1.3 Untersuchung der Dimerisierung von hGBP1 an die immobilisierten hGBP1-
Mutanten mittels AFM und QCM .......................................................................... 141
5.1.4 Überprüfung der Dimerisierung von hGBP1 wt mittels konfokaler
Fluoreszenzmikroskopie ......................................................................................... 145
5.1.5 Diskussion der Ergebnisse ...................................................................................... 147
5.2 Kinetikstudien zur Dimerisierung von hGBP1 mittels SPR ............................................ 149
6 Synthese und strukturelle Untersuchung von proteinre-sistenten Thiolen auf der
Basis von Peptiden ......................................................................................................... 154
6.1 Zusammenfassung der Ergebnisse für das 10er-Peptidthiol ............................................ 154
6.2 Synthese und strukturelle Analyse des 25er-Peptidthiols ................................................ 161
6.2.1 Synthese und Charakterisierung des 25er-Peptidthiols mittels HPLC und
MALDI-TOF .......................................................................................................... 161
6.2.2 Herstellung des Peptid-SAMS und Überprüfung der Proteinresistenz mittels
SPR ......................................................................................................................... 163
6.2.3 Sekundärstrukturanalysen des Peptidthiols mit der Infrarotspektroskopie ............ 169
6.2.3.1 Trockenmessungen im Volumen (Transmission) und im SAM
(Reflexion) .................................................................................................... 169
6.2.3.2 Sekundärstrukturanalyse des Peptidthiols in Lösung mittels IR und CD .... 171
6.2.3.2.1 IR- und CD-Messungen in D2O ......................................................... 171
6.2.3.2.2 Einfluss von Trifluorethanol auf die Sekundärstruktur des
Peptidthiols ......................................................................................... 175
6.2.3.3 Messungen des Peptidthiols an der Oberfläche in Pufferlösung .................. 180
Kapitel 0 Titel und Inhaltsverzeichnis
6.2.3.3.1 ATR FT-IR-Messung im Fluss (D2O) ................................................ 180
6.2.3.3.2 ATR FT-IR-Messungen des Peptidthiol-SAMs am Hyperion IR-
Mikroskop (Bruker) ............................................................................ 182
6.2.3.4 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse ...................................... 189
7 Zusammenfassungen und Ausblick .............................................................................. 194
7.1 Das Streptavidin-hGBP1-System als Fallbeispiel für den Aufbau eines
Multikomponentensystems auf SAM-Oberflächen .......................................................... 194
7.2 Dimerisierungsstudien von oberflächengebundenem hGBP1: Das Streptavidin-
hGBP1/hGBP1-System .................................................................................................... 196
7.3 Synthese und strukturelle Untersuchung proteinresistenter Thiole auf der Basis von
Peptiden ............................................................................................................................ 197
8 Quellenverzeichnis ......................................................................................................... 200
9 Abbildungsverzeichnis ................................................................................................... 213
10 Tabellenverzeichnis ....................................................................................................... 217
11 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................. 218
12 Publikationen ................................................................................................................. 222
13 Lebenslauf ....................................................................................................................... 223
14 Danksagung .................................................................................................................... 224
Kapitel 1 Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Die ursprüngliche Idee dieser Arbeit: Die Anwendung der Ober-
flächenanalytik auf Protein-Protein-Interaktionen
Als Ende 2006 das im Rahmen dieser Doktorarbeit zu bearbeitende Projekt beschrieben
wurde, sollte das interdisziplinäre Arbeiten, auf der einen Seite die Herstellung
rekombinanter Proteine und deren biochemische und biophysikalische Charakterisierung
und auf der anderen Seite das Aufbringen dieser Proteine auf Self-Assembled Monolayers
(SAMs) und die Untersuchung ihres Interaktionsverhaltens über verschiedene Oberflä-
chenmethoden, im Vordergrund stehen. Das zu untersuchende humane Guanylat-
bindende Protein 1 (hGBP1), für das einige antivirale Effekte nachgewiesen werden
konnten (Anderson, 1999; Itsui, Y.Sakamoto, N.; Kurosaki, M.; Kanazawa, N.; Tanabe,
Y.; Koyama, T.;Takeda,Y.Nakagawa, M. et al., 2006; Itsui, Y. et al., 2009) sollte
hinsichtlich seiner bereits bekannten enzymatischen nukleotidabhängigen GTPase-
Aktivität, die durch Selbstassemblierung (Dimerisierung) beschleunigt wird, näher
untersucht werden (Prakash, Renault et al., 2000; Praefcke et al., 2004). Bis dato konnte
nämlich nur die Kristallstruktur des Monomers geklärt werden, aber eine erfolgreiche
Kristallisation des full length hGBP1 in seinem assemblierten dimeren bzw. tetrameren
Zustand ist erfolglos geblieben (Prakash, Praefcke et al., 2000). Dabei wurde auf das
bereits vorhandene Wissen über Struktur und Funktionsweise dieses Proteins
zurückgegriffen und dieses Know-How mit der Erfahrung über die Präparation von
Goldsubstraten und organischen Oberflächen sowie die Adsorption von Proteinen an
Oberflächen geschickt miteinander kombiniert. In diesem Zusammenhang sind die
Arbeiten von Dr. Grunwald (Grunwald, C. et al., 2004; Grunwald, Ch. et al., 2005) und
Dr. Rolf Chelmowski (Chelmowski et al., 2007) zu nennen. die ein System, bestehend aus
biotinylierten Thiolen an einer Goldoberfläche und dem aus der Literatur zahlreich
beschriebenen Streptavidin (Weber, 1989; Wilchek /Bayer, 1990; Freitag, 1997; Klumb et
al., 1998), im Lehrstuhl etabliert haben. Dieses äußerst stabile Biotin-Streptavidin-System
diente als eine Art „Unterbau“ für die Bindung von verschiedenen, mit einem Biotinanker
gekoppelten hGBP1-Mutanten, die dann nukleotidabhängig an andere hGBP1-Moleküle
gebunden werden sollten, um Dimerisierungsstudien durchzuführen.
Kapitel 1 Einleitung
2
1.2 Maßgeschneiderte Oberflächen- die Bedeutung der Biosensorik am
Beispiel der Funktionsweise von hGBP1
Diese Arbeit soll am Beispiel der Dimerisierung von hGBP1 als konkretes Anwendungs-
beispiel für eine spezifische, gewünschte Wechselwirkung einen Einblick in die Mög-
lichkeiten der Biosensorik und die kontrollierte Herstellung von Oberflächen mit ge-
wünschten Eigenschaften geben. Der spezifische Nachweis von (Bio-)molekülen (V.
/Dierk-Meyer-Lüerßen, 2003), z. B. bei Antigen-Antikörper-Reaktionen, über maß-
geschneiderte Sensoroberflächen ist hierbei ein sehr wichtiger und bedeutender An-
wendungsbereich. Gerade aus pharmakologischer und medizinischer Sicht sind die
Aufklärung der Struktur und Funktionsweise von Proteinen sowie die Wechselwirkung
mit anderen Proteinen von entscheidender Bedeutung, um auf diese Weise neue
Wirkstoffe für die Kontrolle bestimmter Stoffwechselvorgänge zu entwickeln. Aufgrund
der bedeutsamen Funktion des hGBP1 als ein Schlüsselprotein im menschlichen
Immunsystem wurden in den letzten Jahren besondere Anstrengungen unternommen, die
Anordnung der einzelnen Bausteine dieses Proteins zu klären und die Art und Weise, wie
es mit anderen Biomolekülen in Wechselwirkung tritt, besser zu verstehen, um Ansätze
für gezieltes Drug Design zu schaffen. Erst vor kurzem konnte die inhibierende Wirkung
von Zn2+
-Zyklen-Komplexen auf die Wechselwirkung des in der Literatur zahlreich
beschriebenen Ras-Proteins mit anderen Effektoren wie Raf nachgewiesen werden
(Rosnizeck et al.). Das Ras-Protein agiert in der Zelle als eine Art „molekularer Schalter“,
der nukleotidabhängig in einen aktiven oder inaktiven Zustand versetzt werden kann.
Mutationen im Ras-Gen können das Protein dauerhaft aktivieren, was zu unkontrolliertem
Zellwachstum führt und somit vielfach zur Entstehung von Krebs. Bei 30 % aller Tumore
konnten Mutationen im Ras-Gen nachgewiesen werden (Bos, 1989). Genauso wie die
Krebsforschung ist auch die Erforschung der biologischen Funktionsweisen und
Wirkmechanismen von Immunproteinen wie das hGBP1 von besonderer Brisanz, denn
hier liegt der Schlüssel zur Entwicklung von gezielt wirksamen Medikamenten und somit
zur Bekämpfung von Krankheitserregern. 2006 konnte zwar der grundsätzliche
Reaktionsmechanismus des Guanylat-bindenden Proteins hGBP1 aufgeklärt werden
(Kunzelmann et al., 2006) und damit eine gute Basis gelegt werden, um nun auch die
Verbindung zwischen Funktion und „biologischer Wirkung“, also der eigentlichen
„Immunreaktion“ (Ghosh et al., 2006) herzustellen, aber die vollständige fundierte
Kapitel 1 Einleitung
3
Aufklärung der Kinetik des Dimerisierungsprozesses konnte bis dato nicht erbracht
werden.
Abbildung 1-1: Molekulare Ansicht zweier hGBP1-Moleküle (das eine hinten in blau und
das andere davor durchsichtig in grün. Durch das Nukleotid GTP (Kugeln in blau, rot und
grau) wird die Interaktion gesteuert (Pressemitteilung Ruhr-Universität Bochum vom
29.9.2006)
Da die Dissoziationskonstante der Dimerisierung bisher nur unter Verwendung eines
vereinfachten Dimerisierungsmodells abgeschätzt werden konnte (Dissertation Simone
Kunzelmann, 2006), sollte diese Arbeit und die Anwendung der Oberflächenplas-
monenresonanzspektroskopie und anderer Oberflächenmethoden (Rasterkraftmikrosko-
pie, engl.: Atomic Force Microscopy (AFM); Mikrofeinwaage, engl.: Quartz Crystal Mic-
robalance (QCM), etc.) dazu dienen, diese Wissenslücke zu schließen. Des Weiteren
sollte der für die Untersuchung des Dimerisierungsprozesses entwickelte Assay soweit
etabliert werden, dass er auch routinemäßig auf andere Prozesse wie die Tetramerisierung
von hGBP1 oder auf andere Proteininteraktionen anwendbar ist.
1.3 Proteinresistente (Bio-)Oberflächen
Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit ist die Entwicklung und strukturelle Untersuchung von
Oberflächen, die proteophobe Eigenschaften aufweisen, also die Adsorption von Bioma-
terialien wie Proteinen vermeiden. Ein Anwendungsbereich, bei dem genau solche Eigen-
schaften erwünscht sind, ist die Herstellung von Implantaten in der Medizintechnik
(Gottenbos et al., 2000). Das Problem mit dem man hier zu kämpfen hat, ist die
immunologisch bedingte Abwehrreaktion des Körpers, der die Implantate als Fremdkör-
Kapitel 1 Einleitung
4
per erkennt und versucht sie abzustoßen. Auf den Implantaten bilden sich unerwünschte
Biofilme, die den Einheilungserfolg und die vollständige Herstellung der Organfunktion
negativ beeinträchtigen können (Gristina, 1987; Khardori /Yassien, 1995; Kasemo, 1998;
Heard, 2001; Emerson, 2004). In den vergangenen Jahren wurden große Anstrengungen
unternommen und zahlreiche empirische Untersuchungen durchgeführt mit dem Ziel, die
Abwehrreaktion des Körpers einzuschränken, gar zu verhindern oder auf der anderen
Seite die Ausbildung von Proteinfilmen auf den Implantaten zu vermeiden. Trotz allem
treten in ca. 10 % der Fälle Biofilmbildungen auf, die sehr oft mit großen Komplikationen
für den Patienten, wie starke Entzündungen, verbunden sind. Die Zerstörung dieser Filme
im Nachhinein war bisher immer erfolglos, woraus man schlussfolgern konnte, dass es
darauf ankommt Strategien zu entwickeln, die die Ausbildung dieser Beläge erst gar nicht
zulassen. Da in den meisten Fällen die Implantate aus hydrophoben Kunststoffen
bestehen, bedingt dies eine starke unspezifische Adsorption von Proteinen und folglich
eine begünstigte Ausbildung von Biofilmen auf den Implantaten. Beschichtungen mit
antibakteriellen Substanzen wurden bereits erprobt (Suci et al., 1998; Schierholz /Beuth,
2001), blieben aber erfolglos, zumal das Risiko von körperinterner Resistenzbildung
besteht. Zurzeit arbeitet man an Strategien, die darauf abzielen, die Implantate und das
umliegende Gewebe besser miteinander zu verknüpfen, um so die Ausbildung von
Biofilmen von vorne herein zu blocken. Diese Problematik wurde zum Anlass
genommen, biomimetische Oberflächen auf der Basis von Peptiden und einem daran
gebundenen Thiolanker zu schaffen (Chelmowski et al., 2008).
Abbildung 1-2: Herstellung proteinresistenter, biokompatibler Oberflächen auf der Basis
von Peptidthiolen. Durch den Thiolanker bildete sich eine selbstorganisierende Monolage
(SAM) auf der Goldoberfläche aus (Chelmowski et al., 2008).
Kapitel 1 Einleitung
5
Dabei wurde die Aminosäuresequenz auf der Basis von Regeln aus früheren Untersu-
chungen über proteinresistente organische Oberflächen ermittelt (Ostuni, E., Yan, L.,
Whitesides, G. M., 1999; Chapman, Ostuni, Takayama et al., 2000; Chapman, Ostuni,
Yan et al., 2000; Herrwerth, S., Eck, W., Reinhardt, S., Grunze, M., 2003; Herrwerth, S.
et al., 2003) und ein Grad an Proteinresistenz erhalten, der vergleichbar mit dem von
Polyethylenglykol (PEG)- SAMs ist, die die am stärksten ausgeprägtesten proteophoben
Eigenschaften von allen bisher untersuchten SAMs aufweisen (Prime /Whitesides, 1991;
Harris, 1992; Herrwerth, S., Eck, W., Reinhardt, S., Grunze, M., 2003). Der Sekundär-
struktur, in der die an die Oberfläche gebundenen Moleküle vorliegen, kommt bei der
Entstehung dieser Proteinresistenz eine maßgebliche Bedeutung zu (Harder et al., 1998),
die in dieser Arbeit über Infrarot- und CD-Spektroskopie näher untersucht werden soll.
1.4 Zielsetzung
Ein System, bestehend aus Biotin und dem biotinbindenden Protein Streptavidin soll dazu
genutzt werden, ein zentrales Protein der Immunabwehr, nämlich das hGBP1, hinsichtlich
seiner für die Dynamin-Familie typischen nukleotidabhängigen Selbstassemblierung
(Dimerisierung) näher zu untersuchen. Hierfür soll in erster Linie die Oberflächenplas-
monenresonanzspektroskopie genutzt werden, die sowohl Informationen über die adsor-
bierten Massen der zu untersuchenden Proteine und somit auch über molare Verhältnisse
liefert, als auch Studien über die Bindungskinetik erlaubt. Darüber hinaus werden Metho-
den wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) und die Mikrofeinwaage (QCM) herangezogen,
um die Schichtdicken der nacheinander aufgebrachten Schichten zu ermitteln und daraus,
unter Einbeziehung der Kristallstrukturen der beteiligten Proteine, also Streptavidin und
hGBP1, Modelle zu entwickeln, die zum einen Informationen über die Orientierung und
Anordnung der monomeren hGBP1-Moleküle auf der Oberfläche und zum anderen
während ihrer Assemblierung zu einem dimeren Komplex liefern. Da es sich bei hGBP1
um eine GTPase handelt, lässt sich anhand der GTP-Hydrolyseaktivität nachweisen, ob
das Protein auf der Oberfläche nativ ist.
Im letzten Teil steht die Untersuchung der Proteinresistenz von Peptidthiolen hinsichtlich
ihrer strukturellen Eigenschaften im Vordergrund, die bereits im Fokus des Interesse vor-
heriger Arbeiten standen (Chelmowski et al., 2008). Hierbei wurde versucht, die bereits
bekannten Charakteristika von klassischen proteinresistenten Thiolen, allen voran des
PEG-Thiol, auf eine alternative, „körperverwandte“ Molekülklasse, nämlich Amino-
Kapitel 1 Einleitung
6
säuren, zu übertragen, um über biologische Bausteine eine höhere Verträglichkeit und
Stabilität bei Langzeitanwendungen der Proteinresistenz z. B. in der Medizin zu er-
reichen. Das Peptiddesign basierte hierbei auf aus der Literatur hergeleiteten Regeln. In
den Vorarbeiten stand in erster Linie der Nachweis der Proteinresistenz im Vordergrund.
Nun soll es darum gehen, mögliche Gründe für die nachgewiesene Proteophobie der
Peptidthiole in der vorliegenden Sekundärstruktur zu suchen Zur Ermittlung der
Sekundärstrukturelemente soll in erster Linie die FT-IR- und CD-Spektroskopie dienen.
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
7
2 Theoretische Grundlagen
2.1 Spezifische und unspezifische (Protein-)Adsorption an Oberflächen
bei der Entwicklung von (Bio)sensoren
Bevor auf ein konkretes Anwendungsbeispiel einer spezifischen Protein-Protein-Interak-
tion eingegangen werden kann, muss man zunächst die Wechselwirkungen zwischen
Proteinen und Festphasenoberflächen betrachten, denn diese spielen bei der Entwicklung
von Sensoren aller Art eine nicht unerhebliche Rolle (Kasemo, 1998; Lottspeich, 1998;
Weinberger et al., 2000; Janiak, 2001; Herrwerth, S. et al., 2003; Czeslik, 2004). Die
Wechselwirkungen zwischen Proteinen und künstlichen Oberflächen können dabei sehr
unterschiedlicher Natur sein. Ein proteinresistentes Verhalten wird nur sehr selten beo-
bachtet. Zumeist kommt es zu unspezifischer Adsorption der Proteine an der Oberfläche.
Bereits in der Einleitung wurde auf die Anwendung von Implantaten in der Medizin und
die Anlagerung von Proteinen an die zumeist aus Kunststoff bestehenden Implantato-
berflächen ausführlich eingegangen. In der Biosensorik kommt es darauf an, dass die
verwendeten Oberflächen auf ihren jeweiligen Anwendungsbereich abgestimmt sind. Nur
so kann die spezifische Detektion von (Bio-)molekülen auch wirklich gewährleistet
werden. Des Weiteren spielen Faktoren wie die Kostengünstigkeit, Zeitersparnis,
Spezifität und Nachweisgrenze der Sensoren in der Industrie eine wichtige Rolle. Die
Proteine gehören zu der Gruppe von Biomolekülen, denen bei der Entwicklung von
Sensoren in der Medizin und Pharmazie ein besonderes Interesse zukommt. Die
Anwendungen reichen vom Nachweis bestimmter allergischer Reaktionen bis hin zu
HIV-Tests, Medikamentenwirksamkeitstest und Tumor-Markern bei der
Krebsfrüherkennung. Bei diesen Tests kommt es darauf an, nicht nur einzelne
Proteinnachweise zu erbringen, sondern ein ganzes Portfolio von Proteinen zu detektie-
ren, die für ein bestimmtes Krankheitsbild charakteristisch sind. So genannte Proteinmik-
rochips werden für den parallelen Nachweis von Proteinen mittels Kombinierung ver-
schiedener miniaturisierter Sensoren auf einem Chip zunehmend eingesetzt. In der Medi-
zin stellt die Anwendung dieser Chips eine enorme Zeitersparnis und Hilfestellung bei der
Diagnose von Krankheiten dar. Aber auch in der Pharmazie werden bereits
hochdurchsatzfähige (High Throughput)-Screening Verfahren angewandt, die die Wirk-
samkeit eines Medikamentes überprüfen. Als letztes Anwendungsbeispiel sei die Bedeu-
tung der Proteomik in der Biochemie genannt. Über den Nachweis und die Untersuchung
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
8
der Gesamtheit aller in einer Zelle oder einem Lebewesen unter definierten Bedingungen
und zu einem definierten Zeitpunkt vorliegenden Proteine erhofft man sich, das Zusam-
menspiel von regulatorischen Schlüsselproteinen des Organismus besser zu verstehen, um
somit Krankheiten wie Krebs, Parkinson und HIV besser therapieren zu können.
Bei der Entwicklung von Biosensoren muss darauf geachtet werden, dass die Ankopplung
der zu untersuchenden Proteine spezifisch vonstatten geht und unerwünschte,
unspezifische Wechselwirkungen von anderen Proteinen nicht zustande kommen. Der
perfekte Sensor kombiniert also ein Zusammenspiel zwischen spezifischer Interaktion
oder Adsorption, die nachgewiesen werden soll, und Proteinresistenz gegenüber
unerwünschten Biomolekülen. Eine besondere Herausforderung der Wissenschaft besteht
somit darin, die biophysikalischen und biochemischen Prozesse der Protein-Oberflächen-
Wechselwirkung besser zu verstehen, um eine höhere Kompatibilität von Sensoren in den
jeweiligen Anwendungsbereichen zu gewährleisten.
2.2 Allgemeine mechanistische Aspekte der Proteinadsorption an Fest-
körperoberflächen
Die spontane Adsorption von Proteinen, die in einer wässrigen Lösung vorliegen, an
Festkörperoberflächen ist ein Phänomen, dass für fast alle Materialien auftritt (Czeslik,
2004). Für diese Oberflächenaktivität sind elektrostatische sowie hydrophobe
Wechselwirkungen, aber auch entropische Effekte bei der Wasserverdrängung verant-
wortlich. Jedenfalls können die Ursachen nicht an einzelnen strukturellen Eigenheiten der
Proteine festgemacht werden. Nicht selten resultiert aus der Festkörperoberflächenad-
sorption eine Denaturierung des Proteins, sämtliche strukturelle und funktionelle Merk-
male gehen dabei verloren. Um die wirkenden Triebkräfte besser zu verstehen, sollte
zunächst ein Blick auf den sehr komplexen Aufbau von Proteinen geworfen werden, der
sich aus der Aminosäuresequenz und der sich daraus ergebenden Sekundär- und
Tertiärstruktur zusammensetzt. Die 20 natürlichen Aminosäuren lassen sich grundsätzlich
in drei Gruppen kategorisieren:
- Aminosäuren mit unpolaren, hydrophoben Seitenketten
- Aminosäuren mit positiv oder negativ geladenen Seitenketten
- Aminosäuren mit polaren, hydrophilen Seitenketten
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
9
Zumeist hat der Proteinkern einen hydrophoben Charakter und wirkt stabilisierend auf die
Tertiärstruktur des Proteins. An der Proteinoberfläche findet man in erster Linie polare
und geladene Aminosäurereste. Durch diesen amphiphilen Charakter der Proteine kann
zumindest teilweise die sehr hohe Oberflächenaktivität begründet werden, doch spielen
zusätzlich die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Oberfläche selbst eine Rolle.
Im Allgemeinen gilt, dass Proteine für hydrophobe Oberflächen affiner sind als für hyd-
rophile. Im Falle von Glas (Si-OH), einer hydrophilen Oberfläche, findet man jedoch bei-
spielsweise ein umgekehrtes Verhalten (Czeslik, 2004). Ein besseres Verständnis für die
bei der Proteinadsorption ablaufenden Vorgänge zu erhalten, war in den letzten Jahren
Gegenstand der Forschung. Die dabei erzielten Ergebnisse werden im Folgenden näher
erläutert.
2.3 Bestimmende Faktoren der Proteinadsorption an Festkörper-
oberflächen
Die Adsorption von Proteinen an Festkörperoberflächen resultiert aus einer Summe von
Wechselwirkungen, auf die an dieser Stelle näher eingegangen werden soll. Zum einen
sind es schwache Wechselwirkungen, wie van-der-Waals-Kräfte, also Wechselwirkungen
zwischen zwei induzierten Dipolen, die zwar einzeln betrachtet nur sehr wenig Einfluss
haben, aber in ihrer Summe große Auswirkungen mit sich bringen können. Neben
Wechselwirkungen zwischen induzierten Dipolen seien noch zusätzlich Kräfte zwischen
ausschließlich permanenten Dipolen (elektrostatische Wechselwirkungen) und zwischen
einem permanenten und einem induzierten Dipol an dieser Stelle genannt (Hiemenz
/Rajagopalan, 1997). Besonders bei sehr kleinen Distanzen zur Oberfläche spielen Dipol-
Dipol-Wechselwirkungen eine wichtige Rolle. Sie hängen entscheidend von den
Geometrien der beteiligten Strukturen ab.
Eine weitere wichtige Komponente ist die Auswirkung elektrostatischer
Wechselwirkungen, die von der Anzahl an geladenen Aminosäuren im Protein und von
den gewählten Pufferbedingungen bzw. der elektrolytischen Umgebung sowie der
Ladungsdichte an der Interaktionsoberfläche abhängen. Bestimmte im Puffer gelöste
Metallionen (Na+
oder Mg2+
) können die Ladung der Aminosäuren gewissermaßen
aufheben und folglich Wechselwirkungen mit der Oberfläche verhindern oder zumindest
schwächen. Ionische Wechselwirkungen sind wie die schwachen Wechselwirkungen
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
10
geometrie- und richtungsabhängig, doch haben einen deutlich höheren Betrag und eine
größere Reichweite.
Den höchsten Einfluss auf die Adsorption von Proteinen an Grenzflächen haben hydro-
phobe Wechselwirkungen (Herrwerth, S., Eck, W., Reinhardt, S., Grunze, M., 2003;
Czeslik, 2004). In wässrigen Puffern findet man für unpolare Gruppen eine nur sehr ge-
ringe Löslichkeit, da sich entlang der hydrophoben Kontaktfläche so genannte „Wasser-
käfige“ von hoher Ordnung formieren (low-entropy water), die mit einer starken Ab-
nahme der Entropie einhergehen. Insgesamt gilt, dass polare Gruppen viel eher eine
Wechselwirkung mit einer ebenfalls polaren Gruppe eingehen (Wasser-Wasser) und glei-
chermaßen unpolare Gruppen einen unpolaren Interaktionspartner bevorzugen. Die
Wechselwirkung zwischen unpolarer und polarer Gruppe ist dagegen nicht begünstigt.
Proteine haben einen insgesamt hydrophoben Kern, was im Umkehrschluss bedeutet, dass
an der Oberfläche nur sehr wenige hydrophobe Aminosäurereste vorhanden sind. Wenn
nun die Distanz zwischen Protein und Oberfläche klein genug wird, treten die hydropho-
ben Aminosäureseitenketten mit der Oberfläche in Kontakt, was zur Folge hat, dass der
hydrophobe Proteinkern auseinander fällt. Der meist irreversible Verlust der Tertiär- und
Quartärstruktur und damit die Denaturierung des Proteins ist die zwangsläufige
Konsequenz dieses Vorgangs. Die hydrophobe Wechselwirkung hat den höchsten Betrag
im Vergleich zu elektrostatischen und van-der-Waals-Wechselwirkungen und hängt
entscheidend von der Polarität der Oberfläche ab. Hydrophobe Oberflächen zeigen in der
Regel einen hohen Grad an Proteinadsorption, da die Oberfläche durch die Ausbildung
des Biofilms eine Abschirmung vor dem entropisch ungünstigen Kontakt mit dem Wasser
erfährt. Im Vergleich zu den beschriebenen polaren Wechselwirkungen haben
hydrophobe Wechselwirkungen nur eine geringe Reichweite und sind auch nicht
orientierungsabhängig.
Ein weiterer Faktor, der die Proteinadsorption beeinflusst, ist die Konformationsentropie
des Proteins. Die Faltungsstabilität eines gelösten, ungefalteten und eines gelösten, ge-
falteten Proteins ist nicht sehr hoch und erreicht gerade mal Werte zwischen 20 bis
60 kJ/mol. Proteine lassen sich somit als äußerst dynamische, flexible und intrinsisch
instabile Systeme auffassen, die auf kleinste Veränderungen, z.B. das Anbieten einer
organischen Oberfläche, reagieren. In zahlreichen Studien wurde gezeigt (Norde, 1996;
Czeslik, 2004), dass in der Regel ein Protein bei Adsorption an einer Oberfläche seine
Konformation verändert, also denaturiert, was gleichzeitig zu einer Erhöhung der
Bindungsenergie des Proteins mit der Oberfläche führt. Neben rein energetischen
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
11
Effekten spielen dabei auch wieder entropische Effekte (Konformationsentropie des
Proteins) eine Rolle. In einigen Fällen wird gemutmaßt, dass eine deutliche Zunahme der
Entropie aus der Proteinadsorption resultiert (Norde, 1996; Czeslik, 2004). Andere
Studien belegen, dass die Gesamtzunahme der Enthalpie durch die Adsorption so groß
werden kann, dass bei physiologischem pH-Wert die Bindung des Proteins an die
Oberfläche und seine Denaturierung praktisch irreversibel ist (Ball et al., 1996; Calonder
et al., 2001).
Zusammenfassend kann man folgenden Mechanismus für die unspezifische Proteinad-
sorption an Oberflächen vorschlagen:
Das Protein wird durch elektrostatische Kräfte, die von Ionen an der Oberfläche
ausgehen, über große Reichweiten an die Oberfläche gezogen.
Mit zunehmender Annäherung an die Oberfläche nimmt der Einfluss der attrakti-
ven „schwachen“ Wechselwirkungen zu und die Geometrie des Proteins wird ver-
zerrt.
Ist einmal der direkte Kontakt mit der Oberfläche hergestellt, so koppeln die ver-
einzelnd an der Oberfläche des Proteins auftretenden hydrophoben
Aminosäureseitenketten an die Substratoberfläche.
Aus der Summe von polaren, „schwachen“ und hydrophoben Wechselwirkungen
resultiert eine so starke Verzerrung des Proteins (partielle Denaturierung), dass es
seine Struktur vollständig verliert und somit die hydrophoben Aminosäuren, die
im nativen Zustand den hydrophoben Kern des Proteins bilden, ebenfalls für
Wechselwirkungen mit der Oberfläche zur Verfügung stehen.
Um die Vorgänge der Proteinadsorption an Oberflächen noch besser zu verstehen, können
aufgrund der zahlreich beschriebenen Einflüsse bei der Proteinadsorption sehr unter-
schiedliche Ansatzpunkte gewählt werden. Zum einen kann man beispielsweise den Ein-
fluss der Temperatur auf die Adsorption untersuchen, um die Bedeutung des entropischen
Beitrags herauszuarbeiten, zum anderen kann man das umgebende Medium variieren.
Man hat zum Beispiel das Adsorptionsverhalten in D2O mit H2O in einer bereits veröf-
fentlichten Studie verglichen (Grunwald, Ch. et al., 2005) und im Falle der Proteine
Rinderserumalbumin (BSA) und Ribonuklease A (RNase) in deuteriertem Wasser eine
deutlich verlangsamte Proteinadsorption gegenüber D2O festgestellt. Da D2O bereits rou-
tinemäßig bei anderen Techniken zur Untersuchung biologischer Grenzflächen (Neutro-
nenstreuung), aber auch zur strukturellen Untersuchung von Biomolekülen (NMR, IR)
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
12
eingesetzt wird und sich bewährt hat, erhofft man sich nun auch für die Erforschung der
unspezifischen Proteinadsorption auf Oberflächen, einen entscheidenden Fortschritt durch
den Einsatz von „schwerem“ Wasser machen zu können.
2.4 Die Besonderheiten der Oligoethylenglykol(OEG)-SAM-Oberflä-
chen
Zum ersten Mal wurden Polyethylenglykole (PEGs) mit großen Molekulargewichten in
den 80er Jahren zur Erzeugung proteinresistenter Oberflächen verwendet (Poly(ethylene
Glycol) Chemistry, 1992). Die Proteine und Zellen wurden dabei aus wässriger Pufferlö-
sung der Oberfläche zugeführt. Das proteophobe Verhalten der PEGs wurde mit „steri-
scher Repulsion“ erklärt. Hinter diesem Begriff verbirgt sich ein entropischer Effekt, der
dadurch zustande kommt, dass die Adsorption der Proteine die Beweglichkeit der PEG-
Polymerketten, die in das Wasser frei hereinragen, einschränkt, was eine Abnahme der
Entropie zur Folge hat. Den genauen Ursachen für die proteinresistenten Eigenschaften
der PEG-Oberflächen wurde in den Folgejahren auf den Grund gegangen. Besonders ist
hier die Gruppe um Whitesides (Boston) zu nennen, die ein Modellsystem entwickelte,
das auf selbstassemblierenden Monoschichten (SAMs) aus OEG-Alkanthiolen (OEGs)
auf einer Goldschicht basierte. Die SAMs konnten durch verschiedene oberflächenphysi-
kalische Methoden näher untersucht werden. Hierfür wurden Organothiole mit verschie-
denen OEG-Einheiten eingesetzt und systematische Untersuchungen durchgeführt (Pale-
Grosdemagne, 1991; Prime /Whitesides, 1991). Die Monoschichten bieten gegenüber
dem PEG mit hohem, polydispersem Molekulargewicht den entscheidenden Vorteil, dass
sie monodispers sind und eine wohldefinierte Grenzschicht zur Flüssigkeit aufweisen.
Obwohl die Ethylenglykol-Einheiten auf der Oberfläche in ihrer Bewegungsfreiheit von
Anfang an deutlich eingeschränkter sind als im Falle der zuvor untersuchten PEG-Poly-
mere, konnte auch hier Proteinresistenz festgestellt werden (Herrwerth, S., Eck, W.,
Reinhardt, S., Grunze, M., 2003). Diese Ergebnisse belegten, dass das Phänomen der
Proteinresistenz von PEG-Oberflächen nicht alleine mit sterischer Repulsion zu erklären
ist. In weiteren Studien konnten einige kritische Faktoren herausgearbeitet werden, die
den Grad der Proteinresistenz der kurzen, monodispersen OEG-Filme entscheidend beein-
flussen (Herrwerth, S., Eck, W., Reinhardt, S., Grunze, M., 2003). Nur wenn das ω-Ende
mehr als zwei EG-Einheiten aufweist, wurden proteophobe Eigenschaften festgestellt
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
13
(Abbildung 2-1). Für Alkanthiole mit drei Ethylenglykoleinheiten und einer terminalen
Methoxyfunktion wurde zusätzlich die innerhalb der Monoschicht vorliegende
Konformation der OEGs als wichtiger Faktor für Proteinresistenz identifiziert.
SH
OOH
6
SH
OOH
3
SH
OOH
2
SH
OOH
Abbildung 2-1: OEG-Thiol mit unterschiedlicher Anzahl an Ethylenglykoleinheiten. Mit
steigender Anzahl der Ethylenglykoleinheiten (EG-Einheiten) wird ein höherer Grad an Proteinre-
sistenz erreicht. Aufgrund der chemischen Instabilität (Oxidationsempfindlichkeit) der OEG-
Thiole kann eine Degradation beobachtet werden, die mit einem gleichzeitigen Verlust der Pro-
teinresistenz einhergeht.
Auf Gold wurde mit Hilfe der Infrarotspektroskopie eine helikale Struktur der OEGs
ermittelt, die sich proteophob verhält, wohingegen auf Silber eine planare („all trans“)
Konformation nachgewiesen werden konnte, die keine proteinresistenten Eigenschaften
mehr aufweist (Pertsin et al., 1998). Aufgrund der höheren Packungsdichte auf Silber im
Vergleich zu Gold kommt es zu einer lateralen Kompression, die die helikale
Konformation kollabieren lässt. Ähnliche amorphe und helikale Konformationen konnte
man auch bei den polydispersen proteinresistenten PEG-Monoschichten nachweisen
(Tokumitsu et al., 2002). Untersuchungen mit dem Rasterkraftmikroskop (AFM) belegten
zusätzlich, dass elektrostatische Abstoßungskräfte mit hohen Reichweiten von bis zu
10 nm von den OEGs ausgehen. Die Studien erfolgten hier an Methoxy-terminierten
Alkanthiolen mit drei EG-Einheiten (Feldman et al., 1999; Dicke /Hahner, 2002b; Dicke
/Hahner, 2002a). Man begründete die gefundene Abstoßung damit, dass sich aufgrund
einer präferentiellen Adsorption von Hydroxid-Ionen aus der den SAM umgebenen
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
14
Elektrolytlösung (Autoprotolyse) eine negative Oberflächenladung aufgebaut hat.
Entsprechend ergänzende Berechnungen konnten diese Annahme bestätigen (Kreuzer et
al., 2003).
Aus den bisher durchgeführten Forschungsarbeiten, wobei hier besonders die Studien in
den Gruppen von Grunze (Heidelberg) und Whitesides (Boston) zu nennen sind
(Chapman, Ostuni, Takayama et al., 2000; Chapman, Ostuni, Yan et al., 2000; Ostuni, E.,
Chapman, Holmlin et al., 2001; Ostuni, E., Chapman, Liang et al., 2001; Herrwerth, S.,
Eck, W., Reinhardt, S., Grunze, M., 2003) konnten einige Kriterien für das Phänomen der
Proteinresistenz bei „klassischen“ proteinresistenten PEG bzw. OEG-Oberflächen herge-
leitet werden:
Das Innere des SAMs muss hydrophil sein (Herrwerth, S., Eck, W., Reinhardt, S.,
Grunze, M., 2003). Diese Regel beruht auf der Beobachtung, dass bei Verwen-
dung von hydrophobem Oligopropylenglykol statt OEG keine proteophoben Ei-
genschaften mehr festgestellt werden.
Bei loser Packungsdichte der SAMs mit einiger Unordnung und möglicher
Defektstrukturen wird eine höhere Proteinresistenz festgestellt als bei dichter Pa-
ckung. Diese Beobachtung korreliert mit der Notwendigkeit, dass Wasser in den
SAM eindringt, was durch Monte-Carlo-Simulationen belegt werden konnte
(Pertsin /Grunze, 2000; Pertsin et al., 2002).
Nur bei loser Packungsdichte kann sich die helikale Struktur der OEG-Einheiten
ausbilden, was die Voraussetzungen dafür schafft, dass Hydroxid-Ionen über
Wasserstoffbrückenbindungen im OEG-SAM eingefangen und „fixiert“ werden
(Kreuzer et al., 2003). Da die Oberflächen der meisten Proteine tendenziell
negativ geladen sind und gleichzeitig die Hydroxid-Ionen nicht verdrängt werden
können, zeigt der negativ geladene Film aufgrund der Abstoßungseffekte
Proteinresistenz.
Einige Fallbeispiele, in denen negativ geladene Oberflächen (SiO2) ohne proteophobe
Eigenschaften (Czeslik et al., 2002; Czeslik, 2004), aber auch Proteine mit positiver
Nettoladung (Lysozym), die ebenfalls nicht an den OEG-Film binden, identifiziert wur-
den, zeigen aber auch deutlich, dass das Phänomen der Proteinresistenz noch nicht voll-
ständig verstanden ist und dass die Erklärungsansätze noch kein vollständiges Bild erge-
ben. Hier bedarf es weiterer Forschungen von PEG und OEG-Oberflächen, aber auch an-
derer organischer Oberflächen, um die Anwendbarkeit der aufgestellten Regeln auf an-
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
15
dere Systeme zu überprüfen. Die hohe Oxidationsempfindlichkeit der terminalen EG-
Einheiten, die mit der Zeit degradiert werden und nicht mehr proteinresistent wirken, und
die hohe Instabilität der OEG-Matrix (Flynn et al., 2003) sind nicht zuletzt triftige
Gründe, dass nach alternativen proteophoben Oberflächen ohne EG-Einheiten gesucht
wird. Aus der Literatur können hierfür schon einige Beispiele genannt werden, die im
Folgenden aufgelistet sind:
Maltose-terminierte SAMs (Prime /Whitesides, 1991)
Tripropylensulfoxid SAMs (Deng et al., 1996)
zwitterionische SAMs (Holmlin et al., 2001; Ostuni, E., Chapman, Liang et al.,
2001; Kane et al., 2003)
Peptidthiol-SAMs (Chelmowski et al., 2008)
Es konnte in Studien, in denen gezielt nach Molekülen gesucht wurde, die sich für
proteinresistente SAMs eignen (Chapman, Ostuni, Takayama et al., 2000; Chapman,
Ostuni, Yan et al., 2000; Ostuni, E., Chapman, Holmlin et al., 2001; Ostuni, E., Chapman,
Liang et al., 2001), die These herausgearbeitet werden, dass Organothiole
Wasserstoffbrückenakzeptoren besitzen müssen, um Proteinadsorption verhindern zu
können. Den gegensätzlichen Effekt, nämlich eine hohe Proteinaffinität, erreicht man,
wenn dagegen Wasserstoffbrückendonoren verwandt werden. Auch diese Beobachtung
konnte jedoch bereits im Falle von Mannitol-Gruppen nicht bestätigt werden (Luk et al.,
2000), was wiederum zeigt, dass der Mechanismus der Proteinresistenz komplizierter und
komplexer zu sein scheint als bisher angenommen. Abschließend sei noch erwähnt, dass
sich bis heute alle Studien, in denen die Proteinresistenz von alternativen Oberflächen
untersucht wurde, an OEG-SAMs orientieren, da sie als die Moleküle gelten, die die
ausgeprägtesten proteophoben Eigenschaften haben. Deswegen ist es umso bemer-
kenswerter, dass es im Jahre 2008 gelungen ist (Chelmowski et al., 2008), Thiole auf der
Basis von Peptiden als SAMs auf Goldoberflächen einzusetzen, die in ihrer Proteinresis-
tenz vergleichbar mit den OEG-Filmen sind. Ob im Falle der Peptidthiol-SAMs ähnliche
oder andere Erklärungsansätze für die starke Proteophobie im Vergleich zu den OEG-
Filmen herangezogen werden können, ist Gegenstand dieser Arbeit.
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
16
2.5 Herstellung von selbstorganisierenden Monolagen (SAMs)
In den bisherigen Ausführungen wurde der Begriff der SAMs (Self Assembled
Monolayers), also selbstorganisierenden Monolagen, im Bezug auf Funktionalisierungen
von Oberflächen schon zahlreich erwähnt und spielt bei den in dieser Arbeit beschriebe-
nen Anwendungen eine entscheidende Rolle. An dieser Stelle soll auf die schnelle und
kostengünstige Herstellung von SAMs, die in vielen Bereichen ihre Anwendung findet,
näher eingegangen werden (Ulman, 1991; Dubois /Nuzzo, 1992). SAMs sind ultradünne,
organische Filme, die durch einfaches Eintauchen eines Metallsubstrates in Lösung von
Organothiolen hergestellt werden können.
Abbildung 2-2: Selbstorganisation von Organthiolen. Schematischer Aufbau eines Alkanthiols
(links): SH-Ankergruppe, Rückgrat (-CH2-Kette) und Funktionalität. Zur schnellen und kosten-
günstigen Herstellung von SAMs wird das Metallsubstrat in eine Thiollösung getaucht und der
SAM formiert sich auf der Metalloberfläche. Die Bindung des Thiols erfolgt über die SH- Anker-
gruppe.
Die vielseitigen Einsatzmöglichkeiten dieser Filme sind durch die hohe strukturelle Qua-
lität bezüglich ihrer Stabilität und Ordnung begründet, die es ermöglicht, diese Oberflä-
chen sogar in der Elektronenstrahllithographie einzusetzen (Gölzhäuser et al., 2000). Die
Defektdichte der SAMs ist bei der richtigen Wahl des Metallsubstrates und des Lösungs-
mittels so klein, dass beste Voraussetzungen für den Ätzprozess nach Strukturierung mit
dem Elektronenstrahl gegeben sind. Oft ist es notwendig, dass die SAMs für bestimmte
Anwendungen in geeigneter Weise funktionalisiert werden müssen. So kommt es zum
Beispiel in der Biosensorik darauf an, SAMs für den spezifischen Nachweis von
Molekülen zu entwickeln. Die sehr stabile terminierende CH3-Einheit wird hierbei durch
passende funktionelle Gruppen ersetzt. Das in dieser Arbeit für die SAM-Herstellung
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
17
verwandte Biotinthiol ist ein gutes Beispiel für ein Molekül, dass das spezifische
Ankoppeln des Proteins Streptavidin ermöglicht. Zur Oberflächenfunktionalisierung
mittels SAMs existieren bereits eine ganze Reihe von Publikationen, wobei an dieser
Stelle die Arbeiten von Nuzzo und Dubois (Dubois /Nuzzo, 1992) sowie Ulman (Ulman,
1991) Erwähnung finden sollen. Aufgrund der sehr umfangreichen Studien der letzten
Jahre über SAMs soll an dieser Stelle auf die Übersichtsartikel von Whitesides (Love et
al., 2005), Wöll (Kind /Wöll, 2008) und Schreiber (Schreiber, 2000) verwiesen werden.
In dieser Arbeit werden eine Reihe von Thiolen zur Oberflächenfunktionalisierung ver-
wendet, die an dieser Stelle vorgestellt werden sollen:
1. Oktadekanthiol
SH
Abbildung 2-3: Strukturformel des Oktadekanthiols (ODT)
Das Oktadekanthiol (ODT) wird im weiteren Verlauf als CH3-Thiol bezeichnet, da es
insbesondere im Projekt „Proteinresistente Peptidthiole“ für die Herstellung einer beson-
ders proteophilen Oberfläche verwendet wird, um einen 100 %-Wert (Positivreferenz) für
die Proteinadsorption zu haben, der mit der Adsorption auf Peptidthiol in Bezug gesetzt
werden kann.
2. Biotinthiol
SH
NH
O
OO
HN
O
S
NH
HN
O
Abbildung 2-4: Strukturformel des Biotinthiols
Das biotinylierte Alkanthiol, dessen Strukturformel in Abbildung 2-4 gezeigt ist, wird im
weiteren Verlauf als Biotinthiol abgekürzt. Über die Biotingruppe kann das Protein
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
18
Streptavidin binden. Auf weitere Details zum Biotin/Streptavidin-System wird in Kapitel
2.7 eingegangen.
3. OEG-Thiol
O SHO
OO
OO
HO
Abbildung 2-5: Strukturformel des proteophoben OEG-Thiols (Oligoethylenglykol-Thiol).
Das Thiol besitzt am ω-Ende sechs OEG-Gruppen und wird durch eine OH-Gruppe terminiert.
Das proteophobe Alkanthiol, dessen Strukturformel in Abbildung 2-5 gezeigt ist, wird im
weiteren Verlauf OEG-Thiol genannt. Bei der Herstellung lateral strukturierter Oberflä-
chen über das Mikrokontaktstempeln und zum Vergleich mit den Peptidthioloberflächen
bezüglich ihrer proteinresistenten Eigenschaften wird es in dieser Arbeit angewandt.
4.Merkapoundekan-1-ol
HO SH
Abbildung 2-6: Strukturformel des proteophoben Merkaptoundekan-1-ol (OH-Thiol)
Das proteophobe Alkanthiol, dessen Strukturformel in Abbildung 2-6 zu sehen ist, wird
im Folgenden OH-Thiol genannt. Zusammen mit Biotinthiol bildet es den Misch-SAM,
der für die Immobilisierung von Streptavidin verwendet wird. Es soll einmal als
„Abstandhalter“ für die Biotinthiole fungieren, die insgesamt nur zu einem Anteil von
10 % dem Gemisch zugesetzt werden. Auf der anderen Seite hat es proteophobe
Eigenschaften, die die unspezifische Bindung von Proteinen vermeidet bzw. drastisch
reduziert. Deswegen wird es auch als Referenzthiol für das Peptidthiol eingesetzt und die
Proteinadsorption auf beiden Oberflächen miteinander verglichen.
2.6 Peptidthiol-SAMs
Die Herstellung von Peptidoberflächen mittels selbstassemblierenden Peptidmolekülen
findet schon seit Mitte der 90er Jahre Erwähnung (Zull et al., 1994). Auf besonderes Inte-
resse stoßen in diesem Zusammenhang so genannte PNA-Moleküle (Peptide Nucleic
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
19
Acid, PNA), die aus chemischer Sicht aufgrund ihres ungeladenen Peptidrückgrates, statt
des negativ geladenen Phosphatrückgrates der DNA, wie ein Peptid betrachtet werden
können. In erster Linie werden aber mit den PNAs größtenteils Hybridisierungsstudien
durchgeführt, die in dieser Arbeit keine Rolle spielen. Die Herstellung von künstlichen,
„proteinähnlichen“ Oberflächen auf der Basis von natürlichen Bausteinen (Aminosäuren)
ist im Vorfeld bereits behandelt worden und bildete somit eine gute Basis für die in dieser
Arbeit durchgeführten Studien. Auf der einen Seite existieren bereits Studien über die
Immobilisierung der Peptide an der Oberfläche, ihre dabei erhaltene Orientierung und
Anordnung (Herbert et al., 1997; Miura et al., 1998b; Miura et al., 1998a; Iizuka-Sakano
et al., 1999; Kimura et al., 2000), auf der anderen Seite ging aber auch die Stoßrichtung
hin zum näheren Verständnis der chemischen und physikalischen Eigenschaften der auf
der Basis von Peptiden erzeugten Filme (Margel et al., 1993; Zull et al., 1994; Duschl et
al., 1996; Fujita et al., 1998; Imanishi et al., 1999; Schultz et al., 1999; Iizuka-Sakano et
al., 2000; Kimura et al., 2000; Ptak et al., 2001; Houseman et al., 2002; Hyun et al., 2002;
Song, S. H. et al., 2003). Insgesamt lassen sich zwei Kernanwendungen für die Peptid-
SAMs benennen. Zum einen geht es dabei um die selektive und dauerhafte Immobilisie-
rung von ganzen Zellen auf strukturierten Peptidoberflächen, zum anderen um sensori-
sche und speziell biosensorische Anwendungen der Peptidfilme. Seit dem Jahr 2000 un-
tersucht man sogar den Einsatz von Peptidelementen in der molekularen Elektronik, was
völlig neue Möglichkeiten für die zukünftige Forschung im Bereich der Peptidchemie
eröffnet.
Hauptgrundlage des in dieser Arbeit behandelten Projektes über die strukturelle Untersu-
chung von proteinresistenten SAMs auf der Basis von Peptidthiolen sind die bereits ver-
öffentlichten Studien, in denen zunächst vornehmlich der eigentliche Nachweis der Pro-
teinresistenz für Peptid-basierende SAMs erbracht wurde (Chelmowski et al., 2008).
Basierend auf Auswahlkriterien aus früheren Studien über proteinresistente organische
Oberflächen (Ostuni, E., Yan, L., Whitesides, G. M., 1999; Chapman, Ostuni, Takayama
et al., 2000; Chapman, Ostuni, Yan et al., 2000; Herrwerth, S. et al., 2003) konnten für
das Peptiddesign entsprechende Regeln aufgestellt werden:
keine hydrophoben Seitenketten, da hydrophobe Reste die unspezifische
Proteinadsorption verstärken würde; die Aminosäuren Phe, Tyr, Trp, Pro, Ile, Leu
und Val scheiden daher aus. Gly und Ala gelten formal zwar auch als hydrophob,
wurden aber aufgrund der hohen Bedeutung für die Flexibilität der Peptidstruktur
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
20
mit einbezogen. Trotz allem sollte darauf geachtet werden, dass der Anteil hydro-
philer Reste in Nachbarschaft von Glycin und Alanin überwiegt.
An terminaler Position sollte eine neutrale Aminosäure wie Ser oder Thr verwen-
det werden.
Auf schwefelhaltige Aminosäuren wurde verzichtet, um die Ausbildung des
Peptid-SAMs auf der Goldoberfläche nicht zu stören. Die Aminosäuren Cys und
Met können an die Goldoberfläche als Thiolate binden (Sasaki et al., 1997;
Qingwen et al., 2001).
Da für OEGs auf Gold eine helikale Struktur nachgewiesen werden konnte, die
sich begünstigend auf die Proteinresistenz auswirkt, wurde für die Peptidthiole
ebenfalls eine α-helikale Struktur angestrebt. Peptide mit helikalen Sekundär-
strukturelementen waren bereits im Vorfeld erfolgreich auf Oberflächen aufge-
bracht und hinsichtlich ihrer Orientierung und lateralen Packungsdichte charakte-
risiert worden (Duschl et al., 1996; Herbert et al., 1997; Fujita et al., 1998; Miura
et al., 1998b; Miura et al., 1998a; Iizuka-Sakano et al., 1999; Imanishi et al., 1999;
Iizuka-Sakano et al., 2000; Kimura et al., 2000; Miura et al., 2001; Song, S. H. et
al., 2003). Bei den helikalen Peptiden, die in diesen Arbeiten verwendet wurden,
konnte ein Helixdipolmoment analog zum Dipolmoment der Ethylenglykole
nachgewiesen werden. Als helixbildende Aminosäuren kamen damit Lys, Ala,
Glu, Leu und Met in Frage. Aufgrund ihres tendenziell hydrophoben Charakters
wurde die Aminosäure Lys so platziert, dass sie sich im Inneren des Peptid-SAMs
befindet, um hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Wasser bzw. Proteinmole-
külen zu vermeiden.
Darüber hinaus wurde auf den Einsatz geladener Aminosäuren verzichtet, um
unter anderem eine durch elektrostatische Wechselwirkung hervorgerufene
Proteinadsorption zu vermeiden.
Außerdem wurde bei der Komposition der Aminosäuresequenz berücksichtigt,
dass nicht nur die letzten 3 bis 4 Aminosäuren, die mit dem Protein an der Peptid-
SAM-Oberfläche direkt wechselwirken können, für die Eigenschaft der Mono-
schicht verantwortlich sind, sondern dass auch die innere Struktur der SAMs, z. B.
hinsichtlich möglicher Einlagerung von Wassermolekülen, eine nicht unwesentli-
che Rolle spielen.
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
21
Auf Basis dieser Kriterien wurde das folgende Peptid synthetisiert und über die 1,3-
dipolare Cycloaddition (Huisgen Reaktion; (Chelmowski et al., 2009)) mit einem Thiol
verbunden:
Abbildung 2-7: Schema zur verwendeten Aminosäuresequenz für das Peptid mit Thiolanker
(Thioester). Peptid A wurde nach den oben aufgestellten Kriterien synthetisiert. Peptid B sollte
als Kontrolle dienen; deswegen wurden Aminosäuren mit hydrophoben Seitenketten verwendet.
Das verwendete Peptid hatte eine Länge von 10 Aminosäuren, um zu gewährleisten, dass
mindestens zwei komplette Windung einer Helix zustande kommen konnten (α-Helix: 3,6
Aminosäurereste pro Windung).
2.7 Die Verwendung des Biotin-Streptavidin-Systems als Immobilisie-
rungs-Assay
Das Homotetramer Streptavidin aus dem Bakterium Streptomyces avidinii ist ein Protein,
welches sich aus vier monomeren Einheiten von ca. 13 kDa zusammensetzt. Das Gen
konnte vollständig entschlüsselt werden, so dass für Streptavidin Standardexpressionsys-
teme existieren, die einen Einbau der Geninformationen in Bakterien (E. coli) und eine
gezielte Überexpression ermöglichen. Auch eine spezifische Veränderung der
Geninformationen, also z. B. ein Einbau gezielter Punktmutationen oder die Erzeugung
von Deletionsmutanten, ist dadurch möglich. Aufgrund der Tatsache, dass die Biotin-
Streptavidin-Bindung zu den stärksten nicht-kovalenten Bindungen zählt (Ka ~ 1014
-1015
M-1
), wird diese Wechselwirkung in den verschiedensten Methoden der Biochemie wie
der Affinitätschromatographie, der Immunohistochemie, für die Entwicklung von
Gensonden oder aber auch in der DNA-Chip-Technologie (Niemeyer, C. M., Sano, T.,
Smith, C. L., Cantor, C. R.,. 1994; Niemeyer, C. M. et al., 1999; Liu et al., 2006; Su,
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
22
2005) und anderen analytischen Anwendungen (Schmidt, H.-L., Schumann, S. W.,
Scheller, F., 1992; Willner, 1999) ausgenutzt.
Abbildung 2-8: Kristall von Streptavidin mit vier gebundenen Biotinmolekülen. Die vier
monomeren Einheiten sind in grün, rot, blau und gelb-grün dargestellt( links). Die Biotine sind
tief in den Bindungstaschen der jeweiligen Monomere verankert. Eine monomere Einheit mit
gebundenem Biotin ist dargestellt (rechts) (Weber, 1989).
Jedes Monomer ist in der Lage, ein Molekül Biotin zu binden. Zahlreiche Studien haben
die Komplexbildung zwischen Streptavidin und Biotin bereits thematisiert, so dass ein
sehr detailliertes Bild über die existierenden Wechselwirkungen auf Biotin innerhalb der
Bindungstasche entstanden ist (Weber, 1989; Wilchek /Bayer, 1990; Freitag, 1997; Knoll
et al., 2000). Unter physiologischen Bedingungen kommt der Streptavidin-Biotin-
Komplex ausschließlich durch nicht-kovalente polare und unpolare Wechselwirkungen
zustande. Die Arbeiten von Weber (Weber, 1989) und Hendrickson (Hendrickson et al.,
1989) über die Struktur des Streptavidin-Biotin-Komplexes lassen sich an dieser Stelle
für weiterführende Informationen heranziehen. Im Gegensatz zu Avidin, das ebenfalls
Biotin bindet, liegt der isoelektrische Punkt für Streptavidin im neutralen Bereich (ca. 7,
je nach Literatur auch 5 bis 6). Darüber hinaus hat Streptavidin eine geringere
Gesamtladung und bindet auch nicht an Kohlenhydrat-Rezeptoren, da es nicht zu den
Glykoproteinen zählt (Wilchek /Bayer, 1990). Auf diese Weise ist es gegenüber
unspezifischer Bindung deutlich unempfindlicher als Avidin.
Streptavidin fungiert in der Regel als eine Art „Linker“, da es in einem ersten Schritt mit
1 bis 2 seiner 4 Biotin-Bindungstaschen an eine Thiolschicht mit einer funktionellen
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
23
Biotingruppe binden kann und in einem zweiten Schritt weitere biotinylierte Proteine
über die zwei freien Bindungsplätze zu immobilisieren vermag. Aufgrund der hohen Af-
finität zwischen Streptavidin und Biotin kann davon ausgegangen werden, dass jedes zu-
gängliche Biotin an Streptavidin gebunden wird. Somit lässt sich ein hohes Maß an spezi-
fischer Proteinadsorption (gilt für Proteine mit Biotinanker) erreichen. Des Weiteren weiß
man, dass Streptavidin bei geeigneten experimentellen Bedingungen ausschließlich eine
Monolage auf der Oberfläche bildet. Die Ausbildung von multimeren Streptavidin-
komplexen konnte bis dato nicht beobachtet werden, wenn alle Bindungsstellen auf der
Oberfläche besetzt sind (Grunwald, C. et al., 2004).
