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Produktion und Freisetzung von L-Glycerol-3-Phosphat (L-G3P)

mit genetisch modifizierten Stämmen von Saccharomyces cerevisiae

vorgelegt von Almut Popp

von der Fakultät III – Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften – Dr. rer. nat. –

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. Dietrich Knorr Berichter: Prof. Dr. Ulf Stahl Berichter: Prof. Dr. Eckhard Boles

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 13. Juli 2007

Berlin 2008

D83

2

Prof. Dr. Dipl.-Ing. Ulf Stahl danke ich, dass ich diese Arbeit im Fachgebiet Mikrobiologie und Genetik an der Technischen Universität Berlin anfertigen durfte. Bei Dr. Elke Nevoigt bedanke ich mich für die Aufnahme in ihre Arbeitsgruppe, für die fachliche Betreuung und für manche Ermutigung. Prof. Dr. Eckhard Boles danke ich für die Bereitschaft, diese Arbeit zu begutachten. Dr. Stéphane E. Guillouet, Kooperationspartner unserer Arbeitsgruppe am Institut National des Sciences Appliquées (INSA), Toulouse, danke ich, dass die Fermentationen in seinem Labor durchgeführt werden konnten. Ihm, Dr. Sandrine Alfenore und Dr. Carine Bideaux danke ich für die fachliche Anleitung, Kenza Boulahya und Dr. Huyen T. T. Nguyen für die tägliche und nächtliche Zusammenarbeit bei der Vorbereitung und Durchführung der Fermentationen und Dr. Xavier Cameleyre für die HPLC-Analysen. Den Mitarbeitern des Fachbereichs Mikrobiologie und Genetik danke ich für die kritische Begleitung dieser Arbeit und manche praktische Hilfe. Hervorzuheben sind Dr. Huyen T. T. Nguyen, die mich in die molekularbiologische Arbeit mit Hefe eingeführt hat, Dörte Müller, Maria Krain und Julia Apelt, die praktische Unterstützung geleistet haben, und Käthe Gaul, die im Rahmen ihrer Studienarbeit zu dieser Arbeit beigetragen hat. Schließlich bedanke ich mich bei Prof. Dr. Eckhard Boles für die Überlassung des Stammes ENY.WA-1A, bei Prof. Dr. Jeffrey Smith für den Stamm JJSY54, bei Prof. Dr. Christine Lang für die Stämme AH22ura3 und AH22ura3∆pep4, bei Dr. Markus Veen für das Plasmid pFLAT1 und bei Dr. Matthias Müller für den Stamm GRF18ura3. Meine Familie hat die Endphase der Fertigstellung dieser Arbeit tapfer durchgestanden. Ohne die Unterstützung meiner Eltern und Schwiegereltern hätte ich nicht zu diesem Zeitpunkt abschließen können – danke.

3

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 7

1.1 Transport von Glycerol-3-Phosphat und Triosephosphaten 7

1.1.1 Bedeutung des Transports von Glycerol-3-Phosphat für Borrelia-Spezies und andere Bakterien 7

1.1.2 Bedeutung des Transports von Triosephosphaten in grünen Pflanzen 8

1.1.3 Charakterisierte und mutmaßliche Transporter für L-G3P 12

1.1.3.1 Bakterien 12

1.1.3.2 Chloroplasten 15

1.1.3.3 Pilze 16

1.1.3.4 Säugetiere 17

1.2 Biotechnologische Produktion von L-Glycerol-3-Phosphat (L-G3P) mit Saccharomyces cerevisiae: Motivation und Stand der Technik 18

1.3 Problemstellung 25

1.4 Auswahl eines G3P-Transporters für das Metabolic Engineering von Saccharomyces cerevisiae zur Freisetzung von akkumuliertem L-G3P 26