Die Dissoziation des Streptavidin von Biotin lässt sich durch verschiedene Faktoren ge-
zielt beeinflussen. Mit zunehmender Nettoladung des Proteins kommt es zu einer leichte-
ren Freisetzung des Liganden. Die stärkste Bindung entsteht am isoelektrischen Punkt
(Green /Toms, 1973; Green, 1974; Wilchek /Bayer, 1990). Die hohe Enthalpie der Biotin-
Streptavidin Bindung führt außerdem zu einer starken Temperaturabhängigkeit. Für eine
Temperaturerhöhung von gerade mal 5 K konnte bereits eine Verdoppelung der Disso-
ziationsrate gemessen werden (Green, 1974; Wilchek /Bayer, 1990). Es sollte des
Weiteren darauf geachtet werden, dass sich am Biotin oder in der Umgebung
irgendwelche sperrigen Gruppen befinden, die eine Bindung zu Streptavidin stören
könnten. Durch Abstandhalter (spacer), also zum Beispiel durch den Einbau von CH2-
Ketten, können solche sterischen Hinderungen vermieden werden.
In einigen lehrstuhlinternen Vorarbeiten (Grunwald, C. et al., 2004; Chelmowski et al.,
2007) wurde bereits das Biotin-Streptavidin-System eingehend untersucht und für den
Aufbau supramolekularer Strukturen, also Mehrschichtensystemen, genutzt. Das Strepta-
vidin war über ein Thiol mit Biotinanker (Biotinthiol) an eine Goldoberfläche gebunden.
Als Modellprotein wurde eine mit einem Biotinamidocaproylanker verlinkte Peroxidase
(horse radish peroxidase, HRP) verwendet. Die enzymatische Aktivität der Peroxidase
auf der Oberfläche wurde über eine bereits etablierte Farbreaktion nachgewiesen (Rendl,
1998).
Besonderes Augenmerk wurde bei der Untersuchung des Mehrschichtensystems auf eine
kontrollierte und möglichst spezifische Adsorption der Proteinkomponenten Streptavidin
und Merrettichperoxidase gelegt. Dazu wurde in einem ersten Schritt die Biotinthiol-
Konzentration variiert, um herauszufinden, welches Mischungsverhältnis für die Adsorp-
tion des Streptavidins optimal ist.
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
24
Abbildung 2-9: Variation der Biotinthiolkonzentration und die Auswirkung auf die
Adsorption von Streptavidin (200 nm). Die Inkubation erfolgte jeweils für 15 min. Die Fehler-
balken zeigen die Streuung von jeweils 4 Messungen. Der prozentuale Anteil von Biotinthiol
bezieht sich jeweils auf das Mischverhältnis mit Merkaptoundekanol (OH-Thiol) (Chelmowski et
al., 2007).
Die höchste Belegung mit Streptavidin konnte in einem Bereich zwischen 5 und 10 %
Biotinthiol erreicht werden. Aufgrund sterischer Effekte, die in früheren Studien bereits
beschrieben wurden (Spinke, 1993), führt eine weitere Erhöhung der Biotinthiol-
konzentration zu einer Verminderung der Streptavidinbelegung. Auch eine weitere
Verringerung der Biotinthiolkonzentration unterhalb von 5 % war für die Adsorption von
Streptavidin eher kontraproduktiv, da die möglichen Bindestellen für das Protein mehr
und mehr verarmen. Als entscheidendes Kriterium für eine reproduzierbare Adsorption
von Streptavidin wurde zudem die Inkubationszeit für die SAM-Herstellung
hervorgehoben. Ein Minimum von 2 bis 3 Stunden sollte für die Inkubation unbedingt
eingehalten werden, um unerwünschte unspezifische Wechselwirkungen des Proteins mit
der Oberfläche zu vermeiden. Weiterhin wurde die Kontrolle der Streptavidinbelegung
über Variation der Inkubationszeit bzw. Konzentration bei gleichzeitiger Konstanthaltung
der Biotinthiolkonzentration (5 % Biotinthiol) eingehend untersucht. Die dadurch
erzielten Erkenntnisse bilden die Grundlage für die in dieser Arbeit beschriebenen
Studien für das Protein hGBP1. Die Streptavidinkinetik folgt einem zweiphasigen Prozess
mit einem stark ausgeprägten linearen Teil (Diffusionsrate: 0,0049 s-1
), der etwa 80 % der
Streptavidinadsorption ausmacht, und einem biexponentiellen Verlauf, dem die restlichen
20 % der Adsorption folgen (Abbildung 2-10).
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
25
Abbildung 2-10: Adsorptionskinetik von Streptavidin (200 nm) auf 5 % Biotinthiol. Das
SPR-Signal wurde vor dem Fitten normiert. Deutlich unterscheidbar ist eine zunächst lineare
Phase, die einen biexponentiellen Verlauf übergeht (Chelmowski et al., 2007).
Die lineare Phase weist dabei auf eine erwartungsgemäß schnelle Adsorption von
Streptavidin an die SAM-Oberfläche. Für den exponentiellen Anteil, der durch zwei
verschiedene Prozesse dominiert wird, kann zum einen die spezifische Adsorption des
Streptavidins an die Biotinthiole und zum anderen die unspezifische Adsorption des
Streptavidins an die OH-terminierten Bereiche der Oberfläche, die deutlich langsamer
vonstatten geht (0,006 s-1
gegenüber 0,081 s-1
), verantwortlich sein. Trotz dieses stark
vereinfachten Modells wurden gute Übereinstimmungen mit den weiterführenden
Untersuchungen zur unspezifischen Adsorption und den erzielten Ergebnisse bei den
AFM-Experimenten erzielt, so dass die gewonnenen Erkenntnisse auch für diese Arbeit
genutzt werden konnten. Um die Reproduzierbarkeit der Streptavidinbeladung zu
gewährleisten und störende Effekte wie Adsorption an den Gefäßwänden
(Proteinverarmung) und Lösungsmittelverdampfung, sollte außerdem mindestens eine
Konzentration von 0,2 µM Streptavidin eingesetzt werden. Alle Kinetiken in Abbildung
2-11 zeigen sehr große Unterschiede bezüglich ihrer Kinetik und maximalen Beladung,
was darauf schließen lässt, dass sich die Verarmung der Lösung bei gering konzentrierten
Proteinlösungen signifikant auf die Adsorption von Streptavidin auswirkt.
Mit Hilfe dieser Erkenntnisse sollte das für das Streptavidin-Peroxidase-
Multikomponentensystem entwickelte Assay auch auf das deutlich komplexere System
Streptavidin/biotinyliertes hGBP1/hGBP1 übertragen und durch weitere methodische
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
26
Ergänzungen erweitert werden, um final Kinetikstudien über die Homodimerisierung von
hGBP1 durchführen zu können.
Abbildung 2-11: Diffusionslimitierte Adsorption des Streptavidins auf dem Biotinthiol-
SAM. Die Immobilisierungsdichte zeigt sehr starke Schwankungen auch bei Verwendung dersel-
ben Konzentration; m(ads) bezieht sich auf die total adsorbierte Masse an Protein (Chelmowski et
al., 2007).
2.8 Das Immunprotein hGBP1- ein Vertreter aus der Dynamin
Superfamilie
2.8.1 Interferone als Botenstoffe der Immunantwort
Da es sich bei dem humanen Guanylat-bindenden Protein (hGBP1) um ein antivirales
Immunprotein handelt, das durch so genannte Interferone, also Botenstoffe, die die spezi-
fische Immunantwort aktivieren, aber auch bakterielle und wachstumshemmende Effekte
haben, induziert wird, werden im Folgenden zunächst die grundsätzlichen Mechanismen
der Immunantwort skizziert, bevor das hGBP1 in seiner Struktur und Funktion
beschrieben wird. Die Interferone α und β gehören zu den so genannten Typ I Interfero-
nen, wohingegen Interferon γ dem Typ II zugeordnet wird. Ein durch ein Virus befallener
Organismus reagiert mit der Ausschüttung der Interferone des Typs I. Durch Bindung der
Interferone an einen Rezeptor (Interferon α/β-Rezeptor-Komplex, IFNAR), wird eine
Signaltransduktionskaskade in Gang gesetzt, die über den so genannten „JAK-STAT-
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
27
pathway“ beschrieben wird (Kotenko /Pestka, 2000). Die Abkürzungen beziehen sich auf
zwei unterschiedliche Proteinfamilien: Die „Janus Activating Kinases“ (JAKs) und die
„Signal Transducer and Activator of Transcription“ (STATs 1 und 2). Diese
Signalproteine sind in der Lage, die intrazellulären Signale vom Interferon-Rezeptor zum
Zellkern zu übertragen, um dort die Genexpression zu verändern (Darnell et al., 1994).
Um in den Zellkern zu gelangen, werden STAT1 und 2 zuvor durch eine aktivierende
Phosphorylierungskaskade dimerisiert.
Abbildung 2-12: Schematische Darstellung des JAK-STAT-Signaltransduktionsweges.
Stimulation der α- und β-Ketten des Interferon γ-Rezeptors (IFNγ-Rα und IFNγ-Rβ) durch Interfe-
ron γ (1); Aktivierung von JAK durch Autophosphorylierung sowie nachfolgende Phosphorylie-
rung von Tyrosinresten an der zytoplasmatischen Domäne des Rezeptors (2); JAK Aktivierung
führt zur Bildung von STAT1-Bindungsstellen, STAT1-Monomere werden aus dem Cytosol zum
Rezeptor rekrutiert und phosphoryliert (3); durch die Tyrosin-Phosphorylierung dimerisieren die
STAT1-Proteine (4) und werden zum Zellkern transloziert (5), wo sie an eine bestimmte DNA-
Sequenz (Gamma Activated Sequence, GAS) binden und die Transkription von Zielgenen in Gang
setzen (entnommen und verändert aus (Shuai /Liu, 2003)).
Im Gegensatz zu Interferon α und β, die von Leukozyten (Interferon α) und Fibroblasten
(Interferon β) ausgeschüttet werden, erfolgt die Exkretion von Interferon γ durch natürli-
che Killerzellen und durch zytotoxische CD4 oder CD8 T-Lymphozyten (CTL).
(Schoenborn /Wilson, 2007). Auch für Interferon γ existieren spezielle Rezeptoren
(Interferon γ- Rezeptoren, IFN-R), die nach Bindung zweier Interferon-Moleküle (Dimer)
einen aktiven Rezeptorkomplex bilden. Der Aktivierung der JAKs über Phosphorylierung
folgt, ähnlich wie bei Interferon α und β, eine Rekrutierung, Aktivierung und Dimerfor-
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
28
mation von STAT1. Nach Serinphosphorylierung wird das aktive STAT-Homodimer in
den Zellkern transloziert und sorgt dort für eine Transkriptionsaktivierung (Stark et al.,
1998; Shuai /Liu, 2003).
Für Interferone konnten sowohl antiproliferative und apoptotische (Maher et al., 2007)
Effekte nachgewiesen und ihre Rolle als Immunmodulator gezeigt werden (Platanias,
2005). Auch die direkte Hemmung der viralen Replikation wurde über verschiedene
Signalwege beschrieben (Meurs et al., 1990; Frese et al., 1996; Zhao et al., 1996).
Der antivirale Effekt der Interferone gegen das Encephalomyocarditis und Vesicular
stomatitis Virus wurde später unter anderem durch eine nachgewiesene Resistenz-
vermittlung über hGBP1 ergänzt (Anderson, 1999; Itsui, Y.Sakamoto, N.; Kurosaki, M.;
Kanazawa, N.; Tanabe, Y.; Koyama, T.;Takeda,Y.Nakagawa, M. et al., 2006; Itsui, Y. et
al., 2009). Der genaue Wirkmechanismus von hGBP1 konnte jedoch bis heute nicht
geklärt werden.
2.8.2 Gemeinsamkeiten GTP-bindender Protein
Das hGBP1 gehört zu den GTP-bindenden Proteinen (GNBP), die an zahlreichen zellulä-
ren Prozessen wie die interzelluläre Signalweiterleitung, die Proteinbiosynthese und der
Transport von Vesikeln (Bourne et al., 1990) beteiligt sind. Die GNBPs lassen sich
grundsätzlich in fünf Superfamilien unterteilen, nämlich die heterotrimeren G-Proteine,
Signalerkennungspartikel, Faktoren für die Proteinbiosynthese, Ras-homologe kleine
GTPasen und die Großen Dynamin verwandten GTPasen, zu denen auch die Guanylat
bindenden Proteine (GBPs), also auch hGBP1 zählen. Alle GTP-bindenden Proteine sind
in der Lage, abhängig von Mg2+
-Komplexierung, Guaninnukleotide zu binden und zu
hydrolysieren, also Guanosintriphosphat (GTP) zu Guanosinddiphosphat (GDP) umzuset-
zen. Bei hGBP1 kommt die Besonderheit hinzu, dass es nicht nur in der Lage ist, GTP zu
GDP und Orthophosphat zu hydrolysieren, sondern GDP auch zu GMP umzusetzen
(Schwemmle /Staeheli, 1994; Praefcke et al., 1999; Kunzelmann et al., 2006). Die
Nukleotidhydrolyse der GTP-bindenden Proteine wird durch hochkonservierte Sequenz-
motive vermittelt (Bourne et al., 1991). Als Modell für eine GTPase-Domäne, die sich
auch in anderen GNBs in völlig identischer oder durch Insertionen oder Extensionen mo-
difizierter Form wiederfindet (Vetter /Wittinghofer, 2001), kann die gut untersuchte
Struktur des Ras-Proteins (Rat Sarcoma) mit seinen konservierten Sequenzmotiven her-
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
29
angezogen werden (Walker et al., 1982; Milburn et al., 1990; Saraste et al., 1990;
Wittinghofer /Pai, 1991; Schmidt, G. et al., 1996; Chook /Blobel, 1999; Cool et al., 1999;
Vetter et al., 1999). Die meisten GNBPs sind innerhalb der Zelle eine Art molekularer
Schalter, der je nach gebundenem Guaninnukleotid, entweder ein oder ausgeschaltet ist.
Die Nukleotidbindung führt zu einer veränderten Bindungspezifität nachgeschalteter Ef-
fektoren. Das Ras-Protein ist zum Beispiel in aktiver Form in der Lage, das
Effektorprotein Raf-Kinase (Rapidly Growing Fibrosarcoma or Rat Fibrosarcoma, Raf)
zu binden, das wiederum mit anderen Proteinen in Wechselwirkung tritt. Am Ende dieser
Signaltransduktionskaskade steht dann eine gezielte Regulation der Transkription be-
stimmter Zielgene. Die Nukleotidhydrolyse und der Nukleotidaustausch werden bei den
Ras-homologen GTPasen durch GTPase aktivierende Proteine (GAPs) und Guaninnuk-
leotid-Austauschfaktoren (GEFs) beschleunigt (McCormick, 1989; Cherfils /Chardin,
1999; Praefcke /McMahon, 2004; Bos et al., 2007). Im Gegensatz dazu benötigt hGBP1
als Vertreter der Dynamin Superfamilie sowie einige andere kleinere GTPasen keine
GAPs, sondern stimuliert sich durch Homooligomerisierung, wodurch die katalytische
Aktivität signifikant um das 20-fache erhöht wird (Prakash, Renault et al., 2000;
Kunzelmann et al., 2006). Deswegen wird hGBP1 auch als G Protein Activated by
Nucleotide Dependant Dimerization (GAD) klassifiziert. Ein Gendefekt des für die
GNBPs beschriebenen GTPase-Zyklus kann in vielen Fällen drastische Auswirkungen
auf die Signalweiterleitung und das Überleben der Zelle haben. Mutationen im Ras Gen
führen zum Beispiel in 30 % aller Fälle zu Krebs, da das Ras Protein aufgrund einer Un-
empfindlichkeit gegenüber GAPs ständig in seiner aktiven Form verbleibt, was zu einer
unkontrollierten Zellproliferation führt (Cox /Der, 2002). Dieses Beispiel zeigt deutlich,
wie empfindlich die Regulationsmechanismen innerhalb der Zellen sind und wie bedeut-
sam es ist, die Struktur und Funktionsweise bestimmter Schlüsselproteine (Ras
(Protoonkogen); hGBP1 (Immunprotein) zu kennen, um gezielt durch Einsatz bestimmter
Wirkstoffe (Medikamente) in die Signaltransduktionswege eingreifen zu können.
2.8.3 Die GBPs als Vertreter der Dynamin-verwandten Proteine
HGBP1 wird in die Gruppe der Dynamin-verwandten oder auch Großen GTP-bindenden
Proteine eingeordnet. Die wichtigsten Eigenschaften lassen sich wie folgt zusammenfas-
sen:
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
30
Vorkommen in verschiedensten Organismen wie Pflanzen, Vertebraten und
Bakterien (Obar et al., 1990; Gu /Verma, 1996; Moshnikova et al., 2006).
Beteiligung an zahlreichen Prozessen: Vesikelabschnürung, Differenzierung von
Zellorganellen, Pathogenresistenz
Domänenarchitektur und Funktion deutlich von den kleinen klassichen GTPasen
wie Ras unterscheidbar: Große GTPase-Domäne (ca. 300 Aminosäuren) mit den
klassischen konservierten Bindungsmotiven und weiteren Insertionen (Praefcke/
McMahon, 2004), Mittel-Domäne, GTPase-Effektor-Domäne, zumeist weitere
Domänen wie Pleckstrin-Homologie-Domänen (PHD) oder Prolin-reiche Domä-
nen (PRD) etc., die die Proteine zu den Zielkompartimenten leiten.
Die Funktion der GEFs und GAPs bei Ras als Initiatoren des Nukleotidaustausches und
als GTP-Hydrolyse-Beschleuniger wird im Falle der Mitglieder der Dynamin Superfami-
lie von der Mittel- und GTPase-Effektor-Domäne sowie der relativ geringen Affinität zu
GTP ersetzt (McCormick, 1989; John et al., 1990; Schwemmle /Staeheli, 1994; Richter et
al., 1995; Binns et al., 1999; Cherfils /Chardin, 1999; Stowell et al., 1999; Klockow et al.,
2002; Praefcke /McMahon, 2004).
Wie bereits erwähnt, nennt sich die Familie, denen die GBPs zugeordnet werden, „Große
Dynamin-verwandte GTPasen“. Im Folgenden soll kurz dargestellt werden, worin diese
Verwandtschaft begründet ist.
Abbildung 2-13: Vergleich der Domänenstruktur von Dynamin und GBP. Die GTPase-Do-
mäne, Mittel-Domäne und GTPase-Effektordomäne (GED) können sowohl in Dynamin als auch
GBPs identifiziert werden. Im Gegensatz zu den GBPs weist das Dynamin zusätzlich eine Prolin-
reiche-Domäne sowie eine PH-Domäne auf.
Wie die GBPs weist auch das Dynamin eine GTPase-Domäne mit den klassischen kon-
servierten Bindungsmotiven, eine Mitteldomäne und eine GTPase-Effektordomäne auf.
Zusätzlich findet man eine Prolin-reiche Domäne und eine Pleckstrin-Homologie-Do-
mäne (PHD), die auf eine Membranassoziation hindeuten könnte (Ferguson et al., 1994).
Für das Dynamin konnte auch, analog zu den GBPs, eine nukleotidabhängige Aktivität,
nämlich die Interaktion mit Mikrotubuli, gezeigt werden (Shpetner /Vallee, 1989). Ein
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
31
GTP-abhängiger Effekt auf die Vesikelabschnürung, bei dem Dynamine ringartige
Strukturen an röhrenförmigen Ausstülpungen der Membran ausbilden (Takei et al., 1995),
wurde bereits beschrieben. Wie genau das zur Vesikelabschnürung beiträgt und welcher
Mechanismus sich dahinter verbirgt, ist bis heute nicht geklärt. Entscheidend ist, dass bei
allen beschriebenen Modellen die Aktivität von Dynamin durch GTP vermittelt wird und
dass die Homooligomerisierung von Dynamin ein entscheidender Bestandteil der
Funktion des Proteins ist, wie zahlreiche Studien belegen (Binns et al., 1999; Muhlberg
/Schmid, 2000; Sever et al., 2000; Narayanan et al., 2005; Roux et al., 2006; Mears et al.,
2007; Bashkirov et al., 2008; Pucadyil /Schmid, 2008; Mettlen et al., 2009).
Die Selbstassemblierung von Dynamin zu helikalen Strukturen scheint in dem
Zusammenhang dafür verantwortlich zu sein, dass sich Vesikel abschnüren können. Die
Mitteldomäne kommt dabei als Angriffsfläche für die nukleotidabhängige Assemblierung
in Frage. Durch Einbau gezielter Mutationen in diesem Bereich konnte die Ausbildung
von Dynamin-Oligomeren inhibiert werden (Ramachandran et al., 2007). Des Weiteren
wurden signifikante Erhöhungen der kooperativen GTPase-Aktivität beobachtet, die mit
der GTPase-Effektor-Domäne in Verbindung gebracht werden konnte (Warnock et al.,
1996; Muhlberg et al., 1997; Song, B. D. et al., 2004).
2.8.4 Mx-Proteine als Vertreter der Dynamin Superfamilie mit antiviraler Aktivität
Die Mx-Proteine wurden zum ersten Mal dadurch entdeckt, dass eine Mutation im Gen
für Mx bei Mäusen mit einem Verlust der Resistenz gegenüber Orthomyxoviren einher-
geht (Lindenmann, 1962; Haller et al., 1979). Wie Dynamin besitzen diese Proteine eine
GTPase-Domäne, eine Mitteldomäne und zusätzlich ein Leucin-Zipper-Motiv (LZ-Mo-
tiv), das den Interaktionsbereich für Dimerisierung bildet (Melen et al., 1996). Analog
zum Dynamin weisen sie ebenfalls eine geringe Affinität gegenüber GTP auf und
oligomerisieren nukleotidabhängig, was die GTPase-Aktivität erhöht (Nakayama et al.,
1993; Staeheli et al., 1993; Kochs et al., 2002). Auch größere ringförmige Strukturen und
GDP-abhängige dicht gepackte Komplexe konnten beobachtet werden. Im Gegensatz zu
hGBP1 wird die antivirale Aktivität der Mx-Proteine duch Interferon α und β, nicht aber
durch Interferon γ vermittelt. Sowohl in Mäusen als auch im Menschen konnte diese
Aktivität gegen zahlreiche Viren nachgewiesen werden (Dreiding et al., 1985; Haller et
al., 1998; Chieux et al., 2001; Gordien et al., 2001; Haller /Kochs, 2002; Andersson et al.,
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
32
2004; Sadler /Williams, 2008). Als Besonderheit gilt, dass für die Isoformen Mx1 und 2
unterschiedliche Zellkompartimente identifiziert wurden (Sadler /Williams, 2008), was
auf eine gezielte antivirale Aktivität schließen lässt. Über die GTPase-Effektor-Domäne
und das Leucin-Zip-Motiv wird die Oligomerisierung vermittelt (Di Paolo et al., 1999),
doch hängt die antivirale Aktivität nicht von dieser Assemblierung ab. Vielmehr geht die
Theorie dahin, dass der oligomere Zustand nur als eine Art Ruhezustand beschrieben
werden kann und das die Monomere die Bekämpfung der Viren bewerkstelligen (Janzen
et al., 2000). Die Guanylat-bindenden Proteine, die im Folgenden beschrieben werden,
weisen wie die Mx-Proteine eine antivirale Aktivität auf und vereinen gleichzeitig die
vom Dynamin bekannte Struktur und das nukleotidabhängige Oligomerisierungsverhalten
auf sich.
2.8.5 Die Familie der Guanylat-bindenden Proteine
Zum ersten Mal wurden Vertreter der Guanylat-bindenden Proteine (GBPs) bei der Be-
handlung von humanen Fibroblasten mit Interferonen entdeckt, die in Folge dessen
resistent gegenüber VSV waren. Für die Resistenz konnten vier Kandidaten mit Massen
zwischen 44 und 68 kDa ausgemacht werden, deren Synthese durch Interferon induziert
wurde (Knight /Korant, 1979). Insbesondere zwei Proteine schienen von der
Interferonzugabe besonders beeinflusst worden zu sein: Ein Protein mit einer Größe von
56 kDa, welches durch Interferon α und β induziert wurde, und ein weiteres mit einer
Größe von 65 kDa, dessen Expression wesentlich stärker von Interferon γ abhing (Cheng
et al., 1983). Die Bindungsaffinität gegenüber GTP, GDP und GMP konnte für beide
Proteine nachgewiesen werden (Cheng et al., 1985; Cheng et al., 1991), so dass beide
später als Guanylat-bindende Proteine klassifiziert wurden. Bis heute konnten im
Menschen 7 verschiedene GBPs mit hoher Sequenzhomologie gefunden werden. Das
kodierende Gen für alle GBPs befindet sich auf einem Cluster in Chromosom 1
(Olszewski et al., 2006). In Mäusen wurden sogar 11 Gene, die für GBPs kodieren
identifiziert, aber auf verschiedenen Chromosomen, (3 Cluster auf Chromosom 3 und 5;
(Degrandi et al., 2007; Kresse et al., 2008)). Auch in Ratten, Hühnern, Fischen etc.
wurden GBPs gefunden (Asundi et al., 1994; Schwemmle et al., 1996; Robertsen et al.,
2006). Über Untersuchungen der Promotorsequenzen wurden entscheidende Hinweise
gefunden, die auf eine interferonabhängige Stimulation hindeuten. Für hGBP1-4 sowie 6
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
33
und 7 und auch mGPB 1-6 ließen sich Transkriptionsbindungsstellen für interferonabhän-
gige Transkriptionsfaktoren identifizieren (Olszewski et al., 2006). Auch die Beteiligung
von murinen GBPs an der zellulären Immunantwort wurde durch ihre nachgewiesene
Assoziation an intrazelluläre Krankheitserreger (Monocytogenes, Toxoplasma Gondii)
gezeigt (Degrandi et al., 2007). Des Weiteren konnten Auswirkungen auf die
Zellproliferation gezeigt werden (Gorbacheva et al., 2002).
2.8.6 Das Humane Guanylat-bindende Protein 1- funktionelle und strukturelle As-
pekte
Wie bereits im vorherigen Abschnitt erwähnt, wird hGBP1 vornehmlich durch Interfe-
ron γ induziert und zwar in vaskulären Endothelzellen von Darm, Magen, Milz etc.
(Lubeseder-Martellato et al., 2002). Die antiviralen Eigenschaften ließen sich durch den
Nachweis der Resistenz gegen Vesicular Stomatitis Viren, Encephalomyocarditis und
Hepatitis C Viren (Anderson, 1999; Itsui, Y.Sakamoto, N.; Kurosaki, M.; Kanazawa, N.;
Tanabe, Y.; Koyama, T.;Takeda,Y.Nakagawa, M. et al., 2006; Itsui, Y. et al., 2009) fest-
stellen. Hinzu kommen antibakterielle Effekte gegen Chlamydien (Tietzel et al., 2009)
und das Auftreten von hGBP1 als sekretiertes Protein bei bakterieller Menningitis
(Naschberger et al., 2006). Es konnte ferner gezeigt werden, dass hGBP1 als Mediator bei
der inhibitorischen Wirkung von inflammatorischen Cytokinen auf die Aktivität von
Endothelzellen fungiert (Guenzi et al., 2001) und dass dafür nur bestimmte Domänen von
hGBP1 nötig sind. Darüber hinaus setzt die Inhibierung der so genannten Matrix-Metallo-
Protease und die damit einhergehende Unterdrückung der Angiogenese (Kapillarwachs-
tum) von Endothelzellen die Hydrolyseaktivität von hGBP1 voraus (Guenzi et al., 2003).
Als Biomarker von Darmkrebs (kolorektalem Karzinom) konnte ebenfalls hGBP1 etab-
liert werden. Die Überexpression des Proteins führt dabei zu einer erhöhten Überlebens-
rate (Naschberger et al., 2008). Weiterführende Studien zielen nun darauf ab, wie diese
Erhöhung der Überlebensrate zustande kommt und ob hGBP1 als direkter Vermittler oder
indirekt über andere Effektoren fungiert. Über die Lokalisation von hGBP1 innerhalb der
Zelle ließ sich bis dato die Feststellung machen, dass nach Induktion durch Interferon γ
eine granuläre Verteilung im Cytosol beobachtbar ist (Lubeseder-Martellato et al., 2002).
Die Überführung von hGBP1 in den Übergangszustand, also GDP gebundenen Zustand,
mittels Aluminiumfluorid führt jedoch zu einer Verlagerung an den Golgi-Apparat, eine
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
34
Zellorganell, das für die Exozytose eine entscheidende Rolle spielt und aus einem Stapel
von flachen membranumschlossenen Zisternen besteht. Dafür ist eine Farnesylierung von
hGBP1 an seiner CaaX-Box erforderlich (Modiano et al., 2005; Tripal et al., 2007). Da
die Kristallstruktur für das monomere hGBP1 gelöst werden konnte (Prakash, Praefcke et
al., 2000), lässt sich die Struktur äußerst detailliert beschreiben. HGBP1 ist ein Protein
mit einer molekularen Masse von 67 kDa und weist eine längliche Struktur auf, die dieses
Protein besonders interessant für rasterkraftmikroskopische Untersuchungen macht, die in
dieser Arbeit durchgeführt wurden. Da sich Länge (130 Å) und Breite (ca. 30 bis 40 Å)
deutlich unterscheiden, lassen sich anhand von Höhenprofilen an einer über
Mikrokontaktstempeln lateral strukturierten SAM-Oberfläche Aussagen über die Orien-
tierung des hGBP1 auf der Oberfläche machen.
Abbildung 2-14: Kristallstruktur von hGBP1 full length im nukleotidfreien Zustand. Die
GTPase-Domäne (LG-Domäne, blau) ist direkt mit der Mitteldomäne (orange) verbunden, die
sich um 90 Å von der LG-Domäne entfernt. Die GTPase-Effektor-Domäne (GED) ist in grün
dargestellt und erstreckt sich 120 Å in Richtung der LG-Domäne. Das Farnesylierungsmotiv be-
findet sich innerhalb der CaaX-Box und befähigt das hGBP1 zur Membranassoziation.
Auch für hGBP1 findet man die für die Mitglieder der Dynamin-Familie bekannte Domä-
nenstruktur aus großer GTPase Domäne, Mitteldomäne und GTPase-Effektor-Domäne
mit C-terminaler CaaX-Box (589
CTIS592
), die auch in Ras zu finden ist und als Erken-
nungssequenz für Isoprenylierung dient. Die Membranassoziation kann nur im
isoprenylierten Zustand erfolgen (Der /Cox, 1991; Kato et al., 1992; Modiano et al., 2005;
Wright /Philips, 2006). Die längliche Struktur des hGBP1 ergibt sich daraus, dass sich die
Mitteldomäne ca. 90 Å von der GTPase-Domäne entfernt. Gleichzeitig erstreckt sich die
GTPase-Effektor-Domäne über eine Länge von 120 Å wieder in Richtung GTPase-Do-
mäne zurück, wobei die Vermittlung über zwei Drei-Helix-Bündel der Mitteldomäne er-
folgt (Prakash, Praefcke et al., 2000). Bis auf einige Insertionen entspricht die GTPase-
Domäne von hGBP1 der minimalen GTPase-Domäne von Ras mit den typischen konser-
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
35
vierten Nukleotidbindungsmotiven. Kleinere Unterschiede ergeben sich beim Erken-
nungsmotiv für die Guaninbase und ihre Positionierung in der Nukleotibindungstasche
(Praefcke et al., 1999; Prakash, Renault et al., 2000).
Wie bereits für Dynamin und die Mitglieder der Dynamin Superfamilie beschrieben, bil-
det hGBP1 nukleotidabhängig ebenfalls Oligomere (Dimere und Tetramere; (Prakash,
Renault et al., 2000; Praefcke et al., 2004)) und zeigt kooperative Hydrolyse, also
enzymatische Aktivität, (Kunzelmann et al., 2005), die es möglich macht, die Beibehal-
tung dieser Aktivität nach Immobilisierung auf einer SAM-Oberfläche nachzuweisen und
Rückschlüsse auf mögliche Denaturierung zulässt. Nur im dimerisierten Zustand erreicht
die katalytische Aktivität ein Maximum. Gegenüber der im monomeren Zustand nach-
weisbaren Basalaktivität steigert die Dimerisierung die GTP-Hydrolyserate um das 20-
fache (Kunzelmann et al., 2005). Die Dimerisierung über die GTPase-Domänen, die rönt-
genkristallographisch gelöst werden konnte (Ghosh et al., 2006) wird über GppNHp, ein
nicht hydrolysierbares GTP-Analog, vermittelt. Daraus ließ sich ein mögliches Modell für
die Dimerisierung vom vollständigen hGBP1 (full length) entwickeln.
Abbildung 2-15: Modell für das hGBP1-Dimer in Anwesenheit von GppNHp. Die Struktur
der dimerisierten GTPase-Domäne konnte durch das nicht hydrolysierbare GTP-Analog GppNHp
(rot) bestimmt werden. Die Modellierung des hGBP1-Dimers erfolgte über die Röntgenkristall-
struktur der dimerisierten GTPase-Domäne. Nachträglich wurden die helikalen Domänen (grün)
in die ermittelte Struktur eingefügt (Ghosh et al., 2006).
Eine Kristallstruktur des hGBP1 Dimers für zwei vollständige Proteine existiert bis heute
nicht, so dass auf indirektem Wege, wie in dieser Arbeit aufgezeigt, einen Zugang zu den
mechanistischen Eigenschaften der Dimerisierung, z. B. über die Untersuchung der
Kinetik, gesucht werden muss. Für die GTPase-Domänen im Komplex mit GDP und
Aluminiumfluorid konnte ebenfalls eine Kristallstruktur gelöst werden. Im GDP-
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
36
gebundenen Zustand ist hGBP1 in der Lage Tetramere auszubilden (Praefcke et al.,
2004).
Was hGBP1 von anderen Mitgliedern der Dynamin Superfamilie unterscheidet, ist zum
einen die Tatsache, dass es GTP, GDP und GMP mit gleicher Affinität bindet (Cheng et
al., 1983; Cheng et al., 1991) und dass es zum anderen GTP nicht nur zu GDP, sondern
auch weiter zu GMP umsetzt (Schwemmle /Staeheli, 1994; Praefcke et al., 1999;
Kunzelmann et al., 2006). Aufgrund dieser Besonderheit wollte man mehr über den
genauen Mechanismus der Hydrolysereaktion herausfinden. Das Lösen der
Kristallstrukturen von hGBP1 und der dimerisierten G-Domänen mit verschiedenen
Nukleotiden ermöglichte eine detaillierte Beschreibung dieses Vorgangs (Scheffzek et al.,
1997; Ghosh et al., 2006; Kunzelmann et al., 2006).
2.9 Kurzdarstellung anderer verwendeter Proteine
Zur Überprüfung der Proteinresistenz der in dieser Arbeit hergestellten Peptidthiol-SAMs
wurden die Proteine Fibronektin, Rinderserumalbumin (BSA) und Fibrinogen verwendet.
Fibronektin ist ein heterodimeres, stabförmiges Glykoprotein der extrazellulären Matrix
und besteht zu 5 % aus Carbohydraten, die an membrangebundene Rezeptorproteine bin-
den. Auch die Bindung an andere Proteine der extrazellulären Matrix wie Collagen, Fib-
rin oder Heparansulfat konnte gezeigt werden. In seiner löslichen, über Disulfidbrücken
gebundenen Form (zwei Polypeptidketten (Monomere) von je 230 kDa) ist es auch im
Blutplasma zu finden. Ansonsten liegt es als unlösliches Glykoprotein-Dimer vor. Da es
in der Lage ist, Zellen mit der extrazellulären Matrix zu verbinden, hat es den Namen
„Zellkleber“ erhalten. Aufgrund seiner A-typischen stabförmigen Struktur, seiner hohen
molekularen Masse und seiner Funktion als Adhäsionsprotein eignet es sich besonders
gut zur Überprüfung der Proteinresistenz, zumal die Einbettung von Implantaten auch
über solche Proteine vermittelt wird. Das in dieser Arbeit verwendete Fibronektin wurde
direkt aus dem Blutplasma isoliert.
Fibrinogen ist ein hexamerer Proteinkomplex, bestehend aus je zwei α-, β- und γ-Unter-
einheiten. Die Untereinheiten sind über Disulfidbrücken so miteinander verbunden, dass
der Amino-Terminus aller Untereinheiten das Zentrum des Komplexes bildet, nämlich die
so genannte E-Domäne. Die einzelnen Monomere führen als Coiled-Coil-Struktur von
dieser Domäne weg. Mit Fibronektin kann es Heteropolymere ausbilden. Fibrinogen liegt
im Blutplasma vor und wird bei Blutgerinnung in Fibrin umgewandelt. Außerdem fun-
Kapitel 2 Theoretische Grundlagen
37
giert es als Kofaktor bei der Blutgerinnung, weist also ebenfalls sehr „klebrige“
Eigenschaften auf, die es zu einem „Härtetest“ für die Peptidthiole machen. Auch in
früheren Studien wurde Fibrinogen bereits verwendet (Herrwerth, S., Eck, W., Reinhardt,
S., Grunze, M., 2003).
Im Gegensatz zu Fibrinogen und Fibronektin ist BSA ein globuläres Protein mit einem
Molekulargewicht von ca. 66 kDa. Albumine gehören zu den am häufigsten vorkommen-
den Proteinen im Blutplasma. Seine Hauptfunktionen bestehen in der Regulation des
Blutes, im Aufrechterhalten des kolloidosmotischen Drucks, in der Bindung von anorga-
nischen Ionen sowie im Transport von Fettsäuren, Steroidhormonen und Pharmaka.
Kapitel 3 Material und Methoden
38
3 Material und Methoden
3.1 Materialien für Oberflächenanalytik
3.1.1 Verwendete Substrate
Siliziumwafer mit [100] Orientierung Silchem Handelsgesellschaft mbH,
Freiberg
Glassubstrate (D263T Dünnglas) Schott AG,
3.1.2 Metalle für thermische Bedampfung im Vakuum
Titan 99,8 %; 6 mm Pellets ChemPur Feinchemikalien, Karlsruhe
Gold 99,99 %; 1-4 mm Granulat ChemPur Feinchemikalien, Karlsruhe
3.1.3 Puffer und Lösungsmittel
Milli-Q-Wasser
Deuteriumoxid 99,9 % Deutero GmbH; Kastellaun
Ethanol, technisch J.T. Baker, Deventer
Ethanol p.a., J.T. Baker, Deventer
Tris-DCl 10 mM Tris (pH 7,4)
Puffer C* 50 mM Tris, 5 mM MgCl2 (pH 7,9)
3.1.4 Thiolierte Reagenzien für Oberflächenmodifikation
n-Oktadekanthiol, 96 % Arcos, AC35498-0250
n-Dekanthiol, 96 % Arcos
11-Hydroxy-1-undecanthiol, 98 % Aldrich, 510467
Biotinyliertes Thiol Synthese: PD Dr. Andreas Terfort
(Universität Hamburg)
OEG(6)-Thiol Synthese: Dr. Wolfgang Eck (Uni
Heidelberg);
Prochimnia Surfaces Sopot (Polen)
Kapitel 3 Material und Methoden
39
3.1.5 Verwendete Proteine
Streptavidin, rekombinant aus E. coli Sigma S-0677
Bovine Serum Albumine (BSA) Sigma A-7906
Fibronektin Sigma F-2006
Fibrinogen Sigma F-3879
3.2 Methoden für die Oberflächenanalytik
3.2.1 Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie
Bei der Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (Surface Plasmon Resonance,
SPR) steht in erster Linie die Charakterisierung der Wechselwirkung zweier oder mehre-
rer Interaktionspartner hinsichtlich ihrer kinetischen und thermodynamischen Interakti-
onseigenschaften und der Spezifität der Bindung im Vordergrund. Das grundsätzliche
Prinzip beruht auf der Messung der so genannten Oberflächenplasmonenresonanz, eines
Phänomens, das aus der Totalreflexion von Licht an der Grenzfläche zwischen einem
Metall und einem Nichtleiter auftritt (Liedberg et al., 1995; Alves et al., 2005). In den
letzten Jahren hat sich diese Methode zu einer wichtigen Methode zum Nachweis von
vornehmlich biochemischen Reaktionen und Interaktionen zwischen Biomolekülen (An-
tigen-Antikörperreaktionen, etc.) entwickelt, aber findet auch intensiven Einsatz bei der
Analyse von Bindungseigenschaften verschiedener Arzneimittel und erleichtert somit das
Auffinden neuer Medikamente in der Pharmazeutischen Industrie immens. Die Vorzüge
der Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie liegen hierbei darin begründet, dass
oberflächennahe Phänomene, zumeist Protein-Proteininteraktionen, zeitaufgelöst und
ohne weitere Markierungen der beteiligten Moleküle durch z. B Fluoreszenzfarbstoffe,
beobachtet werden können. Der Einsatz von Flusszellen ermöglicht zudem eine Untersu-
chung der Biomoleküle unter physiologischen (wässrigen) Bedingungen und bei optima-
ler Gleichgewichtseinstellung der Interaktion über die Regulierung der Flussrate. Auf-
grund dieser Vorzüge konnte sich eine Reihe von kommerziell erhältlichen SPR- Syste-
men (Firma Reichert, BIAcore etc.) in den letzten Jahren im Bereich der Biosensorik
etablieren.
Dass Oberflächenplasmonen als Lösung der Maxwell-Gleichungen dargestellt werden
können, wenn man stetige Randbedingungen annimmt, konnte schon sehr früh vorausge-
Kapitel 3 Material und Methoden
40
sagt werden (1909 Sommerfeld, 1941 Fano), doch die eigentliche praktische Umsetzung
dieser Berechnungen gelang erst in den 60er Jahren und fand in der Entwicklung der
ersten SPR-Geräte in den 90er Jahren seinen bisherigen Höhepunkt. Das damals entwi-
ckelte Konzept bildet bis heute die Grundlage der Oberflächenplasmonenspektroskopie
und soll im Folgenden aspektweise dargestellt werden.
In Metallen liegt aufgrund der Tatsache, dass die äußeren Valenzelektronen von Metallen
(Gold, Silber, Kupfer) durch die inneren, abgeschlossenen Schalen vom Kern stark abge-
schirmt sind, eine höhere Beweglichkeit der selbigen vor und sie können in ihrer Gesamt-
heit als Elektronengas modellhaft beschrieben werden. Bei diesem so genannten
Plasmakonzept werden die positiven Atomrümpfe vernachlässigt. Aus dieser höheren
Beweglichkeit der Elektronen resultieren oszillierende Fluktuationen der Ladungsdichte,
die sich in Form elektromagnetischer Wellen (Plasmonen) ausbreiten. Grundsätzlich
werden zwei Arten von Plasmonen unterschieden, die je nach ihrer Lokalisation,
entweder parallel zur Grenzfläche (Oberflächenplasmonen) oder im Inneren des Metalls
(Volumenplasmonen), unterschieden werden können. Volumenplasmonen sind hierbei
Longitudinalwellen und Oberflächenplasmonen Transversalwellen, die sich entlang der
Grenzfläche zwischen Metall und Dielektrikum ausbreiten. Die beiden Typen von
Plasmonen interferieren nicht miteinander. Die Quantenmechanik weist Licht einen
Teilchen- und Wellencharakter zu (Welle-Teilchen-Dualismus), so dass Oberflächenplas-
monenwelle und Lichtwelle auch als Lichtteilchen (Photonen) beschrieben werden
können, was bei idealer Wechselwirkung (Interferenz) der beiden Wellen zufolge hat,
dass sowohl Energie als auch Impuls vollständig übertragen werden müssen. Dies setzt
eine Übereinstimmung des Wellenvektors und der Polarisation des Lichtes (p-
Polarisation) und der Oberflächenplasmonen voraus. Nur wenn das einfallende Licht p-
polarisiert ist, können über die zur Grenzfläche senkrechte Projektion des elektrischen
Feldes Schwingungen im Metallfilm angeregt werden. Im Normalfall ist eine direkte
Anregung der Oberflächenplasmonen mit Hilfe des monochromatischen, einfallenden
Lichtes nicht möglich, was aus der Betrachtung der Dispersionskurven der Plasmonen
und des Lichtes ersichtlich wird. Um eine Anregung zu erreichen, wird ein Prisma, der als
optischer Koppler fungiert, in den Strahlengang gebracht und sorgt durch seinen höheren
Brechungsindex im Vergleich zu Luft für eine Dämpfung der Lichtgeschwindigkeit und
folglich für eine Herabsetzung der Steigung der Lichtgeraden.
Kapitel 3 Material und Methoden
41
Abbildung 3-1: Darstellung der Dispersionskurven von Oberflächenplasmonen (OP) und
Volumenplasmonen (VP). Nur wenn die Lichtgerade durch ein Dielektrikum geschickt und so-
mit die Steigung herabgesenkt wird, entsteht ein Schnittpunkt mit der Dispersionskurve der Ober-
flächenplasmonen.
Die Dispersionskurven von Licht und Oberflächenplasmonen bilden somit einen
Schnittpunkt und die Voraussetzung für Resonanz ist geschaffen. Die gewählte
Anordnung von Lichtquelle, Prisma und angrenzender Metallschicht folgt der so
genannten Kretschmann-Raether-Konfiguration. Das Licht wird durch das Prisma direkt
auf einen dünnen Gold oder auch Silberfilm gelenkt, wodurch es an der Basis des Prismas
zur Totalreflexion kommt. Die an der Grenzschicht Glas-Metall entstehende evaneszente
Welle dringt in den Metallfilm ein und tritt mit den Oberflächenplasmonen an der
Grenzschicht Metall-Luft in Resonanz. Im Gegensatz dazu wird bei der Otto-
Konfiguration die evaneszente Welle über einen dünnen Luftspalt zur Metallfläche
geleitet und regt die Oberflächenplasmonen an. Aufgrund der leichteren experimentellen
Beherrschbarkeit der Kretschmann-Raether-Anordnung, hat sich diese weitgehend
durchgesetzt und kommt in den meisten kommerziell erhältlichen SPR-Spektrometern zur
Anwendung. Für beide Anordnungen gilt: In der Nähe des so genannten Oberflächenplas-
monenresonanzwinkels stimmt die Komponente des Wellenvektors des einfallenden
Lichtes entlang der Grenzfläche mit dem Wellenvektor der Oberflächenplasmonen
überein und es kommt zur Resonanz. Das Lichtfeld der einfallenden Welle ragt teilweise
in die benachbarte Metallschicht bzw. Metallschicht mit adsorbierter dielektrischer
Schicht hinein (evaneszente Welle), was aus den Stetigkeitsbedingungen für das
Kapitel 3 Material und Methoden
42
elektromagnetische Feld resultiert, und sorgt für eine Energieübertragung auf die frei
beweglichen Elektronen im Metallfilm, die zu schwingen beginnen (Plasmonen).
Abbildung 3-2: Messkonfiguration für Oberflächenplasmonen nach Raether und
Kretschmann. Das p-polarisierte Licht tritt in das Prisma ein und wird direkt auf die an der Basis
angrenzende Goldschicht gelenkt, so dass der Lichtstrahl total reflektiert wird. Der Messwinkel Θ
entspricht nicht dem inneren Grenzflächenwinkel α, da der Lichtstrahl an den Seitenflächen des
Prismas gebrochen wird. Daher muss zunächst eine mathematische Relation hergestellt werden.
Abbildung 3-3: Optische Anregung der Oberflächenplasmonen. Im linken Bild wird der
einfallende Lichtstrahl direkt total reflektiert und eine Anregung der Oberflächenplasmonen
kommt nicht zustande. Im rechten Bild stimmen die Wellenvektoren des Lichtes kx und der
Oberflächenplasmonen (ksp) überein und die Energie und der Impuls können idealerweise
vollständig übertragen werden und die Bedingung für Resonanz ist somit erfüllt.
Ein großer Teil der Energie des Lichtes verbleibt in der Elektronenschwingung und die
Plasmonen lassen sich somit indirekt über eine abgeschwächte Totalreflexion
nachweisen. Im Reflektivitätswinkel Diagramm entsteht ein markantes Plasmonenreso-
nanzminimum, das von der Schichtdicke des Goldes, dem Brechungsindex des
Glasprismas und der Wellenlänge der verwendeten Lichtquelle (Laser oder Leuchtdiode)
Kapitel 3 Material und Methoden
43
abhängt. Die Schichtdicke des Goldes wird so klein gewählt, dass sie im Vergleich zur
Wellenlänge des Lasers oder der Leuchtdiode (in unserem Fall 780 nm) keinen Einfluss
auf den Verlauf des Lichtstrahls an der Grenzfläche Glas-Gold hat und somit die Lage des
Resonanzminimums kaum beeinflusst. Bei Aufbringung einer dielektrischen Schicht
(Thiol) auf die Metallschicht, die eine Oberflächenreaktion zur Folge hat, verändert sich
der Brechungsindex in der Nähe der Oberfläche und der Resonanzwinkel wird zu höheren
Winkeln verschoben. Die daraus resultierende Dispersionskurve ist gegenüber dem Fall
einer unbeschichteten Metalloberfläche etwas weiter herabgesenkt.
Abbildung 3-4: Veränderungen der Dispersionskurve der Oberflächenplasmonen nach Auf-
bringung einer Molekülschicht. Die Kurve wird herabgesenkt, was gemäß der Definition des
Wellenvektors zu einer Verschiebung des Resonanzminimums zu größeren Winkelwerten führt.
Bei den Thiolen kommt die Absenkung der Dispersionskurve auch dadurch zustande,
dass durch die Ausbildung der kovalenten Bindung zwischen Schwefel und Gold eine
drastische Veränderung der elektronischen Struktur der Metalloberfläche resultiert, was
sich aus folgendem Zusammenhang ergibt:
n ( 1)
Für Kinetikmessungen erfolgt die Auftragung des Resonanzminimums gegen die Zeit.
Der fixe Winkel wird so gewählt, dass er sich etwa ein Drittel vom Minimum entfernt im
linken Ast der Kurve befindet, da dieser steiler ist als der rechte und somit eine höhere
Messempfindlichkeit erzielt werden kann. Durch Verschiebung der Resonanzkurve bei
Kapitel 3 Material und Methoden
44
Bindung von Molekülen an die Oberfläche kann direkt die Intensitätsänderung zeitauf-
gelöst gemessen werden.
Abbildung 3-5: Plasmonenresonanzkurven für zwei verschiedene Zeitpunkte T1 und T2
(links) und die Auftragung des Oberflächenplasmonenresonanzwinkels gegen die Zeit
(rechts). Die Kurve im rechten Bild beschreibt die typische Oberflächenadsorptionskinetik eines
Proteins
Die dabei entstehende Adsorptionskinetik kann genutzt werden, um molare Massen oder
molare Verhältnisse bei Mehrschichtensystemen zu berechnen, da zwischen Verschie-
bung des Plasmonenresonanzminimums und der Masse der angelagerten Moleküle (Pro-
teine) ein proportionaler Zusammenhang besteht. Ein entscheidender Vorteil der Oberflä-
chenplasmonenresonanzspektroskopie bei Untersuchung von Protein-Protein-Interaktio-
nen besteht zudem darin, dass keine Markermoleküle, z. B. Fluoreszenzlabel, an die zu
untersuchenden Moleküle gebunden werden müssen, um eine Adsorption in Echtzeit ver-
folgen zu können.
3.2.1.1 Metallisierung der Substrate für die SPR-Messungen
Die vorgefertigten Glaswafer (D263T) der Firma Schott AG mit den Dimensionen
12 x12x0,9 mm wurden vor der Bedampfung mit absolutem Ethanol (Reidel de Haën)
gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet. Der für die Beschichtung verwendete Me-
tallverdampfer stammt von der Firma Leybold Inficon und ist vom Typ XTC/2. Etwa 20
bis 25 Glassubstrate konnten pro Bedampfungsvorgang auf eine Metallscheibe mittels
Haftaufklebern befestigt werden. Hierbei musste darauf geachtet werden, dass nur ein
kleiner Bereich des Glaswafers mit dem Kleber bedeckt wird, damit bei der späteren Ent-
Kapitel 3 Material und Methoden
45
fernung des Wafers keine Rückstände des Klebers am Glas zurückbleiben. Da die
Glasscheiben während des Bedampfungsvorganges nach unten zeigten, war es
gleichzeitig notwendig, die Fixierung mit dem Kleber so vorzunehmen, dass die Scheiben
sich nicht von der Metallscheibe lösen konnten. Trotz kleiner Kleberkontaktfläche eine
möglichst hohe und stabile Fixierung der Glaswafer zu schaffen, stellte eine besondere
Herausforderung dar, die außerordentlich sorgfältig durchgeführt werden musste. Da es
sich bei SPR um eine optische Methode handelt, sind saubere und homogene Glas bzw.
Goldsubstrate absolute Voraussetzung. Zunächst wurde als Haftvermittler eine
Titanschicht von 12 Å auf das Glas mit einer Rate von 1 Ås-1
aufgedampft, gefolgt von
einer 485 Å dicken Goldlage (Bedampfungsrate: 15 Ås-1
). Die Bedampfung wurde bei
einem Druck von ca. 10-7
bar und Raumtemperatur durchgeführt. Die Aufbewahrung der
Goldwafer erfolgte bis zu ihrem Gebrauch im Exsikator.
3.2.1.2 Präparation der SAMs
Die mit Gold beschichteten Goldwafer wurden vor der SPR-Messung mehrfach mit
Ethanol gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet. Die Inkubation mit den jeweiligen
Thiolen erfolgte meistens (auf Abweichungen wird explizit im Ergebnisteil eingegangen)
in einer ethanolischen Lösung für 2-3 Stunden bis zu 24 Stunden. Die Konzentration der
Thiole wurde stets konstant bei 1 mM gehalten. Nach Inkubation wurden die Wafer wie-
derum mit Ethanol gewaschen und getrocknet. Dann konnten die mit dem jeweiligen
SAM modifizierten Goldwafer in das SPR Gerät (Firma Reichert, Xantec (Düsseldorf))
eingesetzt werden.
3.2.1.3 Oberflächenplasmonenresonanzmessungen zur Untersuchung verschiedener
hGBP1-Mutanten und ihres Dimerisierungsverhalten
Das System für die SPR-Messungen besteht aus einem Autosampler, einer Pumpe und
einem Spektrometer (alle von der Firma Reichert, Inc. Walden Avenue, Depew, NY).
Über eine Flusszelle kann die Probe auf die Chip-Oberfläche aufgetragen werden und
anschließend die nicht adsorbierten Moleküle mithilfe eines Puffers entfernt werden. Die
Zeiträume der Assoziations- und Dissoziationsphasen können PC-gesteuert festgelegt
Kapitel 3 Material und Methoden
46
werden. Über den Autosampler werden die vorbereiteten Proben automatisch in ge-
wünschter Reihenfolge über den Chip geleitet.
Während die Protein-Probe über den Chip geleitet wird, kann die Änderung des Bre-
chungsindex des Systems und somit die Änderung des Resonanzwinkels im Messprog-
ramm in Echtzeit verfolgt werden. Die Änderung des reflektierten Lichtes bei einem fi-
xierten Einfallswinkel wird in der Resonanzeinheit µRIU (Refractive Index Units)
angegeben und gegen die Zeit aufgetragen. Der nicht adsorbierte Anteil des Proteins wird
mit Hilfe eines konstanten Pufferflusses vom Chip entfernt. Beginnt das Protein von der
Oberfläche zu dissoziieren, kann dies ebenfalls am Bildschirm beobachtet werden, da
eine Verschiebung des Plasmonenresonanzminimums proportional zur Masse der angela-
gerten Proteine ist. Die Masse der adsorbierten Proteine ergibt sich aus der Resonanzein-
heit des SPR-Signals. Indem die Veränderung des Minimums an Lichtreflexion über
einen gewissen Zeitraum gemessen wird, kann auf die Veränderung des Brechungsindex
RI (refractive index; besitzt keine Einheit) geschlossen werden. Ein ΔRI von 1x10-6
entspricht einer adsorbierten Proteinmasse von 1 pg/mm² (0,1 ng/cm²) auf der
Chipoberfläche und dies wiederum wird definiert als 1,6145 µRIU bzw. 1 RU (response
unit) im Biacore System. Im verwendeten SPR-System der Firma Reichert gelten
folgende Werte:
1 µRIU = 0,05946 ng/cm².
Die Umrechnung für das Biacore System erfolgt nach der folgenden Vorgehensweise:
1 RU = 1,6145 µRIU
ng/cm ² 0,059460,0961,6145
µRIU 1
Für die SPR-Messungen wurden die mit Gold bedampften Goldwafer mit Ethanol von
Verunreinigungen befreit und mit Stickstoff getrocknet. Danach wurden die Wafer mit
einer Lösung aus 10 % Biotinthiol und 90 % Merkaptoundekanol für ca. 3 Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert. Nachdem die Wafer erneut mit Ethanol gereinigt und in einem
Stickstoffstrom getrocknet worden waren, konnten sie in die Messkammer des Spektro-
meters eingebaut werden. Dafür wurde das Prisma mit einem Tropfen Immersionsöl be-
deckt und der Wafer mit einer Pinzette vorsichtig in die Messzelle gelegt. Das Immer-
sionsöl sorgte für luftfreie Messbedingungen, da der Einschluss von Luft zu fehlerhaften
Messungen führen würde. Der Goldwafer wird durch die Messzelle in zwei Halbzellen
Kapitel 3 Material und Methoden
47
unterteilt. Dadurch kann eine Halbzelle als Referenz dienen, während die andere
Halbzelle als eigentliche Messzelle fungiert.
Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Beide Halbzellen wurden
zunächst durch einen konstanten Pufferstrom (Flussrate: 5 µl/min) mit Puffer C* (50 mM
Tris-HCl (pH 7,9), 5 mM MgCl2) äquilibriert, bis eine konstante Basislinie beobachtet
werden konnte. Durch beide Halbzellen wurde für 20 Minuten eine 0,4 µM Streptavidin-
Lösung (gleicher Puffer) geleitet. In der Referenzzelle wurden anschließend 5 µM hGBP1
ohne Biotinanker in Anwesenheit von 50 µM GppNHp über die mit Streptavidin
terminierte Oberfläche für 45 Minuten gegeben. Über die Messzelle wurden zunächst die
biotinylierten Mutanten von hGBP1 in einer Endkonzentration von 1 µM geschickt. Um
das Dimerisierungsverhalten von hGBP1 analysieren zu können, wurde darauf folgend
die Messzelle mit einer Lösung aus 5 µM hGBP1 wt in Anwesenheit von 10 µM
GppNHp inkubiert. Auch diese beiden Inkubationsschritte erfolgten über einen Zeitraum
von 45 Minuten. Zwischen jedem Inkubationsschritt erfolgte eine Dissoziations- oder
Waschphase von mindestens 20 Minuten. Der für alle Proben verwendete Loop hatte ein
Volumen von 250 µl.
Die jeweiligen Proteinlösungen wurden in dem Probenhalter des Autosamplers vorgelegt.
Mit Hilfe der verwendeten Software konnte die Reihenfolge, die Flussrate und die Dauer
der Probeninkubation festgelegt werden. Der Autosampler sorgte für eine automatisierte
Probengabe und Injektion eines exakten Probenvolumens. Nach jedem Inkubationsschritt
wurde die Injektionsapparatur des Autosamplers dreimal mit Puffer C (ohne DTT) von
Probenrückständen gereinigt.
Das für die Inkubation verwendete Streptavidin ist kommerziell erhältlich (Invitrogen).
Alle hGBP1 Mutanten und hGBP1 wt full length wurden eigenständig präpariert
(Abschnitt 3.5.1).
3.2.1.4 Überprüfung der Proteinresistenz von Peptidthiolen
Die Inkubation der Goldwafer erfolgte für 24 Stunden in ethanolischer Lösung. Von je-
dem der folgenden Thiole wurde 1 mM vorgelegt: OEG-Thiol, Merkapto-undekan-1-ol
(OH-Thiol), Oktadekanthiol und Dekanthiol (CH3-Thiole) und das synthetisierte
Peptidthiol. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Volumen
des Loops betrug 100 µl. Über die Flusszelle wurden über einen Zeitraum von 15 Minu-
Kapitel 3 Material und Methoden
48
ten jeweils die Proteine BSA, Fibronektin und Fibrinogen in einer Konzentration von
1 mg/ml gegeben. Danach erfolgte eine Dissoziation von ca. 20 Minuten. Die
Waschphase wurde abgebrochen, wenn vorher ein Plateauwert erreicht war.
Die Proteinresistenz des Peptidthiols wurde nicht nur auf Gold-, sondern auch auf
Silberwafern durchgeführt. Die Präparation der Silberwafer erfolgte nach derselben
Vorschrift wie bei den Goldwafern. Auch die Durchführung der SPR-Messungen wurde
nach der oben beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt.
3.2.2 Rasterkraftmikroskopie
Im Jahre 1981 wurde das Rastertunnelmikroskop (Scanning Tunneling Microscope,
STM), das die Untersuchung von Proben im atomaren Bereich ermöglicht, von Binnig
und Bohrer entwickelt. Da diese Methode auf der Entstehung des so genannten Tunnel-
stroms zwischen der zu untersuchenden Oberfläche und der Spitze des Hebelarms
(Cantilever), mit der die Probe abgerastert wird, beruht und somit ausschließlich auf
halbleitende und leitende Proben anwendbar ist, können biologische Proben nur dann un-
tersucht werden, wenn sie vorher mit leitenden Schichten von z. B. Kohlenstoff und Pla-
tin überzogen wurden. Da jedoch bei biologischen Proben, insbesondere Proteinen, die
Beibehaltung sämtlicher biomolekularer und struktureller Eigenschaften absolute Voraus-
setzung für die sinnvolle Anwendung biophysikalischer Methoden ist, erweist sich die
Herstellung der Leitfähigkeit mittels Beschichtung als absolut kontraproduktiv, da ein
Verlust dieser Eigenschaften in den meisten Fällen die Folge ist. Erst 1986 gelang es den
Wissenschaftlern Binnig, Gerber und Quate eine weitere Variante der Rastersonden-
mikroskopie zu entwickeln, die Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy,
AFM). Der Vorteil dieser Variante besteht darin, dass sie auch auf nicht leitende Oberflä-
chen übertragen werden kann. Mit Hilfe einer feinen Spitze wird die Probe, die auf einer
Piezokeramik befestigt ist und durch einen Piezoscanner in drei Raumrichtungen (x, y, z)
beweglich ist, abgetastet und dabei die direkte Kraft gemessen, die auf den schwingenden
Hebelarm wirkt, an dem die Spitze befestigt ist. Die Auslenkung des Cantilevers hängt
hierbei von der Topologie der Oberfläche ab. Der Lichtstrahl eines Lasers wird von der
Rückseite des Hebelarms reflektiert und auf eine Photodiode mit vier Quadranten gelenkt.
Je nach Bewegung der Spitze durch die Oberflächenbeschaffenheit der Probe trifft der
Kapitel 3 Material und Methoden
49
Lichtstrahl an anderen Positionen auf der Diode auf. Der Photostrom wird durch einen
I/U-Konverter in eine Spannung U umgewandelt.
Abbildung 3-6: Schematische Darstellung der wichtigsten Bauteile eines Rasterkraftmikro-
skops. Ein Rasterkraftmikroskop setzt sich im Allgemeinen aus einem Laser, einem Hebelarm
oder Cantilever mit einer Spitze, einem Vier-Quadranten-Detektor (Photodiode) und einem 3D-
Piezoscanner zusammen. Die Signalverarbeitung und Steuerung erfolgt über einen PC.
Die Viersegment-Diode ermöglicht es, sowohl die Auf- und Abbewegung als auch die
Torsion des Cantilevers zu registrieren. Es kommt dabei zu einem Spannungsunterschied
zwischen den beiden oberen und unteren Quadranten, die für die vertikale Bewegung des
Cantilevers steht und proportional zur Normalkraft ist, die auf die Spitze wirkt. Die
Spannung zwischen linken und rechten Feld ist dagegen proportional zur Lateralkraft und
steht für die Torsion. Das Differenzsignal lässt sich direkt in ein Höhenprofil umwandeln.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Auflagekraft des Cantilevers konstant zu
halten und dafür das piezokeramische Element über Rückkopplung nachzuregulieren. In
diesem Fall bewegt sich also die auf der Piezokeramik fixierte Probe gemäß ihrer
Oberflächentopographie und nicht der Cantilever selbst. Aus dem Steuersignal des Piezos
ergibt sich hierbei die Information zur Oberflächenbeschaffenheit. Auflösungsvermögen
bis hin in den atomaren Bereich sind bei dieser Technik realisierbar. Für die
Rasterkraftmikroskopie kann man verschiedene Faktoren formulieren, die entscheidend
die Auflösung des Mikroskops beeinflussen. Hier ist zum einen das Material zu
benennen, aus dem die Spitze besteht, zum anderen die Härte des Cantilevers, an dem
Kapitel 3 Material und Methoden
50
Spitze befestigt ist und die über die so genannte Elastizitäts-Kraft-Konstante K für ver-
schiedene Canitlever ermittelt werden kann.
3
3
4
Eh bK
l
(2)
E = Elastizitätsmodul; h = Dicke des Cantilevers; b = Breite des Hebelarms; l = Länge des Hebel-
arms
Die Elastizitäts-Kraft-Konstanten variieren in Bereichen von 0,01 und 50 N/m. Auch die
Beschaffenheit der Probe muss an dieser Stelle hervorgehoben werden, denn insbeson-
dere für biologische Probe, z. B. Proteine, gilt, dass sie gegenüber zu hohen Kräften sehr
druckempfindlich sind und man Gefahr läuft, die Probe beim Abrastern zu zerstören. Die
Strukturen von Proteinen oder Proteinkomplexen werden darüber hinaus durch relativ
schwache Wechselwirkungen zusammengehalten und der direkte, ständige Kontakt der
Spitze des Cantilevers mit der Probe würde zwangsläufig dazu führen, dass das Protein an
der Spitze hängen bleibt. Aus diesen Gründen wird auf biologische Proben weitgehend
der so genannte Tapping-Modus angewandt, bei dem die Spitze die Oberfläche nur „an-
tippt“. Auf diese Weise können Scherkräfte eliminiert und vertikal wirkende Kräfte mi-
nimiert werden. Weiter unten folgt eine detailliertere Beschreibung der beim Raster-
kraftmikroskop vorhandenen Betriebsarten, insbesondere dem Tapping-Modus. Auch
äußere Störeinflüsse wie externe Schwingungen, Schall und Temperatur haben eine signi-
fikante Auswirkung auf das Auflösungsvermögen des Rasterkraftmikroskops. Deswegen
kommen schwingungsgedämpfte Tische und spezielle Abdeckungen für das Mikroskop
zum Einsatz. Im Falle von thermischer Drift ist es oft ratsam, die Probe in die Apparatur
einzubauen und dann einige Zeit zu warten, bis sich das thermische Gleichgewicht einge-
stellt hat.
3.2.2.1 Kontakt- und Tapping-Modus
Wie der Name schon sagt, hat im Kontaktmodus die Spitze des Cantilevers direkten
Kontakt mit der Oberfläche und rastert diese ab. Dabei kann entweder die Höhe des
Cantilevers konstant gehalten werden oder die Kraft, mit der der Cantilever die Probe
berührt. Die erste Variante kam in dieser Arbeit ausschließlich zum Einsatz. Wie bereits
erwähnt, lassen sich die erhaltenen Spannungswerte direkt in die Topographie der
Kapitel 3 Material und Methoden
51
Oberfläche umrechnen. Eine weitere Möglichkeit, die Oberfläche darzustellen, ist die
Bestimmung von Reibungskräften (friction forces). Wenn der Cantilever über die
Oberfläche rastert, entstehen im Kontakt-Modus Reibungskräfte, die in einer Torsion des
Cantilevers resultieren. Dies führt je nach Beschaffenheit der Probe hinsichtlich ihrer
Homogenität und Rauhigkeit und je nach Beschaffenheit der Cantilever-Spitze im Bezug
auf ihre Geometrie und das Material, aus dem sie besteht, zu unterschiedlichen Photoströ-
men und auf dem Detektor, der Vier-Quadranten-Photodiode, und folglich zu
unterschiedlichen Spannungswerten. Somit lassen sich über die Reibungskraftmikros-
kopie sogar zwei gleich hohe Adsorbate (z B. zwei Thiole mit unterschiedlichen
funktionellen Gruppen (OH- und CH3-), wenn die Reibungseigenschaften unterschiedlich
genug sind, direkt auf einer Oberfläche nebeneinander darstellen. Höhen- und
Reibungsmodus können parallel und völlig unabhängig voneinander angewandt werden.
Da jede Linie zweimal gemessen wird, kann zwischen einer Trace- („Hin“-bewegung)
und Retrace- („Zurück“-bewegung) Messung unterschieden werden. Somit lässt sich
Height und Friction jeweils bei der einen oder anderen Bewegungsrichtung des
Cantilevers anwenden. Da der Cantilever bei trace- und retrace-Scan in entgegengesetzte
Richtungen verdreht wird, erhält man im Reibungskraft-Modus invertierte Bilder. Die
Qualität der Reibungsbilder wird zudem durch den Scan-Winkel zwischen Spitze und
Probe beeinflusst, der im besten Fall 90° zum Cantilever verlaufen sollte, um auch kleine
Strukturen und Kanten besser abbilden zu können.
Generell ist der Kontakt-Modus für die in dieser Arbeit zu vermessenden Proteinmulti-
schichten nicht geeignet, da der direkte Kontakt der Spitze mit den Proteinen aufgrund
der wirkenden Scher- und Druckkräfte zwangsläufig dazu führt, dass die Proteine ihre
native Struktur verlieren oder dass sie sogar vollständig von der Oberfläche entfernt wer-
den. Selbst wenn die eigentliche Protein-Protein-Interaktion erhalten bleibt, ist die kor-
rekte Bestimmung von Höhenunterschieden nahezu unmöglich, da die Spitze, insbeson-
dere bei den nur durch relativ schwache Wechselwirkungen zusammengehaltenen Protei-
nen, beim direkten Kontakt mit der Oberfläche Verformungen hervorruft, die das Ergeb-
nis drastisch verfälschen. Da es in dieser Arbeit darauf ankam, verschiedene Protein-Pro-
tein-Interaktionen nachzuweisen und die gemessenen Höhenunterschiede mit vorhande-
nen Kristallstrukturen zu vergleichen, wurde auf den Tapping-Modus zurückgegriffen,
bei dem Scherkräfte eliminiert und vertikal wirkende Kräfte minimiert werden können, da
der direkte Kontakt auf ein leichtes, frequenzielles „Antippen“ der Oberfläche reduziert
wird. Mit anderen Worten die für diesen Modus verwendeten Spezial-Cantilever
Kapitel 3 Material und Methoden
52
(Tapping Mode Cantilever, TM-Cantilever) werden bei ihrer Eigenfrequenz ω0 (50 –
500 kHz) und der entsprechenden konstanten Amplitude zum Schwingen gebracht. Was
beim Tapping-Modus nun ausgenutzt wird, ist der direkte Zusammenhang zwischen Van-
der-Waals-Potential und dem Abstand zur Oberfläche und den darauf befindlichen
Strukturen. Solange der Cantilever unbeeinflusst vom Van-der-Waals-Potential ist, be-
stimmt die Federkonstante und die verwendete Anregungsenergie die Amplitude der
Schwingung desselbigen. Wenn die Distanz zur Oberfläche klein genug wird, werden die
Resonanzfrequenz und somit auch die Amplitude erniedrigt, da sich das Van-der-Waals-
Potential und Spitzenpotential nun überschneiden. Gemäß der Schwingungsfrequenz des
Cantilevers erfährt der in Richtung Photodiode reflektierte Lichtstrahl eine ständige Ab-
lenkung, was in einer Auf- und Ab- Bewegung des auf dem Detektor projizierten Licht-
flecks resultiert. Die Auslenkung ist ein Maß für die Amplitude, mit der der Cantilever
schwingt. Die Software ist nun in der Lage, die durch das Abrastern der Oberfläche vari-
ierende Auslenkung des Hebelarms mit einem vorgegebenen Soll-Wert zu vergleichen
und daraus eine Root-Mean-Square-Amplitude (RMS-Amplitude) zu ermitteln:
2 2
min max
2Amplitude
Signal SignalRMS
(3)
Dieser so genannte Amplitude Setpoint lässt sich vom Nutzer des Gerätes vor Beginn der
Messung einstellen und wird durch die Steuerung des piezokeramischen Elements in x-,
y-und z-Richtung über den bereits erwähnten Rückkopplungsmechanismus konstant ge-
halten. Der Sollwert sollte so gewählt werden, dass er nicht zu niedrig ist, da ansonsten
die Probe durch die zu fest aufgedrückte Spitze zerstört werden könnte, und auch nicht zu
hoch festgelegt wird, da daraus ein schwacher Kontakt zwischen Probe und Spitze resul-
tiert, der die Aufnahme der Oberflächentopographie kaum möglich macht. Im so ge-
nannten Phasenmodus ist es darüber hinaus möglich, die Phasenverschiebung gegenüber
der vorliegenden Phase bei der Schwingung des Cantilevers und der tatsächlichen Oszil-
lation des Hebelarms, beeinflusst durch unterschiedliche Oberflächeneigenschaften, wie
Reibung, Viskoelastizität usw., zu messen und dadurch eine lateral strukturierte Probe mit
z. B. zwei unterschiedlich terminierten Thiolen abzubilden. Was bei der Abbildung
ausgenutzt wird, ist der durch die Phasenverschiebung resultierende Phasenkontrast.
Exemplarisch ist in Abbildung 3-7 beispielhaft ein AFM-Bild dargestellt, bei welcher
eine lateral strukturierte Oberfläche nacheinander mit Streptavidin und
Kapitel 3 Material und Methoden
53
Meerrettichperoxidase inkubiert wurde. Da im Topographiemodus kein signifikanter
Höhenunterschied zwischen den verwendeten Thiolen gemessen werden konnte, wurde
das Bild im Phasenmodus aufgenommen. Die laterale Strukturierung ermöglicht die
Ermittlung von Höhenunterschieden zwischen den OEG-Thiol gefüllten und damit
proteinresistenten Stempelflächen und den Stegen.
Abbildung 3-7: Strukturierte SAM-Oberfläche vor und nach stufenweiser Adsorption
mehrerer Proteinschichten: A) Phasenbild einer Oberfläche mit unterschiedlichen
Thiolfunktionalisierungen: OEG(6)-Thiol (Quadrate, Stempelflächen) vs. Misch-SAM, bestehend
aus 10 % Biotinthiol und 90 % Merkaptoundekan-1-ol (Stege); B) Topographiebild nach Inkuba-
tion mit dem Protein Streptavidin, welches insgesamt vier Bindungstaschen für Biotin besitzt und
nach Inkubation im Bereich der Stege für einen Höhenanstieg sorgt; C) Topographiebild nach
Immobilisierung der biotinylierten Meerrettichperoxidase (bHRP) an Streptavidin, was einen
signifikanten Höhenanstieg gegenüber reinem Streptavidin zufolge hat (B2 und C2).
Die ermittelten Höhen können dann mit den durch Kristallstrukturen bekannten Dimensi-
onen der verwandten Proteine verglichen und Rückschlüsse auf ihre möglichen Orientie-
rungen an der Oberfläche gezogen werden.
3.2.2.2 Nanoshaving und Nanografting
Neben dem Mikrokontaktstempeln (Micro-Contact Printing, µCP) gibt es noch eine an-
dere Möglichkeit, lateral strukturierte Oberflächen herzustellen. Hierzu wird die Kraft,
mit der der Cantilever über die Oberfläche rastert, soweit erhöht, dass es möglich wird,
einzelne oder mehrere molekulare Schichten lokal herauszukratzen (Nanoshaving) und
die frei gekratzte Stelle gleichzeitig mit anderen Molekülen wieder aufzufüllen (Nano-
grafting). Da sich die neu eingebauten Moleküle deutlich vom Untergrund unterscheiden,
werden sie als Nanostruktur im topographischen Bild sichtbar. Beispielsweise bietet diese
Kapitel 3 Material und Methoden
54
Methode die Möglichkeit, Alkylthiole von einer Goldoberfläche vollständig zu entfernen
und die dadurch entstehende „eingravierte“ Struktur, im einfachsten Fall ein rechteckiges
oder quadratisches „Loch“, direkt wieder durch Beigabe eines anderen Alkylthiols aufzu-
füllen. Wenn sich die beiden Thiole in ihrer Länge signifikant unterscheiden, ist ein topo-
graphisches Bild ausreichend, um zwischen den beiden Thiole differenzieren zu können.
Ansonsten gibt auch ein Phasenbild oder im Kontaktmodus ein Reibungsbild Informatio-
nen über die unterschiedlichen Moleküle.
Abbildung 3-8: Strukturierung von SAM beschichteten Goldoberflächen mit dem AFM:
Nanoshaving und Nanografting. Nanoshaving (links) beschreibt das lokale Herauskratzen des
an der Oberfläche gebundenen Materials, dem Nanografting (rechts) geht ebenfalls das Shaving
der Oberfläche voraus, nur wird hier die frei gekratzte Fläche direkt wieder mit anderen Molekü-
len wieder aufgefüllt. Beispielhaft sei hier das Nanoshaving eines Thiols und den Austausch
durch ein anderes Thiol gezeigt (zur Verfügung gestellt von Tatjana Ladnorg, KIT Karlsruhe).
Die Anzahl der durch das Nanoshaving entstandenen Areale kann beliebig erweitert
werden und jedes Mal mit anderen Thiolen aufgefüllt werden, so dass auf der Oberfläche
eine Vielzahl von unterscheidbaren Bereichen entsteht, die mit dem Rasterkraftmikroskop
nachgewiesen werden können. In dieser Arbeit wird das Nanoshaving zum Nachweis von
Protein-Protein-Interaktionen auf einer mit Biotinthiol beschichteten Goldoberfläche
eingesetzt. Da die Kristallstrukturen der hierbei verwendeten Proteine (Streptavidin,
hGBP1) bekannt sind, lassen sich anhand der gemessenen Oberflächentopographie und
Kapitel 3 Material und Methoden
55
der daraus ermittelten Höhenprofile Rückschlüsse auf die Orientierung der Biomoleküle
auf der Oberfläche ziehen.
Um auszuschließen, dass der Cantilever bei der „Oberflächenrasur“ nicht nur das
biologische Material und den SAM, sondern womöglich auch noch ein Teil des Goldes
von der Oberfläche kratzt, werden die gemessenen Höhenprofile mit Oberflächen
verglichen, die über Mikrokontaktstempeln strukturiert wurden. Die Stempelflächen
werden mit proteinresistentem OEG(6)-Thiol aufgefüllt, um eine definierte Höhe null
festzulegen. Danach füllt man die Stege nacheinander mit Biotinthiol, Streptavidin und
biotinyliertem hGBP1. Auch die Dimerisierung mit einem weiteren Molekül hGBP1 wird
über die Messung des Höhenprofils nachgewiesen. Durch den Vergleich mit dem
Mikrokontaktstempeln soll das Nanoshaving als potenzielle alternative Methode zur
lateralen Strukturierung von Oberflächen und Ermittlung von Höhenprofilen in dieser
Arbeit etabliert werden.
3.2.2.3 Mikrokontaktstempeln
Das Mikrokontaktstempeln ermöglicht die Herstellung lateral strukturierter Oberflächen
durch die Aufbringung bestimmter Moleküle mittels eines Polymerstempels, der in unse-
rem Fall aus Polydimethylsiloxan (PDMS (Dow corning; Sylgard 184)) besteht. Da sich
Alkanthiole auf Goldsubstraten spontan zu selbstordnenden Monolagen formen, bilden
sie, wenn der mit dem gewünschten Thiol beladene Stempel sanft auf das Gold gedrückt
wird, ausschließlich im Bereich der Stempelfläche eine einzelne Molekülschicht aus.
Hinzu kommt, dass das PDMS nicht mit den aufzustempelnden Substanzen reagiert und
aufgrund seiner hohen Elastizität eventuelle Rauhigkeiten auf dem Goldsubstrat auszu-
gleichen vermag. Die Thiolmoleküle können in das PDMS hineindiffundieren und errei-
chen nach Trocknung des Stempels auch umgekehrt über denselben Vorgang die Gold-
oberfläche. Um eine Strukturierung der Goldsubstrate mit hoher Qualität zu erreichen, ist
höchste Sorgfalt bei der Herstellung des Stempels geboten. Durch Abgießen von mikro-
strukturierten „Masterobjekten“ können PDMS-Stempel mit hoher Präzision hergestellt
werden. Eine mit einem gängigen Zeichenprogramm erstellte Vorlage (Maske) wird
hierzu auf Chrom (Strukuren < 20 µm) oder eine Polymerfolie (> 20 µm) übertragen.
Durch diese Maske wird ein Siliziumwafer, der zuvor mittels Spin-Coating mit einem
Photolack beschichtet wurde, mit UV-Licht bestrahlt. Nach Entwicklung des Wafers
Kapitel 3 Material und Methoden
56
bleibt, abhängig vom Photolack, der bestrahlte oder nicht bestrahlte Bereich des Wafers
als Struktur zurück. Nun erfolgt das bereits erwähnte Übergießen des Masters mit dem
PDMS. Nach Aushärtung des PDMS wird die Masterschablone nach Silanisierung zur
besseren und zerstörungsfreien Abtrennung vom fertigen Stempel abgelöst
Abbildung 3-9: Mikrokontaktstempeln eines Thiols auf einem Goldsubstrat. Zunächst wird
der PDMS-Stempel mit dem gewünschten Thiol beladen und dann auf den mit Gold beschichteten
Silizium- oder Glaswafer sanft aufgedrückt. Nach Entfernung des Stempels bleibt das Thiol in
den Stempelbereichen zurück und die Goldoberfläche zeigt eine laterale Strukturierung.
.Der fertig strukturierte Stempel wird nun für einige Minuten in die gewünschte
Thiollösung eingelegt oder mit ihr benetzt und nach Trocknung mittels Stickstoff auf
einen mit Gold beschichteten Siliziumwafer gesetzt. Die Ausbildung der Struktur erfolgt
meist schon nach 1 bis 2 Minuten und kann nach Wegätzen des restlichen Goldes mit
einem einfachen Lichtmikroskop überprüft werden. Ansonsten werden die nach dem
Stempelvorgang frei gebliebenen Bereiche der Oberfläche (Stege) mit anderen
gewünschten Thiolen und weiteren (Bio-)Molekülen aufgefüllt.
Als besondere Vorteile dieser Methode seien an dieser Stelle die hohe Langlebigkeit,
schnelle Reinigung durch kurze Behandlung im Ultraschallbad und leichte Verformbar-
Kapitel 3 Material und Methoden
57
keit der Stempel genannt, die auch die Strukturierung von unebenen und gewölbten Ober-
flächen erlaubt. Auch die Tatsache, dass die Herstellung der Stempel und das Stempeln
selbst nicht sehr kostenintensiv sind, hat zu einer Etablierung dieser Technik in der In-
dustrie geführt.
3.2.2.4 Experimenteller Teil
3.2.2.4.1 Metallisierung der Substrate für die AFM-Messungen
Für die Bedampfung wurden polierte Siliziumwafer mit einer [100]-Oberflächenterminie-
rung (Prolog Semicor LTD, Ukraine) verwendet und nach der Vorschrift zur Herstellung
der SPR-Goldwafer bedampft (Abschnitt 3.2.1.1). Vor der Bedampfung erfolgten einige
Waschvorgänge mit Aceton (Fluka) und Ethanol (Riedel de Haën). Die Aufdampfung von
ca. 80 Å Titan erfolgte bei einer Rate von bis zu 2 Ås-1
, gefolgt von 1200 Å Gold
(15 Ås-1
). Die Siliziumwafer wurden für die AFM-Messungen zu quadratischen
Bruchstücken von ca. 10 x 10 mm zurechtgeschnitten. Anschließend erfolgte die laterale
Strukturierung mittels Mikrokontaktstempeln oder über Nanoshaving.
3.2.2.4.2 Herstellung lateral strukturierter Oberflächen
1. Mikrokontaktstempeln
Die Herstellung des PDMS-Stempel wurde bereits beschrieben (Abschnitt 3.2.2.3). Für
die Messung von Schichtdicken verschiedener Proteinlagen sollte ein strukturierter Sili-
ziumwafer hergestellt werden, der aus 3 µm x 3 µm- Quadraten besteht. Die Abstände
zwischen den einzelnen Quadraten betrugen ebenfalls 3 µm (Stege). Für das Stempeln
wurde die Stempelfläche für ca. 1 Minute mit einer ethanolischen Lösung von 1 mM
OEG(6)-Thiol inkubiert. Danach wurde der Überstand der Lösung vorsichtig mit einem
fußelfreien Tuch entfernt und der Stempel im Stickstoffstrom getrocknet. Die struktu-
rierte und mit dem Thiol beladene Seite des Stempels wurde vorsichtig auf die Goldober-
fläche gedrückt. Nach ca. 90 s wurde der Stempel wieder entfernt. Die Goldoberfläche
wurde nach gründlichem Waschen mit absolutem Ethanol und Trocknen im Stickstoff-
strom mit einer 1mM ethanolischen Lösung von 10 % Biotinthiol und 90 % Merkapto-
undekanol inkubiert. Nach ca. 5 min wurde wiederum mit Ethanol gewaschen und darauf
geachtet, dass der Wafer nun vollständig trocken war. Dann folgten weitere Inkubations-
Kapitel 3 Material und Methoden
58
schritte mit 0,4 µM Streptavidin und 1 µM biotinyliertes hGBP1 sowie 5 µM hGBP1
ohne Biotinanker mit 50 µM GppNHp. Die Inkubation erfolgte bei jedem Schritt über 20
min. Zwischen den Behandlungen mit den jeweiligen Proteinlösungen wurde die Oberflä-
che zwei bis drei Mal mit dem Puffer C* (50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, pH 7,9), in
dem sich auch die Proteine befanden, gewaschen. Es war zu beachten, dass die
Oberfläche nicht trocken werden durfte, um eine Denaturierung der Proteine zu
vermeiden. Die Lagerung der Wafer erfolgte in einer mit Puffer C* und 5 µM hGBP1
ohne Anker und 50 µM GppNHp befüllten Petrischale. Das Protein und GppNHp wurden
deswegen in den Puffer gegeben, damit im Falle von möglicher Dissoziation der schwach
gebundenen hGBP1 wt-Moleküle an die immobilisierten hGBP1 Mutanten ständig
hGBP1 nachgeliefert und wieder neu binden kann.
2. Nanoshaving
Auch mittels Nanoshaving wurden Proteinmultilagen hinsichtlich ihrer Schichtdicken
untersucht und die erzielten Ergebnisse mit den über Mikrokontakstempeln ermittelten
Werten verglichen. Ein mit Gold beschichteter Siliziumwafer wurde nacheinander mit
dem im vorherigen Abschnitt bereits beschriebenen Misch-SAM, bestehend aus 10 %
Biotinthiol und 90 % Merkaptoundekanol, für ca. 5 Minuten inkubiert. Nach gründlichem
Waschen und Trocknen des Wafers im Stickstoffstrom wurde dieser nacheinander mit
Streptavidin (0,4 µM) und zwei biotinyliertem hGBP1-Mutanten (jeweils 1 µM) behan-
delt. Die Proteine wurden jeweils für ca. 20 Minuten auf der Oberfläche belassen und
dann 2- bis 3-mal mit Puffer (siehe Abschnitt 3.2.1.2) gewaschen. Die Strukturierung der
Goldoberfläche wurde erst nach Einbau des Wafers in das Rasterkraftmikroskop mit Hilfe
des Cantilevers durchgeführt. Die so genannte Drive Amplitude, also die Spannung des
Piezoelements und folglich die Kraft, mit der der Cantilever auf die Oberfläche drückt,
wurde auf ca. 150 mV gesetzt, was einer Erhöhung um das 3 bis 4fache der für die Auf-
nahme der Oberflächentopographie normalerweise eingesetzten Spannung entspricht
(Messparameter für die AFM-Aufnahmen siehe Tabelle 1). Auf diese Weise konnte ein
quadratisches Loch mit definierter Seitenlänge, die über die Software NanoScope
einstellbar war, in die Oberfläche gekratzt und abschließend die Höhendifferenz zwischen
ausgekratztem Bereich und dem Rest der abgerasterten Fläche (15 x 15 µm) ermittelt
werden. Die Auswertung der Oberflächentopographie erfolgte ebenfalls über NanoScope
sowie über die Software SPIP.
Kapitel 3 Material und Methoden
59
3. AFM-Messungen
Für alle Messungen mit Proteinen wurde der Tapping-Modus verwendet, um eine extreme
Verformung oder gar Zerstörung der auf dem Biotinthiol-SAM aufgebrachten Proteine,
also Streptavidin und hGBP1, zu vermeiden. Des Weiteren mussten die Proteinschichten
in Flüssigkeit (Abschnitt 3.1.3) abgerastert werden, um die native Struktur der Proteine
und damit ihre Aktivität aufrechtzuerhalten. Entweder wurde ein Tropfen des Puffers
direkt auf den Goldwafer gegeben, um somit eine vollständige Benetzung der Oberfläche
zu erreichen, oder eine Flüssigkeitszelle mit angebrachten Teflonschläuchen zur Bespü-
lung und zur Entfernung des Puffers wurde auf die Apparatur gesetzt. Bei allen Messun-
gen kam der Tapping-Cantilever vom Typ NP-20 zum Einsatz.
Die Auswahl des gewünschten Ortes auf der Oberfläche für das Scanning erfolgte durch
mechanische Positionierung der Probe relativ zur Spitze in zwei orthogonalen Richtun-
gen. Da die Spitze des Cantilevers selbst nicht zu sehen war, wurde die Oberseite des
Cantilevers zur Orientierung verwendet. Danach konnte der Laserstrahl justiert werden,
so dass er vollständig vom freien Ende des Cantilevers reflektiert wurde. Die Schwin-
gungsamplitude sollte maximal sein, um die größtmögliche Sensitivität zu erreichen. Der
reflektierte Laserstrahl sollte genau im Zentrum des Photodetektors auftreffen, so dass bei
der Abwesenheit einer Biegung des Cantilevers das Regelungssignal am Gerät genau null
ist. Über die Software Nanoscope konnten nun die Parameter für die Aufnahme der Bilder
festgelegt werden. Zunächst wurde mit Scan Range die Länge der Seite eines quadrati-
schen Rasters und somit die Größe des abgebildeten Bereichs der Probe festgelegt. Über
Scan angle konnte der Winkel, mit dem der Cantilever über die Oberfläche rastert,
bestimmt werden. Die Geschwindigkeit, mit der sich die Spitze über die Oberfläche be-
wegt, wurde über die Scan rate eingestellt. Die Geschwindigkeit sollte so klein sein, dass
das Regelungssystem der Topographie folgen kann, aber auch groß genug, um in realisti-
scher Zeit das gewünschte Bild zu erhalten. Der Wert des Z-Limit bestimmte effektiv die
Auflösung bzw. den Kontrast des Bildes, denn dort wurde festgelegt, wie hoch der Can-
tilever schwingen konnte. Über die Drive Amplitude wurde die Spannung des
Piezoelements und somit die Kraft, die auf die Oberfläche ausgeübt wird, gewählt. Die
beiden Parameter Proportional gain und Integral gain gaben die Sensitivität an, mit der
Höhen und Tiefen der Probe erkannt werden können. Über die Drive Frequency konnte
die Schwingungsfrequenz des Cantilevers festgelegt werden. Waren alle Werte überprüft
worden, erfolgte die automatische Spitzenannäherung. Während die Probe gescannt
Kapitel 3 Material und Methoden
60
wurde, mussten die Parameter des Regelungssystems immer wieder korrigiert werden, um
die Qualität des Bildes und die laterale Auflösung zu optimieren.
Tabelle 1: Parameter für rasterkraftmikroskopische Aufnahmen
Scan range 15 bis 20 µm, für Nanoshaving 3 bis 5 µm
Scan angle 0, 45 oder 90 °
Scan rate Überblickscan: 1,5 s-1
; Feinscan: <1 s-1
Z-limit 3 µm
Drive amplitude ca. 50 mV/ Nanoshaving: 150 mV
Proportional gain 3
Integral gain 0,5
Drive frequency 9,5 kHz
3.2.3 Infrarotspektroskopie/-mikroskopie
Die Grundlage der Infrarotspektroskopie basiert auf der Wechselwirkung der zu untersu-
chenden Probe mit dem eingestrahlten Licht. Durch Absorption werden in den Probemo-
lekülen Schwingungen angeregt und es erfolgt ein Übergang in einen angeregten Zustand.
Da eine direkte Proportionalität zwischen der Wechselwirkung elektromagnetischer
Strahlung und dem Dipolmoment des Moleküls besteht, wird Absorption und Emission
nur dann beobachtet, wenn sich das Dipolmoment ändert. Dabei entscheidet der atomare
Aufbau des Probenmoleküls darüber, welche charakteristischen Schwingungsbanden im
Strahlungspektrum entstehen. Aus diesem Grund ist die Infrarotspektroskopie die Me-
thode der Wahl, wenn es um eine einfache und schnelle Strukturaufklärung von organi-
schen Molekülen, einschließlich Peptiden und Proteinen, geht. Wie viele Schwingungen
die zu untersuchenden Molekülen ausführen kann, hängt von der Anzahl der Freiheits-
grade ab, die wiederum für lineare (3N-5) und gewinkelte Moleküle (3N-6) unterschied-
lich definiert sind. Man unterscheidet grundsätzlich zwischen so genannten Deformati-
ons- und Biegeschwingungen, bei denen die Veränderung des Dipolmomentes durch eine
Modifizierung der Bindungswinkel zustande kommt, und Streckschwingungen, die sich
aus der Veränderung der Bindungslängen ergeben. Außerdem hat die chemische Umge-
bung der Moleküle oder einzelner Bindungen einen großen Einfluss auf die
Schwingungsfrequenz. Die Kopplung mit anderen Molekülschwingungen, die reduzierten
Kapitel 3 Material und Methoden
61
Massen der beteiligten Atome, die Bindung zu Nachbaratomen und die Art der Bindung
(Kraftkonstante) sind entscheidende Faktoren, die in sehr sensitiver, aber auch selektiver
Art und Weise Einfluss auf die Verschiebung der Absorptionsbanden im Spektrum
nehmen.
Da in dieser Arbeit die Vibrationsspektren von selbst-assemblierenden Monolagen, Pep-
tidthiolen, an Goldoberflächen betrachtet werden sollen, muss neben den genannten Kri-
terien die Oberflächenauswahlregel beachtet werden. In der Nähe elektrisch leitender
Oberflächen, also auch Gold, können aufgrund der Tatsache, dass Feldkomponenten des
anregenden elektrischen Feldes, die parallel zur Oberfläche verlaufen, unterdrückt wer-
den, bestimmte Absorptionsbanden im Spektrum fehlen. Das einfallende p-polarisierte
Infrarotlicht lässt sich zur Erläuterung der Auswahlregel in einen tangentialen und nor-
malen Anteil aufspalten. Die parallel zur Oberfläche gerichtete Komponente verursacht
eine Verschiebung der im Gold frei beweglichen Elektronen parallel zur Oberfläche.
Durch die daraus resultierende Anhäufung von Elektronen und positiv geladenen Atom-
rümpfen entsteht an der Metalloberfläche ein elektrisches Feld, das dem äußeren Feld
entgegengesetzt gerichtet ist. Die Ladungsverschiebung erfolgt solange, bis das durch die
Polarisation erzeugte und äußere Feld gleich stark sind und sich folglich zu null addieren.
Die senkrecht zur Oberfläche gerichtete Feldkomponente, also der Normalteil, erfährt
eine Verstärkung, da das erzeugte Polarisationsfeld dem äußeren Feld gleichgerichtet ist
und sich zu diesem addiert. Vornehmlich werden also an einer leitenden Metalloberfläche
Molekülschwingungen mit einem zur Oberfläche senkrechten Übergangsdipolmonent
angeregt.
3.2.3.1 FT-IR Mikroskopie
In dieser Arbeit kommt neben der Infrarotspektroskopie auch die –mikroskopie zum Ein-
satz. Das dafür verwendete Mikroskop ist das Hyperion 3000/ Vertex 700 der Firma
Bruker. Monolagen auf Substraten, z. B. Gold, mit hohem Brechungsindex lassen sich
sowohl mit einem GIR- (Grazing Incidence Reflectance) als auch einem ATR-
(Attenuated Total Reflection)-Objektiv gut abbilden und analysieren. Zusätzlich wird mit
einem so genannten Streiflichtobjektiv gearbeitet, das den Lichtstrahl unter einem viel
flacheren Winkel als bei der direkten Transmission auf die Probe auftreffen lässt und so-
mit eine Analyse von sehr dünnen Schichten (Monolagen) erlaubt. Auf diese Weise er-
Kapitel 3 Material und Methoden
62
reicht man eine 25-fache Verstärkung gegenüber der Transmission und auch die Emp-
findlichkeit ist deutlich erhöht, da der Lichtstrahl die Probe zweimal passiert (Abbildung
3-10).
Abbildung 3-10: Strahlengang im Streiflichtobjektiv für IR/VIS (Bruker Optics)
Über die Veränderung der Polarisation lässt sich zusätzlich mit dem GIR-Objektiv festzu-
stellen, ob eine monomolekulare Schicht vorliegt, da in diesem Fall nur bei p-polarisier-
tem Licht die Absorptionsbanden zu sehen sind. Beide Objektive, sowohl ATR als auch
GIR, erlauben eine Analyse von Monolagen anhand ihrer Bandenstruktur, wobei die
Ortsauflösung und Empfindlichkeit bei der ATR-Technik deutlich erhöht ist. Bei
Schwingungen senkrecht zur Probenoberfläche kann ein Verstärkungsfaktor von bis zu
100 erreicht werden. Nachteil der ATR-Technik ist, dass nicht kontaktfrei gemessen wer-
den kann, was eine Veränderung oder sogar Zerstörung der Probe nicht gänzlich aus-
schließt. Um den Druck, mit dem die Probe berührt wird, kontrollieren zu können, sind
elektronische Drucksensoren am Objektiv angebracht. Die Messungen mit dem GIR-Ob-
jektiv können hingegen völlig kontaktfrei vonstatten gehen.
3.2.3.2 Infrarotspektroskopie an Proteinen
Neben gängigen Methoden zur Strukturaufklärung wie NMR, Röntgenstrukturanalyse
und Elektronenmikroskopie gewinnt auch die Infrarotspektroskopie bei der Aufklärung
biologischer Reaktionen und der Struktur von Biomolekülen zunehmend an Bedeutung,
da sie Informationen liefert, die mit den anderen Methoden nicht erhalten werden, und ein
Kapitel 3 Material und Methoden
63
Einsatz von Markern oder Sonden wie z. B. in der Fluoreszenz-Mikroskopie/
Spektroskopie vermieden werden kann. Aussagen über Struktur und Umgebung des
Proteinrückgrats sind ebenso möglich wie die Zugänglichkeit zu dynamischen Prozessen,
z.B. die Änderung von Bindungslängen und –geometrien während einer Proteinreaktion,
die Modifizierung chemischer Gruppen (Protonierung) oder Veränderungen der Ladungs-
dichte einer chemischen Bindung. Aufgrund der Vielzahl von möglichen Schwingungen
im Protein ist die Überlappung einzelner Banden im Schwingungsspektrum zu groß, um
die Beiträge einzelner Aminosäuren oder bestimmter Aminosäuregruppen unterscheiden
zu können. Darüber hinaus werden die C=O Moden des Peptids durch eine starke Was-
serbande bei 1650 cm-1
überlagert, die sich schon bei sehr geringen Schichtdicken von
gerade mal 10 µm aufgrund des hohen Wassergehaltes der Proben drastisch auf die
Transmission des eingestrahlten Lichtes (< 10 %) auswirkt. Da die C=O Valenzschwin-
gung der Carbonylpeptidgruppe zu mehr als 80 % zu der für die Sekundärstrukturanalyse
von Peptiden wichtigen Amid I-Bande beiträgt, wird zumeist in deuteriertem Wasser, also
D2O, und nicht H2O gemessen, da hier die C=O Mode nicht mit der Wasserbande
überlappt, was aus einer niederfrequenten Verschiebung um 450 cm-1
resultiert.
Insgesamt sorgt die Messung in deuteriertem Wasser zu einer Veränderung der Massen
der beteiligten Atome und der Schwingungsfrequenz und somit zu einer verschobenen
Lage der Absorptionsbanden, die wiederum abhängig von der Sekundärstruktur ist.
Während β-Schleife und β-Faltblatt bis zu 10 cm-1
zu niedrigeren Wellenzahlen verscho-
ben sind, zeigen alle anderen Strukturelemente nur eine Verschiebung um maximal
5 cm-1
. Die Amid II Bande bei ca. 1540 bis 1615 cm-1
, die zu 40 bis 60% N-H
Biegeschwingung, zu 18 bis 40% C-N Streckschwingung und zu ca. 10% (C-C)-Streck-
schwingung auf sich vereint, erfährt dagegen in D2O ein drastische Verschiebung um
etwa 100 cm-1
zu kleineren Wellenzahlen, da der Anteil an N-H Biegeschwingung völlig
verschwindet und die Lage der Amid II nur noch von der (C-N)-Steckschwingung
abhängt. Somit kann das Entstehen des Amid II Signals als Marker für einen
erfolgreichen H/D-Austausch betrachtet werden und ermöglicht zudem eine Kontrolle
über den erzielten Protonierungsgrad. Neben der Amid I und II Bande können einer
freien, planaren Peptidgruppe sieben weitere Schwingungsmoden zugeordnet werden, die
mit Amid A und B (bei ca. 3300 cm-1
bzw. 3100 cm-1
) und Amid III bis VII (Amid III:
1390 bis 1430 cm-1
; Amid IV; 620-640 cm-1
; Amid V: 530-580 cm-1
; Amid VI: 535-
606 cm-1
; Amid VII: ca. 200 cm-1
) bezeichnet werden. Während die oft sehr intensiven
Amid I und II Banden wichtige Informationen über die Sekundärstruktur eines Proteins
Kapitel 3 Material und Methoden
64
liefern, werden die Amid III bis VII Banden aufgrund ihrer Unempfindlichkeit gegenüber
strukturellen Veränderungen im Protein und ihrer sehr breiten Konturen, die eine
Auflösung in unterschiedliche Anteile zusätzlich erschweren, kaum berücksichtigt.
Abbildung 3-11: Amid I-Moden verschiedener Sekundärstrukturelemente (E. Goormaghtigh
et. al. (1994))
Die sehr starke Korrelation zwischen der Amid I Bande und der Struktur der zu
vermessenden Biomoleküle kommt dadurch zustande, dass zwischen den C=O
Schwingungen starke Veränderungen der Dipolwechselwirkungen entstehen, wenn die
Lage und Intensität der Bindungswinkel Φ und Θ und somit die exakte Geometrie des
Proteins modifiziert werden. Über Fourier-Selbstdekonvolution lässt sich die Amid I-
Bande in ihre überlappenden Bestandteile aufspalten, was eine anteilmäßige Bestimmung
der in dem zu untersuchenden Protein enthaltenen Sekundärstrukturelemente erlaubt.
3.2.3.3 Experimenteller Teil
3.2.3.3.1 Attenuated total reflection (ATR)-FT-IR-Messungen
Das für die ATR-FT-IR-Messungen verwendete Spektrometer stammte von der Firma
Bruker (Bruker Optics, Ettlingen) und hat die Typenbezeichnung IFS66. Eine vertikale
ATR-Multireflektionseinheit war dem Spektrometer angeschlossen. Das Internal
Reflection Element war ein trapezförmiger Germaniumkristall mit den Maßen 52 x 20 x 2
mm und einem Öffnungswinkel von 45 °, der zu 25 internen Reflexionen führt. Die Be-
dampfung des Germaniumkristalls erfolgte mit dem Metallbedampfer der Firma Leybold
Inficon (XTC/2). Die Durchführung wurde bereits im Abschnitt beschrieben. Die Dicke
der Titanschicht betrug 80 Å, die der Goldschicht 150 Å. Vor der Bedampfung wurde die
Kapitel 3 Material und Methoden
65
Kristalloberfläche mit einer Mischung von Methanol und Chloroform chemisch gereinigt
und dann gründlich abgespült. Es folgte ein kurzes Eintauchen des Kristalls in Schwefel-
säure, um den hydrophilen Charakter der Oberfläche zu erhalten. Danach wurde mit des-
tilliertem Wasser gespült und die Germaniumplatte im Stickstoffstrom getrocknet.
Für die Messungen wurden 150 µl einer 10 mM Peptidthiollösung (Puffer: 10 mM Tris-
DCl, pH 7,4; Einstellen des pH-Wertes mit DCl (2M) hergestellt und ca. 200 ml Laufpuf-
fer (gleiche Zusammensetzung) bereitgestellt. Nachdem der Kristall in die Apparatur ein-
gesetzt und mit dem Laufpuffer gespült worden war, konnte das Peptidthiol mit einer
Flussrate von 5 µl/min über die Oberfläche geleitet werden. Als Referenz wurde das Sig-
nal des reinen Germaniumkristalls mit Goldschicht verwendet. Über die Software OPUS
war es möglich, sowohl das IR-Spektrum auch während der laufenden Adsorption des
Peptidthiols zu betrachten als auch die Adsorptionskinetik zu verfolgen. Um sämtliche
unter der Amid I-Bande befindlichen Peaks zu identifizieren, wurden die 2. Ableitungen
der Spektren gebildet. Außerdem wurde über die von Goormaghtigh (1994) und Ollesch
(2006) beschriebene Kurvenanpassung eine Aufspaltung der Amid I-Bande in die durch
die Sekundärstrukturelemente hervorgerufenen unterschiedlichen Rückgratabsorptionen
vorgenommen.
3.2.3.3.2 Messungen am IR-Mikroskop
Das hier verwendete IR-Mikroskop (Hyperion 3000/ Vertex 70) wurde von der Firma
Bruker in Ettlingen zur Verfügung gestellt. Das Gerät war wahlweise mit einem 20fachen
ATR-Objektiv und einem 15fachen GIR-Objektiv ausgestattet. Die Messzeiten betrugen
in der Regel eine Minute (auf Abweichungen wird explizit hingewiesen). Die erreichbare
spektrale Auflösung lag bei 4cm-1
bei einem messbaren Spektralbereich von 600 bis
4000 cm-1
. Über einen Quecksilber-Cadmiumtellurid (MCT, Mercury-Cadmium-
Telluride)-Detektor wurde das Licht eingefangen und in ein Absorptionsspektrum über-
setzt. Über die Software OPUS wurde die Steuerung des Mikroskops vorgenommen. Für
die Aufnahmen wurden 10 x 10 mm Goldsiliziumwafer (Präparation siehe Abschnitt
3.2.2.4.1) vorbereitet, die in Peptidthiollösung (1 mM Peptidthiol gelöst in 10 mM Tris-
DCl (pH 7,4), pH Einstellung mit DCl (2M)) über ca. 24 Stunden bei Raumtemperatur
inkubiert worden waren. Parallel dazu wurde ein Wafer in Kalibrierlösung, bestehend aus
einem deuteriertem Thiol (1mM Hexadekanthiol in Ethanol, A. Tefort), inkubiert und als
Kapitel 3 Material und Methoden
66
Referenz eingesetzt. Am Mikroskop wurden verschiedene Messreihen durchgeführt, die
im Folgenden dargestellt sind.
3.2.3.3.3 Überprüfung der Peptidthiol-Monolage
Über den Einsatz des GIR-Objektives konnte die Polarisation des einfallenden Lichtes
verändert werden. Nur bei p-polarisiertem Licht sollte die Peptidthiollage anhand des
Bandenspektrums detektierbar sein, nicht aber bei s-Polarisation. Über diese Unterschei-
dung sollte festgestellt werden, ob es sich wirklich um eine monomolekulare
Peptidthiolschicht auf dem Goldwafer handelt. Hierzu wurde ein Goldwafer aus der
Peptidthiollösung mit einer Teflonpipette genommen, einige Male mit Puffer (10 mM
Tris, pH 7,4) gespült und mittels Stickstoffstrom getrocknet. Nach Fixierung auf dem
Objekttisch wurde der Wafer mit Licht unterschiedlicher Polarisation bestrahlt und zeit-
gleich jeweils ein Spektrum aufgenommen.
3.2.3.3.4 Einfluss von Trifluorethanol (TFE) auf die Sekundärstruktur des Peptidthiols
Der stabilisierende Einfluss von TFE auf insbesondere helikale Strukturen in Proteinen ist
bereits nachgewiesen worden (Sticht et al., 1994; Shiraki et al., 1995; Kentsis /Sosnick,
1998; Luo /Baldwin, 1998; Myers et al., 1998). Aus diesem Grund sollte in diesem Ver-
suchsteil der Einfluss von TFE auf das Peptidthiol ebenfalls untersucht werden. Dafür
waren die Peptidthiollösungen, in denen die Goldwafer über 24 Stunden eingelegt wur-
den, mit TFE angereichert. Die eingesetzten Konzentrationen betrugen 5%, 10%, 30%
und 50 % (alle v/v). Der Puffer (10 mM Tris-DCl in D2O (pH 7,4)) und die eingesetzte
Konzentration an Peptidthiol (1 mM) waren jeweils identisch. Zunächst wurde der Ein-
fluss der unterschiedlichen TFE-Konzentrationen nach Herausnahme der Wafer aus der
jeweiligen Lösung mit einer Teflonpipette und Trocknung im Stickstoffstrom untersucht,
anschließend wurde ein Tropfen Puffer dazugegeben und erneut gemessen. Für alle Mes-
sungen wurde das ATR-Objektiv verwendet.
Kapitel 3 Material und Methoden
67
3.2.3.3.5 Inkubation von Puffer in Abhängigkeit von der Zeit
Ein Goldwafer wurde aus der Peptidthiollösung mit einer Teflonpinzette genommen, ei-
nige Male mit Puffer gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet. Zunächst erfolgte die
Messung des Wafers im trockenen Zustand. Auch verschiedene Stellen auf dem Wafer
wurden untersucht, um die Homogenität der SAM-Schicht zu überprüfen. Anschließend
wurde ein Tropfen deuterierter Puffer auf den Wafer gegeben und in Zeitintervallen von 5
min jeweils ein Spektrum aufgenommen. Die letzte Aufnahme erfolgte bei 30 min. Aus
allen Messungen wurde das zuvor aufgenommene Puffer-Referenzspektrum subtrahiert.
3.2.3.3.6 IR-Messungen des Peptidthiols in Lösung
Vergleichsmessungen des Peptidthiols in Lösung wurden am Confocheck IR–Spektro-
meter der Firma Bruker (Bruker Optics, Ettlingen) durchgeführt. Dieses Spektrometer
ermöglicht direkte Messungen von Proteinen in Lösung, um auf diese Weise Informatio-
nen über Konzentrationen, Konformationsänderungen (bei Temperierung oder pH-Wert
Änderung) und Sekundärstrukturen zu erhalten.
Die für die Inkubation der Goldwafer verwendeten Peptidthiollösungen wurden mit einer
Hamiltonspritze in die Injektionskammer des Spektrometers gegeben (Volumen 10 µl)
und gegen den reinen Puffer als Referenz gemessen. Das Peptidthiol wurde sowohl in
reinem Puffer als auch in Puffer mit 10, 30 und 50 % TFE gemessen. Vor jeder Messung
musste ein neues Referenzspektrum des mit unterschiedlichen Konzentrationen an TFE
angereicherten Puffers aufgenommen werden.
3.2.4 Quartz Crystal Microbalance Dissipation (QCM-D)
QCM-D steht für Quartz Crystal Microbalance Dissipation und beschreibt ein Verfahren,
bei dem aus dem Verhalten eines resonant schwingenden Quarzsensors Rückschlüsse auf
die Eigenschaften mit dem Sensor in Kontakt stehender bzw. daran haftender Medien
gezogen werden können. Aufgrund der sehr hohen Genauigkeit und der Möglichkeit,
diese Methode auch in flüssigen Medien anwenden zu können, wird sie neben der Oberf-
lächenplasmonenspektroskopie zur Untersuchung von funktionellen Oberflächen, Pro-
tein-Protein- oder Protein-Festphasen-Interaktionen vermehrt angewendet. Die in dieser
Arbeit verwendete Quarzkristallmikrowaage der Firma Q-sense (Q-sense E4) ist zudem in
Kapitel 3 Material und Methoden
68
der Lage, nicht nur die Adsorption von starren und sehr dünnen Filmen zu messen, son-
dern auch die viskoelastischen Eigenschaften dünner Filme durch Einbeziehung der so
genannten Dissipation, also dem Energieverlust des Systems, zu berücksichtigen.
Wie bei allen QCM Systemen ist das Grundprinzip immer das gleiche. Die resonante An-
regung des Quarzsensors, meist eine flache Scheibe oder Zylinder, erfolgt über die Anle-
gung einer Wechselspannung, die über zwei an Ober- und Unterseite aufgedampfte Elekt-
roden induziert wird.
Abbildung 3-12: QCM- Quarzsensor. Der Sensor besteht aus einem dünnen Quarzplättchen,
dass zwischen zwei Elektroden gespannt ist (Raimund Sauter, LOT-Oriel Group Europe (Q-
sense)).
Entscheidend ist hierbei, dass die Resonanzfrequenz direkt von der oszillierenden Masse
abhängig ist. Nimmt diese Masse durch Adsorption eines Films zu, verringert sich die
Frequenz. Die Abhängigkeit zwischen Masse- und Frequenzänderung ist durch die so
genannte Sauerbrey-Gleichung gegeben:
C fm
n
(4)
n = Obertonzahl (1,3,5,…,13); Δf = Resonanzfrequenzänderung; Δm = Massenänderung;
C = massensensitive Konstante (17,7 ng Hz-1
cm-2
für 5 MHz Quarzkristall)
Für Proteinfilme muss zumeist eine deutlich höhere Elastizität des aufgetragenen Films
angenommen werden. Dies hat einen dämpfenden Effekt auf die Schwingung, da solche
elastischen Filme der Oszillation nicht exakt folgen können. Über den Grad der Dämp-
fung lässt sich die adsorbierte „nasse“ Masse (ko-adsorbierte Wassermoleküle) und In-
formationen über viskoelastische Eigenschaften des zu untersuchenden Systems ableiten.
Ist die Dichte des verwendeten Lösungsmittels und der Probe bekannt, kann zusätzlich
die Schichtdicke des adsorbierten Films über die Beziehung
m h (5)
Kapitel 3 Material und Methoden
69
und der Sauerbrey-Gleichung oder über das viskoelastische Modell nach Kelvin-Voigt
berechnet werden. In dieser Arbeit wird diese Methode zur Bestimmung der Schichtdicke
eines Protein-Multikomponentensystems herangezogen und mit Ergebnissen, die mit dem
Rasterkraftmikroskop (AFM) erhalten wurden, verglichen.
3.2.5 Experimenteller Teil
3.2.5.1 QCM-Messungen zur Untersuchung verschiedener hGBP1-Mutanten und
ihres Dimerisierungsverhaltens
Zunächst wurde die Goldschicht auf dem Quarzsensor mit Biotinthiollösung (10 % Bio-
tinthiol und 90 % Merkaptoundekanol in absolutem Ethanol) über ca. 2 Stunden inku-
biert, indem ein Tropfen der Lösung auf die Oberfläche gegeben wurde. Nach Verduns-
tung des Lösungsmittels wurde wiederum ein Tropfen nachgegeben. Die etwas umständ-
liche Vorgehensweise musste deshalb angewandt werden, da die Elektroden nicht mit
dem Thiol belegt werden durften. Somit war ein Eintauchen des Quarzplättchens in
Thiollösung nicht möglich. Die Inkubation mit Streptavidin (0,4 µM), den hGBP1 Mu-
tanten (1 µM) und hGBP1 ohne Anker (10 µM) in Anwesenheit von GppNHp (50 µM)
erfolgte in ähnlicher Weise, wie bereits im Abschnitt 3.2.1.3 beschrieben. Der verwendete
Laufpuffer als auch der zur Verdünnung der Proteinstammlösungen verwandte Puffer war
50 mM Tris-HCl (pH 7,9) und 5 mM MgCl2.
Da im Gegensatz zu den SPR-Messungen die Schläuche des QCM-Fließystems einen
größeren Durchmesser haben, wurde die Flussrate auf 15 µl/ min festgelegt, um ähnliche
Bedingungen zu schaffen wie bei den SPR-Messungen. Die Auswertung der
Frequenzspektren erfolgte über die Q-Sense Software. Aus der Frequenzerniedrigung und
Dissipation konnte unter Einbeziehung der Dichte (für Proteinlösungen ca. 1,3 kg/ m3) die
Schichtdicke der einzelnen Proteinschichten nach Sauerbrey und/oder Voigt berechnet
werden (Voinova, 1999; Zhang et al., 2009).