2. Material und Methoden 30

2.1 Material 30

2.1.1 Primer 30

2.1.2 Plasmide 31

2.1.3 Stämme 31

2.1.4 Medien und Anzucht 33

2.2 Methoden der Fermentation und Analyse der Fermentationsprodukte 35

2.2.1 Wachstumskurven 35

2.2.2 Fed-Batch-Fermentationen 36

2.2.3 Bestimmung von Biomasse und dem Anteil lebender Zellen 37

2.2.4 Enzymatische Bestimmung von L-G3P 37

2.2.5 Bestimmung von Glucose und Fermentationsprodukten 38

2.2.6 Zusammenführung und Darstellung der Daten 38

2.3 Methoden der Manipulation und Analyse von Nucleinsäuren 40

2.3.1 Puffer, Agarose-Gelelektrophorese 40

2.3.2 Spektrophotometrische Bestimmung von Nucleinsäuren 40

2.3.3 Präparation der Gesamt-DNA aus E. coli 40

2.3.4 PCR (Polymerase Chain Reaction), Aufreinigung der Produkte 41

2.3.5 Klonierung (Restriktion, Ligation) 41

2.3.6 E. coli-Transformation 42

2.3.7 Plasmid-Präparationen aus E. coli („Minipräp“, „Maxipräp“) 42

2.3.8 Hefe-Transformationen 43

2.3.9 Homologe Rekombination in Hefe 43

2.3.10 Präparation der Gesamt-DNA aus Hefe 44

4

2.3.11 DNA-Sequenzierung 44

2.3.12 Präparation und Auftrennung der Gesamt-RNA aus Hefe 44

2.3.13 Northern Blot und Immundetektion der mRNA 45

2.4 Methoden der Protein-Analyse 46

2.4.1 Puffer, Lösungen und Antikörper 46

2.4.2 Proteinaufarbeitung und -fraktionierung 47

2.4.3 Spektrophotometrische Proteinbestimmung 48

2.4.4 SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) 48

2.4.5 Western Blot (semi-dry) und Immundetektion der Proteine 48

2.4.6 Immunfluoreszenz-Mikroskopie 49

3. Ergebnisse 51

3.1 Fermentationen mit dem Stamm ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 51

3.1.1 Wachstum und L-G3P-Produktion in zwei Fermentationen mit unterschiedlicher Belüftungsstrategie 51

3.1.1.1 Biomasse-Produktion 52

3.1.1.2 L-G3P-Produktion insgesamt (intra- plus extrazellulär) 52

3.1.1.3 Gegenüberstellung von spezifischer L-G3P-Produktionsrate und Wachstumsrate 56

3.1.2 Unterscheidung in extra- und intrazelluläres L-G3P 56

3.1.2.1 Extrazelluläres L-G3P: zeitlicher Verlauf und Herkunft 56

3.1.2.2 Intrazelluläres L-G3P: zeitlicher Verlauf 59

3.1.2.3 Konzentrationsgefälle von L-G3P über die Plasmamembran 59

3.1.2.4 Freisetzung von L-G3P aus den Zellen 60

3.1.3 Limitationen der L-G3P-Produktion 62

3.1.3.1 Gegenüberstellung von intrazellulärer L-G3P-Konzentration und Wachstumsrate 62

3.1.3.2 Korrelation von Ethanolkonzentration und Wachstumsrate 64

3.1.3.3 Gegenüberstellung von Glycerolproduktion und intrazellulärer L-G3P-Konzentration 65

3.2 Expression des Glycerol-3-Phosphat-Transporters (GlpT) aus E. coli in S. cerevisiae ∆gpp1/2 67

3.2.1 Klonierung und Nachweis der Expression von GlpT auf Proteinebene 67

3.2.1.1 Kofraktionierung von GlpT mit Membranen von S. cerevisiae 69

3.2.1.2 Apparentes Molekulargewicht von heterolog exprimiertem GlpT 71

3.2.1.3 Abhängigkeit der Expressionsstärke von der Position des c-Myc-Epitops 71

3.2.1.4 Abhängigkeit der Expressionsstärke vom S. cerevisiae-Stammhintergrund 72

3.2.2 Wachstumskurven des Wirtsstammes mit und ohne Expression des heterologen Transmembranproteins 73

3.2.3 Konzentrationsgefälle von L-G3P über die Plasmamembran von S. cerevisiae ∆gpp1/2 mit Expression von GlpT 74

3.2.4 Diagnostische Transformationen von GlpT in Single-Knockout-Mutanten des Stammes S. cerevisiae BY4741 mit Deletionen in Genen für Mannosyltransferasen und Endoproteinasen 74

5

3.2.5 Lokalisierung von GlpT in S. cerevisiae-Transformanten mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie 76

3.2.6 Konstruktion und Expression von Fusionsproteinen aus GlpT und N-terminalen Abschnitten des Alpha-Faktor-Rezeptors (Ste2p) von S. cerevisiae 77

4. Diskussion 79

4.1 L-G3P-Metabolismus und Wachstum des Stammes ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 79

4.1.1 Auf welchem Weg bildet ein Stamm ohne spezifische Glycerol-3-Phosphatase Glycerol? 79

4.1.2 Fluss durch den Glycerolbiosynthese-Weg in einem Stamm mit deregulierter Aktivität der Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase und ausgeschalteter spezifischer Glycerol-3-Phosphatase 81

4.1.3 Wodurch wird die intrazelluläre Akkumulation von L-G3P im Produktionsstamm begrenzt? 83

4.1.4 Wodurch wird das Wachstum des Produktionsstammes limitiert? 86

4.1.5 Auf welchem Weg wird das phosphorylierte Stoffwechselzwischenprodukt L-G3P aus den Zellen freigesetzt? 89

4.1.6 Derzeitige Leistung und wahrscheinliches Potenzial von S. cerevisiae ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 für die Produktion von L-G3P 90

4. 2 Heterologe Expression eines bakteriellen Transporters in S. cerevisiae 92

4.2.1 Bedingungen und Methoden der heterologen Expression 92

4.2.2 Codon usage von S. cerevisiae und E. coli – limitiert die Translation die Expressionsstärke? 93

4.2.3 Nimmt GlpT in der ER-Membran von S. cerevisiae seine native Konformation ein? 95

4.2.4 Wie interagiert GlpT mit der Qualitätskontrolle des ER? 98

4.2.5 Fehlt eine hefetypische Signalsequenz für die Plasmamembran? 101

4.2.6 Welche Rolle spielt die Membranzusammensetzung für die Lokalisierung von GlpT? 107

4.2.7 Auf welchem Weg gelangt GlpT in die Vakuole? 109

4.2.8 Weitere mögliche Strategien für die Verbesserung der Expression und Lokalisierung von GlpT in S. cerevisiae 111

4.2.9 Ausblick 113

5. Zusammenfassung 114

6. Literatur 116

6

Abkürzungen

A. dest. zweimal destilliertes Wasser NAD, NADH

oxidierte und reduzierte Form von Nicotinamidadenindinucleotid

Abb. Abbildung NADP, NADPH

oxidierte und reduzierte Form von Nicotinamidadenindinucleotidphosphat

ABC ATP Binding Cassette npi nitrogen permease inhibition

ADP/ ATP

Adenosindiphosphat, Adenosintriphosphat

MFS Major Facilitator Superfamily

AP Alkalische Phosphatase MOPS N-Morpholinopropansulfonsäure

BiP Binding Protein mRNA messenger-RNA

bp Basenpaare OD600 optische Dichte (Extinktion) bei 600 nm Wellenlänge

COPI/II Coat protein complex I /II PBS Phosphate Buffered Saline

CSM Complete Synthetic Medium PCR Polymerase Chain Reaction

DAPI 4,6-Diamino-2-phenylindol PDI Protein-Disulfid-Isomerase

DHAP Dihyxdroxyacetonphosphat PEG Polethylenglycol

DIG Digoxygenin Pi anorganisches Phosphat

DNA Desoxyribonucleinsäure PM Plasmamembran

DMSO Dimethylsulfoxid PVDF Polyvinylidenfluorid

DTT Dithiothreitol rpm rounds per minute

E. Escherichia RNA Ribonucleinsäure

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure RT Raumtemperatur

ER Endoplasmatisches Reticulum S. Saccharomyces

ERAD Endoplasmic Reticulum Associated Degradation

SDS Natriumdodecylsulfat

ESCRT Endosomal Sorting Complex Required for Transport

Tab. Tabelle

FITC Fluoreszeinisothiocyanat TGN Trans-Golgi-Netzwerk

G3P Glycerol-3-Phosphat TMD Transmembrandomäne(n)

GAP Glycerolaldehyd-3-Phosphat Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

GFP Green Fluorescent Protein tRNA Transfer-RNA

GlpT Glycerol-3-Phosphat-Transporter

UPR

UV Unfolded Protein Response

ultraviolette Strahlung

GPD Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase

vps vacuolar protein sorting

Kb

KDa Kilobasen

Kilodalton

vvm volume (Luft) per volume (Medium) per minute

LB Luria Broth YNB Yeast Nitrogen Base

L-G3P L- bzw. sn-Enantiomer von G3P (vgl. dort)

YPD

wt

Yeast extract Peptone Dextrose

Wildtyp

7

1. Einleitung

1.1 Transport von Glycerol-3-Phosphat und Triosephosphaten

1.1.1 Bedeutung des Transports von Glycerol-3-Phosphat für Borrelia-Spezies

und andere Bakterien

Glycerol-3-Phosphat (G3P) ist ein phosphorylierter C3-Körper, der in zwei Enantiomeren

vorkommt. G3P wird aus glykolytischem DHAP gebildet, bei der Degradation von

Phospholipiden freigesetzt oder entsteht beim Wachstum auf Glycerol durch die Aktivität der

ATP-abhängigen Glycerolkinase (vgl. Abb. 1.1). Von L-G3P (in Hefe und tierischen Zellen

auch von DHAP) gehen außerdem die Synthesewege für Glycerolipide aus, sowohl der

Phospholipide als auch der Triacylglycerole (Athenstaedt et al. 1999).