3.2.6 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie
Neben der bereits beschriebenen Rasterkraftmikroskopie stellt die Fluoreszenzmikrosko-
pie eine weitere Methode zur Darstellung von Oberflächen und kleiner Objekte dar. An
die zu untersuchenden Objekte, z. B. Proteine, werden hierfür spezielle Fluoreszenzmar-
Kapitel 3 Material und Methoden
70
ker angeheftet, die dann mit der passenden Wellenlänge des eingestrahlten, monochro-
matischen Lichtes zum Leuchten angeregt werden. Ein spektral getrennter Farbkanal er-
laubt die Detektion der vom angeregten Farbstoff ausgehenden Lichtemission. Anre-
gungs- und Emissionswellenlängen sowie die Wahl der Filter und Verstärkungsfaktoren
müssen auf den ausgewählten Farbstoff abgestimmt sein. Nachteil dieser Methode im
Gegensatz zur Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) und Rasterkraftmik-
roskopie (AFM) ist die Notwendigkeit, Markermoleküle einzusetzen, die chemisch an das
zu untersuchende Objekt angebunden werden müssen. Insbesondere bei der Untersuchung
von Protein-Protein oder auch Protein-Festphasen-Interaktionen muss deswegen darauf
geachtet, dass die für den Farbstoff gewählte Bindungsstelle so gewählt wird, dass die
gewünschten Wechselwirkungen, die es zu untersuchen gilt, nicht gestört oder gar ver-
hindert werden. Der entscheidende Vorteil der Fluoreszenzmikroskopie besteht darin,
dass aufgrund der spektralen Trennung zwischen Anregung und Emission ein hohes Sig-
nal-Rausch-Verhältnis erzielt wird und somit kleinste Substanzmengen des Farbstoffes
nachgewiesen werden können. Bei ausreichender Auflösung ist sogar die Unterscheidung
einzelner Moleküle möglich. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, die
gebundene Menge des Farbstoffes quantifizieren zu können. Zwischen der Intensität der
emittierten Strahlung und der Anzahl an Farbstoffmolekülen besteht ein proportionales
Verhältnis, das jedoch an Metalloberflächen aufgrund von möglichen Quenching-Effek-
ten nur bedingt gilt.
Bei der Auswahl des Farbstoffes sollte insbesondere eine hohe Fluoreszenzintensität der
entscheidende Faktor sein. Um diese zu erzielen, bedarf es einer möglichst hohen Inten-
sität des eingestrahlten Lichtes und einer günstigen Fluoreszenzausbeute, d. h. es sollte
möglichst viel Strahlung von Versuchsobjekt zurück emittiert werden.
0 (2,303 )FI I c d (6)
IF = Fluoreszenzintensität; I0 = Intensität des eingestrahlten Lichtes; = Fluoreszenzausbeute
(emittierte Photonen/absorbierte Photonen); ε = molarer Extinktionskoeffizient; c = Konzentration
des Fluoreszenzfarbstoffes; d = Schichtdicke der Küvette
Für die Fluoreszenzmessungen wurde der Farbstoff Fluoreszein 5-maleimid verwendet,
der in der Lage ist, spezifisch an die Aminosäure Cystein zu binden. Bei Fluorezcein han-
delt es sich um einen Standardfarbstoff, für den die Lasersysteme der (meisten) Fluores-
zenzmikroskope die entsprechende Anregungswelle erzeugen können. Anregungs- und
Kapitel 3 Material und Methoden
71
Emissionswellenlänge liegen darüber hinaus weit genug auseinander, so dass die anre-
gende Lichtstrahlung den Detektor nicht stört. Durch den Maleimid-Anker ist außerdem
eine gezielte Anbindung an das zu untersuchende Protein, nämlich hGBP1, möglich, wo-
durch erreicht werden kann, dass der Dimerisierungsprozess, der unter dem Fluoreszenz-
mikroskop nachgewiesen werden sollte, nicht gestört wird.
3.2.6.1 Experimenteller Teil
3.2.6.1.1 Herstellung fluoreszeinmarkierter Proteine
Die Herstellung fluoreszeinmarkierter Proteine erfolgte über Fluoreszenzfarbstoffe, die an
Maleinimid über einen Anker gekoppelt waren und somit an Cysteine unter Bildung eines
Thioethers selektiv binden konnten. Der Fluoreszenzmarker wurde von der Firma
MoBiTec GmbH (Göttingen) zur Verfügung gestellt. Das Fluoreszein wurde in einem 2-
fachen Überschuss gegenüber dem Protein eingesetzt. Die Kopplungsreaktion erfolgte in
Phosphatpuffer (K2HPO4/ KH2PO4 (pH 7) über Nacht auf Eis (4 °C)). Am nächsten Tag
wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 mM Dithiothreitol (DTT) gestoppt und das
überschüssige Fluoreszein über eine NAP5-Säule (GE, Healthcare, München) abgetrennt,
so dass das Protein in großer Reinheit vorlag. Abschließend erfolgte, je nach weiterer
Verwendung des Proteins, eine Umpufferung in Puffer C* (50 mM Tris-HCl (pH 7,9) und
5 mM MgCl2) und eine Aufkonzentrierung des Proteins. Die Markierungseffizienz wurde
über die Ermittlung der Absorption des Fluoreszeins (λmax = 492 nm; ε = 83000 M-1
cm-1
)
in Relation zur Proteinkonzentration (λmax = 280 nm; ε = 44800 M-1
cm-1
) ermittelt.
3.2.6.1.2 Messungen mit dem Fluoreszenzmikroskop
Für die Messungen stand das konfokale Mikroskop Leica TCS SP2 AOBS zur Verfü-
gung. Die Anregungswellenlänge des Fluoreszeins betrug 492 nm. Für die Bilder wurde
eine 40fache Vergrößerung verwendet. Die Lichtintensität lag bei 813 mV. Wie im Ab-
schnitt 3.2.2.4.2 für die AFM-Substrate beschrieben, wurden für die Messungen lateral
strukturierte Proteinproben hergestellt. Auf die Goldwafer wurde ein Standarddeckgläs-
chen gesetzt und mit Hilfe von Nagellack auf dem Wafer befestigt, damit dieser auf dem
Objektträger fixiert ist. Anschließend erfolgte der Einbau in das Mikroskop. Für eine
möglichst kontaktfreie Mikroskopie des Präparates wurde ein Puffertropfen
Kapitel 3 Material und Methoden
72
(Puffer C*)auf die Probe gesetzt und ein hochauflösendes Wasserimmersionsobjektiv in
die unmittelbare Nähe der Probe gebracht. Zur Detektion der Fluoreszenzstrahlung diente
ein Photomultiplier mit drei verschiedenen Farbkanälen. Hier wurde ausschließlich der
grüne Farbkanal verwendet.
Für die Fokussierung wurde das Objektiv zunächst ganz nach unten gefahren und das
Objektiv mit ca. 50 µl Immersionsflüssigkeit, also Puffer, benetzt. Anschließend wurde
die Probe eingebaut und mit einem Gegengewicht in z-Richtung fixiert. Die Halterung
wurde anschließend direkt über dem Objektiv positioniert. Durch Betätigung des Grob-
triebes konnte nun das Objektiv an das Präparat angenähert werden. Die Annäherung
wird zunächst gestoppt, wenn der Puffertropfen auf dem Objektiv sich mit dem Präparat
verbindet. Die Laserintensität wurde im nächsten Schritt auf 100 % gesetzt und weiter
vorsichtig angenähert, um jeglichen Kontakt mit der Probe zu vermeiden. Gleichzeitig
konnte während des Annäherns die Zunahme des Fluoreszenzsignals beobachtet werden.
Irgendwann war dann die laterale Strukturierung der Probe zu erkennen.
3.3 Materialien für die molekularbiologischen und biophysikalischen
Methoden
3.3.1 Chemikalien
In dieser Arbeit wurden Chemikalien der Firmen Applichem GmbH (Darmstadt), Boeh-
ringer Ingelheim GmbH (Ingelheim), Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe); Enzo Life
Sciences GmbH (Lörrach), Fermentas GmbH (St. Leon-Rot), GE Health Care GmbH
(München), Mallinckrodt Baker (Griesheim), Merck KGaA (Darmstadt), Qiagen GmbH
(Hilden), Sigma-Aldrich Chemie GmbH (München) und Serva GmbH (Heidelberg) bezo-
gen, die allesamt in höchster Reinheit vorlagen.
3.3.2 Verbrauchsmaterialien
Entsalzungssäulchen Zeba Spin Thermo Fisher Scientific GmbH,
Bonn
Konzentratoren Vivaspin 20 und 500 Sartorius Stedim Biotech GmbH,
Göttingen
Membranfilter ME24 0,2 μm Whatman GmbH, Dassel
Kapitel 3 Material und Methoden
73
Spritzenfilter Filtropur S 0,2 und 0,4 μm Sarstedt AG & Co, Nümbrecht
3.3.3 Reagenzienkits
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen GmbH, Hilden
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen GmbH, Hilden
3.3.4 Enzyme und Marker
BamHI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
DpnI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
KOD Hot Start-DNA-Polymerase Merck KG, Darmstadt
MassRuler DNA-Ladder High-Range Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
MassRuler DNA-Ladder Low-Range Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
Page Ruler Protein Ladder Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
Protein Molecular Weight Marker Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
Trypsin Serva GmbH, Heidelberg
T4 DNA-Ligase Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
3.3.5 Säulenmaterialien
HisPur Cobalt Resin Thermo Fisher Scientific GmbH,
Bonn
Nickel-NTA-Agarose Superflow Qiagen GmbH, Hilden
Superdex 75 GE HealthCare GmbH, München
Superdex 200 GE HealthCare GmbH, München
3.3.6 Antibiotika
Ampicillin Applichem GmbH, Darmstadt
Chloramphenicol Applichem GmbH, Darmstadt
Kapitel 3 Material und Methoden
74
Verwendete Konzentrationen in den Medien: 100 mg/l Ampicilin; 50 mg/l Ampicilin und
12,5 mg/l Chloramphenicol.
3.3.7 Mikroorganismen
TG1 supE, hsdD5, thi, D (lac-proAB), F‘[traD36, proAB+, lacIq,
lacZDM15] (Gibson, 1984)
XL1-Blue recA1, end A1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, lac,
[F‘, proAB, lacIqZDM15, Tn10 (Tetr)], (Bullock und
Fernandez, 1987)
BL21 (DE3) B, F-, hsdS (rB-, mB-), gal, dcm, ompT, l(DE3)
(Studier /Moffatt, 1986)
3.3.8 Nährmedien
Alle Medien wurden vor der Benutzung 20 Minuten bei 121°C autoklaviert.
LB-Medium
10 g/l Bacto Trypton
5 g/l Hefeextrakt
10 g/l NaCl
pH 7,4 mit NaOH
LB-Agar-Medium
10 g/l Bacto Trypton
5 g/l Hefeextrakt
10 g/l NaCl
12 g/l Agar
TB-Medium
12 g/l Bacto Trypton
24 g/l Hefeextrakt
12, 54 g/l K2HPO4
Kapitel 3 Material und Methoden
75
2, 31 g/l KH2PO4
4 ml/l Glycerin
3.3.9 Vektoren
In dieser Arbeit wurden die Vektoren pQE80I und pQE9 (Qiagen, Hilden) verwendet. Die
Vektoren kodieren für einen 6fachen His-tag, eine Ampicilinresistenz und ein T5-Pro-
motor/Lactose Operon Element, das die Möglichkeit bietet, die Genexpression durch
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zu induzieren.
3.3.10 Mutationsprimer
hGBP1 C12A sense
5’- CAT GAC AGG CCC AAT GGC GCT CAT TGA GAA CAC- 3’
hGBP1 C12A antisense
5’- GTG TTC TCA ATG AGC GCC ATT GGG CCT GTC ATG- 3’
hGBP1 C82A sense
5’- GGA ATC TGG ATG TGG GCG GTG CCC CAC CCC AAG- 3’
hGBP1 C82A antisense
5’- CTT GGG GTG GGG CAC CGC CCA CAT CCA GAT TCC- 3’
hGBP1 C225S sense
5’- AAC CTG CCC AGA CTC TCG ATC CGG AAA TTC TTC- 3’
hGBP1 C225S antisense
5’- GAA GAA TTT CCG GAT CGA GAG TCT GGG CAG GTT- 3’
hGBP1 C235A sense
5’- CTT CCC AAA GAA AAA AGC GTT TGT CTT TGA TCG GCC C- 3’
hGBP1 C235A antisense
5’- GGG CCG ATC AAA GAC AAA CGC TTT TTT CTT TGG GAA G- 3’
hGBP1 C270A sense
5’- CAA CAA GTA GCA GAC TTC GCG TCC TAC ATC TTT AG- 3’
hGBP1 C270A antisense
5’- CTA AAG ATG TAG GAC GCG AAG TCT GCT ACT TGT TG- 3’
hGBP1 C311S sense
5’- GTG GGG ATC TGC CGT CGA TGG AGA ACG CAG TC- 3’
hGBP1 C311S antisense
Kapitel 3 Material und Methoden
76
5’- GAC TGC GTT CTC CAT CGA CGG CAG ATC CCC AC- 3’
hGBP1 C396A sense
5’- GCG GGA TGA CTT TGC GAA ACA GAA TCA GGA AGC- 3’
hGBP1 C396A antisense
5’- GCT CAA GCT CAG CTA ATT AAG CTT GGC TGC AGG- 3’
hGBP1 C407S sense
5’- GCA TCA TCA GAT CGT TCC TCA GGT TTA CTT CAG GTC- 3’
hGBP1 C407S antisense
5’- GAC CTG AAG TAA ACC TGA GGA ACG ATC TGA TGA TGC- 3’
hGBP1 K485C sense
5’- GAC CAG ACT CTC ACA GAA TGC GAA AAG GAG ATT GAA GTG GAA CGT- 3’
hGBP1 K485C antisense
5’- ACG TTC CAC TTC AAT CTC CTT TTC GCA TTC TGT GAG AGT CTG GTC- 3’
hGBP1 Q577C sense
5’- GCA GAA TAA TGA AAA ATG AGA TAT GCG ATC TCC AGA CGA AAA TGA GAC G- 3’
hGBP1 Q577C antisense
5’- CGT CTC ATT TTC GTC TGG AGA TCG CAT ATC TCA TTT TTC ATT ATT CTG C- 3’
hGBP1 C589S sense
5’- GAG ACG ACG AAA GGC ATC TAC CAT AAG CTA AAG ACC- 3’
hGBP1 C589S antisense
5’- GGT CTT TAG CTT ATG GTA GAT GCC TTT CGT CGT CTC- 3’
3.3.11 Sequenzierprimer
pQE sense
5’- GTA TCA CGA GGC CCT TTC GTC T- 3’
pQE antisense
5’- CAT TAC TGG ATC TAT CAA CAG GAG- 3’
hGBP1 300-319 sense
5’- ATC TGG ATG TGG TGT GTG CC- 3’
hGBP1 300-319 antisense
5’- GGC ACA CAC CAC ATC CAG AT- 3’
hGBP1 570-589 sense
5’- TCA GCT GAC TTT GTG AGC TT- 3’
hGBP1 570-589 antisense
5’- AAG CTC ACA AAG TCA GCT GA- 3’
Kapitel 3 Material und Methoden
77
3.3.12 Puffer
Vor Gebrauch wurden alle Puffer filtriert und entgast.
Puffer A
50 mM Tris
5 mM MgCl2
500 mM NaCl
2 mM Imidazol
pH 7,9
Puffer B20
50 mM Tris
5 mM MgCl2
100 mM NaCl
10 mM Imidazol
pH 7,9
Puffer B150 (pH 7,9)
50 mM Tris
5 mM MgCl2
100 mM NaCl
150 mM Imidazol
Puffer C (pH 7,9)
50 mM Tris
5 mM MgCl2
2 mM DTT
Puffer C* (pH 7,9)
50 mM Tris
5 mM MgCl2
Kapitel 3 Material und Methoden
78
Puffer Biotinyl./Fluoresz.(pH 7)
50 mM Phosphatpuffer (K2PO4/KH2PO4 (1:1))
5 mM MgCl2
PufferHPLC (pH 6,5)
10 mM Tetrabuthylammoniumbromid (TBA- Br)
30 mM Dikaliumhydrogenphosphat
70 mM Kaliumdihydrogenphosphat
200 μM Natriumazid
PufferGill (pH 6,5)
50 mM Kaliumphosphat-Puffer
5 mM MgCl2
6 M Guanidinhydrochlorid
3.4 Molekularbiologische Methoden
3.4.1 Isolierung von Plasmid-DNA
Plasmide aus E.coli Zellen wurden mittels eines Präparations-Kit (QIAprep Spin Miniprep
Kit) der Firma Qiagen (Hilden) isoliert. Die Durchführung erfolgte gemäß den Angaben
des vom Hersteller beigefügten Handbuches. Die alkalische Lyse zum Aufbruch der Zel-
len, die Fällung der Proteine mit Natriumdodecylsulfat und ihre Aufreinigung mittels
Anionenaustauschersäule sind die zentralen Schritte der Präparation. Die hochreine
Plasmid-DNA wird abschließend in einem kleinen Volumen Puffer (50 µl) aufgenommen
und steht für die sich anschließende Polymerase-Ketten-Reaktion und Transformation zur
Verfügung. Falls nötig, sollte die Lagerung der DNA-Lösung bei -20 °C erfolgen.
3.4.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Die Polymerase-Ketten-Reaktion dient der Vervielfältigung von Genfragmenten. Zur se-
lektiven Vervielfältigung kommen hitzestabile Polymerasen und zwei Oligonukleotide
zum Einsatz. Diese Primer, die bei der Firma MWG-Biotech (Ebersberg) bestellt wurden,
sind dem folgenden PCR-Ansatz hinzu pipettiert worden:
Kapitel 3 Material und Methoden
79
PCR-Ansatz (50 µl)
30- 500 ng Template DNA
1 µl 5‘-Primer (sense) (100 µM)
1 µl 3‘-Primer (antisense) (100 µM)
4,5 µl dNTP-Mix
5 µl 10x KOD-Polymerase Puffer
3 µl MgCl2
1 µl KOD-Polymerase
Das eingesetzte PCR-Gerät Mastercycler der Firma Eppendorf (Hamburg) wurde so pro-
grammiert, dass insgesamt zwischen 25 und 35 Zyklen durchlaufen wurden. Die initiale
Denaturierung erfolgte bei 95 °C für eine Minute, gefolgt von einer zyklischen Erhitzung
(1 min, 95 °C). Bei 54 °C wurde jeweils für 1 Minute hybridisiert und der Zyklus mit der
Elongation durch die Polymerase bei 72 °C (1- 1,5 min) abgeschlossen.
3.4.3 Sequenzierung
Am Lehrstuhl für Biochemie II wurde zur Kontrolle der PCR die eine Sequenzierung der
amplifizierten DNA durchgeführt. Hierfür kam das ABI 3130xl (Applied Biosystems,
Foster City, USA) zum Einsatz. 5 µl der isolierten Plasmid-DNA (150 ng/ µl) und 5 µl
der Sequenzierprimer (Endkonzentration 10 pmol/µl) wurden mitgeschickt. Methodisch
erfolgte die Sequenzierung gemäß der klassischen Sanger-Methode, nur das für die Mar-
kierung keine radioaktiven, sondern fluoreszierende Sonden verwendet wurden.
3.4.4 Herstellung kompetenter Zellen
Für die sich anschließende Transformation wurden zunächst kompetente E.coli Zellen (E.
coli TG1, XL1-blue, BL21 (DE3)) aus 5 ml Übernachtkulturen hergestellt. Je 1ml wurden
auf 100 ml LB-Medium am nächsten Tag übergeimpft und bei 37 °C und bis zu einer
OD600 von 0,5- 0,6 herangezogen (Zeitraum 1- 3 Stunden). Anschließend erfolgte eine 20-
minütige Inkubation auf Eis. Bei 8000 U/min und 4 °C wurden für 5 Minuten die Zellen
mittels Zentrifugation sedimentiert, bevor das Pellet in eiskaltem TSS-Puffer (10 % PEG
8000, 5 % DMSO, 50 mM MgCl2 in LB Medium ohne NaOH, pH 6,5) resuspendiert
Kapitel 3 Material und Methoden
80
wurde. Nach Ergänzung von 15 %-igen Glyzerin wurden Aliquots von 300 µl zusammen-
pipettiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren (Lagerung: -80 °C).
3.4.5 Quick Change Site Directed Mutagenesis
Mittels Quick Change Site Directed Mutagenesis wurden Punktmutationen in eine ent-
sprechende Ziel-DNA eingebaut. Über Primer, die die gewünschte Mutation enthalten,
konnte das zu verändernde Zielgen mittels PCR modifiziert werden. Die für den PCR-
Ansatz verwendete KOD-Polymerase besaß eine 3‘→ 5‘- Exonucleaseaktivität. Der Ver-
dau des Template-Vektors erfolgte über die Restriktionsendonuclease DpnI, die spezi-
fisch für methylierte DNA ist. Somit konnte gezielt ausschließlich die Template-DNA
abgebaut werden. Anschließend erfolgte die Transformation der modifizierten DNA.
Beim Primer-Design wurde darauf geachtet, dass die Empfehlungen des Quick Change
Site Directed Mutagenesis-Kits (Stratagene Europe, Amsterdam) befolgt werden. Die
Länge des Primers sollte zwischen 25 und 45 Basen liegen und die zu mutierende Posi-
tion etwa in der Mitte platziert sein. Die Schmelztemperatur sollte bei ≥ 78 °C liegen. Der
GC-Gehalt sollte ≥ 40 % betragen. Alle verwendeten Primer wurden bereits im Abschnitt
aufgeführt. Der folgende Reaktionsansatz wurde im Allgemeinen verwendet:
PCR-Ansatz (50 µl)
1 µl Template DNA
1,5 µl 5‘-Primer (sense) (100 µM)
1,5 µl 3‘-Primer (antisense) (100 µM)
5 µl dNTP-Mix (2 mM)
5 µl 10x KOD-Polymerase Puffer
4,5 µl MgSO4 (25 mM)
1 µl KOD-Polymerase
30 µl H2O
3.4.6 Transformation
250 µl der kompetenten E. coli-Zellen wurden langsam auf Eis aufgetaut und mit 5-
20 ml eines Ligationsansatzes versetzt. Nach einer Stunde Inkubation auf Eis wurde der
Ansatz einem Hitzeschock unterzogen, indem eine abrupte Erwärmung auf 42 °C für 60s
Kapitel 3 Material und Methoden
81
erfolgte. Nach kurzer Abkühlung (2 min) auf Eis wurden dem Ansatz 900 µl LB-Medium
ohne Antibiotikum zugefügt, gefolgt von einer weiteren Stunde Inkubation bei 37 °C.
Nach Zentrifugation bei 14000 U/min wurde das Zellpellet in 150 µl des Überstandes
aufgenommen und auf mit Antibiotika versetzte Agar-Nährböden gegeben, die dann über
Nacht bei 37 °C im Brutschrank inkubiert wurden.
3.4.7 Verdau von DNA mittels Restriktionsenzymen
Der Enzymverdau wurde in einem Volumen von 40 µl durchgeführt. Die Wahl des Puf-
fers und die Länge der Inkubation sind hierbei Parameter, die es im Besonderen zu be-
achten gilt, da Enzyme je nach pH-Wert und Zusammensetzung des Puffers unterschied-
liche Aktivitäten zeigen. Die Inkubation erfolgte stets bei 37 °C im Brutschrank. Hierbei
sollte auf Hinweise des Herstellers geachtet werden. Die Auftrennung der erhaltenen
DNA-Fragmente wurde mittels Agarosegelelektrophorese bewerkstelligt und anschlie-
ßend die erwünschten Fragmente aus dem Gel herausgeschnitten. Zur Trennung der Ban-
den auf dem Gel wurde ein spezieller Probenpuffer verwandt (0,25 % (w/v) Bromphenol-
blau, 30 % Glyzerol (v/v), 0,25 % Xylen-Cyanol, pH 8,0) und die Detektion der DNA-
haltigen Banden erfolgte mittels 0,001 % Ethidiumbromid und unter einer UV-Lampe.
3.4.8 Ligation
Vektor-DNA und Proben-DNA (gewünschtes Fragment) wurden im Verhältnis 1:4 im
Ligationspuffer (Fermentas, St- Leon-Roth) gemischt. Nach Zugabe von 1U der T4-
DNA-Ligase der Firma Fermentas (St. Leon-Roth) wurde der Ansatz mit einem Gesamt-
volumen von 20 µl über Nacht bei 4 °C oder inkubiert.
3.5 Proteinbiochemische Methoden
3.5.1 Präparative Proteinexpression
Von Übernacht-Kulturen der transformierten E.coli-Zellen wurde je eine Zellkolonie mit
einer Pipettenspitze von dem mit Ampicilin angereicherten Agar-Nährböden abgenom-
men und in 100 ml TB-Medium überführt. Es erfolgte eine Inkubation über Nacht bei
37°C.
Kapitel 3 Material und Methoden
82
Die Vorkultur wurde am darauf folgenden Morgen auf 4 mal 2,5 l autoklaviertes TB-Me-
dium gleichmäßig verteilt und über Tag bei 37°C und 150 rpm auf einem Schüttelgerät
bis zu einer OD600 von 0,5 bis 0,6 herangezogen. Nach Reduzierung der Temperatur auf
25 °C wurde die Überexpression des auf dem Vektor kodierten Proteins mit 100 µM
IPTG eingeleitet und über Nacht auf dem Schüttler inkubiert.
3.5.2 Zellernte
Die Zellernte erfolgte mittels Zentrifugation bei 7000g für 15 Minuten. Der Überstand
wurde verworfen und das Pellet direkt weiterbearbeitet oder bei -80 °C bis zur weiteren
Verwendung gelagert.
3.5.3 Zelllyse
Das nach Zentrifugation erhaltene Zellpellet wurde in einem Lysepuffer (50 mM Tris-
HCL pH 7,9, 5 mM MgCl2, 1 mM PMSF und 1,5 % Triton X100) resuspendiert und, falls
es zuvor bei -80 °C gelagert war, auf diese Weise langsam aufgetaut. Dann erfolgte die
Behandlung der Zell-Lösung mit Ultraschallwellen (Amplitude 80%, 1s Puls/Pause im
Wechsel) für insgesamt 10 Minuten. Um die Temperatur der Zell-Lösung jedoch mög-
lichst niedrig zu halten, wurde der Zellaufschluss unter ständigem Kühlen mit Eis und in
Intervallen von je einer Minute durchgeführt.
Anschließend wurden die Zelltrümmer durch Zentrifugation (4°C; 23000 rpm; 45 Minu-
ten; Rotor: SA 300) abgetrennt. Die gewünschten Proteine befanden sich im Überstand
und wurden im nächsten Schritt durch Affinitätschromatographie mit Hilfe einer Cobalt-
Säule aufgereinigt.
3.5.4 Co2+
-NTA-Affinitätschromatographie
Die Proteinaufreinigung erfolgte mit Hilfe einer HisPur-Cobalt-Resin-Säule. Das zu iso-
lierende Protein besaß einen His-tag (6 Histidin-Reste). Dieser His-tag komplexierte mit
den im Matrixmaterial der Säulen enthaltenen 3-wertigen Cobalt-Metallionen und immo-
bilisierte somit das gesuchte Protein auf der Säule. Alle unerwünschten Proteine konnten
durch Waschschritte von der Säule entfernt werden. Die Elution des gesuchten Proteins
Kapitel 3 Material und Methoden
83
erfolgte mithilfe von Imidazol, das in deprotonierter Form mit zunehmender Affinität die
Histidin-Reste aus dem Co-Komplex verdrängt und somit das gesuchte Protein wieder
von der Säule löste.
Zunächst wurde die Co-Säule mit entgastem Puffer C* über Nacht bei einer Flussrate von
0,3 ml/min gereinigt. In einem nächsten Schritt wurde die Äquilibrierung (Volumen:
25 ml) mit Puffer A (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM Imi-
dazol) bei einer Flussrate von 1,5 ml/min für 2 Stunden durchgeführt. Anschließend er-
folgte die Beladung der Cobaltsäule mit dem Überstand des Zellaufschlusses (Flussrate:
3,5ml/min) und mit einem 4-fachen Säulenvolumen von Puffer A (Flussrate: 2ml/min).
Unspezifisch gebundene Proteine wurden mit Puffer B10 (50 mM Tris-HCl (pH 8,0),
100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10 mM Imidazol) bei einer Flussrate von 4 ml/min von der
Säule gespült. Dann erfolgte der Wechsel zu Puffer B150 (50 mM Tris-HCl, 100 mM
NaCl, 5 mM MgCl2, 150 mM Imidazol), der dazu diente, das mit His-tag markierte, übe-
rexprimierte Protein von der Säule zu spülen und in 4 ml-Fraktionen aufzufangen.
3.5.5 Größenausschlusschromatographie
Die Gelfiltration ist eine Methode zur Auftrennung von Molekülen. Die Säulenmatrix
bildet Poren mit definiertem Durchmesser. Große Moleküle können nicht in die Poren
eindringen und werden ausgeschlossen, während kleinere Moleküle in die Poren
diffundieren. Kleinere Moleküle brauchen somit länger, die Säule zu durchlaufen als grö-
ßere Moleküle; die Moleküle werden somit anhand ihrer Größe aufgetrennt.
Die Protein enthaltenden Fraktionen der Affinitätschromatographie wurden vereinigt und
auf Eis langsam mit 3 M (NH4)2SO4 versetzt, um durch Wasserentzug die Proteine zu prä-
zipitieren. Nach dieser Ammoniumsulfatfällung erfolgte eine Zentrifugation mit
8400 rpm bei 4°C für 15 Minuten (Rotor: Sorvall Heräus). Der Überstand wurde
verworfen und das Pellet in ca. 4 ml Puffer C* resuspendiert. Die Gelfiltrationssäule
(Säulenmaterial: Sephadex® 200 (26/60) wurde blasenfrei mit Hilfe einer Spritze mit der
Protein-Lösung beladen und die Fraktionierung erfolgte über Nacht bei einer Flussrate
von 0,4 ml/min in 4 ml-Fraktionen. Aus dem entstandenen Elutions-Diagramm war
ersichtlich, in welchen Fraktionen sich das gesuchte Protein befand.
Kapitel 3 Material und Methoden
84
3.5.6 Aufkonzentrierung über Ultrafiltration
Die Aufkonzentrierung der Proteinfraktionen aus der Größenausschlusschromatographie
wurde mit Zentrifugationsröhrchen (Vivascience, USA) durchgeführt. Die Porengröße der
Filtermembran konnte wahlweise zwischen 10 und 100 kDa gewählt werden. Durch eine
Zentrifugation bei 4000 rpm und 4 °C konnten alle Bestandteile, die kleiner als die Poren
waren, durch diese hindurchgedrückt werden. Oberhalb der Membran blieb die
aufkonzentrierte Proteinlösung zurück, die mit einer Pipette abgenommen werden
konnte.
3.5.7 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
Aus dem Elutionsdiagramm der Proteinaufreinigung über die Cobaltsäule ging hervor, in
welchen aufgefangenen Eluat-Fraktionen sich das gesuchte Protein befindet. Über eine
SDS-Gelelektrophorese konnte nun der Reinheitsgrad des gewonnenen Proteins bestimmt
werden. Das Detergenz SDS denaturiert Proteine und bindet spezifisch an die
Polypeptidkette. Durch die negative Ladung des Sulfats wird die Eigenladung des
Proteins vernachlässigbar und das Verhältnis von Ladung zu Größe ist für jedes Protein
annähernd gleich. Somit bewegen sich die Proteine annähernd proportional zu ihrer
Größe durch das Gel. Durch die Verwendung eines Protein-Markers bei der SDS-PAGE
Methode, der Proteine definierter molekularer Massen enthält, lässt sich ein unbekanntes
Protein anhand seines Molekulargewichts identifizieren (Schägger und von Jagow 1987).
In diesem Versuch wurde mit einem diskontinuierlichen System aus zwei Gelen gearbei-
tet, einem Sammelgel zur Konzentration der Proben und einem Trenngel zur
Probenauftrenunng. Das vertikale Gelelektrophoresesystem stammt von der Firma
BioRad (München). Die verwendeten Gele wurden nach folgender Rezeptur erstellt:
Trenngel 12,5 % Sammelgel 3,9 %
Protogel 3,1 ml Protogel 0,65 ml
Lower Tris 1,9 ml Upper Tris 1,25 ml
H2O 3,1 ml H2O 3,1 ml
TEMED 5 µl TEMED 5 µl
APS 10 % 100 µl APS 10 % 50 µl
Kapitel 3 Material und Methoden
85
Den Proben wurde ein Probenpuffer (125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 50 % Glyzerin,
10 % SDS, 10 mM β-Merkaptoethanol, 0,01 % Bromphenolblau) zugesetzt. Je 5 µl Probe
wurden mit 15 µl Probenpuffer verdünnt. Zusätzlich wurde ein Marker (Protein
Molecular Weight Marker: 14,4; 18,4; 25; 35; 66; 116 kDa (Fermentas, St. Leon-Rot))
aufgetragen. Die Auftrennung der Gele erfolgte bei einer Spannung von 110 V.
Anschließend wurden die Gele für ca. 15 Minuten gefärbt (Färbelösung: 0,1 % (w/v)
Coomassie Brilliant Blue G250, 0,1 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue R250, 40 %
Ethanol (v/v), 10 % Essigsäure (v/v)). Der nicht gebundene Farbstoff wurde mit Wasser
entfernt.
3.5.8 Proteinkonzentrationsbestimmung nach Gill und von Hippel (1989)
Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde zunächst der molare Extinktionskoeffi-
zient des Proteins bei 280 nm über die Anzahl der Tryptophan- Tyrosin- und Phenylala-
ninreste pro Molekül bestimmt. Über das Lambert-Beersche Gesetz wurde die Konzent-
ration der Proteinlösung ermittelt: A = c*d*ε
Um eine Extinktion zwischen 0,2 und 0,9 zu erreichen, wurde das Protein in 20 mM Ka-
liumphosphat und 6 M Guanidiniumhydrochlorid (pH 6,5) aufgenommen. Dieses Lö-
sungsmittel diente auch als Referenz für die Bestimmung der Absorption mittels UV-
Licht (280 nm). Zur Berechnung des Extinktionskoeffizienten gibt es diverse Internetpro-
gramme wie z. B. „ProtParam“. Die Messungen wurden mit dem Zweistrahlspektrometer
Specord 200 der Firma Analytik Jena vorgenommen.
3.5.9 Biotinylierung von Proteinen mit Maleimid-PEG11-Biotin
Um die verwendeten Proteine an Oberflächen binden zu können, wurde ein Linker benö-
tigt, der Protein und Oberfläche miteinander verbindet. Das Streptavidin/Biotin-System
bot sich hierfür an. Auf den für die SPR und AFM-Messungen verwendeten Goldoberflä-
chen befand sich das Protein Streptavidin. Die zu untersuchenden Proteine mussten bioti-
nyliert werden, damit sie über das Streptavidin an die Oberfläche binden konnten. Für die
Biotinylierung wurde das Kit „Maleimid-PEG11-Biotin“ von Thermo Scientific verwen-
det. Maleimid-PEG11-Biotin ist ein langkettiges, wasserlösliches Reagenz, welches Pro-
teine biotinylieren kann, die über Sulfhydrylgruppen verfügen. Die Maleimid-Gruppe
Kapitel 3 Material und Methoden
86
reagiert effizient und speziell mit reduzierten, freien Sulfhydrylgruppen bei einem pH-
Wert von 6,5 -7,5. Dabei werden stabile Thioether-Bindungen ausgebildet. Die einzuset-
zende Menge an Maleimid-PEG11-Biotin richtete sich nach der Anzahl der freien Sulf-
hydrylgruppen, der gewünschten Modifizierungsrate sowie der Konzentration des zu bio-
tinylierenden Proteins. Zunächst wurde eine 250 mM Stocklösung des Biotin Reagenzes
angefertigt. Die Menge an benötigtem Biotin Reagenz wurde gemäß der Anweisungen
des Kits „Biotin Quantitation Kit“ von Thermo Scientific kalkuliert:
Bevor die Biotinylierung durchgeführt werden konnte, musste eine Umpufferung des
Proteins stattfinden. Das Protein wurde in Puffer C aufbewahrt. Das im Puffer C
enthaltene DTT oxidiert Thiolgruppen, was eine Störung der Biotinylierung zufolge hätte.
Deswegen wurde das Protein mit Hilfe von speziellen Säulen (Resin Zeba Desalter Spin
Columns; Thermo Scientific) in Phosphat-Puffer (50 mM Na2HPO4, 50 mM NaH2PO4 im
Verhältnis 1:1 (pH 7)) überführt.
Die berechnete Menge an 250 mM Biotin Reagenz wurde zu der Proteinlösung gegeben.
Die Inkubation wurde auf Eis durchgeführt und konnte von 2 Stunden bis zu einer Nacht
variiert werden. Um die Kopplungsreaktion zu stoppen, fand eine Zugabe von 2 mM Di-
thioerythritol (DTE) statt. Anschließend wurde das biotinylierte Protein mit Hilfe der
Resin Zeba Spin Columns gemäß Vorschrift erneut in Puffer C* (ohne DTT) umgepuffert.
3.5.10 Quantifizierung der Biotinylierung von Proteinen
Für die Quantifizierung der Biotinylierung wurde das „EZTM
Biotin Quantitation Kit“ von
Thermo Scientific verwendet. HABA (4'-Hydroxyazobenzen-2-carboxylische Säure) ist
ein Reagenz, welches die schnelle Bestimmung des Mol-Verhältnisses von Biotin zu
Protein ermöglicht. Dafür wird das biotinylierte Protein zu einer Mischung aus HABA
und Avidin gegeben. Da Biotin eine höhere Affinität zu Avidin aufweist als das HABA,
verdrängt es das HABA und bindet an das Avidin. Dieser Vorgang kann über ein Photo-
meter verfolgt werden, da die Absorption bei 500 nm proportional zunimmt.
Dem auf Raumtemperatur gebrachten HABA/Avidin Mix wurde 100 µl ultrareines Was-
ser hinzugefügt und gut gemischt. In einer Küvette wurden 800 µl PBS-Puffer vorgelegt
und das Photometer bei 500 nm auf null gestellt. Nachfolgend wurden 100 µl der
HABA/Avidin Lösung in die Küvette gegeben und durch Invertieren gemischt. Die Ab-
sorption wurde gemessen und als A500 HABA/ Avidin (A500 H/A) notiert. Anschließend
Kapitel 3 Material und Methoden
87
wurden 100 µl der biotinylierten Proteinprobe in die Küvette gegeben und die Absorption
bei 500 nm als A500 HABA/Avidin/Biotin-Probe (A500 H/A/B) vermerkt. Die Quantifizie-
rung des Verhältnisses von Biotin zu Protein konnte gemäß den Anweisungen des Kits
von Thermo Scientific ermittelt werden.
3.6 Biophysikalische Methoden
3.6.1 Ermittlung von Nukleotidkonzentrationen
Für die Bestimmung von Nukleotidkonzentrationen wurden Absorptionsmessungen bei
253 nm durchgeführt. Der verwendete Puffer war 20 mM Tris-HCl (pH 7,9). Für die
Messungen wurde ein molarer Extinktionskoeffizient von ε 253 = 13700 M-1
cm-1
verwen-
det (Hiratsuka, 1983).
3.6.2 Analyse von Nukleotiden mittels reversed-phase HPLC
Lenzen (von Lenzen et al., 1995) hat eine Methode zur Bestimmung der Reinheit und
Analyse von Nukleotidgemischen über reversed-phase HPLC entwickelt. Prinzip der
Methode ist die Interaktion der hydrophoben stationären Phase mit dem Ionenpaar, das
aus dem Nukleotid selbst und dem in der mobilen Phase enthaltenen Tetrabutylammo-
niumbromid-Ionen (TBA-Br) besteht. Je nach Anzahl der vorhandenen Phosphatgruppen
variiert die Menge an gebundenem TBA-Br und somit die Retentionszeit. Zur Auftragung
der Proben wurde eine BT 4100 HPLC-Pumpe (Jasco- Groß-Umstadt) verwendet. Die
Trennung wurde über eine 25 cm Reprosil 100 C18 Säule (Dr. Maisch, Ammerbuch,
Entringen) vorgenommen. Um Verunreinigungen der Säule durch denaturierte Proteine
zu vermeiden, kam zusätzlich eine Nucleosil 100-5 C18 Vorsäule zum Einsatz. Als
Laufpuffer wurde 100 mM Kaliumphosphat (pH 6,5), 10 mM TBA-Bromid, 0,3 mM
Natriumazid und 7,5 % Acetonitril verwendet. Die Detektion erfolgte mit Hilfe des
Photodiodenarray-Detektors MD-2010 (Jasco, Groß-Umstadt) bei einer Wellenlänge von
253 nm.
Kapitel 3 Material und Methoden
88
3.6.3 Messungen der Nukleotidhydrolyse
Über reversed-phase HPLC konnte die steady state Hydrolysegeschwindigkeit von GTP
durch das Protein hGBP1 ermittelt werden, um auf diese Weise Aufschluss über die en-
zymatische Aktivität des Proteins in Lösung und an einer Goldoberfläche zu erhalten. Für
die Messung in Lösung wurden die Proteine auf eine Konzentration von 0,5 µM mit Puf-
fer C* (50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2 (pH 7,9)) verdünnt und GTP (Endkonzentration
50 µM) hinzugefügt. Die Inkubation erfolgte bei 25 °C. Nach unterschiedlichen Zeit-
punkten von einigen Minuten wurden 20 µl der Probe auf die Säule aufgetragen und die
Anteile von GTP, GDP und GMP konnten aus dem Elutionsdiagramm entnommen wer-
den. Der Anteil von nicht umgesetzten GTP wurde gegen die Inkubationszeit aufgetragen.
Die Anfangsgeschwindigkeit wurde bis 40 % GTP-Umsatz durch lineare Regression an-
gepasst. Die spezifische Aktivität ergibt sich aus dem Quotient von Anfangsgeschwindig-
keit und Proteinkonzentration.
Für die Messung der spezifischen Aktivität von hGBP1 auf einer mit einem Biotinthiol-
SAM (10 %) und Streptavidin modifizierten Goldoberfläche wurde ebenfalls eine GTP-
Konzentration von 50 µM eingesetzt. Die Oberfläche hatte eine Fläche von ca. 80 cm².
Da der runde, mit einer Goldschicht von 1200 Å beschichtete Siliziumwafer (siehe Her-
stellung der Substrate für AFM Messungen) in eine speziell dafür entwickelte Kunststoff-
schablone eingefasst war, konnte ein definiertes Volumen von 2,5 ml der GTP-Lösung
direkt auf die Oberfläche gegeben werden. Hierbei musste darauf geachtet werden, dass
der gesamte Wafer mit der GTP-Lösung beschichtet war. Die Inkubation erfolgte bei
Raumtemperatur. Nach bestimmten Inkubationszeiten wurden 20 µl der GTP-Lösung mit
einer Hamilton-Spritze vorsichtig abgenommen und der Anteil an GTP über HPLC, wie
oben beschrieben, bestimmt.
3.6.4 Zirkulardichroismus (Circular Dichroism, CD)-Spektroskopie
Zur Bestimmung von Sekundärstrukturelementen eines Proteins oder Peptids kann die so
genannte CD-Spektroskopie (Circular Dichroism) herangezogen werden, die es ermög-
licht, die optische Aktivität asymmetrischer Moleküle in Lösung zu untersuchen. Da α-
Helices und β-Faltblätter chiral sind, sind sie ebenfalls optisch aktiv und lassen sich mit-
tels dieser Methode detektieren. Das grundsätzliche Prinzip der CD-Spektroskopie beruht
darauf, dass linear polarisiertes Licht durch ein (chirales) Medium geschickt und die
Kapitel 3 Material und Methoden
89
Modifikation durch die Wechselwirkung mit der zu untersuchenden Substanz betrachtet
wird. Die Lichtwellen werden wellenlängenabhängig in ihrer Polarisationsrichtung
gedreht, was dann als Rotationsdispersion bezeichnet wird. Wenn zusätzlich die beiden
zirkular polarisierten Anteile, aus denen eine polarisierte Welle besteht, verschieden stark
absorbiert werden, wird von Zirkulardichroismus gesprochen.
Abbildung 3-13: Schematisches CD-Spektrum der Sekundärstrukturelemente random coil,
α-Helix und β-Faltblatt.
Für die einzelnen Sekundärstrukturelemente lassen sich in den jeweiligen Spektren
charakteristische Minima und Maxima benennen, die im Folgenden benannt sind:
Die Amid Bindung zeichnet sich durch einen schwachen, aber breiter n → π*
Übergang bei 220 nm und intensiver π → π* Übergang bei 190 nm.
Random: Positives Signal bei 212 nm (π → π*) und negatives bei 195 nm
(n → π*)
β-Faltblatt: Negativer n → π* Übergang (217 nm), π → π* positiv zwischen 195
und 197 nm; weiteres Signal bei 180 nm. Da β-Faltblattstrukturen sowohl parallel
oder antiparallel angeordnet sein können oder Mischformen beider möglich sind,
sie außerdem inter- oder intramolekular vorkommen und auch unterschiedliche
Verdrillungen aufweisen können, sind die CD-Spektren von Faltblättern lang nicht
so starr wie für Helices und zeigen eine höhere Abhängigkeit gegenüber den Sei-
Kapitel 3 Material und Methoden
90
tenketten der Aminosäuren, die das zu untersuchende Peptid bilden, und dem
verwendeten Lösungsmittel.
α-Helix: Aufspaltung des π → π* Übergangs in den senkrecht polarisierten Über-
gang bei 192 nm und parallel polarisierten Übergang bei 209 nm; Rotverschie-
bung zu 222 nm
3.6.4.1 Experimenteller Teil
Um zu überprüfen, welche Sekundärstrukturelemente in dem in dieser Arbeit syntheti-
sierten Peptidthiol auftreten, sollte neben den infrarotspektroskopischen und-mikroskopi-
schen Methoden auch die CD-Spektroskopie zum Vergleich herangezogen werden, auch
wenn sie sich ausschließlich dazu eignet, die Peptide in Lösung und nicht an einer Gold-
oberfläche zu vermessen. Die Peptidproben (1 mM Peptidkonzentration) wurden in einem
Puffer mit physiologischem pH-Wert (10 mM Tris, pH 7,4) angesetzt. Des Weiteren
folgten Messreihen mit 10 %, 30 % und 50 % Trifluorethanol. Anschließend wurden die
Spektren dazu genutzt, die Anteile bestimmter Sekundärstrukturelemente im Peptid zu
bestimmen, da sich der Dichroismus von Random, Helix und Faltblatt unterscheidet.
3.6.5 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-Time of Flight)
Zur massenspektrometrischen Bestimmung von Biomolekülen kommt die MALDI-TOF-
Massenspektrometrie (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-Time Of Flight Mass
Spectrometry) zum Einsatz. Mit dieser Methode lassen sich Moleküle mit Moleku-
larmassen von bis zu 500 kDa messen. Dazu werden die Probenmoleküle in eine organi-
sche, niedermolekulare Matrix eingebettet und schonend mittels gepulster Laserstrahlung
ionisiert. Trifft der Laserstrahl auf die Matrix, absorbiert diese seine Energie und schützt
somit die Probenmoleküle vor Zerstörung. Anschließend überträgt die Matrix Energie auf
die Probenmoleküle, was zunächst zu ihrer Desorption und schließlich zu ihrer Ionisie-
rung führt. Die gasförmigen Ionen werden nun beschleunigt und durch ein Flugrohr ge-
schickt. Am Ende des Flugrohres werden die Ionen detektiert und können aufgrund ihrer
Massen unterschiedlichen Flugzeiten getrennt werden.
Kapitel 3 Material und Methoden
91
3.6.5.1 Experimenteller Teil
3.6.5.1.1 Überprüfung der Reinheit der Peptidproben
Nachdem die Peptide in einem Mikrowellen Peptide Synthesizer (Firma CEM) herge-
stellt und bereits einer ersten Vorreinigung mittels HPLC unterzogen worden waren,
sollte die massenspektrometrische Untersuchung dazu dienen, die Reinheit des
Peptidthiols zu überprüfen. Als Matrix wurde Dihydroxybenzoesäure (DHB) eingesetzt,
die gesättigt in 30 % Acetonitril und 0,1 TFA vorlag. Zunächst wurde ein Tropfen (1-
2 µl) einer 2 mM Peptidthiollösung (in 10 mM Tris, pH 7,9) auf die Stahlplatte gegeben
und durch einen Tropfen Matrixlösung ergänzt. Nach dem Trocknen wurde die Stahl-
platte eingeschleust und gemessen.
3.6.5.1.2 Detektion verschiedener immobilisierter Proteine auf einer Goldoberfläche
Mit einem Biotinthiol-SAM (10 % Biotinthiol, 90 % Mercatoundecanol) modifizierte
Goldwafer, die zuvor über SPR mit den Proteinen Streptavidin und biotinyliertem hGBP1
beladen worden waren, wurden mittels MALDI hinsichtlich der Fragestellung untersucht,
ob es möglich ist, die einzelnen Proteinkomponenten bekannter Masse auf dem Wafer
identifizieren zu können. Als Matrix wurde Zimtsäure verwendet. Diese lag gesättigt in
30 % Acetonitril und 0,1 % TFA vor. Der Goldwafer wurde zunächst auf den Stahlträger
aufgeklebt. Um zu vermeiden, dass die Goldoberfläche nicht mehr im Fokus des Lasers
liegt, musste im Vorfeld ein Loch in die Stahlplatte gefräst werden, das mit der Dicke des
Wafers exakt übereinstimmt. Anschließend wurde ein Tropfen der Matrixlösung auf die
Oberfläche pipettiert. Nach Verdampfung des Lösungsmittels konnte die Platte in das
Massenspektrometer eingebaut werden. Zur Detektion wurde eine Standardmethode über
die Software hochgeladen. Mit Hilfe einer ebenfalls auf dem Stahlträger aufgetragenen
Kalibrierlösung konnte zunächst anhand der bekannten Massen der in der Lösung enthal-
tenen Proteine (Protein Calibration Standard II, Bruker) die gemessenen Daten den Refe-
renzwerten angepasst werden, umso exakte Ergebnisse zu erhalten. Während des sich
anschließenden Messvorgangs wurde die Laserintensität auf ca. 40 % eingestellt und die
Anzahl der Laserpulse (Shots) auf 200 festgelegt. Jedes Spektrum konnte direkt abgespei-
chert und abschließend alle brauchbaren Spektren aufsummiert werden.
Kapitel 3 Material und Methoden
92
3.6.5.1.3 Detektion von Streptavidin und hGBP1
Die beiden Proteine Streptavidin und hGBP1 wurden nicht nur an einer Goldoberfläche,
sondern auch in Lösung vergleichsweise gemessen. Zusätzlich sollte auch Biotinthiol,
welches zur Bildung des SAMs auf der Goldoberfläche benutzt wurde, um Streptavidin
daran binden zu können, detektiert werden. Um das bestmögliche Ergebnis zu erzielen,
wurden verschiedene Matrizes ausprobiert. Zum Einsatz kamen Sinapinsäure, Dihydroxy-
benzoesäure (DHB) und Zimtsäure, alle gelöst in 30 % Acetonitril und 0,1 % TFA.
0,75 µl der Proben und 0,75 µl der Matrixlösung wurden auf dem Strahlträger auf-
getragen (Dried Droplet Crystallization) und es wurde gewartet, bis das Lösungsmittel
vollständig weggetrocknet war. Die weitere Verfahrensweise wurde bereits im vorausge-
gangenen Abschnitt besprochen. Die Anzahl der Shots betrug hier 50.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
93
4 Das Streptavidin-hGBP1-System als Fallbeispiel für den
Aufbau eines Multikomponentensystems auf SAM-Ober-
flächen
Aufgrund der über Röntgenkristallographie gelösten Struktur, der markanten länglichen
Form und seiner enzymatischen Aktivität, die durch Selbstassemblierung noch verstärkt
wird, eignet sich das Immunprotein hGBP1 im besonderen Maße für das über Streptavi-
din als „Mediator“ aufgebaute Immobilisierungsassay. Hinzu kommt die bereits gut etab-
lierte Überexpression des Proteins in E. coli und seine Aufreinigung (Schwemmle
/Staeheli, 1994), die im Folgenden zunächst beschrieben ist
4.1 Synthese und Aufreinigung von hGBP1
Nach Aufzucht einer Kultur mit einem Volumen von 10 Litern wurden zunächst die Zel-
len abzentrifugiert, in Lysepuffer resuspendiert und mittels Ultraschall aufgeschlossen.
Die Suspension mit den aufgeschlossenen Zellen wurde erneut zentrifugiert, um eine
Trennung zwischen Zellresten und Proteinen zu erreichen. Mittels Co2+
-NTA-Affinitäts-
chromatographie erfolgte die Isolierung des mit einem His-tag versehenen hGBP1 vom
Rest des Protein-Pools. Über einen Probensammler wurde der Durchfluss in 4 ml-
Fraktionen aufgefangen. Die proteinhaltigen Fraktionen konnten anschließend auf ein
SDS-Gel aufgetragen werden (Abbildung 4-1).
Abbildung 4-1: SDS-Gel der hGBP1-haltigen Fraktion nach der Cobaltsäule. Alle Fraktionen
zeigen eine markante Bande bei ca. 67 kDa (rot umrandet), was dem Molekulargewicht von
hGBP1 entspricht. Anhand des mitgelaufenen Proteinstandardmarkers (M) konnte die Laufstrecke
der Bande der entsprechenden Masse zugeordnet werden.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
94
Die Fraktionen mit dem Protein wurden danach vereinigt und mit 3 M Ammoniumsulfat
gefällt. Nach erneuter Zentrifugation wurde das Proteinpellet resuspendiert und auf eine
Sephadex® 200 Gelfiltrationssäule aufgetragen Auch hier wurde der Durchfluss wieder
in 4 ml-Fraktionen aufgefangen und zeitgleich über das angeschlossene UV-Spektrometer
die Absorption des Durchflusses bei 280 nm gemessen (Abbildung 4-2). Das dabei
aufgezeichnete Elutionsdiagramm zeigt einen deutlichen Peak für das hGBP1-Monomer
sowie im geringfügigem Maße für das Dimer und andere Verunreinigungen, die durch
unspezifische Bindung an die Cobaltsäule zustande kommen und erst durch die
Gelfiltration vom reinen Protein abgetrennt werden:
Abbildung 4-2: Elutionsprofil der Aufreinigung von hGBP1 mit der Gelfiltrationssäule
(Superdex 200, 26/60; GE Healthcare). Die Kurve zeigt die Absorption bei 280 nm. Das
monomere hGBP1 wird von anderen Verunreinigungen und dimerisierten Proteinen abgetrennt.
Die proteinhaltigen Fraktionen können anschließend auf ein SDS-Gel aufgetragen und danach
aufkonzentriert werden.
Über ein SDS-Gel konnten besonders reine Fraktionen identifiziert (Abbildung 4-3),
anschließend vereinigt und mittels Ultrafiltration aufkonzentriert werden. Die
Proteinkonzentrationsbestimmung erfolgte nach der Methode von Gill und Hippel (Gill
/von Hippel, 1989). Der verwendete Extinktionskoeffizient betrug 44800 M-1
cm-1
. Da ein
ständiges Auftauen und Wegfrieren der Proteinlösung zur Denaturierung und somit zur
Zerstörung der biologischen Aktivität des Proteins führen kann, wurde die Proteinlösung
in Fraktionen von 5 oder 10 µl aliquotiert, mit Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C
bis zur weiteren Verwendung gelagert.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
95
Abbildung 4-3: Gelfoto der gesammelten Fraktionen nach der Gelfiltration. Das monomere
Protein ist bei ca. 67 kDa zu sehen (rot umrandet). Die besonders reinen Fraktionen wurden über
Ultrafiltration aufkonzentriert und anschließend bei -80 °C gelagert.
4.2 Biotinylierung von hGBP1
4.2.1 Biotinylierung über einen lysinspezifischen Biotinamidocaproylanker
Die Biotinylierung von hGBP1 in seiner Wildtyp-Form für die spätere Immobilisierung
an der Streptavidin-terminierten SAM-Oberfläche wurde zunächst über das
lysinspezifische Biotinamidohexanoyl-6-aminohexansäure-N-Hydroxysuccinimidester
(Biotinamidocaproyl, Sigma) getestet. Da Biotinamidocaproyl photometrisch nicht
messbar ist, wurde jeweils in einem parallelen Ansatz das Fluoreszein 5-
Carboxyfluoresceinsuccinimidylester eingesetzt, das in seiner Kopplungschemie dem
Biotinanker entspricht.
COOH
O OHHO
C
O
N
O
O
Abbildung 4-4: Strukturformel von 5-Carboxyfluoresceinsuccinimidylester und
Biotinamidocaproyl. Beide Moleküle folgen der gleichen Kopplungschemie.
Um dies zu erreichen, trug sowohl der Anker als auch Fluorescein eine funktionelle
Succinimidylester-Gruppe, die spezifisch an Aminogruppen von Lysinen bindet. Das
NH NH
S
O
HN
ONH
O HN
O
OO
N
O
O
Biotinamidhexanoyl-6-aminohexansäure-
hydroxysuccinimidylester
5-Carboxyfluorescein-
succinimidylester
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
96
Fluoreszein (molarer Extinktionskoeffizient: 68000 M-1
cm-1
) absorbierte Licht bei
492 nm und emittierte es bei 519 nm. Dadurch war die Kopplung des Fluoreszeins an
Lysinreste spektrometrisch quantifizierbar und konnte auf die spätere Biotinylierung
übertragen werden. Dabei wurde die Annahme gemacht, dass nicht nur die
Kopplungschemie, sondern auch die Kopplungsausbeute, also die Menge an gekoppeltem
Biotinanker bzw. Fluoreszein, identisch ist. In Vorversuchen wurden zunächst
verschiedene Kopplungsbedingungen ausgetestet. Die finalen Standardtestbedingungen
ergaben sich wie folgt:
50-100 µM hGBP1 (in NaHCO3-Puffer)
5facher Überschuss Biotinamidocaproyl (in DMF)
ad 500 µl NaHCO3-Puffer (pH: 8,3)
über Nacht auf Eis
Umpuffern in Standardpuffer (Puffer C*)
Besonders wichtig war die Inkubation auf Eis, um die Denaturierung des hGBP1 zu
vermeiden und die native Struktur sowie die enzymatische Aktivität zu erhalten. Des
Weiteren musste der pH-Wert sehr exakt eingestellt werden, um eine möglichst
spezifische Fluoreszeinierung bzw. Biotinylierung zu erreichen. Der leicht basische pH-
Wert von 8,3 sollte in erster Linie zur Markierung des N-Terminus führen, da sein pKa-
Wert niedriger ist als bei den anderen Lysinen (pKa: 9- 9,5), von denen es im hGBP1 49
gibt. Nachdem der Labeling-Ansatz 1 bis 2 mal über eine NAP5-Säule aufgereinigt
worden war, um nicht gebundenes Fluorescein abzutrennen, wurde die Extinktion bei
280 nm und 519 nm gemessen und ins Verhältnis gesetzt. Bei der Berechnung des
Verhältnisses wurde berücksichtigt, dass der Fluoreszenzfarbstoff auch bei 280 nm
absorbiert und zu der gemessenen Extinktion beiträgt. Exemplarisch ist in der Abbildung
4-5 ein Wellenlängen-Scan für verschiedene Verdünnungen einer hGBP1 Lösung nach
der Fluoreszeinierung gezeigt, aus dem die effektive Labeling-Effizienz berechnet werden
konnte. Die Konzentration der Proteinlösung betrug in diesem Falle ca. 150 µM. Das
Verhältnis von Protein zu Fluoreszein betrug 1: 1,06. Die Reproduzierbarkeit dieser
Labeling-Effizienz war sehr stark von der genauen Einstellung des pH-Wertes abhängig.