Da sich diese Arbeit mit der Produktion von G3P beschäftigt, ist es wichtig, die Mechanismen

für den Transport von G3P zu kennen. Durch seine Phosphatgruppe, die bei physiologischem

pH-Wert eine Hydrathülle trägt, kann G3P Membranen nur passieren, wenn diese ein

geeignetes Transportsystem aufweisen. So ist G3P beispielsweise kein Substrat für den

Glycerol-Facilitator von E. coli (Sweet et al. 1990), durch den Glycerol mit seinem

Konzentrationsgefälle in die Zelle einströmt. Diesen Umstand nutzt die Zelle, indem sie durch

die schnelle Phosphorylierung von Glycerol zu G3P das Konzentrationsgefälle von Glycerol

über die Zellmembran groß hält und so den kontinuierlichen Nachstrom von Glycerol

sicherstellt (Charrier et al. 1997). G3P wird durch seine Phosphorylierung in der Zelle

festgehalten. Weil ein Export von G3P den Verlust von Energie und Synthesebausteinen

bedeuten würde, sind Transportsysteme, sofern sie vorhanden sind, auf den Import von G3P

spezialisiert.

Wie die Fähigkeit oder Unfähigkeit zum Import von L-G3P die Biologie von Bakterien

beeinflussen kann, zeigt das Beispiel der Gattung Borrelia. Einige Arten dieser Gattung rufen

beim Menschen Rückfallfieber hervor, andere die mildere Lyme-Krankheit („Borreliose“).

Rückfallfieber korreliert mit einer hohen Erregerdichte im Blut des Patienten (>108/ml),

während die Lyme-Krankheit mit einer weit geringeren Erregerdichte (<105/ml) einhergeht.

Auf der Suche nach der genetischen Grundlage dieser unterschiedlichen maximalen

Zelldichten fanden Schwan et al. (2003) Unterschiede in der Fähigkeit, L-G3P aufzunehmen.

Sowohl Rückfallfieber-Borrelien als auch Lyme-Borrelien verfügen über die beiden oben

beschriebenen Wege für die De-novo-Synthese von G3P: (1) Sie nehmen Glycerol durch den

Glycerol-Facilitator (GlpF) auf und phosphorylieren ihn mit Hilfe der Glycerol-Kinase

8

(GlpK). (2) Sie zweigen glykolytisches DHAP ab und reduzieren es mit Hilfe der Glycerol-3-

Phosphat-Synthase (GpsA). Darüber hinaus enthält der glp-Locus der Rückfallfieber-

Borrelien zwei weitere Gene, die den Lyme-Borrelien verloren gegangen sind (Schwan et al.

2003). Sie codieren eine periplasmatische Glycerophosphodiesterase (GlpQ) und einen

Glycerol-3-Phosphat-Transporter (GlpT). Aus dem komplexen Medium Blut können die

Rückfallfieber-Borrelien – und nur sie – mit diesen Genprodukten aus den

Deacylierungsprodukten von Phospholipiden, den Glycerophosphodiestern, L-G3P freisetzen,

aufnehmen und unmittelbar als Baustein für die Synthese von Glycerophospholipiden nutzen.

Gegenüber der De-novo-Synthese von G3P sparen sie damit freie Energie, 1 mol ATP/mol

G3P falls die Phosphorylierung von Glycerol beschritten wird, oder 2 mol ATP/mol G3P,

falls G3P aus der Glykolyse abgezweigt wird. Dieser energetische Vorteil ist

höchstwahrscheinlich für die beiden unterschiedlichen Krankheitsbilder verantwortlich

(Schwan et al. 2003).

Auch im glp-Regulon von E. coli, das für den Metabolismus von Glycerol und G3P

notwendig ist, sind die beiden Gene glpQ und glpT vorhanden. Sie ermöglichen den Zellen,

auf L-G3P als einziger C-Quelle zu wachsen (Lin et al. 1962). G3P selbst ist der Induktor des

Operons, zu dem die beiden Gene gehören. Indem es an den Repressor GlpR bindet, bewirkt

es seine Dissoziation von der DNA in der Nachbarschaft des glpT-Promoters (Larson et al.