Bei geringfügig höheren pH-Werten als 8,3 wurden neben dem N-Terminus zusätzliche
Lysine markiert, wie Abbildung 4-6 zeigt.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
97
Abbildung 4-5: Wellenlängenscans von hGBP1 mit Fluoreszenz-Label. Für die
Proteinkonzentrationsbestimmung wurden verschiedene Verdünnungen der Proteinlösung einge-
setzt. Die gemessene Absorption sollte im linearen Bereich zwischen 0,2 und 0,9 liegen, um die
Konzentration der Proteinlösung möglichst genau bestimmen zu können.
Die Anzahl der nicht protonierten Lysine ist bei einem exakt eingestellten pH-Wert von
8,3 ca. 1. Bei einem pH-Wert von 9 liegen tendenziell 2 Label und bei pH 9,5 sogar drei
Abbildung 4-6: pH-abhängige Labeling-Effizienz von 5 Carboxyfluoreszeinsuccinimidyl-
ester. Die Erhöhung des pH-Wertes von 8,3 auf 9 und 9,5 führt zu einem höheren Anteil an nicht
protonierten Lysinen, die damit für die Kopplung mit dem Fluoreszenzmarker zur Verfügung
stehen.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
98
Anker vor. Wird der pH-Wert noch weiter bis auf 10 bzw. 10,5, nimmt die Anzahl der
Label drastisch zu, da dann alle Lysine in ihrer nicht protonierten Form vorliegen.
4.2.2 Diskussion der Ergebnisse
Die pH-abhängige und lysinspezifische Kopplung des Biotinankers an hGBP1 hat einige
Nachteile hinsichtlich der Intention, das hGBP1 spezifisch zu biotinylieren und kontrol-
liert, mit vorhersagbarer Orientierung auf einer Streptavidin-terminierten Oberfläche zu
immobilisieren:
1. Eine pH-abhängige Kontrolle bedingt eine sehr exakte Einstellung des pH-Wertes und
der Kopplungsbedingungen. Geringfügige Abweichungen verändern die Kopplungs-
ausbeute. Aufgrund der hohen Anzahl an Lysinen (49) ist darüber hinaus die genaue
Identifizierung der Position der Anker sehr arbeitsintensiv. Zunächst müsste ein
tryptischer Verdau durchgeführt werden und anschließend die über Massenspektrometrie
erhaltenen Massen den Fragmentsequenzen von hGBP1 zugeordnet werden. Erst dann
wäre eine Identifzierung der durch die Ankerkopplung veränderten Fragmentmassen
möglich
2. Bei einem exakt eingestellten pH-Wert von 8,3 lag die Labeling-Effizienz zumeist bei
ca. 1, was darauf schließen lässt, dass unter diesen Bedingungen mit großer Wahrschein-
lichkeit (auch ein anderes Lysin mit hoher Exporniertheit ist nicht generell
ausgeschlossen) der N-Terminus (pKs = 7,5-7,9) markiert ist. Der N-Terminus liegt zwar
nicht direkt in der Interaktionsfläche von hGBP1, aber in der GTPase-Domäne, die die
Dimerisierung vermittelt. Deswegen ist bei N-terminaler Kopplung des Ankers davon
auszugehen, dass die Immobilisierung von biotinyliertem hGBP1 an Streptavidin zu einer
Hemmung der Dimerisierung führt, da dann die GTPase-Domäne zur Oberfläche
gerichtet und folglich nicht (oder kaum) zugänglich ist. Diese Annahme kann durch die
SPR-Messung in Abbildung 4-7 bestätigt werden. Streptavidin, biotinyliertes hGBP1 und
hGBP1 wt wurden nacheinander über einen 10%-igen Biotinthiol-SAM geleitet. Einmal
erfolgte die Bindung von hGBP1 wt mit GppNHp (50 µM) und einmal ohne. In beiden
Fällen ist kaum ein Unterschied bezüglich der Beladung festzustellen, was im
Umkehrschluss heißt, dass die beobachtbare Adsorption nicht mit der Dimerisierung von
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
99
hGBP1 korreliert. Dieser Vorgang ist offensichtlich gehemmt. Völlig unabhängig davon,
ob der Anker N-terminal gebunden oder an ein Lysin mit hoher Zugänglichkeit gebunden
ist, zeigt die SPR-Messung, dass Dimerisierungsstudien von hGBP1 wt mit einem
lysinspezifischen Biotinamidocaproylanker nicht möglich sind.
Abbildung 4-7: Konsekutive Immobilisierung von Streptavidin, lysinspezifisch biotinyl-
iertem hGBP1 und hGBP1 wt mit und ohne GppNHp. Alle Komponenten wurden jeweils für
10 min bei einer Flussrate von 5 µl/min über die Oberfläche gegeben. Danach erfolgte jeweils
eine Dissoziationsphase von ebenfalls 10 Minuten. Der Positivprobe für hGBP1 wt wurde 50 µM
GppNHp zugesetzt.
3. Für die Biotinylierung mit Biotinamidocaproyl wurden zwar die gleichen Kopp-
lungsbedingungen wie für das Fluoreszenzlabel gewählt, doch wurde die Annahme
gemacht, dass bei gleicher Kopplungschemie auch die Kopplungsausbeute die gleiche ist.
Da sich der Biotinanker und der Floureszeinanker (Abbildung 4-4) in ihrer chemischen
Struktur deutlich unterscheiden, ist nicht auszuschließen, dass dies auch zumindest
geringfügige Auswirkungen auf die Kopplungsausbeute haben könnte.
Aufgrund der dargestellten Nachteile wurde die cysteinspezifische Biotinylierung für alle
hGBP1-Varianten ausgewählt, auf die im nächsten Abschnitt eingegangen wird.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
100
4.2.3 Biotinylierung über einen cysteinspezifischen Biotinmaleinimidanker
In der Primärstruktur von hGBP1 liegen 9 Cysteine vor. Die Anzahl der möglichen ge-
koppelten Anker ist somit deutlich kleiner als bei den Lysinen. Die Cysteine sind über die
gesamte Sekundärstruktur des Proteins verteilt (Abbildung 4-8). Davon befinden sich 5
Cysteine innerhalb der GTPase-Domäne (LG-Domäne) von hGBP1 (Cys 12, 82, 225, 235
und 270). Cys 311, 396 und 407 sind in der Mitteldomäne lokalisiert, das Cys 589 ist Teil
des hochflexiblen Isoprenylierungsmotivs. Für diese Cysteine lassen sich Unterschiede in
der Exposition gegenüber dem, sie umgebenden, Solvenz feststellen.
Abbildung 4-8: Kristallstruktur von hGBP1 mit Nukleotid (rot) und Mg2+
(grau). Alle
Cysteine sind über die schwarzen Pfeile markiert. 5 Cysteine sind in der LG-Domäne, 3 in der
Mitteldomäne un das Cys 589 im CaaX-Motiv lokalisiert.
Eine Abschätzung der Exporniertheit der einzelnen Cysteine ist über die Accessible
Surface Area (ASA) möglich. Die ASA gibt Informationen über die solvenzexponierte
Oberfläche des zu untersuchenden Moleküls. Dazu wird eine Sonde (Kugel mit einem
Radius von 1,4 Å, entspricht dem Radius eines Wassermoleküls) über die zu
untersuchende Oberfläche bewegt wird (Kristallstruktur des Proteins). Unter
Einbeziehung eines entsprechenden Algorithmus wird anschließend die ASA berechnet
(Tsodikov et al., 2002; Richards, 1977). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt
(Vöpel et al., 2009). Aufgrund dieser Berechnungen und des zur Überprüfung der
vorhergesagten Zugänglichkeiten durchgeführten 5,5´-Dithiobis-(2-Nitrobenzoesäure)
(DTNB)-Tests (Vopel et al., 2009) konnten nun Mutanten von hGBP1 hergestellt werden,
in denen insbesondere die Cysteine, die sich in der GTPase-Domäne befinden und für die
eine hohe Exporniertheit berechnet wurde, durch Einführung einer gezielten
Punktmutation ausgetauscht worden sind.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
101
Tabelle 2: Ergebnisse der ASA Berechnung. Die Kristallstrukturen von hGBP1 ohne Nukleotid
(1dg3, PDB) und die der LG-Domänen gebunden an GDP*AlFx (2b92, PDB) wurden für die
Berechnung verwendet (entnommen aus Vöpel et al., 2009). Das C589 ist Teil des hochflexiblen
Isoprenylierungsmotivs und wurde bei der Berechnung nicht miteinbezogen.
Aminosäure ASA (Ų) PDB: 1dg3 ASA (Ų) PDB: 2b92
Cys 12 14,1 22,8
Cys 82 0 0,9
Cys 225 7,6 36,3
Cys 235 2,3 2,1
Cys 270 12,1 15,3
Cys 311 7,3 -
Cys 396 18,5 -
Cys 407 0 -
Cys 589 - -
Um eine spezifische und vor allen Dingen vorhersagbare Kopplung des Biotinankers zu
ermöglichen, wurde für alle in dieser Arbeit verwendeten hGBP1-Mutanten eine hGBP1-
Variante verwendet, die im Folgenden mit Cys5 bezeichnet wird. In der Cys5-Mutante
sind die Cysteine ausgetauscht worden, für die in den ASA-Berechnungen eine hohe
Exporniertheit vorhergesagt wurde. Die betroffenen Cysteine sind C12, C270, C311,
C396 und C589 (Teil des Isoprenylierungsmotivs (CaaX-Box)). Das C225 hat nur im
nukleotidgebundenen Zustand eine hohe Zugänglichkeit und sollte auf die Biotinylierung
keinen Einfluss haben, da diese nukleotidfrei vonstatten geht. Auf der Basis der Cys5-
Abbildung 4-9: Kristallstruktur von hGBP1 mit markiertem Glutamin an der Position 577.
Das Glutamin (Q) wurde durch ein Cystein (C), um an dieser Position eine gezielte Kopplung des
Biotinankers zu ermöglichen.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
102
Mutante wurden weitere Mutanten hergestellt, die für die Bindung an Streptavidin auf der
Biotin-SAM-Oberfläche genutzt werden sollten. Zum einen wurde eine Einfachmutante
erzeugt, bei der an der Position 577 ein Glutamin durch ein Cystein ersetzt wurde.
Zum anderen wurde neben der Einführung des Cysteins an der Stelle 577 ein weiteres
Cystein an der Position 485 eingebaut. Diese auf der Basis von Cys5 hergestellte Dop-
pelmutante ist in Abbildung 4-10 dargestellt:
Abbildung 4-10: Kristallstruktur von hGBP1 mit markiertem Glutamin 577 und Lysin 485.
Beide Positionen wurden durch ein Cystein ersetzt.
Bei der dritten Mutante sollte ausschließlich die Position 485 biotinyliert werden
(Abbildung 4-11).
Abbildung 4-11: Kristallstruktur von hGBP1 mit markiertem Lysin 485. Das Lysin wurde
für eine spezifische Biotinmaleinimidverankerung durch ein Cystein ersetzt.
Die beiden Einfachmutanten Q577C und K485C sollten im Vergleich zur zweifach
biotinylierten Mutante Q577C/ K485C erwartungsgemäß ein anderes Bindungsverhalten
und in Folge dessen eine andere Orientierung und Flexibilität auf der Oberfläche zeigen.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
103
Dies nachzuweisen und zu belegen, steht im Vordergrund dieses 1.Projektes (Kapitel 4).
Erst im zweiten Projekt (Kapitel 5) soll die Dimerisierung von hGBP1 betrachtet und
hinsichtlich kinetischer Aspekte untersucht werden. Da die Dimerisierung hauptsächlich
über die G-Domäne vermittelt wird, wurde für diese Studien in erster Linie die Mutante
K485C (Abbildung 4-11) erzeugt, bei der dieser Bereich frei zugänglich ist und das hGBP1
praktisch als „Fängermolekül“ für in Lösung befindliche hGBP1-Moleküle fungieren
kann.
Für die Biotinylierung der drei Mutanten wurde das Kit „Maleimid-PEG11-Biotin“
(Thermo Scientific) verwendet. Der Linker ist 59,1 Å lang und hat eine molare Masse von
922,09 g/mol. Die Reaktionsbedingungen und die Berechnung der benötigten Menge an
Biotin Reagenz wurden gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Die
Kopplungsreaktion erfolgte für 2 Stunden auf Eis in 50 mM Phosphatpuffer.
Anschließend wurde in Puffer C* umgepuffert. Neben der Einfach- und Doppelmutante
wurde jeweils ein dritter Ansatz mit der nicht mutierten Cys5 angesetzt, um
auszuschließen, dass neben den Cysteinen an der Position 577 und/oder 485 noch andere
Cysteine unter den gewählten Reaktionsbedingungen mit dem Biotinanker reagieren.
Für die Quantifizierung der Biotinylierung wurde das „EZTM
Biotin Quantitation Kit“ von
Thermo Scientific verwendet. Alle Arbeitsschritte wurden gemäß Anleitung durchgeführt.
Zur Überprüfung des Farbtests wurde zunächst die vom Hersteller mitgelieferte
Merrettichperoxidase (HRP), die ausschließlich einen Biotinanker besaß, eingesetzt.
Tabelle 3: Ergebnisse der Quantifizierung der Biotinylierungseffizienz über das "EZTM
Bio-
tin Quantitation Kit".
Protein Anzahl der Anker
Merrettichperoxidase (HRP) 1,05
Cys5 0,08
Einfachmutante Q577C 1,1
Doppelmutante Q577C/ K485C 1,96
Einfachmutante K485C 0,98
Dieser eine Anker konnte mit einer Varianz von weniger als 10 % ermittelt werden.
Die Ergebnisse der Quantifizierung sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Da für die Merrettichperoxidase genau ein Anker nachgewiesen werden konnte, wurde
der Beweis erbracht, dass unter den gewählten Versuchsbedingungen der Farbtest funkti-
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
104
oniert. Desweiteren wurde für die Cys5-Mutante, die die Basis für die anderen Mutanten
(Q577C und Q577C/K485C) bildet, keine Ankerkopplung nachgewiesen und damit ge-
zeigt, dass die in der Cys5 vorhandenen Cysteine bei den verwendeten Inkubationszeiten
von 2 Stunden und den Reaktionsbedingungen (auf Eis in Phosphatpuffer) keine Kopp-
lungsreaktion mit dem Biotinanker eingehen. Erwartungsgemäß wurden für die Doppel-
mutante zwei Anker und für die beiden Einfachmutanten ein Anker mit hoher Effizienz
nachgewiesen.
4.2.4 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse
Im Gegensatz zu der lysinspezifischen und pH-abhängigen Biotinankerkopplung erweist
sich die Kopplung über die Cysteine in hGBP1 als deutlich einfacher und vor allen Din-
gen effektiver. Da es im hGBP1 nur 9 Cysteine (aber 49 Lysine) gibt, von denen 5 eine
hohe Exporniertheit gegenüber dem umgebenden Solvenz zeigen (Berechnung über
ASA), war es durch Einführung gezielter Punktmutationen möglich, diese Cysteine durch
Serin oder Alanin zu ersetzen. Die daraus entstandene Cys5-Mutante wurde eingesetzt,
um die an den Positionen 577 und/oder 485 gezielt eingefügten Cysteine mit einem
Biotinmaleinimidanker zu koppeln. Über einen Farbschnelltest, der die direkte
Quantifizierung der gebundenen Anker im Protein ermöglicht, wurde die erfolgreiche
Kopplung von einem Anker an die Einfachmutanten und zwei Anker an die
Doppelmutante nachgewiesen. Da für die veränderte Cys5 keine Ankerkopplung
festgestellt werden konnte, war damit gezeigt, dass sich die Anker an der Position 577
und/oder 485 befinden müssen. Bei der lysinspezifischen Kopplung wäre die Substitution
aller Lysine durch Punktmutationen im vorgegebenen Zeitrahmen nicht möglich gewesen.
Auch der für die cysteinspezifische Kopplung angewandte Farbtest zur Quantifizierung
ist wegen der hohen Anzahl an Lysinen nicht anwendbar. In dem Fall wäre der
zeitintensive Weg über enzymatischen Verdau und massenspektrometrischen (MALDI)
Nachweis unumgänglich.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
105
4.3 Oberflächenspektroskopische Untersuchungen des Streptavidin-
hGBP1-Systems
4.3.1 Massenspektrometrischer Nachweis des immobilisierten Streptavidin und
hGBP1 an der Biotin-SAM-Oberfläche
Im nächsten Schritt wurde ein Goldwafer mit einem aufgebrachten Biotinthiol-SAM
(10%ig im Bezug auf OH-Thiol) und den über Oberflächenplasmonenspektroskopie im-
mobilisierten Proteinen Streptavidin und hGBP1 mit His-tag und Biotinanker einer mas-
senspektrometrischen Untersuchung mittels MALDI-TOF unterzogen, um die detektier-
ten Massen mit den aus der Kristallstruktur theoretisch ermittelten Massen zu verglei-
chen. Exemplarisch wurde für die Immobilisierung die Einfachmutante Q577C
verwendet.
Zunächst wurden die Massen von Streptavidin und hGBP1 in Lösung gemessen. Für
diese Messung wurde das hGBP1 ohne Biotinanker eingesetzt. Die verwendeten Matrizes
waren bei Streptavidin Sinapinsäure und bei hGBP1 Zimtsäure:
Abbildung 4-12: MALDI-Spektrum von Streptavidin. Die verwendete Matrix ist Sinapinsäure.
Der Peak mit der höchsten Intensität bei m/z = 13105,5 entspricht einem Streptavidin-Monomer.
Die aktive Form von Streptavidin, das Tetramer, ist nur sehr schwach zu erkennen (m/z =
52256,7).
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
106
Das tetramere Streptavidin hat eine molare Masse von 52168 kDa (UniProt: P22629), was
gut mit der im MALDI-Spektrum erhaltenen Masse übereinstimmt (m/z = 52256,7).
Abbildung 4-13: MALDI-Spektrum von hGBP1. Die verwendete Matrix ist Zimtsäure. Die
beiden Peaks bei 69507,7 und 34753,8 lassen sich der molaren Masse von hGBP1 als einfach und
zweifach geladenes Molekülion zuordnen.
Abbildung 4-14: MALDI-Spektrum von Biotinthiol auf einer Goldoberfläche. Der Peak bei
m/z= 596,7 entspricht dem Molekulargewicht von Biotinthiol mit einem Na+-Addukt
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
107
Des Weiteren lassen sich das dimere und monomere Streptavidin (m/z = 26150,2 und
13105,5) detektieren. Das MALDI-Spektrum von hGBP1 (Abbildung 4-13) zeigt zwei
markante Peaks bei m/z = 69507,7 und 34753,8, die der Masse von hGBP1 (69384 g/mol;
UniProt: P32455). Im nächsten Spektrum (Abbildung 4-14) erfolgte die direkte Ionisierung
des Biotinthiol-SAMs von der Goldoberfläche. Da für den Misch-SAM, bestehend aus
10 % Biotinthiol und 90 % Merkaptoundekanol, keine ausreichenden Intensitäten erreicht
werden konnten, wurde eine Goldoberfläche mit 100 % Biotinthiol präpariert. Der Peak
bei 596,7 entspricht dem Biotinthiol (574 g/mol) und einem Na+-Addukt. Das
Streptavidin konnte auf der Biotinthiol-SAM-Oberfläche (hier Misch-SAM, bestehend
aus 10 % Biotinthiol und 90 % OH-Thiol) nach Immobilisierung über Oberflächenplas-
monenresonanzspektroskopie als einfach (m/z = 6508,8) und zweifach (m/z = 13003,2)
geladenes Monomer sowie Dimer (m/z = 26081,3) nachgewiesen werden (Abbildung
4-15)
Abbildung 4-15: MALDI-Spektrum von immobilisiertem Streptavidin auf einem
Biotinthiol-SAM. Das Streptavidin wurde mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie
(SPR) immobilisiert. Das Streptavidin-Monomer (m/z = 13003,15 (einfach geladen) und 6508,8
(zweifach geladen)) sowie das Dimer (m/z = 26081,3) lassen sich dem Spektrum zuordnen.
Wird die Oberfläche anschließend mit hGBP1 beladen, lässt sich ein schwacher Peak bei
ca. m/z = 70430 identifizieren (Abbildung 4-16), der dem hGBP1 (m/z = 69507,7) mit
Biotinanker (M = 922,09 g/mol) zuzuordnen ist.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
108
Abbildung 4-16: MALDI-Spektrum von nacheinander immobilisiertem Streptavidin und
hGBP1 auf einem Biotinthiol-SAM. Die Immobilisierung erfolgte über SPR. Streptavidin-
Monomer (13390,9) und Dimer (26415,4) sowie das hGBP1 mit His-tag und Biotinanker
(70430,4) lassen sich den gemessenen Massen zuordnen.
4.3.1.1 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse
Die Ergebnisse der MALDI-Messungen zeigen, dass die beiden Proteinkomponenten,
Streptavidin und hGBP1 sowie das Biotinthiol als wichtigste SAM-Komponente
erfolgreich auf der Goldoberfläche immobilisiert werden konnten und direkt auf dem
SPR-Chip detektierbar waren. Besonders hervorzuheben ist darüber hinaus, dass
Streptavidin in Lösung (Abbildung 4-12) nicht nur als Monomer und Dimer, sondern
auch in seiner tetrameren Form, wenn auch mit sehr geringer Intensität, detektierbar war.
Erst kürzlich (Wortmann et al., 2007) wurde in diesem Zusammenhang das so genannte
„first shot phenomenon in MALDI mass spectrometry“ untersucht. Dahinter verbirgt sich
die Beobachtung, dass „nicht-kovalente“ Proteinkomplexe wie das tetramere Streptavidin
nur nach einem einzigen Laserpuls detektierbar seien und bei weiteren Shots direkt in
Monomere und Dimere zerfallen. Deswegen ist es umso bemerkenswerter, dass es bei
geringer Laserintensität und 50 Shots gelungen ist, das tetramere Streptavidin zu
identifizieren. Auch wenn die Intensität des Massenpeaks noch sehr gering ausfällt, ist
eine erste Grundlage für zukünftige Studien gelegt.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
109
4.3.2 Oberflächenplasmonenresonanzmessungen
4.3.2.1 Einfluss der verwendeten Biotinthiolkonzentration auf die Immobilisierung
von hGBP1
In vorherigen Arbeiten (Chelmowski et al., 2007) wurde bereits untersucht, welchen Ein-
fluss die verwendete Biotinthiolkonzentration auf die Belegungsdichte von Streptavidin
hat und welches Mischungsverhältnis zwischen Biotinthiol und OH-Thiol für die
Immobilisierung des Proteins optimal ist. Hierbei wurde festgestellt, dass im Bereich
zwischen 5 und 10 % Biotinthiol die Belegung von Streptavidin maximal ist und der
Anteil an unspezifischer Adsorption minimiert werden kann. In dieser Arbeit wurde
zusätzlich der Einfluss der Biotinthiolkonzentration auf die Immobilisierung von hGBP1
auf Streptavidin gemessen. Hierzu wurden die SPR-Goldwafer mit verschieden
konzentrierten Biotinthiol-Lösungen im Bereich zwischen 0,1 und 10 % (die Verdünnung
erfolgte mit OH-Thiol-Lösung) über 3 Stunden inkubiert und anschließend mittels SPR
die beiden Proteinkomponenten Streptavidin und biotinyliertes hGBP1 (Einfachmutante
Q577C und Doppelmutante Q577C/K485C) über die SAM-Oberfläche geleitet
Abbildung 4-17: Konsekutive Immobilisierung von Streptavidin und biotinyliertem hGBP1
(Doppelmutante Q577C/K485C) auf unterschiedlich biotinylierten SAMs. Die
Prozentangaben in der Legende beziehen sich auf die Konzentration an Biotinthiol in der binären
Mischung mit OH-Thiol.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
110
Für die Einfachmutante K485C wurde diese Studie nicht durchgeführt. In Abbildung 4-17
ist die konsekutive Immobilisierung von Streptavidin und exemplarisch für die
Doppelmutante gezeigt.
Abbildung 4-18: Beladung der Oberfläche mit Streptavidin und den beiden hGBP1-
Mutanten (Q577C und Q577C/K485C) in Abhängigkeit von der Biotinthiolkonzentration.
Die Konzentration von Biotinthiol bezieht sich auf die binäre Mischung mit OH-Thiol.
Die Kopplung von Streptavidin und den beiden hGBP1-Mutanten Q577C und
Q577C/K485C in Abhängigkeit von der Biotinthiolkonzentration sind in Abbildung 4-18
zusammengefasst. In Tabelle 4 sind die Maximalwerte der Beladung für Streptavidin und
den beiden hGBP1-Mutanten bei der jeweiligen Biotinthiol-Konzentration dargestellt.
Streptavidin erreicht erwartungsgemäß im Bereich zwischen 5 und 10 % Biotinthiol die
höchste Beladung mit 160 bzw. 154 ng/cm2 (Chelmowski et al., 2007). Ansonsten lässt
sich das Immobilisierungsverhalten von Streptavidin so beschreiben, dass zwischen 0,1
und 0,4 % einen im Rahmen der Fehlergrenzen einheitlicher Wert von knapp 40 ng/cm²
festgestellt werden kann, der beim Übergang von 0,4 (37 ng/cm²) zu 0,6 % (110 ng/cm²)
auf den dreifachen Wert rapide ansteigt. Die Entwicklung zwischen 0,6 und 5 %
Biotinthiol lässt sich dagegen eher mit einem kontinuierlichen Anstieg der
Streptavidinbelegung beschreiben. Für die Einfachmutante Q577C ist ein analoges
Verhalten zum Streptavidin festzustellen. Auch hier liegt die Maximalbelegung zwischen
5 und 10 % Biotinthiol (190 bzw. 185 ng/cm²).
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
111
Tabelle 4: Ergebnisse der Belegung von Streptavidin und den biotinylierten hGBP1-
Mutanten in Abhängigkeit von der Biotinthiolkonzentration
Biotinthiol-
Konzentration
[mol-%]
Maximale Beladung
Streptavidin
[ng/cm²]
Maximale Beladung
K485C/Q577C
[ng/cm²]
Maximale Beladung
Q577C
[ng/cm²]
0,1 38 ± 5 78 ± 5 59 ± 5
0,2 32 ± 5 92 ± 5 60 ± 5
0,4 37 ± 5 85 ± 5 55 ± 5
0,6 110 ± 5 90 ± 5 162 ± 5
0,8 105 ± 5 85 ± 5 163 ± 5
1 130 ± 5 72 ± 5 175 ± 5
5 160 ± 5 65 ± 5 190 ± 5
10 154 ± 5 52 ± 5 185 ± 5
Wie bei Streptavidin steigt die Maximalbelegung beim Übergang von 0,4 (55 ng/cm²) zu
0,6 % Biotinthiol sprunghaft auf den dreifachen Wert an. Dagegen zeigt die
Doppelmutante ein innerhalb des untersuchten Biotinthiolkonzentrationsbereiches
unabhängiges Immobilisierungsverhalten. Insgesamt nimmt die Belegung von 0,1 bis
10 % Biotinthiol um ein Drittel ab. Ein sprunghafter Anstieg zwischen 0,4 und 0,6 %
Biotinthiol kann nicht beobachtet werden.
Die Ermittlung der molaren Verhältnisse zwischen Streptavidin und den beiden Mutanten
ergeben sich im Bereich von 5 und 10 % Biotinthiol wie folgt. Für die Berechnung wird
die erhaltene Beladung durch die molare Masse von Streptavidin (52 kDa) bzw. hGBP1
(69 kDa) geteilt und die erhaltenen Werte ins Verhältnis gesetzt:
Beispiel (10 % Biotinthiol):
52 154(Doppelmutante) (Strep) 0,0008 0,003 0,27
69.000 52.000
Das molare Verhältnis von Streptavidin zur Doppelmutante ist somit 1: 0,27. Auf ein
hGBP1-Molekül kommen also ca. 4 Tetramere Streptavidin. Dementsprechend ergeben
sich für die Berechnung der anderen molaren Verhältnisse bei 10 % Biotinthiol folgende
Werte:
Streptavidin: Einfachmutante = 1 : 0,95
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
112
Doppelmutante: Einfachmutante = 1 : 3,55
Das Verhältnis von Streptavidin zu der Einfachmutante Q577C kann demnach mit
meinem 1:1-Verhältnis beschrieben werden. Die Beladung der Einfachmutante im
Vergleich zur Doppelmutante ist drei- bis vierfach höher. Bei 0,4 % Biotinthiol, also
direkt vor dem sprunghaften Anstieg der Beladung mit Streptavidin und der
Einfachmutante, ergeben sich die folgenden molaren Verhältnisse:
0,4 % Biotinthiol:
Streptavidin: Einfachmutante = 1: 1,17
Streptavidin: Doppelmutante = 1: 1,81
Doppelmutante: Einfachmutante = 1: 0,72
Das Verhältnis von Streptavidin zur Einfachmutante bleibt auch hier in etwa 1:1. Die
Belegung der Doppelmutante jedoch ist bei 0,4 % Biotinthiol fast doppelt so groß
gegenüber Streptavidin und auch im Vergleich zur Einfachmutante wird ca. ein Drittel
mehr immobilisiert.
4.3.2.2 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse
Aus diesen Ergebnissen ließen sich für die weitere Vorgehensweise wichtige Erkennt-
nisse ziehen. Die Veränderung der Biotinthiolkonzentration hat einen gravierenden Ein-
fluss auf das Gesamtsystem mit den Komponenten Streptavidin und den beiden biotiny-
lierten hGBP1-Mutanten. Im Bereich zwischen 5 und 10 % Biotinthiol lassen sich die
gemessenen Beladungen und berechneten molaren Verhältnissen sehr gut mit den be-
kannten molekularen Geometrien der beteiligten Proteine und den aufgrund der Einfach-
bzw. Mehrfachbiotinylierung zu erwartenden unterschiedlichen Orientierungen der
beiden hGBP1-Mutanten in Einklang bringen. Für die Einfachmutante ist gegenüber der
Doppelmutante bei 10 % Biotinthiol eine 3 bis 4-fach höhere Belegung ermittelt worden.
Wenn davon ausgegangen wird, dass die Einfachmutante mit einem Anker an die
Oberfläche gebunden ist, die Doppelmutante jedoch mit zwei Ankern, die an den beiden
Enden der langen Seite des Moleküls lokalisiert sind, ergeben sich für die Mutanten
unterschiedliche Footprints, also Kontaktflächen mit der Oberfläche. Der Anker der
Einfachmutante ist im Bereich der GTPase-Domäne von hGBP1 lokalisiert. Die Mutante
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
113
Q577C sollte also senkrecht auf der Oberfläche stehen, wobei die G-Domäne zur
Oberfläche gerichtet ist. Wird die aus der Kristallstruktur bekannte Geometrie von
hGBP1 für die Berechnung des Footprints zugrundegelegt ((2-3) nm x 4 nm x 13 nm)
würde die Kontaktfläche ca. 8 bis 12 nm² groß sein. Im Gegensatz dazu besitzt die
Doppelmutante zwei Anker an den beiden Enden der langen Seite von hGBP1 (13 nm),
die dazu führen, dass das hGBP1 flach auf der Oberfläche liegt und damit einen 3 bis 4-
fach höheren Footprint (3 x 13 nm = 39 nm²) auf der Oberfläche einnimmt. Folglich ist
zu erwarten, dass die gemessene Belegung für die Doppelmutante ca. 3 bis 4-fach kleiner
ausfallen müsste als für die Einfachmutante, was durch das molare Verhältnis von 1 zu
3,55 (Doppelmutante: Einfachmutante) bestätigt wird. Auf Basis dieser Überlegungen
lässt sich ebenso begründen, warum die Einfachmutante bei 10 % Biotinthiol in einem 1
zu 1 Verhältnis (1: 0,95 ↔ Streptavidin: Einfachmutante), die Doppelmutante in einem 1
zu 4 Verhältnis (1: 0,276 ↔ Streptavidin: Doppelmutante) gegenüber Streptavidin an die
Oberfläche bindet. Während der Footprint der Einfachmutante ausreichend klein ist, um
eine Bindung mit jedem Streptavidin-Molekül einzugehen, werden bei der
Doppelmutante 3 bis 4 Proteine Streptavidine bedeckt. Die Bindung der Q577C/K485C
an die Oberfläche erfolgt also nur über jedes vierte Molekül Streptavidin, wodurch auch
zu erklären wäre, warum die Immobilisierung der Doppelmutante auch im Bereich
zwischen 0,1 und 0,4 % Biotinthiol konstant bleibt. Streptavidin verfügt, wenn es an eine
organische Oberfläche angekoppelt wird, über eine Kontaktfläche von 4,5 nm * 5,3 nm =
23,85 nm². In einem dicht gepackten SAM aus Alkanthiolen wird diese Fläche von mehr
als 111 Alkanthiol-Molekülen ausgefüllt, sofern man den Platzbedarf pro Alkanthiol-
Molekül mit 21,4 Ų ansetzt. In einer Proteinmonolage benötigen die Proteine mehr Platz
als die geometrische Grundfläche. Für Streptavidin wurde eine maximale
Flächenausfüllung von 66 % in einem zweidimensionalen Proteinkristall gemessen (Knoll
et al., 2000). Auf biotinylierten Lipiden, wo die Streptavidine gegeneinander verschiebbar
sind, wurde eine Flächenausfüllung von 65 % und auf biotinylierten SAM-Oberflächen
von 53 % beobachtet, d. h. um eine vollständige Streptavidin-Monolage an einer
organischen Dünnschicht aufzubauen, genügt es, auf 222 OH-Thiole statistisch ein
Biotinthiol anzukoppeln, was einer Konzentration von 0,45 mol-% Biotinthiol entspricht
(Ostuni, E., Yan, L., Whitesides, G. M., 1999). Diese theoretischen Überlegungen lassen
sich mit den gemessenen Beladungen in Einklang bringen. Beim Übergang von 0,4 zu
0,6 % steigt die Adsorption von Streptavidin auf ca. das Dreifache des ursprünglichen
Wertes an (110 → 37 ng/cm²). Gemäß den statistischen Berechnungen ist bei 0,4 % der
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
114
Aufbau einer Streptavidin-Monolage nicht mehr möglich, bei 0,6 % dagegen schon. Der
Grund, warum die Immobilisierung der Doppelmutante zwischen 0,1 und 0,4 %
Biotinthiol jedoch konstant bleibt, lässt sich so erklären, dass, wie bereits erwähnt, ca. 3
bis 4 Moleküle Streptavidin von der flach auf der Oberfläche liegenden Mutante bedeckt
werden und somit an der Bindung nicht beteiligt sind. Erst bei weiterer Abnahme der
Biotinthiolkonzentration müsste folgerichtig auch die Belegung der Doppelmutante
abnehmen. Da die Einfachmutante an jedes Streptavidin-Molekül bindet, sollte sich die
Immobilisierung parallel zur Belegung von Streptavidin verhalten, was durch die
Ergebnisse bestätigt wird. Beim Übergang von 0,4 zu 0,6 % Biotinthiol ist sowohl bei
Streptavidin als auch bei der Q577C ein sprunghafter Anstieg der Adsorption
festzustellen.
Des Weiteren lässt sich zwischen von 0,4 und 10 % ein höherer Anteil an unspezifischer
Bindung der Einfachmutante an die mit Streptavidin belegte Oberfläche feststellen.
Während bei 0,4 % Biotinthiol das molare Verhältnis von Streptavidin zu Einfachmutante
1: 1,17 beträgt, verändert sich der Wert bei 10 % auf 1: 0,95, nähert sich also einem
exakten 1:1-Verhältnis an. Dieses Ergebnis untermauert die in früheren Studien
beschriebenen Beobachtungen (Chelmowski et al., 2007), dass der Anteil an unspezifisch
gebundenem Protein zwischen 5 und 10 % Biotinthiol am geringsten ist. Des Weiteren
wurde festgestellt, dass unterhalb von 5 % Biotinthiol die Bindungsstellen für
Streptavidin zunehmend verarmen, was zu einer verminderten Belegung führt. Auch dies
kann durch die Ergebnisse bestätigt werden. Die Beladung hat ein Maximum zwischen 5
und 10 % Biotinthiol (160 bzw. 154 ng/cm²) und sinkt kontinuierlich auf 130 (1 %
Biotinthiol) und weiter auf 110 bzw 105 ng/cm² ab (0,6 bzw 0,8 % Biotinthiol), bevor
dann der abrupte Abfall folgt, der, wie beschrieben, dadurch zustande kommt, dass eine
Streptavidin-Monolage nicht mehr ausgebildet werden kann. Obwohl die Belegung der
Doppelmutante insgesamt relativ konstant ist, ist ein leichtes Absinken der Beladung
Anstieg der Adsorption von 78 ng/cm² bei 0,1 % Biotinthiol auf 52 ng/cm² be1 10 %
Biotinthiol festzustellen. Auch hier kann sicherlich mit einer Abnahme an unspezifischer
Adsorption argumentiert werden, was ein weiteres Argument für eine Beibehaltung der
ursprünglichen Biotinthiolkonzentration von 10 % Biotinthiol für die weiteren
Messungen ist. Darüber hinaus könnte der Anstieg der Beladung auch damit erklärt
werden, dass mit zunehmender Verarmung der Streptavidin-Moleküle auf der Oberfläche
die Doppelmutante nicht mehr mit beiden Ankern an die Oberfläche immobilisiert,
sondern teilweise nur mit einem, was eine Verkleinerung des Footprints und damit die
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
115
Möglichkeit für eine höhere Belegung bietet. Auch diese Erklärung führt aber ebenso zu
der Erkenntnis, dass die Verringerung der Biotinthiolkonzentration unterhalb von 5 %
Biotinthiol die Belegung mit Streptavidin und hGBP1 unkontrollierbar macht und keine
eindeutigen Aussagen über molare Verhältnisse und Orientierung der Moleküle auf der
Oberfläche zulassen, da zunehmend störende Faktoren, wie die unerwünschte spezifische
Bindung, auf die Messungen Einfluss nimmt.
4.3.2.3 Überprüfung der unspezifischen Adsorption von Streptavidin und hGBP1
auf einem reinen OH-Thiol-SAM
In Abbildung 20 ist die unspezifische Adsorption der verwendeten Proteine auf einem
OH-terminierten SAM dargestellt. Zunächst wurde Streptavidin dreimal hintereinander
jeweils für 45 Minuten inkubiert (A1- A3). Die Mehrfachinkubation diente dazu, auch die
unspezifische Adsorption von Streptavidin auf Streptavidin zu betrachten. Anschließend
erfolgte die Adsorption von hGBP1 ohne Anker direkt auf Streptavidin (A4). In allen
Fällen A1 bis A4 fällt die Adsorption sehr gering aus und steigt maximal auf 2 ng/cm² an.
Abbildung 4-19: Unspezifische Adsorption von Streptavidin und hGBP1 auf einem reinen
OH-Thiol-SAM. Die grüne und rote Kurve zeigen die unspezifische Adsorption von Streptavidin
auf einem SAM aus OH-Thiol (A1-A3) und die von hGBP1 ohne Anker auf dem unspezifisch
adsorbierten Streptavidin (A4). In der schwarzen Kurve (B) ist die unspezifische Adsorption von
hGBP1 auf dem OH-Thiol-SAM dargestellt.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
116
Da nach Dissoziation (Waschen) der Wert sowohl für Streptavidin als auch für hGBP1
wieder auf null (Mads > 0,5 ng/cm²) abfällt, sind für den beobachtbaren Anstieg in erster
Linie minimale „Bulk“-Effekte verantwortlich. Die unspezifische Adsorption von hGBP1
direkt auf OH-Thiol fällt mit ca. 5 ng/cm² geringfügig höher aus und sinkt auch während
der Dissoziationsphase nicht weiter ab. Insgesamt ist für alle beteiligten Proteinkompo-
nenten die unspezifische Bindung zwar messbar, aber sehr schwach und damit kaum von
Relevanz.
4.3.2.4 Kontrolle der Streptavidinbelegung
Im Abschnitt 2.7 wurde bereits ausführlich über das Biotin-Streptavidin-System gespro-
chen und anhand des in der Literatur beschriebenen Fallbeispiels (Chelmowski et al.,
2007) konnten bereits wichtige Erkenntnisse bezüglich der Adsorptionskinetik und Bele-
gung von Streptavidin gewonnen werden, die in dieser Arbeit ihre Anwendung finden.
Um die Reproduzierbarkeit der Belegung für verschiedene Goldwafer zu überprüfen,
wurden SPR-Goldchips für exakt zwei Stunden in 10 % Biotinthiol und 90 % OH-Thiol
inkubiert und anschließend Streptavidin für 20 Minuten mittels SPR inkubiert. Die Er-
gebnisse sind in Abbildung 4-20 und Tabelle 4 dargestellt.
Abbildung 4-20: Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Adsorption von Streptavidin auf
verschiedenen SPR-Goldchips. Die Goldchips wurden zwei Stunden mit 10 % Biotinthiol und
90 % OH-Thiol inkubiert. Anschließend wurde über 20 Minuten Streptavidin (0,4 µM) über die
Oberfläche geleitet.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
117
Tabelle 5: Streptavidin-Belegung auf verschiedenen Goldchips
Anzahl der Messungen Adsorption Streptavidin [ng/cm²]
1 (hellblaue Kurve) 137
2 (gelbe Kurve) 141
3(braune Kurve) 137
4 (schwarze Kurve) 137
5 (violette Kurve) 142
6 (rote Kurve) 141
7 (dunkelgrüne Kurve) 141
8 (dunkelblaue Kurve) 140
9 (olivgrüne Kurve) 140
Der Mittelwert der Einzeladsorptionen ergibt sich zu 139,6 ng/cm², die Standardab-
weichung beträgt ± 2 ng/cm², was einer prozentualen Abweichung von weniger als 2 %
entspricht.
Abbildung 4-21: Adsorption von Streptavidin (1. Anstieg) und den beiden hGBP1-Mutanten
auf einem Biotinthiol-SAM (2.Anstieg). Die Belegungsdichte mit Streptavidin (ca. 145 ng/cm²)
ist bei 10 % Biotinthiol gut kontrollierbar und reproduzierbar. Die Beladung der Einfach- (rote
Kurve) und Doppelmutante (schwarze Kurve) erfolgt ca. in einem 3:1-Verhältnis. Die
unspezifische Adsorption für das nicht biotinylierte hGBP1 ist in der blauen Kurve dargestellt.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
118
In der Abbildung 4-21 ist zunächst die Bindungskinetik der beiden hGBP1-Mutanten
Q577C und Q577C/K485C auf Streptavidin gezeigt. Für die Präparation des Goldwafers
wurde 10 % Biotinthiol verwendet, um eine möglichst maximale Belegung zu erreichen
und den Anteil an unspezifischer Adsorption gering zu halten, und für ca. 3 Stunden
inkubiert. Die Belegung mit Streptavidin (0,4 µM) und Dissoziation erfolgte jeweils über
20 Minuten, bevor die beiden hGBP1-Mutanten (1 µM) und als Referenz hGBP1 ohne
Anker für weitere 20 Minuten über die Oberfläche geschickt wurden. Die anschließende
Dissoziationsphase erfolgte hier über 50 Minuten Wie in Abschnitt 4.3.2.2 bereits
besprochen, lassen sich die beiden Mutanten anhand ihrer Belegung unterscheiden, die
aus der unterschiedlichen Anzahl von Ankern (1 bzw. 2 Anker) und der daraus ergebenen
Orientierung auf der Oberfläche resultieren.
Abbildung 4-22: Bindungskinetiken der drei hGBP1-Mutanten. Die drei Mutanten sind
anhand ihres Bindungsverhaltens klar unterscheidbar. Die Belegung erfolgt in einem 3:2:1
Verhältnis (Q577C: K485C: Q577C/K485C).
In einer weiteren Messserie wurden zusätzlich die Mutante K485C hinsichtlich ihres
Immobilisierungsverhaltens untersucht und ihre Belegungsdichte mit den anderen beiden
Mutanten verglichen. Diese Ergebnisse sind in Abbildung 4-22 dargestellt. Für beide
Messungen (Abbildung 4-21) ergibt sich eine einheitliche Belegung mit Streptavidin
von145 ng/cm², was einer Belegung von ca. 30 % entspricht, wenn für Streptavidin eine
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
119
Kontaktfläche (Footprint) von 23,85 nm² angenommen (Ostuni, E., Yan, L., Whitesides,
G. M., 1999; Knoll et al., 2000) wird. Während der Dissoziationsphase bleibt die
Streptavidinbelegung aufgrund der starken Bindung zu Biotin konstant. Die
Immobilisierung der beiden hGBP1-Mutanten Q577C und Q577C/K485C erfolgt
erwartungsgemäß sehr rasch und zeigt auch während der Waschphase (Dissoziation) eine
stabile Belegung (Abbildung 4-21). Die maximale Beladung der Einfachmutante Q577C
ist dreimal höher (ca.205 ng/cm²) als für die Doppelmutante (77 ng/cm²). Auf eine
hGBP1-Doppelmutante kommen drei Tetramere Streptavidin, bei der Einfachmutante ein
Molekül. Die unspezifische Adsorption der hGBP1-Variante ohne Anker fällt mit <
5 ng/cm² erwartungsgemäß schwach aus.
Obwohl in der zweiten Messserie (Abbildung 4-22) die Beladung der Einfachmutante
Q577C und der Doppelmutante insgesamt etwas kleiner ausfällt (182 zu 68 ng/cm²), wird
auch hier ein 3:1-Verhältnis erhalten. Die Belegungsdichte für die Mutante K485C ist in
etwa genauso hoch (178 ng/cm²) wie bei der anderen einfach biotinylierten hGBP1-
Variante.
4.3.3 Schichtdickenbestimmung mittels AFM und QCM
Zur Verifizierung der SPR Daten wurden im nächsten Schritt die Schichtdicken der
Proteinlagen mittels Rasterkraftmikroskopie und Mikrofeinwaage bestimmt. Abbildung
4-23 zeigt die Ergebnisse für die AFM-Messungen an einem strukturierten Biotinthiol-
SAM, auf dem nacheinander Streptavidin und die hGBP1-Mutanten Q577C und
Q577C/K485C immobilisiert worden sind. Die Strukturierung erfolgte über das
Abkratzen der Oberfläche mit Hilfe der AFM-Spitze, der dabei mit hoher Kraft über die
Oberfläche rastert. Diese Technik wird als Nanoshaving bezeichnet und ist neben dem
Mikrokontaktstempeln eine mittlerweile gängige Methode zur lateralen Strukturierung
von Oberflächen. Für alle Messungen wurde der so genannte Tapping-Modus verwendet,
um Kompressionseffekte möglichst gering zu halten. Auf die Mutante K485C wurde das
Nanoshaving nicht angewendet. Die Topographiebilder zeigen deutlich, dass die
gebundenen Proteine eine geschlossene und homogene Schicht auf der Oberfläche bilden.
Über die Software SPIP konnte eine Querschnittsflächenanalyse durchgeführt und daraus
die Höhenprofile ermittelt werden. Für das Multikomponentensystem, welches sich aus
den Proteinen Streptavidin und hGBP1 zusammensetzt, ergibt sich bei der Doppelmutante
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
120
eine Höhe von (63,4± 10) Å und bei der Einfachmutante eine Höhe von (165± 5) Å. Wird
die in vorherigen Studien (Chelmowski et al., 2007) ermittelte Höhe von (42,2 ± 10) Å
zugrunde, ergeben sich aus der Höhendifferenz Schichtdicken von (21,2 ± 10) Å für die
Doppelmutante und (122,8 ± 10) Å für die Einfachmutante.
Abbildung 4-23: Topographiebilder (oben) und Höhenprofile (unten) nach Inkubation mit
Streptavidin und den hGBP1-Mutanten (links: Doppelmutante Q577C/K485C; rechts:
Einfachmutante Q577C). Durch Abkratzen (Nanoshaving) entsteht ein „Loch“ (dunkler
rechteckiger Bereich) in der Oberfläche, das bei der Schichtdickenbestimmung als Referenz
(Höhe = 0 nm) dient. Innerhalb der weißen Rechtecke in den Topographiebildern wurden die
Höhenprofilanalysen durchgeführt. Die ermittelte Höhe für die Streptavidin (ca. 4 nm) und der
Doppelmutante entspricht etwa nur einem Drittel der ermittelten Höhe für Streptavidin und
Einfachmutante (16,5 nm).
Beim Vergleich mit der Kristallstruktur von hGBP1 findet man bei den gemessenen
Höhen eine gute Übereinstimmung mit den Maßen der breiten Seite (20 -30 Å) bzw.
langen Seite (130 Å) von hGBP1. Zusammen mit den SPR-Ergebnisse unterstützen die
gemessenen Schichtdicken die Annahme, dass die Doppelmutante mit der langen Seite
auf der Oberfläche liegt, wohingegen die Einfachmutante mit der langen Seite orthogonal
zur Oberfläche orientiert ist.
Da beim Nanoshaving nicht gänzlich ausgeschlossen werden kann, dass der SAM und die
daran gebundenen Proteinschichten nur teilweise von der Oberfläche gekratzt werden und
somit die „ausgekratzte“ Fläche keine eindeutig definierte Nullwert-Referenz darstellt,
wurden Kontrollexperimente mittels Mikrokontaktstempeln durchgeführt. Im Bereich der
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
121
Abbildung 4-24: Topographiebilder nach Inkubation mit Streptavidin (links), der
Doppelmutante Q577C/K485C (Mitte) bzw. der Einfachmutante Q577C (rechts). Die Stem-
pelflächen (dunkle Quadrate, 3 µm x 3 µm) sind mit proteinresistentem OEG(6)-Thiol inkubiert
worden, die Stege (helle Bereiche) sind die Bereiche, in denen sich ein Biotinthiol-SAM und die
beteiligten Proteinkomponenten Streptavidin und/ oder hGBP1 befinden. Unter den Topographie-
bildern sind die jeweiligen Höhenprofile dargestellt. Die angegebenen Höhen für die Mutanten
beziehen sich immer auf die Summe von Streptavidin + hGBP1 Doppel- bzw. Einfachmutante.
Stempelflächen (dunkle Quadrate, Abbildung 4-24) befindet sich proteinresistentes
OEG(6)-Thiol, das präzise differentielle Höhenmessungen ermöglicht. In den Stegen zwi-
schen den Quadraten (helle Bereiche, Abbildung 4-24) sind nacheinander Biotinthiol,
Streptavidin sowie die beiden Einfach- (Q577C und K485C) bzw. Doppelmutante von
hGBP1 inkubiert worden. Die biotinylierten und mit den Proteinen inkubierten Bereiche
der Oberfläche können im Topographie-Modus deutlich unterschieden werden und
ergeben für alle immobilisierten Komponenten eindeutig zuzuordnende
Höhenunterschiede. Anhand der lateralen Strukturierung können, ähnlich wie beim
Nanoshaving, die Höhen der Proteinschichten charakterisiert werden. Die
Höhenmessungen (cross section) liefern für das Streptavidin (Abbildung 4-24) eine Höhe
von (41,3 ± 10) Å. Dieses Ergebnis stimmt mit dem über Nanoshaving erhaltenen Wert
gut überein und zeigt darüber hinaus eine gute Übereinstimmung mit Vermessungen der
Kristallstruktur von Streptavidin (Bank, 2005). Nach der sich anschließenden Inkubation
mit den hGBP1-Mutanten Q577C/K485C und Q577C steigt die Höhe der
Gesamtproteinlage auf (76,3 ± 10) Å und (163 ± 10) Å für die Einfachmutante an. Der
Unterschied zur Höhe der Streptavidinlage beträgt demnach (35 ± 10) Å für die
Doppelmutante und (121,7 ± 10) Å für die Einfachmutante. Auch diese gemessenen
Höhen stimmen gut mit den über Nanoshaving erhaltenen Werten überein und
unterstützen die Annahme, dass die beiden hGBP1-Mutanten in der Weise orientiert sind,
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
122
dass sie zum einen flach auf der Oberfläche liegen und über zwei Anker an Streptavidin
gebunden sind (Doppelmutante) und zum anderen senkrecht auf der Oberfläche stehen, so
dass die lange Seite von hGBP1 orthogonal zur Oberfläche steht (Einfachmutante).
In einer weiteren Messung wurde auch die Schichtdicke für die Mutante K485C ermittelt.
Abbildung 4-25: Topographiebilder einer lateral strukturierten Oberfläche nach Inkuba-
tion mit Streptavidin und der hGBP1-Mutante K485C. Die Aufnahme dieser Bilder erfolgte
analog zu den beiden anderen Mutanten.
Für die Doppelschicht von Streptavidin und der Mutante ergibt sich eine Höhe von
insgesamt (159,7 ± 10) Å. Nach Subtraktion der Schichtdicke von Streptavidin konnte
eine Höhe von (119,2 ± 10) Å für die Mutante K485C ermittelt werden. Dieses Ergebnis
spricht dafür, dass die Mutante mit der langen Seite auf der Oberfläche steht, und
bestätigt die über SPR erhaltenen Daten.
Ergänzend zu den AFM und SPR-Daten wurde die QCM-D-Technik angewendet, um die
Immobilisierung der beiden hGBP1-Mutanten zu untersuchen. Durch Einbeziehung des
Dissipationsfaktors erlaubt diese Methode nicht nur die Bestimmung der Masse von
dünnen Monolagen, sondern liefert auch Informationen über strukturelle (viskoelastische)
Eigenschaften des adsorbierten Films. Durch Multifrequenzmessungen und gleichzeitiger
Bestimmung der Dissipation, also des Energieverlusts des Systems, bietet die QCM-D-
Technik die Möglichkeit, sowohl die Schichtdicke als auch die Viskosität und Elastizität
zu berechnen. Hierfür wird ein mathematisches Modell angewendet, das auf dem
viskoelastischen Modell nach Voigt und Kelvin beruht.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
123
Abbildung 4-26: Frequenz- und Dissipationsänderung während der Inkubation mit
Streptavidin und der hGBP1-Mutanten Q577C und Q577C/K485C für die Oberschwingun-
gen 5 (schwarz/ grün) und 7 (rot/ blau).
Abbildung 4-27: Schichtdickenberechnung für Streptavidin und die beiden hGBP1 Mutan-
ten Q577C und Q577C/K485C über QCM-D. Unter Einbeziehung der Multifrequenz- und
Dissipationsmessungen während der Immobilisierung der Proteinkomponenten konnte über die
integrierte Software Q-tools die Schichtdicke der adsorbierten Schichten ermittelt werden.
In Abbildung 4-26 ist exemplarisch die gleichzeitige zeitaufgelöste Frequenz- und
Dissipationsantwort beim Aufbau des Streptavidin-/hGBP1-Systems für die Doppelmu-
tante und die Einfachmutante Q577C gezeigt. Aus diesen Informationen lässt sich direkt
die Schichtdicke der einzelnen Proteinlagen berechnen.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
124
Abbildung 4-28: Schichtdickenberechnung für Streptavidin, die hGBP1-Mutante K485C
Dies wurde für alle drei Mutanten durchgeführt Die Höhe der Streptavidinschicht beläuft
sich gemäß den Daten auf (42 ± 10) Å (Abbildung 4-27, links), (40 ± 10) Å (Abbildung
4-27, rechts) sowie (39 ± 10) Å und zeigt auch hier eine hohe Übereinstimmung mit der
Höhe von Streptavidin in der Kristallstruktur.
Tabelle 6: Zusammenstellung der Schichtdickenbestimmung für Streptavidin und die
hGBP1-Mutanten mittels AFM und QCM-D
AFM QCM-D
(in Å) (in Å)
Nanoshaving µCP
Streptavidin 42 ±10 41 ± 10 (42/40 /39 )± 10
Doppelmutante 21 ±10 35 ± 10 30 ± 10
Einfachmutante Q577C 123 ±10 122 ± 10 111 ± 10
Einfachmutante K485C 120 ± 10 119 ± 10
Darüber bestätigen die errechneten Schichtdicken für die Mutanten von (30 ± 10) Å
(Q577C/K485C), (110 ± 10) Å (Q577C) und (118 ± 10) Å unter Berücksichtigung der
angegebenen Fehlergrenzen die Höhenprofilmessungen, die über AFM erhalten worden
sind.
Damit wird auch über QCM-D das unterschiedliche Bindungs- und Orientierungsverhal-
ten der beiden hGBP1-Mutanten bestätigt. Die erhaltenen Daten machen eine deutliche
Unterscheidung des Bindungsverhaltens der beiden hGBP1-Einfachmutanten im
Vergleich zur Doppelmutante möglich und lassen sich mit den AFM und SPR-Resultaten
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
125
gut in Einklang bringen. Die erhaltenen Schichtdicken für AFM und QCM-D sind in
Tabelle 6 nochmal zusammengestellt:
4.3.3.1 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse
Insgesamt führen alle auf die drei hGBP1-Mutanten angewandten oberflächenspek-
troskopischen Methoden, basierend auf unterschiedlichen biophysikalischen
Eigenschaften, zu derselben Schlussfolgerung bezüglich ihrer Orientierung auf der
Oberfläche.
Abbildung 4-29: Mögliches Modell (Schema) für die Immobilisierung von Streptavidin und
der hGBP1-Einfachmutante Q577C auf einem Biotinthiol-SAM. Der SAM sowie der
Biotinmaleinimidanker sind schematisch durch kurze (OH-Thiol) und lange schwarze Striche
(Biotinthiol, Biotinanker) dargestellt. Die Einfachmutante Q577C bindet über jedes Molekül
Streptavidin an die Oberfläche.
Das unterschiedliche Bindungsverhalten der einfach biotinylierten hGBP1-Mutanten
beruht auf der Tatsache, dass die sie jeweils nur einen Biotinanker besitzen, nämlich
einmal in der Nähe der G-Domäne (α 13, Position 577) und einmal auf der
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
126
gegenüberliegenden Seite in der α12 (Position 485), die Doppelmutante jedoch zwei
Anker an beiden genannten Positionen.
Abbildung 4-30: Mögliches Modell (Schema) für die Immobilisierung von Streptavidin und
der hGBP1-Einfachmutante K485C an Streptavidin.
Abbildung 4-31: Mögliches Modell (Schema) für die Immobilisierung von Streptavidin und
der hGBP1-Doppelmutante auf einem Biotinthiol-SAM.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
127
Die Einfachbiotinylierung führt bei beiden Mutanten Q577C und K485C gemäß der
angewandten Methoden SPR, AFM und QCM dazu, dass das hGBP1 mit der langen Seite
orthogonal zur Oberfläche steht und somit einen dreifach kleineren Footprint (ca. 12 nm²)
als die aufgrund der Zweifachbiotinylierung flach auf der Oberfläche liegenden
Doppelmutante (39 nm²) erzeugt. Die Werte zur Berechnung der Kontaktfläche ergeben
sich dabei aus der Kristallstruktur von hGBP1. Final lassen sich aus den gewonnenen
Erkenntnissen somit für die drei hGBP1-Mutanten schematische Modelle für die
Immobilisierung an der Oberfläche erstellen (Abbildung 4-29-31).
4.3.4 Überprüfung der GTP-Hydrolyse Aktivität der hGBP1-Mutanten in Lösung
und an der Oberfläche
Um zu überprüfen, ob das an der Oberfläche immobilisierte hGBP1 seine enzymatische
Aktivität beibehält, wurde seine Fähigkeit ausgenutzt, GTP zu GDP und GMP zu
hydrolysieren. Über Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
konnten die Nukleotide voneinander getrennt und der jeweilige Anteil bestimmt werden.
Die für eine bestimmte Konzentration spezifische Aktivität ergab sich dabei direkt aus
dem zeitlichen Verlauf der GTP-Hydrolyse. Aus der Steigung wurde dafür zunächst die
Reaktionsgeschwindigkeit im steady state bestimmt und anschließend durch die Protein-
konzentration geteilt. Unter der Annahme, dass während der Reaktion nur hGBP1-
Monomere und Dimere im Gleichgewicht vorliegen und die spezifische Aktivität sich aus
der Summe der Hydrolysegeschwindigkeiten der beiden Spezies ergibt, kann die Kon-
zentrationsabhängigkeit durch Gleichung (7) beschrieben werden. Die Anpassung einer
Bindungsgleichung ergibt die Parameter der Reaktion (Smin, Smax, Kd).
22
min max min
4 4. *
( )d dK KE E E
spez Aktivität s s sE
(7)
mit smin = minimale spezifische Aktivität
smax = maximale spezifische Aktivität
[E] = Proteinkonzentration
Kd = Dissoziationskonstante des Dimers
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
128
Die Auftragung der spezifischen Aktivität gegen die Proteinkonzentration gibt Aufschluss
über die Kooperativität der Reaktion. Für die in dieser Arbeit verwendete Cys-5-Mutante
von hGBP1, die die Basis für die Doppelmutante Q577C/K485C und Einfachmutante
Q577C bildet, wurde bereits im Vorfeld die GTP-Hydrolyse gemessen und Informationen
über die spezifische Aktivität erhalten (Dissertation Vöpel, 2009). Für die Messungen
wurden jeweils 350 µM GTP umgesetzt. Die maximale spezifische Aktivität der Cys-5 ist
mit ca. 38 min-1
um den Faktor 1,8 gegenüber hGBP1 wt erhöht (Kunzelmann et al.,
2006). Im Folgenden sind die Ergebnisse des Aktivitätstests in Lösung und an der
Oberfläche für die beiden hGBP1-Mutanten dargestellt. Für alle Messungen wurde eine
Nukleotidkonzentration von 50 µM eingesetzt. Die Proteinkonzentration in Lösung
(0,5 µM) wurde so gewählt, dass GTP in einem 100-fachen Überschuss vorlag.
Abbildung 4-32: Konzentrationsabhängigkeit der GTPase-Reaktion von hGBP1-Cys-5
(Dissertation Tobias Vöpel, 2010) . Die Hydrolyse wurde im Steady State mit 350 µM GTP
bei 25 °C gemessen.
Links: Zunächst wurde der zeitliche Verlauf der Hydrolyse für Proteinkonzentrationen von
0,0156 µM, 0,0625 µM, 0,25 µM, 0,5 µM, 1 µM, 2 µM, 3 µM und 4 µM dargestellt (umso höher
die Konzentration, desto steiler der Verlauf). Aus der Steigung der linearen Regression wurde die
spezifische Aktivität für die eingesetzten Proteinkonzentrationen ermittelt.
Rechts: Auftragung der spezifischen Aktivität gegen die Proteinkonzentration
Die Belegung der Goldwafer mit hGBP1 konnte aus den SPR-Bindungskinetiken
errechnet werden und unter Berücksichtigung des definierten Volumens an Puffer (V =
2,5 ml) und der Fläche des Goldwafers (78,5 cm²), mit dem die Oberfläche bedeckt
wurde, in eine „Konzentration“ umgerechnet werden. Für die Einfachmutanten K485C
und Q577C ergab sich ein einheitliche Konzentration von ca. 0,08 µm, für die Doppelmu-
tante 0,033 µM. GTP (50 µM) lag damit für die Oberflächenmessungen in einem 625
bzw. 1515-fachen Überschuss vor. Aufgrund der äußerst geringen Konzentrationen der
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
129
hGBP1-Mutanten an der mit Flüssigkeit (Puffer) bedeckten Oberfläche und der
Wärmeempfindlichkeit von hGBP1, wurde die eingesetzte GTP-Konzentration von 350
auf 50 µM herabgesetzt. Damit konnte eine im Rahmen der Fehlergrenzen detektierbare
GTP-Umsetzung deutlich schneller nachgewiesen werden, da weniger Substrat in Lösung
vorlag und mögliche Denaturierungseffekte der immobilisierten hGBP1-Moleküle
vermieden wurden. Der Grund, warum die Nukleotidkonzentration nicht auf einen,
parallel zu den Messungen in Lösung, 100-fachen Überschuss gegenüber der
Proteinkonzentration angepasst werden konnte, war das Detektionslimit des eingesetzten
Detektors.
In Lösung ergeben sich für alle drei Mutanten insgesamt sehr ähnliche Aktivitäten von
14 min-1
(Q577C), 20 min-1
(K485C)und 17 min-1
(Q577C/K485C) (Abbildung 4-33).
Abbildung 4-33: Aktivitätstest der hGBP1-Mutanten in Lösung (25 °C). Der zeitliche Verlauf
der Hydrolyse wurde bei einer Konzentration von 0,5 µM hGBP1 und einem 100fachen Über-
schuss GTP (50 µm) durchgeführt. Aus der Steigung der linearen Regression der GTP-Hydrolyse
wurde die spezifische Aktivität ermittelt. Desweiteren ist die gleichzeitige GDP- und GMP-
Produktion dargestellt.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
130
An der Oberfläche fällt die Aktivität um einen Faktor von ca. 2,4 bei der Doppelmutante
(7,04 min-1
), um einen Faktor 4,6 bei der Einfachmutante Q577C (3,07 min-1
) und sogar
um einen Faktor 20 bei der anderen Einfachmutante kleiner aus als in Lösung. Als
Referenz wurde ein mit Biotinthiol und Streptavidin beladener Goldwafer verwendet und
synchron zu dem Wafer mit hGBP1 mit der GTP-Lösung bedeckt. Zeitgleich wurden
jeweils Aliquots für die HPLC-Messungen abgenommen.
Abbildung 4-34: Aktivitätstest der hGBP1-Mutanten an der Oberfläche (25 °C). Die Hydro-
lyse wurde im Steady State bei 50 µM GTP gemessen. Die berechneten hGBP1-Konzentrationen
ergaben sich aus den Bindungskinetiken, die mittels SPR gemessen worden waren. Als Referenz
(siehe Graphen oben) wurde ein mit Biotinthiol und Streptavidin belegter Wafer verwendet, der
parallel zu dem mit hGBP1 besetzten Wafer mit GTP-Lösung bedeckt wurde. Aus der Steigung
der linearen Regression wurden die spezifischen Aktivitäten ermittelt.
In beiden Fällen (Abbildung 4-34, oben) konnte für die Referenzprobe erwartungsgemäß
keine Aktivität gemessen werden. Wie bereits erwähnt, wurden für alle Messungen der
Umsatz von 50 µM GTP gemessen. Um die erhaltenen Aktivitäten mit der in Abbildung
4-32 dargestellten Auftragung der spezifischer Aktivitäten, die bei 350 statt 50 µM GTP
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
131
gemessen wurden, besser vergleichen und beurteilen zu können, wurde exemplarisch für
die Einfachmutante (0,5 µM) die Hydrolyse sowohl bei 50 µM als auch 350 µM GTP in
Lösung bei 25 °C gemessen und der Einfluss der eingesetzten GTP-Konzentration auf die
Hydrolyserate bestimmt. Die gemessene spezifische Aktivität für 350 µM GTP
(Abbildung 4-35) beträgt 25,72 min-1
und ist um den Faktor 1,8 höher als für 50 µM GTP
(13,94 min-1
).
Abbildung 4-35: Messung der Hydrolyseaktivität bei 350 µM GTP und 0,5 µM hGBP1.
Tabelle 7: Übersicht zu den gemessenen Hydrolyseaktivitäten
Konzentration
(µM) Aktivität (min
-1) GDP/GMP (%)
Protein GTP
Einfach-
mutante
Q577C
Einfach-
mutante
K485C
Doppel-
mutante Cys 5
Einfach-
mutante
Q577C
Einfach-
mutante
K485C
Doppel-
mutante
Lösung 0,5 350 26 34
0,5 50 14 20 17 24/62 29/41 28/60
Oberfläche
0,08 50 3 28/16
0,08 50 1 50/15
0,03 7 42/13
Eine weitere wichtige Beobachtung kann bei Betrachtung der GDP- und GMP-Produktion
gemacht werden. In Lösung ist das Hauptprodukt der Hydrolyse innerhalb der
gemessenen Zeiträume von 3 bis maximal 5 Minuten für alle Mutanten GMP (siehe
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
132
Tabelle 7). An der Oberfläche jedoch ist die GMP-Produktion deutlich reduziert und das
Verhältnis GDP:GMP ändert sich bei allen Mutanten zugunsten von GDP. Besonders
deutlich fällt dieser Trend bei der Einfachmutante K485C aus.
4.3.4.1 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse
Für die reine Cys-5-Mutante ohne Biotinanker wurde eine Aktivität in Lösung für 0,5 µM
hGBP1 und 350 µM GTP von 33,9 min-1
gefunden (Abbildung 4-32). Im direkten Ver-
gleich sind die gemessenen Aktivitäten für die Einfach- und Doppelmutante bei 50 µM
GTP (Abbildung 4-33) ca. halb so groß (13,94 bzw. 16,97 min-1
). Der Einfluss der GTP-
Konzentration geht zusätzlich mit einem Faktor von ca. 1,8 in die Berechnung mit ein,
wie die Messung der Einfachmutante bei 350 µM GTP zeigt (Abbildung 4-35). Die
Hydrolysegeschwindigkeit des Enzyms nimmt also erwartungsgemäß bei höherer Sub-
stratkonzentration deutlich zu (25,72 statt 13,94 min-1
) Dass die gemessene Aktivität der
biotinylierten Einfachmutante bei 350 µM GTP trotz allem nochmal um einen Faktor von
1,3 kleiner als für die unbehandelte Cys-5-Mutante ausfällt (Vergleich: Abbildung 4-32
und Abbildung 4-35), ist auf den Einfluss durch die Präparationsschritte während der
Biotinylierung zurückzuführen. Das Auftauen der Proteinlösung, die Inkubation über
Nacht und die Umpufferung können dabei einen negativen Einfluss auf die enzymatische
Aktivität von hGBP1 haben. Da trotz allem für beide biotinylierte hGBP1-Mutanten eine
signifikante Aktivität gemessen werden konnte, ist der Nachweis erbracht, dass die
Proteine weiterhin nativ sind. Des Weiteren muss berücksichtigt werden, dass für die
Messungen in Abbildung 4-32 und Abbildung 4-35 unterschiedliche Protein-Pools
verwendet wurden, die aufgrund der sehr aufwendigen und zeitintensiven Präparation und
Aufreinigung in ihrer Aktivität deutliche Unterschiede aufweisen können.
Auf der Oberfläche sind die Aktivitäten bei 50 µM GTP für alle Mutanten mit 3,04 min1
(Q577C), 1 min-1
(K485C) und 7,04 min-1
(Doppelmutante) deutlich niedriger als in
Lösung (Faktor 4,6 (Q577C), 20 (K485C) bzw. 2,6 (Doppelmutante)). Besonders deutlich
fällt der Unterschied bei der Einfachmutante K485C aus. Eine eingeschränkte
Zugänglichkeit des Substrates GTP zum immobilisierten hGBP1 und das aufgrund der
dichteren Packung möglicherweise limitierte Diffusionsvermögen der Substrate wurde
bereits in vorherigen Studien (Chelmowski et al., 2007) als Grund für eine reduzierte
Aktivität an der Oberfläche angeführt. Da jedoch das Substrat GTP im Vergleich zum
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
133
Protein sehr klein ist und obendrein in großem Überschuss in der Lösung vorliegt, sollten
sich die eingeschränkte Zugänglichkeit oder Diffusionslimitierungen, wenn überhaupt,
nur geringfügig auf die Aktivität auswirken.
Abbildung 4-36: Dimerisierungsmodell von hGBP1 (nach Gosh et al., 2006)
Vielmehr ist anzunehmen, dass sich die Situation in Lösung und an der Oberfläche
dahingehend unterscheidet, dass in Lösung Homo-Dimerisierung ungehindert stattfinden
und die Aktivität beschleunigt, an der Oberfläche durch die Immobilisierung der Proteine
jedoch behindert oder zumindest eingeschränkt wird, so dass die Proteine als Monomere
vorliegen und ausschließlich eine Basalaktivität zeigen.
Abbildung 4-37: Modell der Verteilung von Streptavidin bei 50 % Belegung. Die Streptavi-
din-Moleküle (schwarze Felder) sind wie auf einem Schachbrettmuster verteilt und liegen so nah
beieinander (entlang der Diagonalen, weiß), dass eine direkte Interaktion zwischen hGBP1-Mole-
külen, die an Streptavidin gebunden sind, möglich wäre.
Wenn etwa ein Faktor 4-5 für den Einfluss der Dimerisierung auf die Aktivität in dem
von uns verwendeten Konzentrationsbereich annimmt (vgl auch (Ghosh et al., 2006) ,
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
134
spricht die gemessene Hydrolysegeschwindigkeit der beiden Einfachmutanten mit 3,04
(Q577C) und 1 min-1
eindeutig für das Vorliegen von Monomeren auf der Oberfläche, die
keine Wechselwirkungen eingehen können.
Da der Anker sich an der Position 577 befindet und somit in der Nähe der G-Domäne, die
die Dimerisierung hauptsächlich vermittelt, ist eine Wechselwirkung mit benachbarten
hGBP1-Molekülen ohnehin sehr unwahrscheinlich. Hinzu kommt, dass die Abstände
zwischen den hGBP1-Molekülen zu klein sind, um Dimerisierung zu ermöglichen. Die
schwarzen Felder stellen Streptavidin-Moleküle dar, auf die in der nächsten Schicht das
hGBP1 binden soll. Wie bereits erwähnt, ist die maximale Flächenausfüllung von
Streptavidin ca. 53 %, was unter der Annahme, dass die Verteilung auf der Oberfläche
gleichmäßig ist, zu dem Modell in Abbildung 4-37 führen würde. Die Belegung mit
Streptavidin ergibt sich jedoch unter den gewählten Bedingungen (Inkubationszeiten mit
Biotinthiol etc., Puffer) zu 25-30 % (maximal 35 %), woraus sich das Modell in
Abbildung 4-38 ergibt. Es ist unter Berücksichtigung des Dimerisierungsmodells
(Abbildung 4-36) klar ersichtlich, dass bei einer Belegung von 25 % die Abstände
zwischen den Streptavidin-Molekülen zu klein sind (ca. 4-5 nm), damit die immobilisierte
hGBP1-Varianten Q577C und K485C eine Interaktion mit den Nachbarn eingehen kann.
Abbildung 4-38: Modell der Verteilung von Streptavidin bei 25 % Belegung. Die Abstände
zwischen den Streptavidin-Molekülen betragen ca. 4-5 nm, wenn man von einer gleichmäßigen
Verteilung der Proteine ausgeht.
Da die G-Domäne der Einfachmutante als zusätzlich erschwerender Faktor zur
Oberfläche gerichtet ist und somit benachbarte G-Domänen der gebundenen hGBP1-
Moleküle aufgrund der Biotinankerbindung an Streptavidin sich nur sehr schwer
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
135
zueinander ausrichten können, ist die Dimerisierung von benachbarten Einfachmutanten
auszuschließen.
Anders sieht die Situation bei der Doppelmutante aus, die über zwei Anker an die
Oberfläche gebunden ist und somit mit der langen Seite auf dieser liegt. Die gemessenen
Aktivitäten in Lösung und Oberfläche unterscheiden sich gerade mal um einen Faktor 2,5,
was nicht für das ausschließliche Vorliegen von Monomeren an der Oberfläche spricht.
Obwohl die Zweifachbiotinylierung zu einer deutlich eingeschränkten Beweglichkeit und
Flexibilität der Doppelmutante im Vergleich zu den Einfachmutanten führt, ist die
Wahrscheinlichkeit, dass die G-Domänen zweier gebundener hGBP1-Moleküle
interagieren, deutlich höher. Da die hGBP1-Moleküle auf der Oberfläche liegen, sind zum
einen die GTP-bindenden Domänen nicht wie bei den Einfachmutanten zur Oberfläche
gerichtet, sondern deutlich freier zugänglich, und zum anderen ist Möglichkeit gegeben,
dass sich die benachbarten Doppelmutanten zumindest teilweise in der Weise ausrichten,
wie es durch das Dimerisierungsmodell vorgegeben ist (vgl. Abbildung 4-36).
Abbildung 4-39: Mögliches Modell der Dimerisierung der hGBP1-Doppelmutante zwischen
immobilisierten Nachbarmolekülen. Zwei hGBP1-Moleküle (Doppelmutanten) sind so an der
Oberfläche fixiert, dass die beiden G-Domänen (weiße Pfeile) die Dimerisierung vermitteln kön-
nen.
Diese in der Abbildung 4-39 gezeigte Konstellation setzt voraus, dass die G-Domänen
zweier benachbarter hGBP1-Moleküle direkt einander zugewandt sind, da ansonsten
durch die zweifache Bindung an die Streptavidin-Moleküle wenig Bewegungsspielraum
für die hGBP1-Moleküle besteht, sich aufeinander zuzubewegen. Sicherlich wird der in
der Abbildung beschriebene Fall nur vereinzelt vorkommen, doch im Mittel wird sich
dies auf die gemessene Aktivität auswirken. Die Ergebnisse bestätigen dies.
Kapitel 4 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1-System
136
Die Betrachtung der GDP und GMP-Produktion in Lösung und an der Oberfläche hat zu
einem ebenfalls interessanten Ergebnis geführt (Tabelle 7). Offenbar ist die GMP-
Produktion auf der Oberfläche gehemmt und GDP konnte für alle hGBP1-Mutanten als
Hauptprodukt ermittelt werden, GMP dagegen nur marginal. Im Rahmen der Doktorarbeit
von Adrian Syguda konnte bereits postuliert werden, dass der tetramere Übergangs-
zustand essentiell für die Hydrolyse von GDP zu GMP ist. Dies wirkt sich folglich auf
das Produktverhältnis der Hydrolyse aus, das in Richtung GMP verschoben wird.
In einer vor kurzem veröffentlichten Studie wurde desweiteren festgestellt, dass die
Tetramerisierung durch den Kontakt zwischen den Helices α12/13 und der α4´ vermittelt
wird. Wenn dieser Kontakt durch eine Quervernetzung (Cross-linker) verankert wird,
können wichtige strukturelle Änderungen, die zu einer Freisetzung der Interaktions-
flächen in der α12/13 führen und somit die Tetramerisierung vermitteln, nicht vollzogen
werden und GDP wird als Hauptprodukt der Hydrolyse erhalten (Vopel et al., 2010). Eine
dauerhafte Auflösung dieses Kontakts führt dagegen hauptsächlich zu GMP. Auf der
Oberfläche sind im Unterschied zur Situation in Lösung die biotinylierten hGBP1-
Mutanten zum einen sehr dicht gepackt und zum anderen an Streptavidin immobilisiert
sind, so dass hier eine Tetramerisierung nicht stattfinden kann. GTP sollte daher
hauptsächlich zu GDP, aber nicht zu GMP hydrolisiert werden, was durch die Ergebnisse
bestätigt wird.
Kapitel 5 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
137
5 Dimerisierungsstudien von immobilisiertem hGBP1: Das
Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
Nachdem zunächst das Streptavidin-hGBP1-System auf einer Biotinthiol-SAM-Oberflä-
che hinsichtlich des Bindungsverhaltens der beteiligten Proteinkomponenten, also
Streptavidin und die hGBP1-Mutanten Q577C, K485C und Q577C/K485C, untersucht
wurde, sollte es in diesem Projekt darum gehen, die Dimerisierung von hGBP1 bezüglich
kinetischer Aspekte zu beleuchten. Diese Untersuchung wurde hauptsächlich auf der
Basis der Mutante K485C (Abbildung 4-11) durchgeführt, da bei dieser hGBP1-Variante
die G-Domäne zur Umgebung gerichtet ist, so dass eine uneingeschränkte Bindung von
solvatisierten hGBP1-Molekülen in Anwesenheit von GppNHp möglich ist. Die anderen
beiden Mutanten, also die Einfachmutante Q577C, bei der die G-Domäne zur Oberfläche
gerichtet ist, und die Doppelmutante Q577C/K485C werden ebenfalls bezüglich ihrer
Dimerisierungsfähigkeit auf der Oberfläche in diesem Kapitel betrachtet und mit der
Mutante K485C verglichen.
5.1 Oberflächenspektroskopische Untersuchungen des Streptavidin-
hGBP1/hGBP1-Systems
5.1.1 SPR-Bindungsstudien von hGBP1 wt mit den immobilisierten hGBP1-
Mutanten
In Abbildung 5-1 ist die Immobilisierung von Streptavidin und den drei Mutanten
K485C, Q577C und Q577C/K485C sowie die jeweilige Bindung von hGBP1 wt
gegenübergestellt. Die Belegung mit Streptavidin (0,4 µM) erfolgte über 20 Minuten,
bevor die jeweiligen hGBP1-Mutanten (1 µM) ebenfalls für 20 Minuten über die
Oberfläche geleitet wurden. Im letzten Schritt erfolgte die Inkubation mit hGBP1 wt
(5 µM) ohne Anker in Anwesenheit von 50 µM GppNHp über 40 Minuten. Bei der
Mutante K485C wurde die Inkubationsphase mit hGBP1 wt auf 60 Minuten erhöht, um
auch hier einen Plateauwert für die Belegung zu erreichen. Die Dissoziationsphase betrug
jeweils weitere 20 Minuten. Abbildung 5-2 zeigt nochmal separat Bindungskinetiken für
zwei unterschiedliche Pools der Mutante K485C und die jeweilige Bindung von hGBP1
wt in Anwesenheit von GppNHp. Obwohl die Belegungsdichte der Mutante in Messung 2
um ca. ein Drittel reduziert ist, wird in beiden Messungen für hGBP1 wt eine maximale
Kapitel 5 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
138
Belegung von knapp 130 ng/cm² erreicht. Ein möglicher Grund für diese Beobachtung
könnte sein, dass die Dimerkomplexe ausreichend Platz auf der Oberfläche benötigen, um
sich bilden können. In diesem Zusammenhang sei auch nochmal auf die Abbildung 4-36
verwiesen, in der verdeutlich wird, dass bei Dimerisierung die Mittel- und GTPase-
Effektordomäne voneinander wegzeigen, was zu einer Spannweite von insgesamt 230 Å
führt.
Abbildung 5-1: Konsekutive Beladung der SAM-Oberfläche mit Streptavidin, den drei
hGBP1-Mutanten und hGBP1 wt ohne Anker in Anwesenheit von 50 µM GppNHp. Alle
Inkubationsschritte erfolgten über 15 Minuten mit anschließender Dissoziation.
Genau diese Spannweite könnte der Grund sein, warum die Belegungsdichte mit hGBP1
wt ohne Anker einen Maximalwert anstrebt, der sich auch bei höherer Beladung mit der
biotinylierten Mutante nicht weiter steigern lässt. Dass die Belegungsdichte für
unterschiedliche Pools von Protein ein wenig variieren kann, kann zahlreiche Gründe
haben, aber hängt zumeist mit der Präparation des Proteins zusammen. In dieser Studie
kommen noch weitere kritische Schritte wie die Biotinylierung und Immobilisierung an
der Oberfläche hinzu, die eventuell dazu geführt haben könnten, dass ein kleiner Teil der
Proteine zwar biotinyliert, aber denaturiert ist und sich auf der Oberfläche entfaltet hat.
Dies führt zu einem größeren Footprint und folglich zu einer kleineren Belegung.
Nichtsdestotrotz konnte für die Bindung von hGBP1 wt bei geringerer Belegungsdichte
Kapitel 5 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
139
der Mutante in Anwesenheit von GppNHp ein nahezu exaktes 1:1-Verhältnis (1:0,9)
(Abbildung 5-2, grüne Kurve) gegenüber der Mutante festgestellt werden. Für Messung 1
(Abbildung 5-2, blaue Kurve) fällt die Belegung etwas schwächer aus, so dass hier das
molare Verhältnis 1: 0,6 beträgt.
Abbildung 5-2: Konsekutive Beladung der SAM-Oberfläche mit Streptavidin, der hGBP1-
Mutante K485C und hGBP1 wt in Anwesenheit von 50 µM GppNHp.
Abbildung 5-3 stellt die Wt-Belegung auf allen hGBP1-Mutanten nochmal gegenüber.
Als Referenz wurde zum einen hGBP1 wt direkt über Streptavidin geleitet, zum anderen
wurde kein GppNHp, das für die Dimerisierung essentiell ist, dem Protein zugefügt. Auch
nach Abzug der durch die die Referenzmessungen erhaltenen Belegungen würde das
molare Verhältnis zwischen hGBP1 wt und der K485C immer noch 1:0,5 (Messung 1,
Abbildung 5-2 ) bzw. 1:0,8 (Messung 2, Abbildung 5-2) betragen und somit auf einen
hohen Dimerisierungsgrad auf der Oberfläche hindeuten. Bei vollständiger Belegung der
Oberfläche mit der Mutante K485C (Messung 1) liegt demnach jedes zweite verankerte
Protein als Dimerkomplex vor. Im Gegensatz dazu ist Wt-Belegung bei der Einfachmu-
tante Q577C kaum höher als bei den Referenzmessungen, wohingegen im Falle der
Doppelmutante eine ebenfalls signifikante Immobilisierung von hGBP1 wt feststellbar ist.
Das molare Verhältnis zwischen immobilisierter Doppelmutante (ca. 68 ng/cm², vgl.
Abbildung 4-22) und Wildtyp (55 ng/cm²) beträgt 1:0,8.
Kapitel 5 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
140
Abbildung 5-3: Belegung von hGBP1 wt in Anwesenheit von 50 µM GppNHp auf den drei
hGBP1 Mutanten. Im Gegensatz zu den Mutanten Q577C und Q577C/K485C zeigt die Mutante
K485C einen deutlichen Dimerisierungseffekt. Die Belegunsdichte der anderen Mutanten ist
kaum größer als die messbare Adsorption bei den Referenzmessungen.
5.1.2 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse
Die Tatsache, dass sich bei der K485C der Anker in der α12 auf der von der G-Domäne
abgewandten Seite befindet und folglich die Mutante so an die Oberfläche dirigiert, dass
die G-Domäne zur Umgebung gerichtet und damit frei zugänglich für in Lösung
befindliche hGBP1-Moleküle ist, hat gemäß den SPR-Ergebnissen einen begünstigenden
Effekt auf die Dimerisierung. Etwa 50 % der hGBP1-Mutanten (bei Messung 2 in
Abbildung 5-2 sogar 90 %) binden an ein Wildtyp-Molekül. Durch den erhöhten
Platzbedarf, den der Dimerkomplex auf der Oberfläche benötigt und die dichte Belegung
der Mutante K485C kann die Beladung mit hGBP1 wt nicht über einen Maximalwert
hinaus (etwa 130 ng/cm²) gesteigert werden. Im Gegensatz dazu ergibt sich für die
anderen Einfachmutante Q577C keine signifikante Belegung mit hGBP1 wt. Da bei der
Q577C die G-Domäne zur Oberfläche gerichtet ist und für die Dimerisierung kaum oder
gar nicht zugänglich ist, ist die Dimerisierung aus sterischen Gründen nicht möglich. Bei
der Doppelmutante dagegen ist ein ebenfalls ein hoher Dimerisierungsgrad festzustellen.
Wahrscheinlich führt hier die Mehrfachbiotinylierung dazu, dass die G-Domäne, da die
Mutante mit der langen Seite auf der Oberfläche liegt, für Moleküle aus der Lösung
Kapitel 5 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
141
zugänglich wird und mit ihnen Dimerkomplexe ausbildet. Desweiteren haben die in
Abschnitt 4.3.4 durchgeführten Aktivitätstests bereits gezeigt, dass die Doppelmutante
scheinbar zusätzlich in der Lage ist, auch mit benachbarten, immobilisierten hGBP1-
Molekülen Dimerkomplexe zu bilden. Insgesamt gilt also: Umso besser die G-Domäne
des immobilisierten hGBP1-Moleküls zugänglich ist, desto eher werden Dimere
ausgebildet. Zur Absicherung dieser Daten wurden analog zu Kapitel 4 die Schichtdicken
der Proteinlagen, diesmal nach Immobilisierung von hGBP1 wt bestimmt
5.1.3 Untersuchung der Dimerisierung von hGBP1 an die immobilisierten hGBP1-
Mutanten mittels AFM und QCM
Im nächsten Schritt wurde versucht, die Bindung von hGBP1 wt an die immobilisierten
Mutanten mit AFM und QCM nachzuweisen. Für die rasterkraftmikroskopischen
Messungen wurden mittels Mikrokontaktstempeln lateral strukturierte Oberflächen
hergestellt.
Abbildung 5-4: Topographiebild nach Inkubation mit Streptavidin, der hGBP1-Doppelmu-
tante und hGBP1 wt in Anwesenheit von GppNHp. Die Stempelflächen (dunkle Quadrate, 3 x
3 µm) sind mit proteinresistentem OEG(6)-Thiol inkubiert worden, die Stege (helle Bereiche)
sind die Bereiche, in denen sich der Biotinthiol-SAM und die beteiligten Proteinkomponenten
Streptavidin, die Doppelmutante und hGBP1 wt befinden. Unter dem Topographiebild ist das
Höhenprofil (erstellt über Nanoscope) dargestellt. Die angegebene Höhe bezieht sich auf
Abbildung 4-24, in der bereits die Schichtdicke nach Inkubation mit Streptavidin und der
Doppelmutante (76,3 ± 10) Å dargestellt sind.
Kapitel 5 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
142
Die Stempelflächen wurden mit proteinresistentem OEG(6)-Thiol gefüllt, die
Stegbereiche nacheinander mit 10 % Biotinthiol, Streptavidin, den biotinylierten hGBP1-
Mutanten und hGBP1 wt in Anwesenheit von GppNHp. In den Abbildung 5-4 und
Abbildung 5-5 sind die Ergebnisse nach Inkubation mit Streptavidin und der
Doppelmutante sowie der Einfachmutante K485C dargestellt.
Für die Einfachmutante Q577C konnte, wie bereits die SPR-Messungen gezeigt hat, kein
zusätzlicher Anstieg der Schichtdicke nach Inkubation mit hGBP1 wt nachgewiesen
werden. Deswegen ist hierfür kein Topographiebild gezeigt. Bei der Doppelmutante steigt
die Schichtdicke von (76,3 ± 10) Å (vgl. Abbildung 4-24 ) auf (98,1 ± 10) Å an. Aus der
Differenz der beiden Werte ergibt sich eine Höhe von (21,8 ± 10) Å. Diese ermittelte
Höhe zeigt eine gute Übereinstimmung mit der Länge der breiten Seite von hGBP1.
Analog kann für die Einfachmutante K485C einen Höhenzuwachs von ursprünglich
(159,7 ± 10) Å auf (188,1 ± 10) Å nachgewiesen werden, wenn hGBP1 wt hinzugegeben
wird. Daraus ergibt sich eine Höhendifferenz von (28,4 ± 10) Å, was in etwa dem Wert
entspricht, der für die Doppelmutante gefunden wurde.
Abbildung 5-5: Topographiebild nach Inkubation mit Streptavidin, der hGBP1-Mutante
K485C und hGBP1 wt in Anwesenheit von GppNHp. Die angegebene Höhe bezieht sich auf
Abbildung 4-25, in der bereits die Schichtdicke nach Inkubation mit Streptavidin und der
Doppelmutante (15,97 ± 10) Å dargestellt sind. Das Höhenprofil wurde über die Software SPIP
erstellt
Ergänzend zu den AFM- und SPR-Daten wurde die QCM-D-Technik angewendet, um
einen möglichen Anstieg der Schichtdicke durch die Bindung von hGBP1 wt
Kapitel 5 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
143
nachzuweisen. Bereits in den Abbildung 4-27 und Abbildung 4-28 wurden die
Schichtdickenberechnungen für Streptavidin und die beiden hGBP1-Mutanten Q577C
und Q577C/K485C gezeigt. In den Abbildung 5-6 und Abbildung 5-7 sind nun die
Schichtdickenberechnungen für die Mutanten dargestellt, nachdem hGBP1 wt über die
Oberfläche in Anwesenheit von GppNHp über die Oberfläche geleitet worden ist. Da die
Mutante K485C separat vermessen wurde und sich die Injektionszeiten geringfügig
unterscheiden (für Streptavidin 50 statt 60 Minuten, außerdem Inkubation mit hGBP1 wt
über 80 Minuten statt 35 Minuten), wurde diese Messung separat dargestellt.
Insbesondere die Inkubation mit hGBP1 wt musste deutlich verlängert werden, da
ansonsten kein Plateau erreicht worden wäre.
Abbildung 5-6: Schichtdickenberechnung über QCM-D für hGBP1 wt nach Immobilisie-
rung an die zuvor immobilisierten hGBP1-Mutanten Q577C und Q577C/K485C. Unter
Einbeziehung der Multifrequenz- und Dissipationsmessungen konnte über die integrierte
Software Q-tools die Schichtdicke der Proteinlagen ermittelt werden.
Für die Einfachmutante Q577C konnte ein Schichtdickenzuwachs von 2,1 nm nach
Inkubation mit hGBP1 wt in Anwesenheit von GppNHp ermittelt werden. Auf der
Doppelmutante immobilisierten weitere 5,2 nm und auf der Einfachmutante K485C sogar
8,3 nm. Die gemessenen Schichtdicken für die Wildtyp-Belegung sind in der folgenden
Abbildung 5-8 nochmal gegenübergestellt. Auch hier wurde die K485C wiederum separat
behandelt.
Kapitel 5 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
144
Abbildung 5-7: Schichtdickenberechnung für Streptavidin, die hGBP1-Mutante K485C und
hGBP1 wt in Anwesenheit von GppNHp.
Abbildung 5-8: Schichtdickenberechnung von hGBP1 wt mittels QCM-D für die drei
hGBP1-Mutanten. In den Referenzmessungen (schwarz) wurde zum einen hGBP1 wt direkt über
Streptavidin geleitet. Desweiteren wurde hGBP1 wt ohne GppNHp injiziert.
Der Zuwachs der Schichtdicke infolge der Inkubation mit hGBP1 wt ist bei der Einfach-
mutante Q577C ist in etwa mit den Referenzen gleichzusetzen (Abbildung 5-8). Als
Referenzen wurde hGBP1 wt direkt auf Streptavidin inkubiert, um den unspezifisch
gebundenen Anteil der Adsorption zu ermitteln. Desweiteren wurde hGBP1 ohne
GppNHp injiziert und über die Oberfläche geleitet. Für die Doppelmutante ergibt sich
demnach nach Abzug der Referenz, bei der hGBP1 direkt über Streptavidin geleitet
Kapitel 5 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
145
wurde, ein Schichtdickenzuwachs von ca. (32 ± 10) Å infolge der Wildtyp-Immobili-
sierung. Für die Referenz ohne GppNHp beträgt der Schichtdickenzuwachs sogar (38 ±
10) Å.
Tabelle 8: Ermittelter Schichtdickenzuwachs für die drei hGBP1-Mutanten nach Beladung
der Oberfläche mit hGBP1 wt in Anwesenheit von GppNHp
AFM QCM-D
(in Å) (in Å)
Einfachmutante
K485C 29 ±10 36 ± 10/ 63 ± 10
Doppelmutante 22 ± 10 32 ± 10/ 37 ± 10
Einfachmutante
Q577C
Für die Schichtdickenberechnung der Mutante K485C sind noch größere Unterschiede bei
den Referenzmessungen festzustellen. Hier ergibt sich nach Abzug der Referenz „hGBP1
wt auf Streptavidin“ eine Schichtdicke für hGBP1 wt von (36 ± 10) Å und für die
Referenz ohne GppNHp sogar (63 ± 10) Å. Zur besseren Übersicht sind alle Werte in
Tabelle 8 nochmal zusammengefasst.
5.1.4 Überprüfung der Dimerisierung von hGBP1 wt mittels konfokaler
Fluoreszenzmikroskopie
In den vorausgegangenen Dimerisierungsstudien von hGBP1 konnte im Falle der
Doppelmutante Q577C keine Bindung von hGBP1 wt in Anwesenheit von GppNHp.
detektiert werden. Zurückgeführt wurde diese Beobachtung darauf, dass diese Mutante
nach Immobilisierung an der Oberfläche so orientiert ist, dass die G-Domäne zur
Oberfläche zeigt und somit für andere hGBP1-Moleküle nicht zugänglich ist Für die in
Abbildung 5-9 gezeigten fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen wurden Goldwafer
zunächst mittels Mikrokontaktstempeln lateral strukturiert. Die gestempelten Bereiche
wurden mit proteinresistentem OEG(6)-Thiol inkubiert. In den Stegbereichen erfolgte die
konsekutive Immobilisierung von Biotinthiol, Streptavidin, den Mutanten Q577C bzw.
exemplarisch für die Doppelmutante, für die über SPR, AFM und QCM eine signifikante
Dimerisierung festgestellt werden konnte, und fluoreszenzmarkiertem hGBP1 wt in
Kapitel 5 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
146
Anwesenheit von 50 µM GppNHp. Für die Mutante K485C wurde diese Studie nicht
durchgeführt. Die Proteinlösungen wurden jeweils ca. 20 Minuten auf der Oberfläche
belassen. Zwischen den Inkubationsschritten erfolgte ein 4-5 maliges Waschen mit Puffer
C (50 mM Tris, 5 mM MgCl2, pH 7,9). Im Falle einer Dimerisierung sollte das
fluoreszenzmarkierte hGBP1 in den Stegbereichen anhand des emittierten Lichtes (grün)
detektierbar sein. Auf dem Wafer, der mit der Doppelmutante Q577C/K485C inkubiert
wurde, kann, wie in Abbildung 5-9 (links) zu sehen ist, eine signifikante Belegung mit
fluoreszenzmarkiertem hGBP1 wt nachgewiesen werden, die spezifisch in den
Stegbereichen detektierbar ist. Für die Einfachmutante Q577C ist dagegen keine
Immobilisierung von hGBP1 wt erkennbar (Abbildung 5-9, Mitte).
Abbildung 5-9: Fluoreszenzmikroskopie Aufnahmen von lateral strukturierten SAMs. Auf
dem Wafer, der mit der Doppelmutante Q577C/K485C inkubiert wurde (links) ist die laterale
Strukturierung gut zu erkennen. Fluoreszenzmarkiertes hGBP1 ist bevorzugt in den Stegbereichen
an die Oberfläche gebunden. Für die Einfachmutante dagegen ist keine Strukturierung zu erken-
nen (Mitte). Eine spezifische Beladung mit hGBP1 wt kann nicht nachgewiesen werden. Das
gleiche Resultat wird erhalten, wenn GppNHp (50 µM) bei der Inkubation von
fluoreszenzmarkiertem hGBP1 auf der immobilisierten Doppelmutante weggelassen wird
(rechts).
Um nachzuweisen, ob es sich bei dem beobachtbaren Effekt bei der Doppelmutante auch
wirklich um dimerisiertes hGBP1 handelt, wurde ein weiteres Experiment in
Abwesenheit von GppNHp durchgeführt (Abbildung 5-9, rechts). Auch hier ist keine
Immobilisierung detektierbar.
3 µm
Kapitel 5 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
147
Wie bei den anderen verwendeten Messmethoden kann mittels konfokaler
Fluoreszenzmikroskopie für die Doppelmutante eine deutliche Belegung mit hGBP1 wt in
Anwesenheit von GppNHp nachgewiesen werden. Ohne Nukleotid ist dieser Effekt nicht
mehr beobachtbar, was darauf schließen lässt, dass die Bindung von Wildtyp spezifisch
ist und aus der Dimerisierung an der Oberfläche resultiert. Dagegen ist für die
Einfachmutante Q577C keine Bindung von Wildtyp-hGBP1 detektierbar. Diese
Beobachtung konnte auch bei SPR, AFM und QCM gemacht werden. Durch die
Fluoreszenzmikroskopie, die gegenüber SPR sogar deutlich sensitiver ist, konnte
ebenfalls die Annahme bestätigt werden, dass aufgrund der Tatsache, dass die
Doppelmutante auf der Oberfläche liegt und somit die G-Domäne besser zugänglich ist
als bei der Einfachmutante Q577C, die Dimerisierung begünstigt wird.
5.1.5 Diskussion der Ergebnisse
Für die Doppelmutante als auch für die K485C konnte eine Dimerisierung mit hGBP1 wt
in Anwesenheit von GppNHp nachgewiesen werden. Bei der anderen Einfachmutante ist
die Dimerisierung nicht möglich, da die G-Domäne in dem Fall zur Oberfläche gerichtet
und somit für andere hGBP wt-Moleküle nicht zugänglich ist Unter Einbeziehung der
SPR, AFM und QCM-D-Daten und unter der Annahme, dass die Dimerisierung an der
Oberfläche genauso wie in dem bereits beschriebenen Dimerisierungsmodell von hGBP1
(Ghosh et al., 2006) vonstatten geht, könnte die Bindung von hGBP1 wt an die Doppel-
mutante in etwa wie in Abbildung 5-11 aussehen. Alle ermittelten Daten deuten darauf
hin, dass die Mutante mit der flachen Seite auf der Oberfläche liegt und über zwei Anker
immobilisiert wird. Nach Inkubation mit hGBP1 wt in Anwesenheit von GppNHp ergibt
sich ein Höhenzuwachs von ca. 2 nm mittels AFM und je nach gewählter Referenz 3,2
(hGBP1 wt direkt auf Streptavidin) bzw. 3,7 nm (hGBP1 wt ohne GppNHp) mittels
QCM. Gemäß dem Dimerisierungsmodell sollte die Interaktion zwischen
immobilisiertem hGBP1 und hGBP1 wt in der Weise erfolgen, dass die beiden G-
Domänen die Dimerisierung vermitteln und die Mittel- und GTPase-Effektor-Domänen
der beiden Moleküle voneinander weg zeigen. Das in Abbildung 5-10 dargestellte Modell
liefert auch eine Erklärung dafür, warum die über AFM ermittelten Schichtdicken sich
deutlich von den QCM-Daten unterscheiden. Mittel und GTPase-Effektor-Domäne des
gebundenen hGBP1-wt sind zur Umgebung gerichtet und daher in ihrer Beweglichkeit
Kapitel 5 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
148
sehr flexibel. Dies führt dazu, dass eine genaue Höhenbestimmung gar nicht möglich ist,
wenn davon ausgegangen wird, dass die gemessene Höhe die Distanz zwischen
gebundener G-Domäne und dem abgewinkelten Rest des Proteins beschreibt
Abbildung 5-10: Mögliches Modell (Schema) für die Dimerisierung von hGBP1 wt an die
immobilisierte hGBP1-Doppelmutante. Die in den AFM und QCM-D Messungen ermittelten
Höhen von 2,1 bzw. 3,2 und 3,7 nm zeigen deutliche Unterschiede (Ghosh et al., 2006). Durch
Mittel- und GTPase-Effektordomänen von hGBP1 wt sind an der Oberfläche zur Umgebung
gerichtet und folglich sehr flexibel sind, was eine genaue Höhenbestimmung nicht möglich macht.
Hinzu kommt, dass es sich bei AFM um eine mechanische Methode handelt. Auch wenn
für alle Messungen der Tapping-Modus eingesetzt wurde, der Berührungen mit der Probe
weitgehend vermeiden soll, sind leichte Kompressionen nicht ausgeschlossen. Es ist klar
ersichtlich, dass die mechanische Kraft des Cantilevers sich insbesondere auf den zur
Umgebung gerichteten, flexiblen „Schwanz“ (Mittel- und GTPase-Effektor-Domäne) von
hGBP1 auswirkt. Diese Annahme wird dadurch unterstützt, dass die über AFM
ermittelten Schichtdicken deutlich kleiner sind als die über QCM berechneten Höhen.
Das Dimerisierungsmodell für die K485 C an der Oberfläche ist in Abbildung 5-11
dargestellt. Unter Berücksichtigung, dass bei vollständiger Belegung mit der Mutante
K485C jedes zweite Streptavidin-Molekül mit einer hGBP1-Mutante interagiert und den
Informationen aus dem Dimerisierungsmodell (Ghosh et al., 2006) lassen sich die
schematisch dargestellten Verhältnisse an der Oberfläche (Abbildung 5-11) während der
Dimerisierung sehr anschaulich beschreiben und zeigen darüber hinaus eine große
Übereinstimmung mit der über AFM und QCM-D ermittelten Höhe , die sich für die
Belegung von hGBP1 wt ergibt.
Kapitel 5 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
149
Abbildung 5-11: Mögliches Modell für die Dimerisierung von K485C und hGBP1 wt in
Anwesenheit von GppNHp an der Oberfläche. Aus den AFM-Daten lässt sich ein
Höhenzuwachs von ca. 2,8 nm, aus den QCM-Daten sogar von 3,6 und 6,3 nm ermitteln.
Dass auch hier die über AFM ermittelte Höhe im Vergleich zu den QCM-Daten kleiner
ausfällt, kann wiederum mit der hohen Flexibilität des „Schwanzes“ von hGBP1 erklärt
werden. Für eine solche Anordnung der Dimere, wie sie in Abbildung 5-11 angenommen
wird, muss postuliert werden, dass die Abstände zwischen den immobilisierten
Molekülen groß genug ist. Da die Streptavidin-Belegung ca. 25 % beträgt (Abbildung
4-38) und nur etwa mehr jedes zweite Streptavidin ein hGBP1-Molekül gebunden hat,
sind auch diese Voraussetzungen erfüllt.
5.2 Kinetikstudien zur Dimerisierung von hGBP1 mittels SPR
Nachdem in den vorangegangenen Studien verschiedene hGBP1-Mutanten an eine Ober-
fläche immobilisiert worden waren und ein unterschiedliches Bindungsverhalten, bedingt
durch die Lokalisation und Anzahl der Biotinanker, gezeigt werden konnten, wurden im
Anschluss Kinetikstudien zur Dimerisierung von hGBP1 mittels SPR angestrebt. Für
diese Untersuchungen war besonders die hGBP1-Mutante K485C geeignet, die einen
Biotinanker innerhalb der α12 auf der von der G-Domänen abgewandten Seite trägt und
somit in der Weise an der Oberfläche immobilisiert, dass der GTP-bindende Bereich, der
Kapitel 5 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
150
hauptsächlich die Dimerisierung vermittelt, zur Umgebung gerichtet ist. Somit kann die
K485C-Mutante als „Fängermolekül“ für in Lösung befindliche hGBP1-Moleküle fungie-
ren, wenn GppNHp als Mediator des Dimerisierungsprozesses präsent ist. Der hohe Bin-
dungsgrad von hGBP1 wt in Anwesenheit von Nukleotid an die immobilisierte K485C-
Mutante, der durch SPR-Messungen gezeigt werden konnte, zeigt, dass die Dimerisierung
an der Oberfläche nahezu ungehemmt erfolgen kann. Außerdem wurde eine hohe
Reproduzierbarkeit des Bindungsverhaltens ermittelt und damit beste Voraussetzungen
geschaffen, um konzentrationsabhängige Bindungskinetikstudien durchzuführen. Im
Vergleich zur Doppelmutante zeigt die K485C auch keine Wechselwirkung mit anderen
immobilisierten hGBP1-Mutanten, was durch die Aktivitätstests gezeigt werde konnte,
und steht somit für hGBP1-Moleküle aus der Lösung vollständig zur Verfügung. Dafür
wurde wiederum das aus den vorherigen Kapiteln bekannte Multikomponentensystem,
bestehend aus Streptavidin, der hGBP1-Mutante und hGBP1 wt in Anwesenheit von
GppNHp auf einem Biotinthiol-SAM aufgebaut.
Abbildung 5-12: SPR-Bindungskinetik von hGBP1 wt an die immobilisierte hGBP1-Mu-
tante K485C in Anwesenheit von GppNHp.
Die Konzentration von Streptavidin (0,4 µM) und der Mutante (1 µm) wurde konstant
halten und ausschließlich die Konzentration des Wildtyps variiert. Zu den hGBP1 wt
Proben wurden jeweils 50 µM GppNHp hinzugegeben. In Abbildung 5-12 sind die
Ergebnisse der Wildtyp-Belegung dargestellt. Die Geschwindigkeitskonstanten kobs erster
Ordnung wurden aus Kurvenanpassungen einer einfach exponentiellen Funktion erhalten.
Kapitel 5 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
151
Abbildung 5-13 zeigt eine Auftragung der beobachtbaren Geschwindigkeitskonstanten
gegen die Proteinkonzentration. Die Geschwindigkeits-konstanten der Assoziation kass
und Dissoziation kdiss wurden aus der Steigung bzw. dem Achsenabschnitt einer linearen
Regression erhalten. Die lineare Anpassung folgt dabei folgender Gleichung:
1obs off onk k k hGBP (8)
Die Geschwindigkeitskonstante kdiss für die Bindungskinetik von hGBP1 beträgt demnach
0,03952 s-1
, kass ergibt einen Wert von 0,0053 µM-1
s-1
.
Abbildung 5-13: Kinetik der Assoziation von hGBP1 an die immobilisierte hGBP1-Mutante
K485C wt mit 50 µM GppNHp. Die Assoziationskinetiken wurden mittels SPR erhalten. Die
Geschwindigkeitskonstanten wurden aus Anpassungen einer einfach exponentiellen Funktion er-
halten und in Abhängigkeit zur Proteinkonzentration gesetzt. Die Geschwindigkeitskonstanten der
Assoziation kass und der Dissoziation kdiss wurden aus der Steigung bzw. dem Achsenabschnitt
einer linearen Regression ermittelt.
Aus diesen Werten kann ein KD von 7,45 µM berechnet werden. Dieser Wert zeigt eine
gute Übereinstimmung mit dem KD, der sich ergibt, wenn nicht der Achsenabschnitt als
kdiss gewählt wird, sondern der Mittelwert, der sich aus den Anpassungen einer einfach
exponentiellen Funktion der einzelnen Kurven ergibt (Abbildung 5-12). Die hergeleitete
Geschwindigkeitskonstante kdiss ist nur geringfügig kleiner (0,03352 s-1
) als der
Achsenabschnitt und der sich daraus ergebene KD von 6,32 µM zeigt eine hohe
Kapitel 5 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
152
Übereinstimmung. Hier ist jedoch kritisch zu sehen, dass sich während der
Dissoziationsphase kein GppNHp in der Lösung befand. Aus diesem Grund vereinen sich
während der Dissoziation zwei Prozesse, zum einen die Dissoziation des Nukleotids und
zum anderen die Dissoziation des Dimers. Hinzu kommt, dass alle Kurven zeigen, dass
insgesamt nur sehr wenig von der Oberfläche dissoziiert. Es wäre eigentlich zu erwarten
gewesen, dass die Dissoziation von hGBP1 wt deutlich schneller erfolgt und ein schneller
Abfall der Kurve zu beobachten ist. Dies kann anhand der Daten nicht bestätigt werden.
Um den Einfluss der Nukleotiddissoziation während der durch die Kurven beschriebenen
Dissoziationsphase besser beurteilen zu können, wurden zur weiteren Überprüfung und
Absicherung anschließend die Maximalwerte der Belegung gegen die
Proteinkonzentrationen aufgetragen (Abbildung 5-14) und mittels folgender Gleichung
angepasst:
22
0 00
min max min0
1 / 4 ( 1 / 4) 11 ( 1 1 )
1
d dads ads adshGBP K hGBP K hGBP
s hGBP hGBP hGBPhGBP
( 9)
Da die Plateauwerte einen Gleichgewichtszustand zwischen gebundenen und ungebunde-
nen Molekülen, also Assoziation und Dissoziation beschreiben, sollte der erhaltene KD
von 8,89 µM von störenden Effekten wie Massentransport in der Assoziationsphase oder
Rebinding in der Dissoziationsphase bereinigt sein. Da auch dieser KD sich kaum von den
Werten unterscheidet, die über die Kurvenanpassungen erhalten wurden, können diese
Effekte weitgehend ausgeschlossen werden. Desweiteren wird im Gleichgewicht der
Dimerisierungsprozess und damit auch die Dissoziation in Anwesenheit von GppNHp
betrachtet. Da der über die Kurvenanpasssungen ermittelte KD (6,32 µM) sich kaum von
dem über die Plateauwerte bestimmten Wert (8,89 µM) unterscheidet, kann ein Einfluss
durch die Dissoziation von GppNHp als gering eingeschätzt werden. Beide KD-Werte
beschreiben ein und denselben Prozess, nämlich die Dimerisierung von hGBP1. Dass die
Dissoziation in Abbildung 5-14 insgesamt sehr gering ausfällt, mag hauptsächlich mit der
niedrigen Flussrate von 5 µl/min zusammenhängen, die den Abtransport der Proteine
eventuell erschweren könnten.
Kapitel 5 Ergebnisse- das Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
153
Abbildung 5-14: Auftragung der Plateau-Werte der Wildtyp-Belegung gegen die Protein-
konzentration. Aus einer Kurvenanpassung konnte die Dissoziationskonstante KD ermittelt
werden.
Da jedoch Vergleichsdaten für höhere Flussraten nicht vorliegen, lassen sich darüber
keine konkreten Aussagen treffen.
Vergleicht man abschließend die über SPR ermittelten KD-Werte mit der in vorherigen
Studien über Single Turnover-Kinetikstudien bestimmten Dissoziationskonstante
(Dissertation Kunzelmann, 2006), die auf 0,88 µM abgeschätzt werden konnte, so liegen
alle Daten in derselben Größenordnung. An dieser Stelle sei noch mal erwähnt, dass die
Bestimmung der Dissoziationskonstante des GTP-gebundenen hGBP1-Dimers aus der
Konzentrationsabhängigkeit der Single Turnover-Kinetik auf der Annahme eines stark
vereinfachten Dimerisierungsmodell beruht und nicht direkt aus den Daten erhältlich ist.
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
154
6 Synthese und strukturelle Untersuchung von proteinre-
sistenten Thiolen auf der Basis von Peptiden
6.1 Zusammenfassung der Ergebnisse für das 10er-Peptidthiol
Im Abschnitt 2.6 wurden die bisher durchgeführten Studien über die Untersuchung von
Peptidthiol-SAMs bereits vorgestellt und die Motivation für die Verwendung solcher
SAMs herausgearbeitet (Chelmowski et al., 2008). Da für die Synthese der Peptide aus-
schließlich natürliche Bausteine, nämlich Aminosäuren, verwendet werden, könnten sol-
che Peptidthiol-SAMs in der Medizintechnik für die Beschichtung von Implantatoberflä-
chen oder in der Entwicklung von Kontaktlinsen zum Einsatz kommen, um die uner-
wünschte Bildung von Biofilmen aufgrund der immunologisch bedingten Abwehrreaktion
des Körpers zu vermeiden. Die Auswahl der verwendeten Aminosäuren erfolgte dabei auf
der Basis von früheren Studien über proteinresistente organische Oberflächen, insbeson-
dere über die OEG-Thiol-SAMs (Abschnitt 2.4).
Für das in dieser Untersuchung verwendete 10er Peptid , das über 1,3-dipolare
Cycloaddition mit einem Thiol verbunden wurde (Chelmowski et al., 2009) konnte der
Nachweis eines hohen Grades an Proteinresistenz erbracht werden (Tabelle 9) Die
Abfolge der Arbeitsschritte erfolgte dabei, wie bereits im Abschnitt 2.6 und in dem veröf-
fentlichten Artikel von 2008 beschrieben (Chelmowski et al., 2008). Zunächst erfolgte die
Überprüfung eines hohen Reinheitsgrades (MALDI/ ESI-MS), anschließend der Nach-
weis der Proteinresistenz mittels SPR. Zur weiteren Charakterisierung des Peptid-SAMs
wurde die Infrarotspektroskopie und XPS Messungen herangezogen. Anhand der Amid I-
Bande wurde zum einen versucht, auf eventuell vorliegende Sekundärstrukturelemente zu
schließen, zum anderen sollte anhand der Schichtdickenbestimmung mittels XPS und
über die Höhe der angelagerten Moleküle direkt Informationen über die vorliegende
Konformationen erhalten werden.
In der folgenden Abbildung sind die Adsorptionskurven für Streptavidin auf verschieden
terminierten SAMs gezeigt. Gegen Streptavidin zeigt der Peptidthiol-SAM des 10er-Pep-
tids ein hohes Maß an Proteinresistenz. Der CH3-terminierte SAM gilt dabei als Kon-
trolle, bei der eine sehr stark ausgeprägte unspezifische Adsorption stattfindet, während
der OEG(6)-Thiol-SAM proteinresistent ist. Tabelle 9 fasst die Ergebnisse der Adsorp-
tionsmessungen zusammen. Auf dem CH3-terminierten SAM und auf dem Peptid-2-SAM
(Erläuterung Abschnitt 2.6), auf dem aufgrund einer hohen Anzahl an hydrophoben
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
155
Aminosäuren ein hohes Maß an unspezifischer Adsorption zu erwarten ist, adsorbiert viel
Protein, wohingegen auf dem OEG(6)-Thiol-SAM keine Adsorption festgestellt werden
konnte. Die beobachtbare Adsorption für den Peptid-1-SAM zeigt das gleiche Ergebnis
wie für die OEG-Terminierung.
Tabelle 9: Zusammenfassung der Streptavidin-Adsorption auf dem 10er-Peptidthiol-SAM
SAM CH3 Peptid-2 OEG(6) Peptid-1
m (ads): [ng/cm²] c=0,01 mg/ml 66,3 62,3 ≤0,1 ≤0,1
m (ads): [ng/cm²] c=1,00 mg/ml 131,02 - ≤0,1 4,06
Für einen besseren Vergleich mit der Literatur wurden die Messungen mit einer Protein-
konzentration von 1 mg/ml wiederholt, die Injektionszeit wurde aus denselben Gründen
auf 10 min erhöht. Die Ergebnisse mit den höheren Konzentrationen entsprechen etwa
den gemessenen Adsorptionen, die mit der niedrigeren Konzentration erzielt wurden.
Auch für andere Proteine wie BSA und Fibronektin konnten die proteinresistenten Eigen-
schaften des Peptidthiols bestätigt werden.
Abbildung 6-1: IR-Spektren des Peptid-1-Thiol-SAMs als Volumenspektrum (KBr, oberes
Spektrum) und an der Oberfläche vor (unteres Spektrum) und nach (mittleres Spektrum)
Inkubation des Streptavidins (15 min) (Chelmowski et al., 2008).
Ergänzend zu den SPR-Messungen wurden IR-Spektren aufgenommen. Dazu wurden
Au/Si-Wafer hergestellt und anschließend in Stücke von 20 mm x 30 mm geschnitten und
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
156
mit Ethanol gesäubert sowie im Stickstoffstrom getrocknet. Die Wafer wurden dann für
24 Stunden in einer 1 mM Lösung der Peptidthiole eingelegt. Anschließend wurden die
fertigen Substrate erneut mit Ethanol gewaschen und wiederum getrocknet. Nach Auf-
nahme des IR-Spektrums wurde der Wafer in einer 200 nm Streptavidin-Lösung inkubiert
und nach 15 Minuten erneut ein Spektrum aufgenommen. Die Inkubation mit Streptavidin
führt zu keiner signifikanten Änderung des Signals, so dass davon ausgegangen werden
kann, dass sich kein Protein angelagert hat. Die Banden der IR-Messungen sind in
Tabelle 10 zusammengefasst.
Tabelle 10: Vergleich der IR-Spektren im Volumen und an der Oberfläche vor und nach
Adsorption des Streptavidins. Anhand der Amid I-Bandenverschiebung (rot markiert) können
Aussagen über eventuell vorliegende Sekundärstrukturelemente erfolgen.
Gruppe KBr SAM
vor Strep.-Inkubation nach Strep.Inkubation
Amid-A 3330 3291 3303
C=C (Triazol-Ring) 3069 3073 3067
CH (aliphatisch) 2931 2927 2924
Amid I 1673 1690 1689
Amid II 1546 1545 1545
Amid III 1130 1078 1081
Amid IV 826 802 811
Die für das Protein charakteristischen Amid-Banden (-A, -I, -II, -III, -IV) sind deutlich zu
erkennen. Über die Lage der Amid-I Bande ist es möglich, dem Peptidthiol Sekun-
därstrukturelemente zuzuordnen. Nach Goormaghtigh (Goormaghtigh et al., 1994) erge-
ben sich dabei folgende Bandenzuordnungen:
Abbildung 6-2: Amid I-Moden verschiedener Sekundärstrukturelemente (Goormaghtigh et
al., 1994).
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
157
Demnach können die Amid-I Banden des Peptid-1-Thiols bei 1674 bzw. 1690 cm-1
oder
nach Inkubation bei 1689 cm-1
einem β-Faltblatt (KBr) bzw. einer β-Schleife (SAM) zu-
geordnet werden, wenn ausschließlich das Maximum der Amid I-Bande zugrunde gelegt
wird. Es ist aus dem IR-Spektrum klar ersichtlich, dass die Amid I-Bande eine relativ
breite konturlose Bande darstellt, die sich aus überlappenden Einzelkomponenten zu-
sammensetzt, die für verschiedene Sekundärstrukturelemente charakteristisch sind
(Abbildung 6-3). Daher werden gängige Verfahren angewandt, um das Spektrum zu
dekonvolieren und somit eine bessere Auflösung zu erreichen. Eine davon ist die Bildung
der 2. Ableitung. Es ergeben sich dabei schmalere Banden mit negativem Vorzeichen.
Um die unter den Amid I-Banden befindlichen Komponenten zu entschlüsseln, kam auch
für das Peptidthiol diese Methode zur Anwendung. Das Ergebnis (Abbildung 6-3) zeigt
eine negative, gerade noch vom Rauschen unterscheidbare Bande bei ca. 1652 cm-1
, aber
nicht bei 1674 cm-1, was etwa genau der Mitte der Amid I-Bande entspricht, wenn keine
weiteren Maßnahmen zur Verbesserung der Auflösung unternommen werden (Abbildung
6-3).
Abbildung 6-3: Ausschnitt aus dem IR-Spektrum des Peptidthiols. Dargestellt sind die
charakteristischen Amid I und Amid II-Bande des Peptids (oben) und die 2. Ableitung (unten).
Insgesamt ist der Amid I-Peak sehr breit, was darauf hindeutet, dass sich mehrere
Einzelkomponenten unter der Bande befinden. Wird genau die Mitte der dargestellten Bande
genommen, ergibt sich ein Wert für die Bandenverschiebung von ca. 1674 cm-1
und ca. 1550 für
die Amid II-Bande. In der 2. Ableitung ergibt sich bei 1652 cm-1
eine einzige negative Bande, die
vom Rauschen gerade noch unterscheidbar ist.
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
158
Wird die Bandenstruktur für H2O herangezogen(Abbildung 6-2), so lässt sich der durch
die 2. Ableitung erhaltene Werte entweder einer Helix oder aber einer ungeordneten
Struktur zuordnen, aber nicht einem β-Faltblatt. Dieses Beispiel zeigt deutlich, dass für
die Sekundärstrukturanalyse von Proteinen mittels IR zum einen gewährleistet sein muss,
dass die Intensitäten der Spektren ausreichend hoch und die Banden scharf genug sein
müssen, um eine direkte Analyse ohne Auflösungsverbesserung vornehmen zu können.
Oft reicht IR als einzige Methode oft nicht aus, um eine eindeutige Struktur zu ermitteln,
da die Bandenbereiche der einzelnen Sekundärstrukturelemente sich teilweise stark
überlappen.
Zur weiteren Charakterisierung wurden deswegen mit dem Peptid-Thiol-SAM XPS-Mes-
sungen durchgeführt, um Informationen über die Schichtdicke des SAMs zu erhalten. Als
Referenz wurde ein Oktadekanthiol SAM vorbereitet und eine Schichtdicke von 22 Å
angenommen (Herleitung über NIST X-ray Photoelectron Spectroscopy Database). Des
Weiteren konnte eine Formel für die Schichtdickenbestimmung aus der Literatur herange-
zogen werden (Fuxen, 2001). Für die Analyse wurden die Flächen unter der Au4f und
C1s-Banden integriert. Über eine numerische Lösung der Gleichung zur Ermittlung der
Höhe des Films konnte eine Schichtdicke des Peptid-Thiol-SAMs von 56,6 ± 6 Å erhalten
werden. Diese Höhe passt zu einem Thiolanker (20,8 Å) mit einem Dekapeptid (30 Å),
das zu einem β-Faltblatt angeordnet ist, und deckt sich mit dem IR-Ergebnis, wenn die
unveränderte Amid I-Bande, aber nicht die 2. Ableitung als Grundlage genommen wird.
Eine ganz andere mögliche Interpretation der Ergebnisse muss aber an dieser Stelle
ebenfalls in Erwägung gezogen werden. Die in XPS ermittelten Schichtdicken könnten
auch darauf hinweisen, dass das Peptidthiol nur sehr leicht gewunden ist oder sogar gar
keine geordnete Struktur hat (random). Nach Bildung der 2. Ableitung ergibt sich im IR-
Spektrum eine negative Bande bei. 1652 cm-1
, die anhand der Tabelle in Abbildung 6-2
sowohl einer Helix als auch einer ungeordneten Struktur zugeordnet werden könnte.
Zusammen mit den XPS-Messungen jedoch ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine α-Helix
vorliegt, eher gering einzuschätzen.
Um weitere Anhaltspunkte zu sammeln, die auf eine bestimmte Sekundärstruktur des
10er-Peptidthiols hindeuten könnten, wurden Simulationen mit verschiedenen Algorith-
men durchgeführt (MLRC, DBM, GORIV). Die Internetplattform „Network Protein
Sequence“ (www.nps.pbil.ibcp.fr, NetworkProteinSequence, TBIS, 2000, 25, 147-150)
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
159
bietet die Möglichkeit, alle drei Algorithmen zu verwenden. Das Ergebnis dieser
Simulationen ist in folgender Tabelle dargestellt:
Tabelle 11: Simulationsergebnisse für die Sekundärstrukturbestimmung des Peptids für
drei verschiedene Algorithmen
Sekundärstruktur MLRC DBM GORIV
α-Helix 0 0 0
β-Faltblatt 0 0 0
Schleife 80 0 50
ungeordnet 20 100 50
Besonders die Ergebnisse der Simulation über GORIV und MLRC würden die aus den
IR-Ergebnissen ableitbare Schleifenstruktur zumindest teilweise bestätigen, aber viel eher
wird durch alle drei Algorithmen eine ungeordnete Struktur favorisiert. Damit fällt eine
helikale Struktur, wie sie bei OEG-Thiol auf Goldoberflächen gefunden wurde und als
entscheidender Mediator der Proteinresistenz identifiziert werden konnte, für das 10-er-
Peptid gemäß den Daten heraus. Bei Verlust seiner helikalen Struktur verliert ein OEG-
SAM auch seine proteinresistenten Eigenschaften. Da diese Sekundärstruktur für das
Peptidthiol nicht gefunden werden konnte, müssen andere Mechanismen für die
Proteinresistenz verantwortlich sein.
Unter Berücksichtigung, dass in einem Peptid im Gegensatz zu einem Protein sehr viel
schwächere Wechselwirkungen wirken, die zu einer stabilen Konformation führen
könnten, ist das ermittelte Ergebnis zunächst einmal nicht unbedingt überraschend. Es ist
durchaus viel eher realistisch, dass es sich bei dem 10er-Peptidthiol sowohl im Volumen,
aber auch als SAM, um ein dynamisches System handelt, dass sich zufällig zu einer
Struktur anordnet. Hinzu kommt an der Oberfläche, dass der durch die
nachbarschaftlichen Abstoßungen resultierende Abstand zwischen den Peptiden, die mehr
Volumen einnehmen als das OEG-Thiol, nach Formierung des SAMs wahrscheinlich für
die Ausbildung von geordneten Sekundärstrukturelementen, besonders für helikale
Strukturen, nicht ausreicht. Viel eher könnten die proteinresistenten Eigenschaften des
10er-Peptids auf die verhältnismäßig hohe Anzahl an Hydroxylgruppen der Serine in dem
Peptid zurückzuführen sein, die auf der Oberfläche einem OH-terminierten SAM sehr
ähnlich sind und somit Proteinresistenz zeigen.
Unter Berücksichtigung der experimentellen Ergebnisse und in die Diskussion einge-
brachten theoretischen Überlegungen für das 10er-Peptid wurden für die weitere Vorge-
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
160
hensweise, also die Synthese weiterer Peptidthiole, Methodenauswahl, Wahl der Ver-
suchsbedingungen etc., folgende Schlussfolgerungen gezogen:
1. Ein längeres Peptid sollte eher in der Lage sein, eine helikale Struktur mit mehre-
ren Windungen auszubilden, da eine größere Flexibilität und Beweglichkeit des
Peptids gegeben ist. Des Weiteren konnte für das OEG-Thiol festgestellt werden,
dass eine Verlängerung der Kette zu einem höheren Grad von Proteinresistenz
führt. Aus diesem Grund sollte überprüft werden, ob dies auch analog für das
Peptidthiol gilt.
2. Der hydrophile Charakter soll durch Verwendung von Serin noch verstärkt
werden, da insbesondere in der OH-Gruppe des Serinrestes der Schlüssel zu einer
starken Proteophobie liegen könnte (ähnlich wie beim OH-Thiol).
3. Auch Glycin als guter Helixbildner soll verstärkt bei der Synthese berücksichtigt
werden.
4. Da weder die XPS noch die IR-Daten unter physiologischen Bedingungen, d. h. in
wässriger Umgebung bei einem pH-Wert zwischen 7,4, ermittelt wurden, sollten
nun die Peptidthiole im Hinblick auf ihr mögliches Einsatzgebiet, nämlich auf Im-
plantaten oder Kontaktlinsen im menschlichen Körper, untersucht werden. Von
Proteinen weiß man, dass ihre Struktur ausschließlich in wässriger Umgebung bei
physiologischem pH-Wert erhalten bleibt. Ansonsten setzt eine Denaturierung des
Proteins, also eine Veränderung oder gar Zerstörung der nativen Struktur, ein.
Auch wenn das Peptidthiol deutlich kleiner als ein Protein ist, sind auch hier
mögliche Unterschiede in der Sekundärstruktur in Luft oder Vakuum im Ver-
gleich zur „natürlichen“ Umgebung nicht auszuschließen.
5. Da der Abzug der Wasserbande (H2O) im Amid I-Bereich nicht ganz unproblema-
tisch ist und die relativen Flächenanteile der „angefitteten“ Kurven beeinflussen
kann, wurde die folgenden Messungen weitgehend in D2O durchgeführt, welches
im Bereich der Amidbande nicht absorbiert. Die Kontrolle des
Deuterierungsgrades des Proteins kann dabei über das Verschwinden des Amid II-
und das Entstehen des sogenannten Amid II‘-Signals bei 1450 cm-1
in D2O über-
prüft werden.
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
161
6.2 Synthese und strukturelle Analyse des 25er-Peptidthiols
Aus den im vorherigen Abschnitt aufgestellten Kriterien wurde eine Aminosäuresequenz
mit einer Länge von 25 Aminosäuren für das neue Peptid ausgewählt.
Abbildung 6-4: Aminosäuresequenz und chemische Struktur des verwendeten 25er-Peptids
und des Thiolankers. (Bild erstellt in CS Chem DRAW)
Die Bindung des Peptids an das Thiol erfolgte über 1,3-dipolare Cycloaddition. Sämtliche
Synthese- und Aufreinigungsschritte wurden analog zum 10er-Peptid durchgeführt. Die
gewählte Peptidsequenz ist in Abbildung 6-4 dargestellt. Da bereits für das 10er-Peptid
eine hohe Proteinresistenz gefunden worden war, wurde die Sequenz um 5 SSG-Einheiten
verlängert, da insbesondere in den Serinresten, also den Hydroxylgruppe, ein
entscheidender Faktor für Proteophobie vermutet wurde.
6.2.1 Synthese und Charakterisierung des 25er-Peptidthiols mittels HPLC und
MALDI-TOF
Sämtliche Syntheseschritte wurden im Lehrstuhl für Anorganische Chemie I
durchgeführt. Die Peptidsynthese erfolgte analog zum 10-mer in einem kommerziellen
Peptid-Synthesizer (Firma CEM) Der Ansatz bestand dabei aus 0,1 mM Leu-Wang-Harz
(Beladung 0,69 mmol/g), 0,2 M Aminosäurelösungen in DMF, 0,26 mmol
Azidoessigsäure, 0,5 M Aktivator TBTU/HOBt und 2 M DIPEA Lösung. Die fertigen
Peptide wurden anschließend über HPLC und MALDI charakterisiert. Die Synthese und
Charakterisierung von Oligo-Peptiden ist bereits etabliert und in der Literatur weit
verbreitet. Das MALDI-Spektrum ist in Abbildung 6-6 dargestellt und zeigt deutlich
einen Peak bei m/z = 2389, was dem Massenpeak des Peptidthiols entspricht (vergleiche
Abbildung 6-6). Aus dem Massenspektrum kann somit eindeutig auf das gewünschte
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
162
Peptidthiol geschlossen werden. Die HPLC zeigt zusätzlich, dass die Substanz in großer
Reinheit vorliegt.
Abbildung 6-5: HPLC-Spektrum des Produktes aus der Synthese des 25er-Peptids.
Abbildung 6-6: MALDI-Spektrum des 25er-Peptidthiols. Der Peak bei m/z = 2389 kann
eindeutig dem Peptidthiol zugeordnet werden. Zudem liegt das Hauptprodukt in großer
Reinheit vor.
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
163
Für die anschließende Click-Reaktion wurden die Peptide für 72 Stunden in einer Lösung
aus CuI (0,2123 mmol), DIPEA (12,73 mmol) und 11-Thioacetyl-undekansäure-
propargyl-amid (0,1698 mmol) in DMF (1,1 ml) inkubiert. Für die Experimente wurde
eine Stammlösung der Peptide in Ethanol angesetzt (c = 36 mM). Für die weiteren
Experimente wurden jeweils Lösungen mit einer Peptidthiolkonzentration von 1 mM
angesetzt.
6.2.2 Herstellung des Peptid-SAMS und Überprüfung der Proteinresistenz mittels
SPR
Die Herstellung der Au/Si-Wafer wurde, wie bereits für das 10er-Peptidthiol beschrieben
(Abschnitt 3.2.2.4.1), hergestellt. Die präparierten SAMs wurden mittels IR-Spektrosko-
pie (Reflexions-Absorptionsspektroskopie, IRRAS) sowohl im Volumen als auch auf der
Oberfläche (SAM) charakterisiert.
Abbildung 6-7: IR-Spektrum des 25er-Peptidthiols im Volumen (KBr). Die charakteristi-
schen Bandenverschiebungen sind durch schwarze Striche im Spektrum markiert.
Anhand der Spektren sollten zunächst nur die charakteristischen Amid-Banden identi-
fiziert und die Banden im Volumen und im SAM miteinander verglichen werden, bevor
dann im Folgenden zunächst die Proteinresistenz des SAMs überprüft und anschließend
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
164
eine Sekundärstrukturanalyse anhand der Amid I-Bande vorgenommen wurde. Die für die
Peptide charakteristischen Amid-Banden I und II sind deutlich zu erkennen.
Abbildung 6-8: IR-Spektrum des 25er-Peptidthiols im SAM.
Tabelle 12: Zusammenfassung der wichtigsten Banden für das 25er-Peptidthiol im Volumen
(KBr) und im SAM.
Gruppe Volumen SAM
Amid-A 3290 3330
Amid-I 1622 1677
Amid-II 1519 1549
Amid-III 1207 -
Amid-IV/V 800 816
C=C (Triazolring) 3071 3067
CH (aliphatisch) 2935 2928
Auch für die Amid III und IV (V) kann zumindest teilweise eine Zuordnung getroffen
werden. Eine grobe Analyse der Sekundärstruktur anhand der Gesamtspektren ergibt für
den SAM eine Schleifenstruktur (evtl. auch ein β-Faltblatt). Im Volumen würde alles auf
ein β-Faltblatt hindeuten. Ohne weitere Auflösungsverbesserung der Spektren zeigen die
Ergebnisse für das 10-er und 25-er-Peptid bezüglich der Sekundärstrukturen, die anhand
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
165
der Banden den beiden Molekülen zugeordnet werden können, eine hohe
Übereinstimmung. (siehe auch Tabelle 10).
Zur Überprüfung der Proteinresistenz wurde die Adsorption verschiedener Proteine,
nämlich Streptavidin, BSA, Fibronektin und Fibrinogen gemessen. Die Vorgehensweise
erfolgte analog zum 10-er-Peptid, nur das längere Messzeiten von 20 Minuten und eine
Flussrate von 5 µl/min verwendet wurden. Exemplarisch sind die Adsorptionskurven für
Fibrinogen und Fibronektin auf verschieden terminierten SAMs gezeigt. Alle Ergebnisse
sind in Abbildung 6-11 zusammengefasst. Hier sind die verwendeten Proteine und die
jeweiligen Adsorptionen auf Gold nach einer 20 minütigen Dissoziationsphase
dargestellt. Desweiteren wurden die gemessenen Belegungsdichten mit dem aus
Abschnitt 6.1 beschriebenen 10er-Peptid verglichen.
Abbildung 6-9: Zusammenfassung der Adsorptionskurven für Fibrinogen auf verschieden
terminierten SAMs. Start und Ende der Inkubation sind mit gestrichelten Linien gekenn-
zeichnet.
Für alle getesteten Proteine zeigt das Peptidthiol einen hohen Grad an Proteinresistenz.
Besonders für Fibronektin und Fibrinogen, das für seine „klebrigen“ Eigenschaften be-
kannt ist und schon in früheren Studien mit OEG-Thiol (Herrwerth, S., Eck, W.,
Reinhardt, S., Grunze, M., 2003) verwendet wurde, ist die Proteophobie besonders ausge-
prägt und mit OEG-Thiol vergleichbar. Etwas kleiner, aber durchaus deutlich, fällt der
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
166
Effekt bei Streptavidin und BSA aus. Für das 10er-Peptidthiol wurde der
Proteinresistenzgrad nur für Streptavidin, BSA und Fibronektin ermittelt.
Abbildung 6-10: Zusammenfassung der Adsorptionskurven für Fibronektin.
615 16
816 19
14 1 5148 7
19
92
31 30
239
349
0
50
100
150
200
250
300
350
400
SA BSA Fibronectin Fibrinogen
Ad
sorp
tion
[n
g/c
m²]
10er-Peptidthiol 25er-Peptidthiol OEG-Thiol OH-Thiol CH3-Thiol
Abbildung 6-11: Zusammenfassung der Proteinadsorption auf verschiedenen SAMs für
Gold.
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
167
Der Vergleich der gemessenen Adsorptionen mit dem 25er-Peptidthiol deutet insgesamt
auf eine hohe Übereinstimmung hin. Sowohl für den 10er- als auch den 25er-Peptidthiol-
SAM auf Gold konnte somit ein hohes Maß an Proteinresistenz gezeigt werden. Für
Silberoberflächen, auf der die Packungsdichte der PEG-Thiole deutlich höher ist und
somit die Ausbildung von helikalen Strukturen verhindert wird, konnte in vorherigen
Studien der Nachweis erbracht werden, dass ein OEG-SAM seine proteophoben
Eigenschaften verliert. Wenn die Sekundärstruktur in gleichem Maße beim Peptidthiol
ein entscheidender Faktor für Proteinresistenz ist, sollte ein ähnlicher Effekt wie beim
OEG-Thiol zu beobachten sein, wenn die SPR-Messungen auf Silberoberflächen
wiederholt werden. Exemplarisch ist die Adsorption von Fibrinogen auf verschieden
terminierten SAMs, die auf Silberwafern aufgebracht worden sind, in Abbildung 6-12
dargestellt. Da je nach SAM die Dissoziationsphasen, aber auch Assoziationsphasen
unterschiedlich lange dauerten, wurde die Länge der Inkubationsphasen teilweise variiert
(CH3-Thiol-SAM) bzw. die Läufe eher beendet, da die Oxidationsempfindlichkeit der
Silberwafer sehr hoch ist und somit die Läufe so kurz wie möglich gehalten werden
mussten. Für das 10er-Peptidthiol wurden die SPR-Messungen auf Silber nicht
durchgeführt.
Abbildung 6-12: Zusammenfassung der Adsorption von Fibrinogen auf verschieden
terminierten SAMs für Silber.
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
168
Die Zusammenfassung der Adsorption für alle Proteine und SAMs ist in Abbildung 6-13
dargestellt. Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Proteinresistenz für das Peptidthiol
vollständig erhalten bleibt, sogar teilweise noch verstärkt wird.
0,59 7 10,5
92 45
12
43
75
5
40
239
300
0
50
100
150
200
250
300
350
SA BSA Fibronectin Fibrinogen
Ad
sorp
tio
n [
ng
/cm
²]
Peptidthiol OEG-Thiol OH-Thiol CH3-Thiol
Abbildung 6-13: Zusammenfassung der Proteinadsorption auf verschiedenen SAMs für
Silber.
Dagegen nehmen die proteophoben Eigenschaften des OEG-Thiol-SAMs
erwartungsgemäß merklich ab. Bei allen verwendeten Proteinen adsorbiert mindestens
mehr als das Doppelte auf der Oberfläche als bei Gold. Die SPR-Ergebnisse stützen die
schon zuvor gemachten Beobachtungen, dass auf Silber die Packungsdichte der OEG-
Thiole zu hoch ist, um helikale Strukturen auszubilden und somit die Proteinresistenz
verringert oder sogar ganz verloren geht. Da die Peptidthiole gemäß den Resultaten ihre
proteophoben Eigenschaften auch auf Silberoberflächen beibehalten, scheinen hier,
analog zum 10-er-Peptid andere Mechanismen zu wirken als beim OEG-Thiol. Um dies
zu zeigen, wurden im Anschluss Sekundärstrukturanalysen mittels IR durchgeführt.
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
169
6.2.3 Sekundärstrukturanalysen des Peptidthiols mit der Infrarotspektroskopie
6.2.3.1 Trockenmessungen im Volumen (Transmission) und im SAM (Reflexion)
Die in Abbildung 6-7 und Abbildung 6-8 gezeigten IR-Spektren wurden zur besseren
Erkennung von Einzelkomponenten mit Hilfe der 2. Ableitung, im Bereich der Amid I-
Abbildung 6-14: IR-Spektrum (Transmission) des Peptidthiols im Volumen (KBr) gemessen
an Luft und 2. Ableitung des Spektrums (Gesamtspektrum siehe Abbildung 6-7)
Abbildung 6-15: IR-Spektrum (Reflexion) des Peptidthiols im SAM gemessen an Luft und 2.
Ableitung des Spektrums. (Gesamtspektrum siehe Abbildung 6-8)
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
170
Bande besser aufgelöst. Aus den unveränderten Spektren konnten bis dato die Erkennt-
nisse gewonnen werden, dass sich das Peptidthiol im Volumen tendenziell zu einem
β-Faltblatt, an der Oberfläche zu einer Faltblatt- oder Schleifenstruktur formt (vgl.
Abschnitt 6.2.2). Nach der Feinstrukturanalyse ergeben sich jedoch folgende Ergebnisse:
Die 2. Ableitung zeigt in beiden Fällen, sowohl an der Oberfläche als auch im Volumen,
ein Minimum bei 1652 cm-1
. Zusätzlich kann bei der Volumenmessung eine weitere ne-
gative Bande bei 1684 cm-1
ausgemacht werden, die sich jedoch nur geringfügig vom
Rauschen unterscheidet. Diese Ergebnisse würden, analog zum 10er-Peptid, für eine
weitgehend ungeordnete Struktur sprechen. Im Volumen kann zusätzlich eine β-
Faltblattstruktur anhand der Bande bei 1684 cm-1
identifiziert werden, die jedoch eine
geringere Intensität aufweist als die Bande bei 1652 cm-1
. An der Oberfläche (SAM) ist
ausschließlich ein schwacher negativer Peak bei 1652 cm-1
detektierbar, der sich nur
wenig vom Rauschen absetzt. Insgesamt scheint also die β-Faltblattstruktur an der
Oberfläche zu verschwinden, doch muss hinsichtlich der Interpretation der Ergebnisse
berücksichtigt werden, dass die Intensitäten an der Oberfläche deutlich geringer sind als
im Volumen, so dass nur schlechte Signal/Rausch-Verhältnisse erreicht werden und
schwache Banden unter Umständen nicht mehr detektierbar sind. Da die Ergebnisse für
das 10-er- und 25-er-Peptid große Übereinstimmungen zeigen, können ähnliche
strukturelle Gegebenheiten angenommen werden. Aus diesem Grund ist es
wahrscheinlicher, dass die Bandenverschiebung bei 1652 cm-1
auch beim 25er-Peptid in
erster Linie für eine ungeordnete Struktur spricht, zumal die XPS-Messungen und
Simulationen beim 10-er-Peptid keinen Anhaltspunkt für gewundene Strukturen lieferten.
Das bedeutet jedoch nicht, dass helikale oder partiell helikale Strukturen prinzipiell
ausgeschlossen sind. Der negative Peak bei 1652 cm-1
könnte auch als Mischung
zwischen einem dominierenden Random-Anteil und einem kleineren helikalen Anteil
gedeutet werden.
Um der Klärung dieser Frage nachzugehen, wurden im Anschluss für eine vertiefende
Konkretisierung dieser Resultate zunächst Messungen in Lösung bei physiologischem
pH-Wert durchgeführt und anschließend mit der Situation im trockenen und befeuchteten
SAM verglichen. Um eine möglichst hohe Auflösung für die Messungen an der
Oberfläche zu erreichen, wurden die ab dem Abschnitt 6.2.3.3 gezeigten Messungen im
SAM mit einer ATR-Einheit durchgeführt (Hyperion 3000 (Bruker))
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
171
Ein Vergleich zur CD-Spektroskopie sollte darüber hinaus Aufschluss darüber geben, ob
das Peptidthiol durch eine ungeordnete oder aber eine helikale Struktur dominiert wird,
da die IR-Daten keine eindeutige Zuordnung zulassen.
6.2.3.2 Sekundärstrukturanalyse des Peptidthiols in Lösung mittels IR und CD
6.2.3.2.1 IR- und CD-Messungen in D2O
Für die Untersuchung der Sekundärstruktur in Lösung wurde standardmäßig statt in H2O
in D2O gemessen (Konfocheck, Bruker), da der Abzug der H2O-Bande im Amid I-Be-
reich sehr problematisch ist und zu ungewünschten Verschiebungen der relativen Flä-
chenanteile der angefitteten Kurven führen kann. Gleichzeitig sollten die Messungen zü-
gig durchgeführt werden, um den Austausch von Deuterium zu Wasserstoff nicht zu weit
fortschreiten zu lassen, da ansonsten die H2O-Bande im Laufe der Zeit (einige Minuten
bis einige Stunden je nach Stabilität der Proteinstruktur) wieder auftaucht und zu schwer
einkalkulierenden Bandenverschiebungen führen kann.
Das IR-Spektrum des Peptidthiols in D2O (Abbildung 6-16) stellt nur einen Ausschnitt
dar, in dem die Amid I und II-Banden gezeigt sind. Anhand der Amid-I Bande kann
definitiv dem Peptidthiol eine Schleifenstruktur zugeordnet werden.
Abbildung 6-16: IR-Spektrum des Peptidthiols in D2O und 2. Ableitung.
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
172
Das zweite Maximum bei 1652 cm-1
spricht entweder für eine ungeordnete Struktur oder
eine α-Helix.
Abbildung 6-17: Berechnung der Anteile für die Einzelkomponenten der Amid I-Bande.
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
173
Die Amid-II-Bande bei ca. 1460 cm-1
zeigt deutlich an, dass das umgebende Medium
D2O ist. Auch für die 2. Ableitung ergeben sich dieselben Bandenzuordnungen.
Des Weiteren wurde versucht anhand verschiedener Kurvenanpassungen eine
Dekomposition der Amid I-Bande nach vorangegangener Fourier-Selbstdekonvolution
durchzuführen. Je nach Kurvenanpassung ergeben sich dabei verschiedene Anteile. In
beiden Fits ergibt sich demnach ein hoher Anteil an Helix, gepaart mit einer, je nach
Anpassung, ungeordneten oder Schleifenstruktur. Die Ergebnisse würden insgesamt dafür
sprechen, dass der nach Bildung der 2. Ableitung entstehende Peak bei 1650 cm-1
durchaus auch einer Helix zugeordnet werden kann. Hinzu kommt die negative Bande bei
1674 cm-1,
die, wie bereits erwähnt, für einen zusätzlichen Schleifenanteil spricht, der
durch die in Abbildung 6-17 durchgeführte Dekomposition der Amid I-Bande bestätigt
wird. Anhand der Anteilsberechnungen (Abbildung 6-17) lässt sich aber auch sehr gut
veranschaulichen, wie problematisch eine quantitative Beurteilung und auch eine
eindeutige Zuordnung der Sekundärstruktur ist. Je nach Anpassung wird von zwei oder
drei Anteilen ausgegangen, die relativ hohe prozentuale Schwankungen zeigen. Für die
Kurven wurden noch weitere Anpassungen (Fits) durchgeführt (Kurven nicht gezeigt),
die stets stark voneinander abwichen. Auch deutlich höhere Random-Anteile als in der
rechten Kurve kamen dabei teilweise zustande. Hinzu kommt bei der Interpretation der
Peptidthiolstruktur in Lösung mittels IR noch ein ganz anderes Problem, nämlich dass für
die Synthese des Peptids Trifluoressigsäure (TFA) benötigt wird , das eine starke
Infrarotbande bei 1673 cm-1
aufweist und somit einen Teil des Amid I-Bandenbereiches
überdeckt. Die Peptidthiole wurden zwar einige Male mit 0,1 M Salzsäure (HCl)
gewaschen (Andrushchenko et al., 2001), doch kann ein vollständiges Entfernen von TFA
zunächst einmal nicht garantiert werden.
Trotz allem bleibt zunächst festzuhalten, dass die durchgeführte
Einzelkomponentenzerlegung zumindest qualitativ Hinweise auf helikale Strukturen
liefert, die je nach Fit die Gesamtstruktur des Peptids sogar dominieren.
Um die IR-Daten aus den genannten Gründen besser beurteilen zu können, wurde ein
CD-Spektrum in Lösung aufgenommen (Abbildung 6-18). Anschließend wurden die
Anteile der Sekundärstrukturelemente anhand von verschiedenen Methoden nach Reed
und Yang berechnet (Chen, 1971; Lux, 1972; Reid et al., 1981; Reed, 1997).
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
174
Abbildung 6-18: CD-Spektren des Peptidthiols. Als Referenz wurde der reine Puffer (D2O,
10 mM Tris, pH 7,4) ohne Peptidthiol eingesetzt.
Diese Methoden waren in der dem CD-Spektrometer beigefügten Software integriert und
basieren auf Datensätzen von nativen Vergleichsproteinen, deren Sekundärstruktur
bekannt ist.
Tabelle 13: Berechnung der Sekundärstrukturanteile mittels CD-Spektroskopie
Sekundärstrukturelemente Anteile der Sekundärstrukturelemente
(Reed/Yang)
α-Helix 6/0
β-Faltblatt 31,3/23,6
β-Turn 0/17,7
Random-Coil 67,3/58,7
Die Anteile, die sich daraus ergeben (Tabelle 13), sind für beide Methoden zum größten
Teil Random, was an dem schwach ausgeprägten Maximum bei ca. 212 nm (p→p*) und
dem deutlichen Minimum bei 195 nm (n→p*) in den Spektren (Abbildung 6-18) zu
erkennen ist. Zu geringeren Anteilen (31 % (Reed) bzw. 24 % (Yang)) treten auch β-
Faltblatt-Strukturen auf. Desweiteren liefert die Methode nach Yang auch Hinweise auf
β-Schleifen (17,7 %). Zu einem sehr geringen Anteil konnten auch Helixstrukturen
identifiziert werden (Reed, 6 %). Werden diese CD-Daten zugrundegelegt und mit den
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
175
IR-Daten verglichen, kann klar bestätigt werden, dass sich die in Abbildung 6-17
durchgeführte Einzelkomponentenzerlegung für eine quantitative Sekundärstrukturana-
lyse nicht wirklich eignet, zumal je nach Anpassung sowohl die Anzahl der berechneten
Sekundärstrukturelemente und als auch die sich ergebenden Anteile stark variieren.
Prinzipiell könnte man den negativen Peak bei 1674 cm-1
im IR-Spektrum (Abbildung
6-16) dem TFA zuordnen, doch würde dieser Peak auch einer β-Schleife entsprechen, die
sich ebenfalls aus den Berechnungen der CD-Spektren ergibt. Der Einfluss durch TFA ist
scheinbar äußerst gering einzuschätzen. Der zweite negative Peak bei 1652 cm-1
würde
zusammen mit den CD-Ergebnissen größtenteils einer Random-Struktur zuzuordnen sein,
gepaart mit einem marginalen Anteil Helix.
6.2.3.2.2 Einfluss von Trifluorethanol auf die Sekundärstruktur des Peptidthiols
Auch die folgenden Messreihen wurden sowohl mit IR- als auch CD-Spektroskopie
durchgeführt. Insgesamt wurde der Einfluss von Trifluorethanol auf die Struktur des
Peptidthiols getestet. Von Trifluorethanol (TFE) ist bekannt, dass es helikale Strukturen
stabilisiert bzw. induziert (Sticht et al., 1994; Shiraki et al., 1995; Kentsis /Sosnick, 1998;
Luo /Baldwin, 1998; Myers et al., 1998). Wenn das Peptidthiol zu einer Helix, zumindest
partiell gefaltet ist, sollte das TFE diesen Effekt verstärken.
Abbildung 6-19: IR-Spektren des Peptidthiols in H2O (rote Kurve) und 5 % Trifluorethanol
(schwarze Kurve) im Bereich von 1400 bis 1750 cm-1
.
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
176
Zunächst wurde eine Messung bei 5 % TFE durchgeführt (Abbildung 6-19). Hier ist
allerdings zu bemerken, dass hier H2O und nicht D2O verwendet wurde. und nicht
verwendet. Um auszuschließen. dass durch die H2O-Bande die Amid-I-Bande verdeckt
wird und nach Berechnung der 2. Ableitung wichtige Strukturinformationen verloren
gehen, wurde eine weitere Messreihe mit 10%, 30 % und 50 % TFE in D2O durchgeführt
(Abbildung 6-21). Im Bereich zwischen 1400 und 1750 cm-1
sieht es im Falle von 5 %
Trifluorethanol in H2O (Abbildung 6-19) zunächst so aus, als ob Trifluorethanol keinen
entscheidenden Einfluss auf die Absorptionsbande bei ca. 1652 cm-1
, die sowohl einer
Helix als auch einer ungeordneten Struktur zugeordnet werden könnte, hat.
Abbildung 6-20: IR-Spektren des Peptidthiols in H2O und 5 % Trifluorethanol (TFE) im
Bereich von 1600 bis 1700 cm-1
.
Wird jedoch ausschließlich der Amid I-Bereich betrachtet (Abbildung 6-20), so wird eine
Bandenverschiebung von 1649 cm-1
(rote Kurve) auf 1655 cm-1
(schwarze Kurve) nach
Zugabe von 5 % Trifluorethanol beobachtet. Der andere negative Peak bei ca. 1680 cm-1
,
der einem β-Faltblatt bzw. einer Schleife zugeordnet werden kann, verschiebt sich jedoch
nicht. Der beobachtete Shift hat somit nichts damit zu tun, dass sich das Gesamtspektrum
durch Zugabe von TFE aufgrund eines systematischen Fehlers bei Verrechnung mit
Referenz o.ä. insgesamt verschoben hat, sondern scheint definitiv in der Struktur des
Peptidthiols begründet zu sein. Eine mögliche Deutung dieser Beobachtung wäre zum
einen, dass ohne TFE das Peptidthiol in einer ungeordneten Struktur vorliegt, mit TFE
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
177
auch helikale Anteile, die auf intramolekularen Umstrukturierungen basieren,
hinzukommen. Zum anderen wäre es auch möglich, dass die meisten Peptidthiole
weiterhin ungeordnet vorliegen und nur eine kleinere Population helikale Windungen
ausbildet. Damit bleibt festzuhalten, dass eine Umstrukturierung des Peptidthiols unter
dem Einfluss von TFE eintritt, die durchaus als Induktion von Helices interpretiert
werden kann.
Leider konnten die Messungen für 10 %, 30 % und 50 % TFE (Abbildung 6-21), die in
D2O durchgeführt wurden, den beobachteten Bandenshift nicht bestätigen, da das
Signal/Rausch-Verhältnis deutlich schlechter war.
Abbildung 6-21: IR-Spektren des Peptidthiols in D2O und verschiedenen TFE-
Konzentrationen.
Bis auf die in H2O im Vergleich zu D2O aufgrund der unterschiedlichen Massen der
beteiligten Atome H und D und der daraus resultierenden Veränderung der
Schwingungsfrequenz Verschiebung der Banden zu höheren Wellenzahlen (ca. 3-5 cm-1
)
können keine weiteren signifikanten Unterschiede im Spektrum ausgemacht werden.
Insgesamt sind nach 2. Ableitung zwei negative Banden bei 1674 cm-1
(β-Faltblatt oder
Schleife) und eine schwache konturlose Bande bei ca. 1646 cm-1
(ungeordnet/ Helix) zu
sehen, die wiederum für Helix oder Random sprechen würde.
Um herauszufinden, ob die beobachtete Bandenverschiebung ein Hinweis auf eine
strukturelle Veränderung des Peptidthiols von einer ungeordneten zu einer Helixstruktur
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
178
sein könnte, wurden zur Kontrolle CD-Messungen durchgeführt. Desweiteren sollte
ausgeschlossen werden, dass die Trifluoressigsäure die Amid I-Bande partiell überdeckt
und zu verfälschten Ergebnissen geführt hat. Da der durch Trifluorethanol hervorgerufene
Shift ausschließlich in H2O beobachtet werden konnte, wurden die CD-Messungen in
demselben Lösungsmittel (10 mM Tris-HCl, pH 7,4) durchgeführt. Sämtliche Ergebnisse
der CD-Messungen sind in Tabelle 14 zusammengefasst. Eine helikale Struktur kann
gemäß den Berechnungen der Sekundärstrukturelemente mittels CD-Spektroskopie
sowohl über Reid als auch über Yang nahezu ausgeschlossen werden. Außerdem sind
auch keine signifikanten Veränderungen des Spektrums mit zunehmender TFE-
Konzentration zu beobachten. Es dominieren ungeordnete Strukturen und β-
Faltblattanteile, die bei 30 und 50 % TFE einen Anteil von bis zu 40 % haben. Der
Random-Anteil ist bei allen TFE-Konzentrationen sehr stark ausgeprägt (ca. 60 %), zeigt
jedoch insgesamt eine abnehmende Tendenz. Bei einer Konzentration von 10 % TFE
können zusätzlich ca. zu einem Drittel auch β-Schleifen, jedoch im Vergleich zu 30 und
50 % TFE kein β-Faltblatt identifiziert werden. Der Anteil an β-Schleifen fällt bei 0, 30
und 50 % TFE mit 17,7, 16,7 und 8,5 % deutlich geringer aus.
Abbildung 6-22: CD-Spektren des Peptidthiols für verschiedene TFE-Konzentrationen
Ob dies rein zufällig zustande gekommen ist oder ob ein TFE-Anteil von 10 %
insbesondere Schleifenstrukturen stabilisiert oder sogar induziert, kann aufgrund
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
179
fehlender Vergleichsdaten nicht bestätigt werden. Beim Vergleich mit den IR-Spektren
zeigt sich insgesamt eine hohe Übereinstimmung mit den CD-Daten. Auch hier findet
man zu geringeren Anteilen β-Faltblattstrukturen anhand der Bandenverschiebung
(1674 cm-1
) sowie einen dominanten Anteil Random (1652 cm-1
), der mit der negativen
IR-Bande bei 1652 cm-1
korreliert.
Tabelle 14: Berechnung der Sekundärstrukturanteile mittels CD-Spektroskopie
Peptidthiol
(Reed/Yang)
+0% TFE +10% TFE +30% TFE +50% TFE
α-Helix 1,4/0 0,6/0 0/4,3 4,5/0
β-Faltblatt 31,3/23,6 0/0 40,7/27,5 33,5/40
β-Turn 0/17,7 31,1/33,1 0/16,7 0/8,5
Random-Coil 67,3/58,7 68,4/66,9 59,3/51,5 62/51,5
Unter Einbeziehung der CD-Daten müsste der negative Peak bei 1652 cm-1
im IR-
Spektrum in erster Linie einer ungeordneten Struktur zugeordnet werden. Die
Sekundärstruktur des Peptidthiols wird also demnach durch einen dominanten Random-
Anteil bestimmt. Desweiteren gibt es Hinweise auf helikale Anteile, die im Vergleich zur
ungeordneten Struktur jedoch deutlich geringer ausfallen. Hierfür seien zum einen die
Einzelkomponentenzerlegung der Spektren (Abbildung 6-17), gemessen in D2O, die
Bandenverschiebung bei der IR.-Messung vor und nach Zugabe von 5 % TFE (Abbildung
6-20) sowie die CD-Messung in D2O ohne TFE (Abbildung 6-18) genannt. Weder für die
IR-Messungen noch für die CD-Messreihe in D2O konnte nach Zugabe von 10, 30 und
50 % TFE ein induktiver Effekt beobachtet werden. Eventuell muss durch weitere
Vergleichsdaten geklärt werden, ob die beobachtete Bandenverschiebung von der
eingesetzten TFE-Konzentration abhängt und inwieweit das eingesetzte Lösungsmittel,
also H2O oder D2O, dabei eine Rolle spielt. Der Shift konnte nämlich ausschließlich in
H2O nachgewiesen werden. Es ist nicht auszuschließen, dass die im Vergleich zu den
Deuteriumbrücken deutlich stärkeren Wasserstoffbrücken den induktiven Effekt von TFE
noch begünstigen. Jedoch muss an dieser Stelle auch erwähnt werden, dass das
Signal/Rausch-Verhältnis zumindest bei den IR-Messungen in D2O nicht ausreichte, um
bezüglich irgendwelcher Bandenshifts, hervorgerufen durch TFE, konkrete Aussagen
treffen zu können. Es bleibt also abschließend festzuhalten, dass die vorliegenden Daten
für das Peptidthiol in Lösung eine vorwiegend ungeordnete Struktur zeigen. Zusätzlich
können β-Faltblätter und zu geringerem Anteil auch β-Schleifen eindeutig nachgewiesen
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
180
werden. Besonders hervorzuheben ist an dieser Stelle jedoch, dass es auch Hinweise
darauf gibt, dass zumindest in geringfügigem Maße auch helikale Strukturen vorliegen
könnten.
Im nächsten Schritt sollte der Frage nachgegangen werden, ob sich die Sekundärstruktur
des Peptidthiols im SAM verändert, wenn die Oberfläche entweder mit Puffer (H2O und
D2O) benetzt oder die gesamte Aufbringung des SAMs im Fluss (D2O) vonstatten geht.
6.2.3.3 Messungen des Peptidthiols an der Oberfläche in Pufferlösung
6.2.3.3.1 ATR FT-IR-Messung im Fluss (D2O)
Für diese Messungen wurde das Peptidthiol im Fluss an eine Goldoberfläche
(Schichtdicke ca. 15 nm) adsorbiert, die auf einen Germanium-ATR-Kristall aufgebracht
wurde (Schichtdicke des Goldes: ca. 12 nm). Der dafür verwendete Puffer (10 mM Tris,
pH 7,4) wurde mit D2O hergestellt und der pH mit DCl eingestellt. Für die Detektion
wurde die ATR FT-IR-Technik angewandt. Bei den Oberflächenmessungen erweist sich
insgesamt die Bandenintensität als limitierender Faktor.
Abbildung 6-23: Adsorptionskinetik des Peptidthiols.
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
181
Bei Oberflächenmessungen im Fluss, bei denen ausschließlich der nach Inkubation
adsorbierte Peptidthiol-SAM untersucht wird, sollte die Trifluoressigsäure keine Rolle
spielen und somit auch nicht im IR-Spektrum absorbieren, da die Oberfläche nach Einbau
des Kristalls reichlich mit Puffer gespült wird.
Abbildung 6-23 zeigt zunächst die Adsorption von Peptidthiol an der Oberfläche. Wäh-
rend der Dissoziationsphase sinkt die Kurve geringfügig ab, stabilisiert sich dann aber auf
einem konstanten Wert (ca. 0,002). Damit ist gezeigt, dass der SAM sich erfolgreich auf
der Oberfläche gebildet hat.
Aus dem IR-Spektrum kann eine Bandenposition von 1666 cm-1
hergeleitet werden
(Abbildung 6-24), die wie bei den Transmissions-Messungen des SAMs an Luft einer
Schleifenstruktur zugeordnet werden kann. Durch D2O wird das Maximum der Amid I-
Bande erwartungsgemäß ein wenig zu kleineren Wellenzahlen verschoben (1666 statt
1674 cm-1
). Aufgrund des schlechten Signal/ Rausch-Verhältnisses kann aus dem
Spektrum nach Bildung der 2. Ableitung keine negativen Peaks identifiziert werden.
Abbildung 6-24: IR-Spektrum des Peptidthiols an einer Goldoberfläche in D2O (Flussmes-
sung).
Dafür sind zwei positive Banden bei 1684 und 1652 cm-1
zu sehen, die auch schon in den
vorangegangenen Reflexions-Messungen für den SAM an Luft gefunden wurden und
einer Faltblatt bzw. Schleife sowie einer ungeordneten Struktur und/oder Helix
zugeordnet werden konnten. Eventuell sind jedoch in diesem Fall die Bandenpositionen
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
182
rein zufällig dieselben wie bei den Peaks in den Spektren zuvor, da die
Auflösungsverbesserung mittels 2. Ableitung ausschließlich zu schmaleren Banden mit
negativen Vorzeichen führen sollte. Die Aussagekraft des Feinstrukturspektrums
(Abbildung 6-24, rechts) ist also insgesamt sehr gering einzuschätzen. Diese Messung
wurde auch in H2O wiederholt (Spektren nicht gezeigt), doch ergab keine neuen
Erkenntnisse. Hier erwies sich das Herausrechnen der H2O-Bande scheinbar als
limitierender Faktor.
Eine Feinstrukturauflösung durch Berechnung der 2. Ableitung lieferte keine weiteren
strukturellen Informationen. Besonders problematisch ist bei dieser Messtechnik die
Bedampfung des Germanium-Kristalls. Ist die Goldschicht zu inhomogen oder zu dick,
mindert dies die gemessenen Bandenintensitäten drastisch. Besser als die Bedampfungs-
methode eignet sich die Beschichtung mittels Sputtering, da eine deutlich höhere
Homogenität und Stabilität der Schicht erreicht werden kann. Zukünftig soll diese
Methode zur Verbesserung der Signalintensitäten zum Einsatz kommen.
6.2.3.3.2 ATR FT-IR-Messungen des Peptidthiol-SAMs am Hyperion IR-Mikroskop
(Bruker)
Am IR-Mikroskop Hyperion 3000 (Bruker) wurden weitere IR-Spektren des Peptidthiols
aufgenommen und versucht, mit Hilfe eines ATR-Objektivs eine möglichst hohe
Auflösung zu erreichen. Es wurden Messungen des SAMs sowohl trocken und mit Puffer,
H2O und D2O (jeweils mit 10 mM Tris, pH 7,4), benetzt durchgeführt, um eventuelle
Konformationsänderungen beim Übergang von einem zum anderen Zustand festzustellen.
Auch TFE kam wieder als „Helixstabilisator“ zum Einsatz, um eventuelle Bandenshifts
detektieren zu können. Vor allem in Hinblick auf die durchgeführten IR und CD-
Messungen in Lösung sollten die am IR-Mikroskop erhaltenen Daten als Vergleich
dienen, um eventuelle strukturelle Unterschiede im SAM ausmachen zu können. Zunächst
wurde der SAM, der zuvor in 1 mM Peptidthiollösung (Puffer 10 mM Tris in D2O, pH
7,4) inkubiert worden war, vollständig getrocknet und vier verschiedene Messpunkte auf
dem Wafer ausgewählt, um die Homogenität des SAMs zu überprüfen (Abbildung 6-25).
Dies wurde für zwei verschiedene Datensätze durchgeführt. Die gefundenen
Bandenpositionen bei 1650 (random und/oder Helix)) und 1674 cm-1
(Faltblatt/Schleife)
nach Anwendung der 2. Ableitung, die auch schon zuvor über die Reflexionsmethode
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
183
erhalten wurden, (Abbildung 6-15) können auch mit der ATR-Technik bestätigt werden.
Hinzu kommt noch ein weiterer Peak bei 1681 cm-1
. Im unveränderten Spektrum kann die
Amid I-Bande bei 1668 cm-1
einer Schleifenstruktur zugeordnet werden. Die 2. Ableitung
weist sowohl auf Schleife (1668 cm-1
) als auch auf Faltblatt (1631/ 1681 cm-1
) und zu
einem hohen Anteil auf eine ungeordnete Struktur (ca. 1650 cm-1
) hin. Auch eine
Kombination aus ungeordneter und helikaler Struktur ist durchaus möglich.
Abbildung 6-25: IR-Spektrum des Peptidthiol-SAMs im trockenen Zustand an vier
verschiedenen Messpunkten und 2. Ableitung (gezeigt sind 2 Datensätze mit jeweils 4 Mes-
sungen). Von einem Datensatz wurde die 2. Ableitung gebildet.
Durch die zuvor erhaltenen Daten in Lösung und für den trockenen SAM ist auch bei
dieser Messreihe jedoch nicht davon auszugehen, dass die Bande bei 1650 cm-1
ausschließlich einer Helix entspricht.
Danach wurde ein Tropfen H2O auf die Oberfläche gegeben und in Zeitabständen von
jeweils 5 Minuten gemessen. Bei dieser Messreihe sollte es darum gehen, strukturelle
Unterschiede zwischen trockenen und feuchten SAM herauszuarbeiten Innerhalb des
gemessenen Zeitraumes von 30 Minuten sind die Spektren sehr einheitlich und es ist auf
ersten Blick keine Verschiebung der Amid I-Bande zu erkennen Die Mitte der Amid I-
Bande liegt im Reinspektrum bei 1663 cm-1, was einer Schleifenstruktur entspricht. Nach
Berechnung der 2. Ableitung ergeben sich bei grober Auflösung zwei deutliche Minima
bei 1650 cm-1
(random und/oder Helix) und 1681 cm-1
(Faltblatt). Desweiteren sind zwei
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
184
schwächere Peaks bei 1635 und 1666 cm-1
zu erkennen, die ebenfalls einer Faltblatt- und
einer Schleifenstruktur zugeordnet werden können.
Abbildung 6-26: Entwicklung des IR-Spektrums des Peptidthiol-SAMs während einer
Inkubation mit H2O.
Eine besondere Beobachtung konnte gemacht werden, als die Bande bei ca. 1650 cm-1
,
wie in Abbildung 6-27 zu sehen, höher aufgelöst wurde. Für die gemessenen Zeitpunkte
ist ein kontinuierlicher Shift der Bande von anfänglich 1648 cm-1
im trockenen Zustand
zu 1651 cm-1
zu beobachten. Diese Veränderung um 3 Wellenzahlen ist sicherlich nicht
sehr deutlich, aber reproduzierbar und damit ein Hinweis auf eine strukturelle
Veränderung des Peptidthiols. Die anderen Banden bleiben nämlich während der
Inkubation mit H2O an derselben Position. Vielleicht ist es zunächst einmal nicht
sonderlich überraschend, dass das Peptidthiol, sobald es von H2O umgeben ist, aufgrund
von Wechselwirkungen (H-Brücken, elektrostatische Wechselwirkungen etc.) mit dem
Solvenz seine Struktur verändert. Aber die Tatsache, dass es sich insbesondere um den
Peak bei ca. 1650 cm-1
handelt, der nicht eindeutig einer Sekundärstruktur zuzuordnen ist,
sondern einer Random- oder Helixstruktur, macht diese Beobachtung so interessant,
zumal aus vorherigen Studien bekannt ist, dass die helikale Struktur von OEGs einen
entscheidenden Einfluss auf die Proteinresistenz hat.
Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass nicht nur in Lösung, sondern auch beim
Übergang von trockener zu nasser Oberfläche scheinbar Umstrukturierungen im
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
185
Peptidthiol stattfinden. Eine mögliche Interpretation wäre auch hier, dass bei Zugabe von
H2O sich im Peptidthiol-SAM ein Teil der Moleküle von einer anfangs größtenteils
ungeordneten Struktur in eine helikale oder partiell helikale Struktur umwandelt.
Abbildung 6-27: Bandenshift während Inkubation mit H2O
Anschließend wurde die Messung mit D2O (10 mM Tris, pH 7,4) wiederholt, um auch
hier festzustellen, ob das Peptidthiol an der Oberfläche seine Struktur verändert, wenn es
von Puffer umgeben ist. Des Weiteren sollten eventuelle Unterschiede zwischen den
H2O-Spektren (Abbildung 6-26) und D2O-Spektren (Abbildung 6-28) herausgearbeitet
werden. Gegenüber dem H2O-Spektrum ist die Amid I-Bande in D2O erwartungsgemäß
geringfügig zu kleineren Wellenzahlen verschoben. Die 2. Ableitung offenbart analog zu
H2O einen Peak bei ca. 1650 cm-1
(Random), und weitere negative Banden bei 1679 und
1630 (β-Faltblatt) und 1663 cm-1
(β-Schleife). Nur das IR-Spektrum nach 20 Minuten
Inkubation (Abbildung 6-28, cyan) zeigt ausschließlich eine schwache konturlose Bande
bei 1663 cm-1
. Eventuell ist hier beim Abzug der Referenz etwas schief gelaufen. Anhand
der Amid II-Bande (Abbildung 6-28, links), die auch nach 20 Minuten eine deutliche
Absorption bei 1460 cm-1
(D2O), aber nur eine schwache Absorption bei 1540 cm-1
(H2O)
aufweist, kann ausgeschlossen werden, dass sich das in der Umgebung befindliche H2O
bemerkbar gemacht und zu einem Austausch von D zu H geführt hat.
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
186
Abbildung 6-28: IR-Spektren während Inkubation mit D2O (10 mM Tris, pH 7,4).
Bis auf die üblichen geringfügigen Bandenverschiebungen bei H2O und D2O, die aus den
unterschiedlichen Massen der schwingenden Atome resultieren (H und D), können keine
drastischen Abweichungen der Bandenpositionen und folglich keine strukturellen
Unterschiede des Peptidthiols in leichtem und schweren Wasser nachgewiesen werden.
Aufgrund des deutlich schlechteren Signal/Rausch-Verhältnisses kann darüber hinaus für
die Messreihe in D2O nicht festgestellt werden, ob es zu irgendwelchen Bandenshifts,
insbesondere für die Bande bei 1650 cm-1
, während der Inkubation gekommen ist. An
dieser Stelle sei jedoch betont, dass für die Oberflächenmessungen generell, sowohl für
H2O und D2O, sehr schlechte Signale erreicht wurden. Dass dieser Bandenshift in H2O
überhaupt zu beobachten war, erforderte eine hohe Reinheit der SAM-Oberfläche und ein
äußerst gründliches Arbeiten. Solch scharfe Signale, wie in Abbildung 6-27 gezeigt,
wurden nur sehr selten erhalten. Es kann also anhand der Daten nicht ausgeschlossen
werden, dass eine ähnliche Bandenverschiebung bei einem weniger verrauschten Signal
auch in D2O zu beobachten wäre. Um abschließend beurteilen zu können, ob H2O und
D2O unterschiedliche strukturelle Einflüsse auf das Peptidthiol haben, bedarf es zukünftig
weiterer Vergleichsdaten.
Auch für den SAM an der Oberfläche wurde der Einfluss von Trifluorethanol getestet. In
einem ersten Schritt wurden die Au/Si-Wafer nach Inkubation in 10, 30 und 50 % TFE
(10 mM Tris (D2O), pH 7,4) getrocknet und dann vermessen (Abbildung 6-29).
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
187
Anschließend wurde ein Tropfen des Puffers mit der jeweiligen TFE-Konzentration auf
die Oberfläche gegeben und erneut Spektren aufgenommen (Abbildung 6-30). Die
Amid I-Bande zeigt für die Trockenmessung hinsichtlich ihrer Absorption (1667 cm-1
)
eine gute Übereinstimmung mir den Spektren in Abbildung 6-25, bei denen ebenfalls im
trocknen Zustand gemessen und eine Schleifenstruktur identifiziert wurde. Die 2.
Ableitung liefert kein eindeutiges Ergebnis, sondern nur eine flache sehr breite konturlose
negative Bande bei ebenfalls 1663 cm-1
. In diesem Fall hat die Feinstrukturauflösung
mittels 2. Ableitung zu keinen weiteren Erkenntnissen geführt.
Ähnlich wie bei den vorangegangenen Messungen in reinem H2O und D2O sind für die
Feuchtmessung nach Berechnung der 2. Ableitung mehrere negative Banden zu erkennen
(Abbildung 6-26, Abbildung 6-30).
Abbildung 6-29: IR-Spektren nach Inkubation mit TFE (trocken). Die 2. Ableitung liefert nur
für 10 % TFE 2 schwache Minima bei 1663 und 1654 cm-1
.
Es ergeben sich Minima bei 1650 (random und/ oder Helix), 1662 (Schleife) sowie 1620,
1631 und 1679 cm-1
(Faltblatt). Auswirkungen auf die Amid I-Banden durch TFE können
in den Spektren nicht festgestellt werden, da die 2. Ableitung sehr verrauschte negative
Banden mit äußerst geringer Intensität liefert. Ein wenig aus der Reihe fällt in dem
Zusammenhang die 2. Ableitung für 10 % TFE in Abbildung 6-30, die bei 1650 cm-1
eine
positive Bande statt einer negativen wie bei den anderen TFE-Konzentrationen zeigt.
Durch entsprechende Vergleichsmessungen wird zu klären sein, ob dieses Verhalten
durch eine schlechte Referenzmessung für diese Probe zustande gekommen ist oder ob
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
188
dies ein Indiz dafür darstellt, dass an der Oberfläche bei 10 % TFE der wahrscheinlich
vorliegende Random(und/oder Helix)-Anteil verschwindet und ausschließlich β-Schleifen
und β-Faltblätter auftreten. Die Messungen in Lösung haben zumindest keinen Hinweis
darauf geliefert, dass es bei 10 % TFE zu irgendwelchen strukturellen Unterschieden
kommt, zumal TFE dafür bekannt ist, helikale Strukturen zu induzieren. Somit bleibt es
eher fraglich, ob dieser beobachteten positiven Bande bei 1650 cm-1
irgendeine
Bedeutung zukommt.
Abbildung 6-30: IR-Spektren während Inkubation mit TFE (verschiedene TFE-
Konzentrationen). Die Oberflächen wurden vor der Messungen mit TFE-haltigem Puffer
betropft.
Insgesamt bleibt festzuhalten, dass die Messungen keinen induktiven Effekt von TFE
zeigen und damit auch keine weiteren strukturellen Informationen liefern. Dies mag in
erster Linie damit zusammenhängen, dass die Spektren zu verrauscht und somit für eine
Sekundärstrukturanalyse nicht geeignet sind. Es stellt sich aber besonders hinsichtlich der
Feuchtmessung wiederum die Frage, ob die Spektren in H2O (statt D2O) ein anderes
Ergebnis erzielt worden wäre. Die Bedeutung des Lösungsmittels, insbesondere die
Unterschiede zwischen leichtem und schwerem Wasser, wird in weiterführenden Studien
noch herauszuarbeiten sein.
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
189
6.2.3.4 Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse
In dieser Studie sollte es darum gehen, Peptid-basierende proteophobe Oberflächen
herzustellen, die auf lange Sicht auch in der Industrie, z.B. für die Beschichtung von
Implantaten oder Kontaktlinsen, eingesetzt werden können, um die Ausbildung von
Biofilmen zu vermeiden. Dazu wurde ein Peptidthiol mit 25 Aminosäuren auf der Basis
von „Design Rules“ synthetisiert, die bereits in einer vorherigen Studie (siehe
Dissertation Chelmowski/ Chelmowski et al., 2008) für ein anderes stark proteophobes
Peptid mit 10 Aminosäuren (10er-Peptid) herausgearbeitet wurden. Zunächst sollte,
analog zum 10er-Peptid, auch für das 25er-Peptidthiol die Proteinresistenz nachgewiesen
werden. Es zeigt auf Goldoberflächen eine vergleichbare Proteinresistenz sowohl zum
10er-Peptidthiol als auch zum OEG-Thiol, das für seine starke Proteophobie bekannt ist.
Auf Silberoberflächen kann die Beobachtung gemacht werden, dass das 25er-Peptidthiol
seine Proteinresistenz vollständig beibehält, wohingegen das OEG-Thiol erwartungsge-
mäß einen Teil seiner proteophoben Eigenschaften einbüßt. Vom OEG-Thiol ist aus
früheren Studien bekannt, dass es sein proteinabweisendes Potential aus der Ausbildung
helikaler Strukturen und der damit verbundenen Wassereinlagerung schöpft. Da die
Packungsdichte auf Silber- im Vergleich zu Goldoberflächen höher ist, können jedoch
helikale Strukturen nicht mehr so leicht ausgebildet werden, was einen Verlust der
Proteinresistenz zur Folge hat (Herrwerth, S., Eck, W., Reinhardt, S., Grunze, M., 2003).
Aus dieser Beobachtung kann, wenn für das Peptidthiol ähnliche Mechanismen wie für
die OEG-Thiole angenommen werden, also zunächst geschlussfolgert werden, dass die
Struktur nicht für die Proteinresistenz des Peptids verantwortlich ist. Vielmehr scheint der
Grund für die Proteophobie wohl eher in der verwendeten Aminosäuresequenz und den
Aminosäureresten zu liegen. Der hohe Anteil an Hydroxylgruppen in den Serinen führt
offenbar dazu, dass der daraus resultierende SAM einem OH-terminierten SAM, der
ebenfalls proteophob ist, ähnelt und damit vergleichbare Eigenschaften entwickelt.
Gegenüber einen reinem OH-Thiol-SAM ist die Proteinresistenz sogar stärker ausgeprägt
(Abbildung 6-11 und Abbildung 6-13). Ein Grund für diese Beobachtung könnte sein,
dass die OH-Gruppen nicht dicht nebeneinander an der Oberfläche stehen, sondern in die
Struktur des Peptidthiols eingegliedert sind. Dadurch entsteht eine höhere Unordnung, die
im Vergleich zu einer dichten Packung in einer gesteigerten Proteinresistenz resultiert.
Ähnliche Beobachtungen konnten bereits für das OEG-Thiol gemacht werden (Pertsin
/Grunze, 2000; Pertsin et al., 2002)
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
190
Die Resultate der Sekundärstrukturanalyse bestätigen die These, dass die Konformation
scheinbar keinen Einfluss auf die Proteophobie hat, aber nur teilweise. Sämtliche
Ergebnisse sind in Tabelle 15 zusammengefasst (siehe zum Vergleich Abbildung 6-2)
Tabelle 15: Zusammenfassung der Ergebnisse der Sekundärstrukturanalyse des
Peptidthiols. Die Messungen. in denen es fundierte Hinweise auf helikale Strukturen gab,
sind rot gekennzeichnet.
Methode 10er-Peptid 25er-Peptid
IR Spektrum 2. Ableitung Spektrum 2. Ableitung
KBr (Volumen) Schleife random β-Faltblatt random/β-Faltblatt
in Lösung (D2O) random/Schleife random/Helix/ Schleife
in Lösung (D2O)+ TFE random random/Schleife
In Lösung (H2O)+ TFE Schleife random/Helix/Schleife
SAM ; im Fluss (D2O) random/β-Faltblatt random/β-Faltblatt
SAM-trocken β-Faltblatt Schleife random
SAM nach Ink. in D2O-trocken Schleife random/Schleife/β-Faltblatt
SAM (Ink. mit H2O)- trocken/ nass Schleife random/Helix
SAM (Ink. mit D2O)- trocken/ nass random random/Schleife/β-Faltblatt
SAM nach TFE-Ink. (D2O)- trocken Schleife random/Schleife
SAM (Ink. mit TFE (D2O)-nass random random/Schleife/β-Faltblatt
XPS
SAM Faltblatt/random
Simulation
Schleife/ungeordnet
CD-Spektroskopie
In Lösung random/Helix/Faltblatt/Schleife
Die Daten für beide Peptidvarianten (10er- und 25erPeptid) zeigen zunächst einmal ein
sehr ähnliches Bild, was überraschenderweise nur auf geringfügige strukturelle
Unterschiede hindeutet. Insbesondere für das deutlich längere 25er-Peptid wäre zu
erwarten gewesen, dass es gegenüber dem 10er-Peptidthiol deutliche strukturelle
Unterschiede aufweist und vielleicht eher dazu neigt, auch helikale Windungen
auszubilden. Sowohl im Volumen (KBr), in Lösung und im trockenen und „feuchten“
SAM ergibt sich eine Sekundärstruktur, die durch einen ungeordneten Anteil (random)
dominiert wird. Hinzu kommen Schleifen-und β-Faltblattanteile, die sich ausschließlich
hinsichtlich ihrer Ausprägung, die anhand der relativen Bandenintensitäten qualitativ
ermittelt wurde, geringfügig unterscheiden. Bei näherer Betrachtung können jedoch
geringfügige Unterschiede festgestellt werden, die für die Gesamtinterpretation der
Ergebnisse sehr bedeutsam sind. Von besonderem Interesse für diese Studie war die
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
191
negative Bande (2. Ableitung), die in den vorliegenden Messungen zwischen 1648 und
1655 cm-1
zu sehen ist. Gemäß den Bandenzuordnungen nach Goormaghtigh (Abbildung
6-2) könnte sie sowohl einer Random- als auch einer Helixstruktur zuzuordnen sein.
Insbesondere der Nachweis einer helikalen Struktur der Peptidthiole wäre von
außerordentlicher Brisanz, weil damit eine mögliche Antwort auf die Frage erbracht wäre
ob das Peptidthiol zumindest einen Teil seines proteinabweisenden Potentials aus seiner
Struktur schöpft oder ausschließlich aus den Hydroygruppen der eingebauten Serine.
Im Folgenden möchte ich zunächst auf die Ergebnisse der IR-Messungen im Volumen
und in Lösung eingehen. Alle Daten deuten auf eine vorwiegend ungeordnete Struktur
hin, die auch Anteile von β-Faltblättern und teilweise auch β-Schleifen enthält. Einige
Ergebnisse (Tabelle 15) liefern aber auch Hinweise darauf, dass zumindest zu geringen
Anteilen auch helikale Strukturen auftreten. An dieser Stelle sei die Einzelkomponenten-
zerlegung in D2O (Abbildung 6-17), die CD-Messung, ebenfalls gemessen in D2O
(Abbildung 6-18) und die Bandenverschiebung in H2O nach Zugabe von 5 % TFE
(Abbildung 6-20) genannt. Die Zerlegung in Einzelbanden eignet sich zwar nicht für eine
quantitative Beurteilung der Anteile, aber zumindest für eine qualitative Bewertung.
Diese spricht durchaus dafür, dass helikale Strukturen vorliegen. Auch die beobachtete
Bandenverschiebung nach Zugabe von TFE ist ein Indiz dafür, dass eine
Umstrukturierung stattgefunden hat (Byler /Susi, 1986). Das bedeutet nicht, dass davon
ausgegangen werden kann, dass sämtliche Peptidthiole helikal gewunden sind. Vielmehr
wird entweder nur ein kleiner Teil der Moleküle in dieser Konformation vorliegen oder
aber alle Moleküle partiell helikal strukturiert sein. Die CD-Messung des Peptidthiols
bestätigt zusätzlich, dass Helices zu kleineren Anteilen vorliegen. Warum für höhere
Konzentrationen an TFE (Abbildung 6-21) kein induktiver Effekt nachgewiesen werden
konnte und welche Rolle dabei das Lösungsmittel, entweder H2O oder D2O, spielt, muss
in zukünftigen Studien noch gezeigt werden.
An der Oberfläche sind im Vergleich zu den Messungen in Lösung die identifizierten
negativen Banden insgesamt nahezu identisch, so dass es sehr unwahrscheinlich ist, dass
die Struktur des Peptidthiols sich von einem eher dominierenden Random-Anteil (vgl.
CD-Spektren Abbildung 6-18 und Abbildung 6-22 sowie Tabelle 13) an der Oberfläche
zu einer dominanten Helixstruktur umwandelt. Vielmehr scheint es sich um ein eher
dynamisches System zu handeln, das in Anbetracht der Tatsache, dass in einem Peptid
nur sehr schwache Wechselwirkungen auftreten, die kaum dazu ausreichen, eine
geordnete Struktur zu erzeugen, durchaus wahrscheinlich ist. Für diese These spricht
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
192
außerdem, dass sowohl in Lösung als auch an der trockenen und feuchten Oberfläche fast
alle bekannten Sekundärstrukturen gleichzeitig nachgewiesen werden können. Es ist eher
unwahrscheinlich, dass Faltblatt-, Schleifen- und ungeordnete Struktur alle in einem
einzigen Peptidthiolmolekül gleichzeitig vorliegen, sondern das ein Teil der Moleküle
zum Zeitpunkt der IR-Aufnahme die Konformation eines β-Faltblattes, andere die einer
β-Schleife oder einfach nur ungeordnet vorliegt. An dieser Stelle sei bemerkt, dass ein
Infrarotspektrum zunächst einmal nur eine Momentaufnahme ist und nicht direkt auf die
Dynamik des Systems schließen lässt. Wenn jedoch von einer Dynamik ausgegangen
wird, wäre es aber durchaus auch denkbar, dass das Peptidthiol zumindest partiell und im
geringen Maße auch helikal strukturiert ist. Bei detaillierter Betrachtung der Daten kann
dies auch für die Messung im SAM nicht kategorisch ausgeschlossen werden. Während
der zwanzigminütigen Inkubation mit H2O, also beim Übergang vom trockenen zum
nassen SAM, ist eine kontinuierliche Bandenverschiebung um drei Wellenzahlen von
1648 zu 1651 cm-1
zu erkennen., die als schwacher induktiver Effekt hin zu helikalen
oder partiell helikalen Strukturen gedeutet werden könnte. In D2O konnte diese
Beobachtung nicht gemacht werden. Ob damit jedoch gezeigt ist, dass dieser Effekt H2O-
spezifisch ist, kann anhand der Daten bis dato geklärt werden, da insbesondere an der
Oberfläche die Bandenintensitäten sowohl für H2O als auch D2O zumeist so gering
waren, dass nach Berechnung der 2. Ableitung eine seriöse Sekundärstrukturanalyse nicht
möglich gewesen wäre. Hier erweist sich für die meisten Messungen die Signalintensität
als limitierender Faktor und könnte eventuell auch verhindert haben, dass ein ähnlicher
Effekt in D2O festzustellen war. Für weiterführende zukünftige Studien wird es auf sehr
konstante Messbedingungen essentiell ankommen, um maximale Signalintensität zu
erreichen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in dieser Arbeit gesammelten
Hinweise auf eventuell helikale Strukturen zunächst einmal nur punktuelle (jedoch
reproduzierbare) Beobachtungen sind, die aber in Hinblick auf die Motivation dieser
Studie, nämlich, analog zu den OEGS, für den Peptidthiol-SAM ebenfalls helikale
Strukturen auf Goldoberflächen nachzuweisen, betont werden sollten und für die Planung
weiterführender Studien genutzt werden sollten. Auch der beobachtete durch TFE
hervorgerufene Effekt in Lösung bedarf weiterer Vergleichsdaten. Insbesondere sollte
auch hier die Frage geklärt werden, ob der Shift H2O-spezifisch und reproduzierbar ist
und inwieweit die eingesetzte Konzentration an TFE eine Rolle dabei spielen könnte. Bei
der anderen TFE-Messreihe wurden 10, 30 und 50 % TFE eingesetzt und D2O als
Kapitel 6 Ergebnisse- proteinresistente Peptidthiole
193
Solvenz verwendet, was einen direkten Vergleich mit der Messung in H2O vor und nach
Zugabe von 5 % TFE schwierig gestaltet.
Zusammenfassend lässt sich zur Beurteilung der Sekundärstruktur sagen, dass insgesamt
die Unterschiede in Lösung, im Volumen (KBr), an der Oberfläche und auch zwischen
getrockneter und befeuchteter Oberfläche gering ausfallen. In allen Fällen gibt es einen
dominanten ungeordneten Anteil sowie in geringerem Maße β-Faltblatt- und
Schleifenstrukturen. Es gibt aber auch Hinweise darauf, dass helikale oder partiell
helikale Anteile durchaus möglich sind.
Kapitel 7 Zusammenfassung und Ausblick
194
7 Zusammenfassungen und Ausblick
Die Untersuchung von Proteinwechselwirkungen mit unterschiedlichen SAMs, aber auch
die Betrachtung von Interaktionen zwischen Proteinen über verschiedene
oberflächenspektroskopische Verfahren, sollte im Vordergrund dieser Arbeit stehen. Die
beiden Hauptmethoden waren zum einen die Oberflächenplasmonenspektroskopie (SPR),
die dazu genutzt wurde, das Bindungsverhalten der verwendeten Proteine und
verschiedener Proteinmutanten unter Berücksichtigung kinetischer Aspekte auf
(bio)organischen SAMs zu charakterisieren, zum anderen die Infrarotspektroskopie, die
eine Identifizierung der chemischen Struktur der verwendeten Moleküle für die SAM-
Herstellung und eine Sekundärstrukturanalyse der selbigen ermöglichte.
7.1 Das Streptavidin-hGBP1-System als Fallbeispiel für den Aufbau
eines Multikomponentensystems auf SAM-Oberflächen
Ein Assay, bestehend aus einem Thiol mit Biotingruppe und dem Biotin-bindenden Strep-
tavidin, wurde entwickelt, um das Immunprotein hGBP1 und verschiedene hGBP1-
Mutanten an eine Goldoberfläche zu binden und hinsichtlich des Bindungsverhaltens und
der, durch die Anzahl und Lokalisation der Anker, resultierenden Orientierung der ver-
wendeten Mutanten durch eine Kombination verschiedener Techniken (SPR, AFM,
QCM) zu charakterisieren. Für die Messungen mit dem Rasterkraftmikroskop wurden
über das Mikrokontaktstempeln und die Technik des Nanoshavings lateral strukturierte
Oberflächen hergestellt. Das Stempeln erfolgte mit proteinresistentem OEG(6)-Thiol. Die
ungestempelten Flächen wurden mit 10%-Biotinthiol, Streptavidin und den verschiedenen
hGBP1-Mutanten aufgefüllt. Für die SPR-Goldchips und die QCM-Sensoren wurde
ausschließlich 10% Biotinthiol verwendet. Insgesamt konnte durch die Verwendung
verschiedener Oberflächenmethoden ein konsistentes Bild der hGBP1-Immobilisierung
erstellt und unter Berücksichtigung der Kristallstrukturen der zu untersuchenden Proteine
in ein schematisches Immobilisierungsmodellmodell übertragen werden.
Als wichtige Voraussetzungen dafür kam zum Tragen, dass die Interaktion zwischen
hGBP1 und Streptavidin sehr spezifisch ist und nur eine vernachlässigbare unspezifische
Adsorption festgestellt werden kann. Dies wurde über eine Variation der Biotinthiolkon-
zentration und Streptavidinbelegung festgestellt. Die Orientierung der an das Streptavidin
Kapitel 7 Zusammenfassung und Ausblick
195
gebundenen hGBP1-Mutanten hängt entscheidend davon ab, mit wie viel Biotinankern
sie versehen sind und wo die Anker lokalisiert sind. Da hGBP1 ein längliches Protein ist,
entsteht bei zwei Biotinanker, die an den beiden Enden der langen Seite von hGBP1
gebunden sind, ein etwa dreifach höherer Footprint als bei einem Biotinanker, der nur an
einem Ende des Proteins lokalisiert ist. Über die Belegungsdichte, die mittels SPR
bestimmt wurde, und eine Ermittlung der Schichtdicke über AFM und QCM konnte diese
Annahme eindeutig nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde anhand der AFM-Bilder
gezeigt, dass die Proteine eine echte Monolage auf der Oberfläche ausbilden, die sehr
homogen ist und kaum Defektstellen aufweist. Da es sich bei hGBP1 um ein Enzym
handelt, ließ sich anhand seiner GTP-Hydrolyseaktivität nachweisen, dass es auf der
Oberfläche weiterhin katalytisch aktiv ist. Für die doppelt biotinylierte hGBP1-Mutante,
die flach auf der Oberfläche liegt, wurde gerade mal eine 2,5-fach kleinere Aktivität wie
in Lösung gefunden, dagegen für die einfach biotinylierten Mutanten eine 4,5- bis 20-fach
kleinere Aktivität. Da bekannt ist, dass die Hydrolyseaktivität von hGBP1 durch die
Selbstassemblierung (Homodimerisierung) beschleunigt wird und in Lösung ein
Gleichgewicht zwischen Monomer und Dimer vorliegt, konnte anhand der gemessenen
Aktivität, die höher ist als die für hGBP1-Monomere charakteristische Basalaktivität,
gezeigt werden, dass die doppelt biotinylierte hGBP1-Mutante durch die Zugänglichkeit
der G-Domäne, die die Dimerisierung hauptsächlich vermittelt, auf der Oberfläche mit
benachbarten Molekülen interagiert, die Einfachmutanten aufgrund der zu hohen
Belegungsdichte, die die Ausbildung von Dimerkomplexen verhindert, jedoch nicht.
HGPB1 ist in der Lage, GTP zu GDP und GMP zu hydrolysieren. Für alle drei Mutanten
konnte jedoch eine gehemmte GMP-Produktion auf der Oberfläche nachgewiesen
werden. Diese Daten bestätigen zunächst die bereits in vorherigen Studien geäußerte
These, dass hGBP1 für die Hydrolyse von GDP zu GMP einen tetrameren
Übergangszustand durchlaufen muss, der sich an der Oberfläche aufgrund der hohen
Proteindichte und der daraus resultierenden zu geringen Distanzen zu den benachbarten
Molekülen nicht ausbilden kann. Um bezüglich dieser Beobachtung fundierte Aussagen
treffen zu können, werden jedoch weitere Vergleichsdaten nötig sein.
Kapitel 7 Zusammenfassung und Ausblick
196
7.2 Dimerisierungsstudien von oberflächengebundenem hGBP1: Das
Streptavidin-hGBP1/hGBP1-System
Nachdem im ersten Projekt verschiedene hGBP1-Mutanten an eine Oberfläche
immobilisiert worden waren und ein unterschiedliches Bindungsverhalten, bedingt durch
die Anzahl und Lokalisation der Biotinanker, gezeigt werden konnte, wurden in Projekt 2
Kinetikstudien zur Dimerisierung von hGBP1 mittels SPR angestrebt. Für diese Untersu-
chungen war besonders die hGBP1-Mutante K485C geeignet, die einen Biotinanker in-
nerhalb der α12 auf der von der G-Domänen abgewandten Seite trägt und somit in der
Weise an der Oberfläche immobilisiert, dass der GTP-bindende Bereich, der hauptsäch-
lich die Dimerisierung vermittelt, zur Umgebung gerichtet ist. Somit kann die K485C-
Mutante als „Fängermolekül“ für in Lösung befindliche hGBP1-Moleküle fungieren,
wenn GppNHp als Mediator des Dimerisierungsprozesses präsent ist. Durch den hohen
Bindungsgrad von hGBP1 wt in Anwesenheit von Nukleotid an die immobilisierte
K485C-Mutante (1:1 Verhältnis), der durch SPR-Messungen gezeigt werden konnte und
ein Beleg dafür ist, dass die Dimerisierung an der Oberfläche nahezu ungehemmt
erfolgen kann, und die hohe Reproduzierbarkeit des Bindungsverhaltens waren beste
Voraussetzungen geschaffen, um konzentrationsabhängige Bindungskinetikstudien
durchzuführen. Auch für die an beiden Enden biotinylierte Mutante konnte ein hohe
Belegung von hGBP1 wt festgestellt werden, da auch hier die G-Domäne für Moleküle
aus der Lösung zugänglich ist. Dagegen wurde für eine weitere einfach biotinylierte
Mutante (Q577C), bei der die G-Domäne nach Immobilisierung zur Oberfläche gerichtet
und daher nicht zugänglich ist, keine Dimerisierung festgestellt. Zur Ermittlung des
Höhenzuwachses nach Bindung von hGBP1 wt wurden wiederum andere
Oberflächenmethoden wie AFM und QCM zur Schichtdickenbestimmung angewandt
Dabei konnte gezeigt werden, dass die Doppelmutante und die K485C-Mutante in der
Weise dimerisieren, wie es in vorherigen Studien bereits modellhaft dargestellt wurde
(Ghosh et al., 2006). Des Weiteren verdeutlichen die AFM-Daten, dass sich die Dimere
homogen auf der Oberfläche verteilen und eine echte Monolage bilden. Im Falle der
anderen Einfachmutante Q577C war es auch über AFM, QCM sowie konfokaler
Fluoreszenzmikroskopie möglich, die Hemmung der Dimerisierung an der Oberfläche
nachzuweisen. Es gilt die Regel: Umso besser die Zugänglichkeit der G-Domäne
gewährleistet ist, desto besser funktioniert die Selbstassemblierung.
Kapitel 7 Zusammenfassung und Ausblick
197
Mit der K485C wurden anschließend Dimerisierungsstudien durchgeführt, bei denen Dis-
soziationskonstanten von 7,45 µM bzw. 6,35 µM (kdiss aus Achsenabschnitt bzw. aus den
angepassten Dissoziationskurven) und 8,89 µM (aus Plateauwerten, Maximalwerte) er-
mittelt werden konnten. Alle Werte unterscheiden sich kaum und liegen in derselben
Größenordnung des KD-Wertes, der bereits in vorherigen Studien aus Single Turnover-
Kinetiken abgeschätzt wurde (Dissertation Kunzelmann, 2006).
Für zukünftige Arbeiten kann das entwickelte Assay genutzt werden, um zum einen auch
das Phänomen der Tetramerisierung von hGBP1 zu untersuchen, zum anderen aber auch
das Bindungsverhalten von anderen katalytisch aktiven Proteinen und deren Interakti-
onspartnern zu charakterisieren und Kinetikstudien durchzuführen.
7.3 Synthese und strukturelle Untersuchung proteinresistenter Thiole
auf der Basis von Peptiden
In diesem Teil wurden SAMs auf der Basis von Peptiden hergestellt und charakterisiert
(Chelmowski et al., 2008). Die Kopplung an die Metalloberfläche erfolgte mit einem
Thiolanker, der mittels 1,3-dipolare Cycloaddition an das Peptid gebunden wurde. In
früheren Arbeiten wurde bereits ein 10er-Peptid-SAM mittels IRRAS charakterisiert und
die Proteinresistenz für verschiedene Proteine (Streptavidin, BSA, Fibronektin) unter-
sucht. Hierbei konnte eine Adsorption aller Proteine ermittelt werden, die der Größenord-
nung eines OEG(6)-terminierten SAMs (<0,1 ng/cm²) sehr nahe kam. Da dieser Ansatz
zu stark proteophoben SAMs führte, wurde auf der Basis dieses Dekapeptids eine Erwei-
terung der Aminosäuresequenz um 5 SSG-Einheiten vorgenommen und zur Charakteri-
sierung wiederum die Infrarotspektroskopie herangezogen. Die Überprüfung der Protein-
resistenz erfolgte über die Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie. Dabei konnte
sowohl auf Gold- als auch auf Silberoberflächen ein hohes Maß an Proteinresistenz für
BSA, Streptavidin, Fibrinogen und Fibronektin festgestellt werden. Im Gegensatz zum
OEG(6)-Thiol-SAM behielt der Peptidthiol-SAM seine proteophoben Eigenschaften auf
Silberwafern bei, was darauf hindeutete, dass die Struktur des Peptidthiols nicht in erster
Linie für die Proteinresistenz verantwortlich ist. Von OEG-Thiol-SAMs ist bekannt, dass
sie auf Silberwafern aufgrund der höheren Packungsdichte gegenüber Gold ihre proteo-
phoben Eigenschaften verlieren, da sie keine helikalen Strukturen mehr ausbilden können.
Um dies zu überprüfen, wurden Sekundärstrukturanalysen mittels IR und CD sowie XPS
Kapitel 7 Zusammenfassung und Ausblick
198
(nur für das 10er-Peptid) durchgeführt. Dabei wurden die Peptidthiole sowohl im Volu-
men als auch im SAM untersucht. Für das 25er-Peptidthiol und den 25er-Peptidthiol-
SAM wurden zusätzlich IR-Spektren an Luft als auch in Lösung bei physiologischem pH-
Wert aufgenommen und der Einfluss von Trifluorethanol als Helixstabilisator getestet.
Insgesamt wurden größere Unterschiede zwischen Luft und wässriger Lösung bzw. SAM
(trocken/feucht) hinsichtlich der vorliegenden Sekundärstruktur nicht festgestellt. Für
beide Peptidvarianten wurde eine größtenteils ungeordnete Struktur gefunden. Des
Weiteren konnten Schleifen- und Faltblattanteile identifiziert werden und für das 25er-
Peptidthiol auch punktuelle Hinweise gesammelt werden, die auf helikale oder partiell
helikale Struktur hindeuten könnten.
Die Ergebnisse zeigen somit insgesamt, dass der hohe Anteil an OH-Gruppen innerhalb
des Peptids, bedingt durch die Aminosäure Serin, hauptverantwortlich für die
proteinresistenten Eigenschaften ist. Die Tatsache, dass der Peptidthiol-SAM tendenziell
proteinresistenter ist als ein reiner OH-SAM, kann damit begründet werden, dass die OH-
Gruppen in der Peptidschicht in viel höherer Unordnung vorliegen, die, analog zum OEG-
Thiol, zu stärkerer Ausprägung der proteinabweisenden Eigenschaften führt. Aufgrund
der gesammelten Indizien für helikale Strukturen deutet jedoch auch vieles darauf hin,
dass zumindest in geringfügigem Maße die Sekundärstruktur des Peptids zur
Proteinresistenz beiträgt.
Zukünftig könnten weitere Peptide synthetisiert werden und dabei völlig andere
Aminosäurekombination gewählt werden, die nicht unbedingt auf der Basis der „Design
Rules“ für OEG-Thiol entwickelt werden müssen. Die vorliegende Arbeit zeigt deutlich,
dass sich die Eigenschaften der OEGs nicht unbedingt auf andere Moleküle (Peptidthiol)
übertragen lassen. Andererseits sind die Studien zu den OEGS die einzigen
Anhaltspunkte, die für das Design zur Verfügung stehen. Ein direktes
Anschlussexperiment an diese Arbeit wäre dabei die stufenweise Reduzierung der Serine,
um zu überprüfen, ob die Hydroxylgruppen definitiv die Proteinresistenz verursachen
oder ob es noch andere Gründe gibt.
Für eine weiterführende Sekundärstrukturanalyse des 25er-Peptidthiols sollte sowohl der
Einfluss von TFE sowie des eingesetzten Solvenz, also H2O und D2O, noch detaillierter
betrachtet werden, wenn von einem dynamischen System ausgegangen wird, müsste auch
die Temperaturabhängigkeit mit in Betracht gezogen werden. Auch eine zeit-und
ortsaufgelöste in situ-Messung sowie eine Simulation des 25er-Peptidthiols könnte
Kapitel 7 Zusammenfassung und Ausblick
199
wichtige strukturelle Informationen liefern, vor allem in Hinblick auf die Dynamik des
Systems, liefern. Desweiteren wäre es sinnvoll als Vergleich Peptide heranzuziehen, die
in vorangegangenen Studien als helikal identifiziert werden konnten und mit dem 25er-
Peptidthiol zu vergleichen.
Kapitel 8 Quellenverzeichnis
200
8 Quellenverzeichnis
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Kapitel 9 Abbildungsverzeichnis
213
9 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1-1: Molekulare Ansicht zweier hGBP1-Moleküle ........................................................ 3
Abbildung 1-2: Herstellung proteinresistenter, biokompatibler Oberflächen. ................................. 4
Abbildung 2-1: OEG-Thiol mit unterschiedlicher Anzahl an Ethylenglykoleinheiten. ................. 13
Abbildung 2-2: Selbstorganisation von Organthiolen. ................................................................... 16
Abbildung 2-3: Strukturformel des Oktadekanthiols (ODT) ......................................................... 17
Abbildung 2-4: Strukturformel des Biotinthiols ............................................................................. 17
Abbildung 2-5: Strukturformel des proteophoben OEG-Thiols ..................................................... 18
Abbildung 2-6: Strukturformel des proteophoben Merkaptoundekan-1-ol (OH-Thiol) ................ 18
Abbildung 2-7: Schema zur verwendeten Aminosäuresequenz für das Peptid .............................. 21
Abbildung 2-8: Kristall von Streptavidin mit vier gebundenen Biotinmolekülen. ........................ 22
Abbildung 2-9: Variation der Biotinthiolkonzentration ................................................................. 24
Abbildung 2-10: Adsorptionskinetik von Streptavidin (200 nm) auf 5 % Biotinthiol. .................. 25
Abbildung 2-11: Diffusionslimitierte Adsorption des Streptavidins auf dem Biotinthiol-SAM.... 26
Abbildung 2-12: Schematische Darstellung des JAK-STAT-Signaltransduktionsweges.. ............ 27
Abbildung 2-13: Vergleich der Domänenstruktur von Dynamin und GBP. .................................. 30
Abbildung 2-14: Kristallstruktur von hGBP1 full length im nukleotidfreien Zustand................... 34
Abbildung 2-15: Modell für das hGBP1-Dimer in Anwesenheit von GppNHp.. .......................... 35
Abbildung 3-1: Darstellung der Dispersionskurven von Oberflächenplasmonen .......................... 41
Abbildung 3-2: Messkonfiguration für Oberflächenplasmonen nach Raether und Kretschm.. ..... 42
Abbildung 3-3: Optische Anregung der Oberflächenplasmonen. .................................................. 42
Abbildung 3-4: Veränderungen der Dispersionskurve der Oberflächenplasmonen ....................... 43
Abbildung 3-5: Plasmonenresonanzkurven für zwei verschiedene Zeitpunkte ............................. 44
Abbildung 3-6: Schematische Darstellung- Rasterkraftmikroskop. ............................................... 49
Abbildung 3-7: Strukturierte SAM-Oberfläche (AFM) ................................................................. 53
Abbildung 3-8: Strukturierung von SAM beschichteten Goldoberflächen mit dem AFM: ........... 54
Abbildung 3-9: Mikrokontaktstempeln eines Thiols ...................................................................... 56
Abbildung 3-10: Strahlengang im Streiflichtobjektiv für IR/VIS (Bruker Optics) ........................ 62
Abbildung 3-11: Amid I-Moden verschiedener Sekundärstrukturelemente .................................. 64
Abbildung 3-12: QCM- Quarzsensor. ............................................................................................ 68
Abbildung 3-13: Schematisches CD-Spektrum der Sekundärstrukturelemente ............................. 89
Abbildung 4-1: SDS-Gel der hGBP1-haltigen Fraktion nach der Cobaltsäule. ............................. 93
Abbildung 4-2: Elutionsprofil der Aufreinigung von hGBP1 mit der Gelfiltrationssäule. ............ 94
Kapitel 9 Abbildungsverzeichnis
214
Abbildung 4-3: Gelfoto der gesammelten Fraktionen nach der Gelfiltration.. .............................. 95
Abbildung 4-4: Strukturformel von 5-Carboxyfluoresceinsuccinimidylester ............................... 95
Abbildung 4-5: Wellenlängenscans von hGBP1 mit Fluoreszenz-Label....................................... 97
Abbildung 4-6: pH-abhängige Labeling-Effizienz von 5 Carboxyfluoreszeinsuccinimidylester.. 97
Abbildung 4-7: Konsekutive Immobilisierung von Streptavidin ................................................... 99
Abbildung 4-8: Kristallstruktur von hGBP1 mit Nukleotid (rot) und Mg2+
(grau).. .................... 100
Abbildung 4-9: Kristallstruktur von hGBP1 mit markiertem Glutamin an der Position 577. ..... 101
Abbildung 4-10: Kristallstruktur von hGBP1 mit markiertem Glutamin 577 und Lysin 485 ..... 102
Abbildung 4-11: Kristallstruktur von hGBP1 mit markiertem Lysin 485.. ................................. 102
Abbildung 4-12: MALDI-Spektrum von Streptavidin. ................................................................ 105
Abbildung 4-13: MALDI-Spektrum von hGBP1. Die verwendete Matrix ist Zimtsäure............ 106
Abbildung 4-14: MALDI-Spektrum von Biotinthiol auf einer Goldoberfläche. ......................... 106
Abbildung 4-15: MALDI-Spektrum von immobilisiertem Streptavidin ..................................... 107
Abbildung 4-16: MALDI-Spektrum von nacheinander immobilisiertem Streptavidin/hGBP1. . 108
Abbildung 4-17: Konsekutive Immobilisierung von Streptavidin/biotinyliertem hGBP1 ......... 109
Abbildung 4-18: Beladung der Oberfläche mit Streptavidin/ hGBP1-Mutanten ........................ 110
Abbildung 4-19: Unspezifische Adsorption von Streptavidin und hGBP1 . ............................... 115
Abbildung 4-20: Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Adsorption von Streptavidin ........... 116
Abbildung 4-21: Adsorption von Streptavidin und den beiden hGBP1-Mutanten ...................... 117
Abbildung 4-22: Bindungskinetiken der drei hGBP1-Mutanten. ................................................ 118
Abbildung 4-23: Topographiebilder (oben) und Höhenprofile (unten) ....................................... 120
Abbildung 4-24: Topographiebilder nach Inkubation mit Streptavidin und Mutanten. .............. 121
Abbildung 4-25: Topographiebilder einer lateral strukturierten Oberfläche ............................... 122
Abbildung 4-26: Frequenz- und Dissipationsänderung ............................................................... 123
Abbildung 4-27: Schichtdickenberechnung für Streptavidin/hGBP1 Mutanten .......................... 123
Abbildung 4-28: Schichtdickenberechnung für Streptavidin, die hGBP1-Mutante K485C ........ 124
Abbildung 4-29: Mögliches Modell für die Immobilisierung von Streptavidin/Q577C ............. 125
Abbildung 4-30: Mögliches Modell für die Immobilisierung von Streptavidin/K485C. ............ 126
Abbildung 4-31: Mögliches Modell für die Immobilisierung von Streptavidin/Doppelm. ......... 126
Abbildung 4-32: Konzentrationsabhängigkeit der GTPase-Reaktion .......................................... 128
Abbildung 4-33: Aktivitätstest der hGBP1-Mutanten in Lösung (25 °C). .................................. 129
Abbildung 4-34: Aktivitätstest der hGBP1-Mutanten an der Oberfläche (25 °C). ...................... 130
Abbildung 4-35: Messung der Hydrolyseaktivität bei 350 µM GTP und 0,5 µM hGBP1. ......... 131
Abbildung 4-36: Dimerisierungsmodell von hGBP1 (nach Gosh et al., 2006) ........................... 133
Kapitel 9 Abbildungsverzeichnis
215
Abbildung 4-37: Modell der Verteilung von Streptavidin bei 50 % Belegung. ........................... 133
Abbildung 4-38: Modell der Verteilung von Streptavidin bei 25 % Belegung. ........................... 134
Abbildung 4-39: Mögliches Modell der Dimerisierung ............................................................... 135
Abbildung 5-1: Konsekutive Beladung der SAM-Oberfläche mit Streptavidin, Mutanten ......... 138
Abbildung 5-2: Konsekutive Beladung der SAM-Oberfläche mit Streptavidin, K485C. ............ 139
Abbildung 5-3: Belegung von hGBP1 wt in Anwesenheit von 50 µM GppNHp. ....................... 140
Abbildung 5-4: Topographiebild nach Inkubation mit Streptavidin/ hGBP1-Doppelm. ............. 141
Abbildung 5-5: Topographiebild nach Inkubation mit Streptavidin/K485C ................................ 142
Abbildung 5-6: Schichtdickenberechnung über QCM-D. ............................................................ 143
Abbildung 5-7: Schichtdickenberechnung für Streptavidin/hGBP1-Mutante K485C/wt. ........... 144
Abbildung 5-8: Schichtdickenberechnung von hGBP1 wt mittels QCM-D. ............................... 144
Abbildung 5-9: Fluoreszenzmikroskopie Aufnahmen von lateral strukturierten SAMs. ............. 146
Abbildung 5-10: Mögliches Modell (Schema) für die Dimerisierung von hGBP1 wt ................. 148
Abbildung 5-11: Mögliches Modell für die Dimerisierung .......................................................... 149
Abbildung 5-12: SPR-Bindungskinetik von hGBP1 wt ............................................................... 150
Abbildung 5-13: Kinetik der Assoziation von hGBP1. ................................................................ 151
Abbildung 5-14: Auftragung der Plateau-Werte d ....................................................................... 153
Abbildung 6-1: IR-Spektren des Peptid-1-Thiol-SAMs als Volumenspektrum ........................... 155
Abbildung 6-2: Amid I-Moden verschiedener Sekundärstrukturelemente. ................................. 156
Abbildung 6-3: Ausschnitt aus dem IR-Spektrum des Peptidthiols. ............................................ 157
Abbildung 6-4: Aminosäuresequenz und chemische Struktur des verwendeten 25er-Peptids .... 161
Abbildung 6-5: HPLC-Spektrum des Produktes aus der Synthese des 25er-Peptids. .................. 162
Abbildung 6-6: MALDI-Spektrum des 25er-Peptidthiols. ........................................................... 162
Abbildung 6-7: IR-Spektrum des 25er-Peptidthiols im Volumen (KBr).. ................................... 163
Abbildung 6-8: IR-Spektrum des 25er-Peptidthiols im SAM. ..................................................... 164
Abbildung 6-9: Zusammenfassung der Adsorptionskurven für Fibrinogen ................................. 165
Abbildung 6-10: Zusammenfassung der Adsorptionskurven für Fibronektin. ............................. 166
Abbildung 6-11: Zusammenfassung der Proteinadsorption auf SAMs für Gold. ........................ 166
Abbildung 6-12: Zusammenfassung der Adsorption von Fibrinogen .......................................... 167
Abbildung 6-13: Zusammenfassung der Proteinadsorption auf SAMs für Silber. ....................... 168
Abbildung 6-14: IR-Spektrum (Transmission) des Peptidthiols im Volumen (KBr) ................... 169
Abbildung 6-15: IR-Spektrum (Reflexion) des Peptidthiols im SAM gemessen an Luft ............ 169
Abbildung 6-16: IR-Spektrum des Peptidthiols in D2O und 2. Ableitung. .................................. 171
Abbildung 6-17: Berechnung der Anteile für die Einzelkomponenten der Amid I-Bande. ......... 172
Kapitel 9 Abbildungsverzeichnis
216
Abbildung 6-18: CD-Spektren des Peptidthiols.. ......................................................................... 174
Abbildung 6-19: IR-Spektren des Peptidthiols in H2O (rote Kurve) und 5 % Trifluorethanol. ... 175
Abbildung 6-20: IR-Spektren des Peptidthiols in H2O und 5 % Trifluorethanol (TFE). ............. 176
Abbildung 6-21: IR-Spektren des Peptidthiols in D2O und verschied. TFE-Konzentrationen. ... 177
Abbildung 6-22: CD-Spektren des Peptidthiols für verschiedene TFE-Konzentrationen ........... 178
Abbildung 6-23: Adsorptionskinetik des Peptidthiols. ................................................................ 180
Abbildung 6-24: IR-Spektrum des Peptidthiols an einer Goldoberfläche in D2O. ...................... 181
Abbildung 6-25: IR-Spektrum des Peptidthiol-SAMs im trockenen Zustand ............................. 183
Abbildung 6-26: Entwicklung des IR-Spektrums des Peptidthiol-SAMs .................................... 184
Abbildung 6-27: Bandenshift während Inkubation mit H2O ....................................................... 185
Abbildung 6-28: IR-Spektren während Inkubation mit D2O (10 mM Tris, pH 7,4). ................... 186
Abbildung 6-29: IR-Spektren nach Inkubation mit TFE (trocken).. ............................................ 187
Abbildung 6-30: IR-Spektren während Inkubation mit TFE. ...................................................... 188
Kapitel 10 Tabellenverzeichnis
217
10 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Parameter für rasterkraftmikroskopische Aufnahmen ................................................... 60
Tabelle 2: Ergebnisse der ASA Berechnung. ............................................................................... 101
Tabelle 3: Ergebnisse der Quantifizierung der Biotinylierungseffizienz ..................................... 103
Tabelle 4: Ergebnisse der Belegung von Streptavidin/ biotinylierte hGBP1-Mutanten i............. 111
Tabelle 5: Streptavidin-Belegung auf verschiedenen Goldchips................................................. 117
Tabelle 6: Schichtdickenbestimmung für Streptavidin/hGBP1-Mutanten ................................... 124
Tabelle 7: Übersicht zu den gemessenen Hydrolyseaktivitäten ................................................... 131
Tabelle 8: Ermittelter Schichtdickenzuwachs für die drei hGBP1-Mutanten .............................. 145
Tabelle 9: Zusammenfassung der Streptavidin-Adsorption auf dem 10er-Peptidthiol-SAM ...... 155
Tabelle 10: Vergleich der IR-Spektren im Volumen und an der Oberfläche. .............................. 156
Tabelle 11: Simulationsergebnisse für die Sekundärstrukturbestimmung des Peptids ................ 159
Tabelle 12: Zusammenfassung der wichtigsten Banden für das 25er-Peptidthiol........................ 164
Tabelle 13: Berechnung der Sekundärstrukturanteile mittels CD-Spektroskopie ........................ 174
Tabelle 14: Berechnung der Sekundärstrukturanteile mittels CD-Spektroskopie ........................ 179
Tabelle 15: Zusammenfassung der Ergebnisse der Sekundärstrukturanalyse des Peptidthiols. ... 190
Kapitel 11 Abkürzungsverzeichnis
218
11 Abkürzungsverzeichnis
Å Ångström (1 Å = 1*10-10
m)
AG Aktiengesellschaft
AFM Atomic Force Microscopy (Rasterkraftmikroskopie)
ASA Accessible Surface Area
ATR Attenuated Total Reflexion
bHRP Biotinylated Horse Radish Peroxidase
BSA Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin)
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
c Konzentration
ca. circa
CD Circular Dichroism (Zirkulardichroismus)
CTL CD4 oder CD8 T-Lymphozyten
d Schichtdicke der Küvette
dest. destilliert
DNA Desoxyribonukleinsäure
D2O Deuteriumoxid
d. h. das heißt
DNA Desoxyribonukleinsäure
DTNB 5,5´-Dithiobis-(2-Nitrobenzoesäure)
DTT Dithiothreitol
ESI-MS Electrospray Ionisation- Mass Spectrometry
et al. et alii (und andere)
GAP GTPase-aktivierende Proteine
GBP Guanylat-bindende Proteine
GDP Guanosindiphosphat
GED GTPase-Effektor-Domäne
GEF Guaninnukleotid Austauschfaktor
g/l Gramm pro Liter
GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung
GMP Guanosinmonophosphat
GNBP GTP-bindende Proteine
GppNHp Guanosin-5´-(βγ-imino)-triphosphat
GTP Guanosintriphosphat
H2O Wasserstoffoxid (Wasser)
HCl Chlorwasserstoff, Salzsäure
hGBP humanes Guanylat-bindendes Protein
HIV humanes Immundefizienz-Virus
HPLC High Performance Liquid Chromatography
IFNAR Interferon α/β-Rezeptor Komplex
IFNR Interferon γ-Rezeptoren
Inc. Incorporated
Ink. Inkubation
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
IRRAS Infrarot-Reflexions-Absorptions-Spektroskopie
Kapitel 11 Abkürzungsverzeichnis
219
JAK Janus Kinase
K Kelvin
K2HPO4 Dikaliumhydrogenphosphat
KCl Kaliumchlorid
kDa Kilodalton
KG Kommanditgesellschaft
KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat
kJ Kilojoule
l Liter
LG Large Globular
MALDI-TOF Matrix-assisted Laser Desorption Ionization-
Time of flight
M-1
cm-1
pro Mol pro Zentimeter
mGBP murines Guanylat-bindendes Protein
Mg2+
Magnesium-Ion
MgCl2 Magnesiumdichlorid
mg/l Milligramm pro Liter
MgSO4 Magnesiumsulfat
min Minute
ml Milliliter
mM Millimolar
NaCl Natriumchlorid
NaOH Natriumhydroxid
ng Nanogramm
nm Nanometer
NTA Nitrilotriessigsäure
OD optische Dichte
OEG Oligoethylenglykol
PCR Polymerasekettenreaktion
PDMS Polydimethylsiloxan
PDB Protein Data Bank
PEG Polyethylenglykol
pH Potentia Hydrogenii
PHD Pleckstrin-Homologie-Domäne
pmol/µl Pikomol pro Mikroliter
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PNA Peptide Nucleic Acid
PRD Prolin-reiche Domäne
Prof. Professor
QCM Quartz Crystal Microbalance
(Quarzkristallmikrofeinwaage)
QCM-D Quartz Crystal Microbalance Dissipation
Ras Rat Sarcoma
RMS Root Mean Square (quadratisches Mittel)
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuklease A
RNAi Ribonukleinsäure Interferenz
s Sekunde
Kapitel 11 Abkürzungsverzeichnis
220
SA Streptavidin
SAM(s) Self-assembled Monolayer(s)
SDS Natriumdodecylsulfat
sog. sogenannte(r,s)
s.o. siehe oben
SP Surface Plasmon(s)
SPR Surface Plasmon Resonance Spectroscopy
(Oberflächenplasmonenresonanzspektrokopie)
STAT Signal Tranducer and Activator of Transcription
STM Scanning Tunneling Microscopy
(Rastertunnelmikroskopie)
TBA-Br Tetrabutylammoniumbromid
TEM Transmission Electron Microscopy
Transmissionelektronenmikroskopie
TFA Trifluoroacetic acid (Trifluoressigsäure)
TFE Trifluorethanol
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Tris-HCl Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid
u.a. und andere
µl Mikroliter
µm Mikrometer
UV Ultraviolett
V Volt
vgl. vergleiche
VIS Visible
VP Volumenplasmonen
VSV Vesicular Stomatitis Virus
wt Wildtyp
XPS X-ray Photo electron Microscopy
Röntgenphotoelektronenspektroskopie
Symbole:
α Alpha
β Beta
γ Gamma
ε Extinktionskoeffizient
λ Lambda
% Prozent
Aminosäuren Ein- und Dreibuchstabencode:
Alanin Ala A
Cystein Cys C
Asparaginsäure Asp D
Glutaminsäure Glu E
Phenylalanin Phe F
Glycin Gly G
Histidin His H
Kapitel 11 Abkürzungsverzeichnis
221
Isoleucin Ile I
Lysin Lys K
Leucin Leu L
Methionin Met M
Asparagin Asn N
Prolin Pro P
Glutamin Gln Q
Arginin Arg R
Serin Ser S
Threonin Thr T
Valin Val V
Tryptophan Trp W
Tyrosin Tyr Y
Kapitel 12 Publikationen
222
12 Publikationen
1. R. Chelmowski, S. D. Koster, A. Kerstan, A. Prekelt, C. Grunwald, T. Winkler,
N.,Metzler-Nolte, A. Terfort and C. Woll (2008). "Peptide-based SAMs that resist the
adsorption of proteins." J Am Chem Soc 130(45): 14952-3.
2. A. Kerstan, T. Ladnorg, Ch. Grunwald, T. Vöpel, D. Zacher, Ch. Herrmann, Ch. Wöll.
„HGBP1 as a model system investigated by several surface techniques”,
Biointerphases, accepted
3. A. Kerstan, Tobias Vöpel, T. Ladnorg, D. Zacher, Ch.Wöll, Ch. Herrmann.
"Immobilization of biotinylated hGBP1 on surfaces and investigation of ist
oligomerization using various biophysical and biochemical techniques”, in progress
Kapitel 13 Lebenslauf
223
13 Lebenslauf
Persönliche Daten
Name: Kerstan, Andreas
Anschrift: Theodor-Otte-Str. 146
45897 Gelsenkirchen
0209/1486614
Mail: andreas.kerstan@rub.de
Geburtsdatum: 28.04.1981 in Gelsenkirchen
Familienstand: ledig
Voraussichtlicher Berufsabschluss
WS 2010 Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer.nat.)
Hochschulstudium
WS 06/07 - WS 10/11 Promotion im Fachbereich Biochemie
an der Ruhr-Universität Bochum
WS 01/02 - WS 06/07 Master of Science im Fachbereich Biochemie
an der Ruhr-Universität Bochum
Abschluss: Master Biochemiker
Studienschwerpunkte: Biophysikalische Chemie; Proteinbiochemie,
Oberflächenchemie
Wehrdienst
07/2000 – 05/2001: Deines-Bruchmüller-Kaserne Koblenz
Schulbildung
08/1991 – 05/2000: Max-Planck-Gymnasium Gelsenkirchen-Buer, Abitur
08/1986 – 05/1990: Grundschule an der Flurstraße, Gelsenkirchen
Besondere Kenntnisse und Interessen
Fach: Business to Business Marketing, Grundkenntnisse
EDV: Word, Excel, PowerPoint, Corel Draw, Chem Draw, Isis
Draw, Nanoscope IIIa, Pymol
Sprachen: Englisch, Latein, Französisch
Interessen: Lesen, Schreiben, Tennis, Fitness, Musik hören
Kapitel 14 Danksagung
224
14 Danksagung
Ohne die Hilfe vieler fleißiger „Bienchen“, die zum Gelingen der Arbeit beigetragen
haben, wäre dieses Schriftstück in der vorliegenden Form nicht zustande gekommen.
Dafür möchte ich mich von ganzem Herzen bedanken. Falls ich jemanden vergessen
sollte, bitte nicht böse sein.
Allen voran möchte ich ein ganz dickes Dankeschön an Herrn Herrmann richten, der mir
vor allen Dingen in den letzten Monaten, aber auch während der gesamten Zeit meiner
Promotion, mit Rat und Tat zur Seite stand. Das große Interesse an meiner Arbeit, die
konstruktiven Diskussionen und auch die eine oder andere kritische Äußerung haben mir
sehr geholfen, die Höhen und Tiefen, die man während der Jahre durchlebt, zu überstehen
und gestärkt daraus hervorzugehen. Kurzum von Ihnen habe ich viel gelernt und Sie als
echt „korrekten“ Menschen kennengelernt. Ihnen und Herrn Wöll gilt gleichermaßen der
Dank, dass mir die Möglichkeit gegeben wurde, an sehr spannenden Forschungsthemen
arbeiten zu dürfen, und dass ich die nötige finanzielle und wissenschaftliche
Unterstützung bekommen habe. Sie haben stets dafür gesorgt, dass zu jeder Zeit die
besten Voraussetzungen für wissenschaftliches Arbeiten gegeben waren. Danke!
Rolf und Tatjana danke ich ganz besonders für die tolle Zusammenarbeit und die vielen
amüsanten Stunden. Solche Sätze wie „Nimm dir was von dem großen Igel, der
schmeckt“ oder „dann hol dir ne Pulle“ werde ich nie vergessen.
Natürlich möchte ich auch die anderen „Bürobewohner“ Andreas Prekelt, Daniel Käfer,
Stefanie Winkler und ganz besonders Paavo Pohndorff, und Stanislav Gann erwähnen,
die unser Büro zum Besten im ganzen Lehrstuhl gemacht haben. Und nochmal ein großes
Dankeschön an Paavo und Stan: Ohne Euch wäre ich zwischendurch ganz schön
aufgeschmissen gewesen!!!
Ich danke dem ganzen Lehrstuhl für die vielen Ratschläge und Unterstützung, aber auch
die tolle Atmosphäre. An dieser Stelle seien im Besonderen erwähnt: Ruth, Angelika,
Ulla, Herr Birkner, Herr Ader („Goldader“), Liu, Herr Zwingmann, Jennifer, Xia, Asif,
Herr Wasmuth und Herr Krause, etc…Auch der „Witte-Fraktion“ möchte ich an dieser
Stelle nochmal einen herzlichen Gruß schicken, besonders Jan und Christian.
Auch die Unterstützung beim „Peptidthiol-Projekt“, die ich durch Herrn Grunwald
erfahren habe, soll in dieser Danksagung besondere Erwähnung finden. Danke, Christian!
Kapitel 14 Danksagung
225
Ich danke der AG Protein-Protein-Interaktion für die vielen konstruktiven Gespräche und
die Unterstützung, die ihr mir entgegengebracht habt. Ganz besonders möchte ich in dem
Zusammenhang Tobias, Maik und Adrian hervorheben.
Ohne Kooperationen mit anderen Lehrstühlen wäre die Arbeit so nicht zustande
gekommen, deswegen ein „Dankeschön“ an David, Denise, Sebastian und Jörn (Rub)
sowie Stefan Heissler (Kit), den Leuten der Firma Bruker und Herrn Terfort (ohne das
Alkinthiol wäre ich verloren gewesen).
Zu guter Letzt danke ich meinen Freunden und meiner Familie, allen voran meinen
Eltern, die mir dieses Studium ermöglicht haben und mich stets moralisch sowie tatkräftig
unterstützt haben, und Steffi für die Korrektur meiner Arbeit und den festen Glauben an
mich (und natürlich dafür, dass es dich gibt).
Kapitel 15 Eidesstattliche Erklärung
226
Hiermit versichere ich an Eides statt, dass ich die hier vorgelegte Dissertation
eigenständig, ohne unerlaubte Hilfe und unter ausschließlicher Verwendung der
angegebenen Quellen und Hilfsmittel angefertigt habe. Diese Dissertation ist in der
vorliegenden oder einer ähnlichen Form noch bei keiner anderen Institution eingereicht
worden.
Bochum, im Oktober 2010
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