1987). Für die unmittelbare Verwendung von L-G3P als Baustein für die Lipidsynthese

spricht, dass radioaktiv markiertes L-G3P innerhalb von rund 20 Minuten in den

Phospholipiden von E. coli erscheint (Brzoska et al. 1994).

Dass der energetische Vorteil des L-G3P-Imports erheblich ist, gilt außerdem als Erklärung

für die Seltenheit von Fosfomycin-resistenten Bakterienstämmen in Kliniken. Die Resistenz

beruht auf einer Inaktivität von GlpT. Gegen diese herrscht anscheinend ein starker

Selektionsdruck (Nilsson et al. 2003).

1.1.2 Bedeutung des Transports von Triosephosphaten in grünen Pflanzen

Die Triosephosphate Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) und Glycerolaldehyd-3-Phosphat

(GAP) stehen im Zentrum des zentralen Kohlenstoffwechsels der Organismen. Sie werden bei

der Glykolyse und in Pflanzen zusätzlich bei der Kohlenstoffdioxidfixierung im Calvin-

Zyklus gebildet.

9

Glucose

G6P

F6P

FBP

GAP

BPG

3-PGA

PEP

Pyruvat

3-PGA

BPG

GAP

DHAP

G3P

Glycerol

Glycerophospholipide

Glycerophosphodiester

Triacylglycerole

Phospholipasen

PA

Glycero-phospho-diesterasen

CO2

Calvin-Zyklus

Phosphoglyceratkinase

ATP

Glycerolkinase

ATP

Hexokinase

ATP

Phosphofructokinase

ATP

Aldolase

ATP

ATP

Triosephosphat-isomerase

RuBP

Ru5P

Phosphoribulosekinase

ATP

Glucose

G6P

F6P

FBP

GAP

BPG

3-PGA

PEP

Pyruvat

3-PGA

BPG

GAP

DHAP

G3P

Glycerol

Glycerophospholipide

Glycerophosphodiester

Triacylglycerole

Phospholipasen

PA

Glycero-phospho-diesterasen

CO2

Calvin-Zyklus

Phosphoglyceratkinase

ATP

Glycerolkinase

ATP

Hexokinase

ATP

Phosphofructokinase

ATP

Aldolase

ATP

ATP

Triosephosphat-isomerase

RuBP

Ru5P

Phosphoribulosekinase

ATP

Abb. 1.1. Entstehung und Nutzung von Glycerol-3-Phosphat und Triosephosphaten (fett) in den Reaktionswegen der Glykolyse, des Glycerolmetabolismus, des Glycerolipidmetabolismus und der photosynthetischen Kohlenstoffdioxidfixierung. Nicht alle Organismen verfügen über alle gezeigten Stoffwechselwege (Beschreibungen vgl. 1.1.1–1.1.2). Auf die Darstellung von Kompartimenten und Zellgrenzen wurde verzichtet, da einige Reaktionen in mehreren Kompartimenten sowie intra- und extrazellulär ablaufen.

Abkürzungen: ATP: Adenosintriphosphat, BPG: 1,3-Bisphospoglycerat, DHAP: Dihydroxyacetonphosphat, F6P: Fructose-6-Phosphat, FBP: Fructose-1,6-Bisphosphat, G3P: Glycerol-3-Phosphat, GAP: Glycerolaldehyd-3-Phosphat, G6P: Glucose-6-Phosphat, PA: Phosphatidat, PEP: Phosphoenolpyruvat, 3-PGA: 3-Phosphoglycerat, Ru5P: Ribulose-5-Phosphat, RuBP: Ribulose-1,5-Bisphosphat.

Im Rahmen der Glykolyse erfolgt die ATP-getriebene Phosphorylierung, die zur Bildung der

Triosephosphate führt, auf der Ebene der Hexosen durch Hexokinase und

Phosphofructokinase. Eine Aldolase setzt anschließend aus der zweifach phosphorylierten

Hexose Fructose-1,6-Bisphosphat (FBP) die beiden einfach phosphorylierten Triosen DHAP

10

und GAP frei. Sie stehen über die Triosephosphat-Isomerase miteinander im Gleichgewicht.

Cytosolisches DHAP oder GAP repräsentieren freie Enthalpie, weil im Rahmen der

glykolytischen Substratkettenphosphorylierung aus 1,3-Bisphosphoglycerat (BPG) und

Phosphoenolpyruvat (PEP) je 1 ATP gebildet werden kann (Abb. 1.1). Im Rahmen der

Zellatmung wird in den Mitochondrien zusätzlich ein Vielfaches an ATP gewonnen.

In allen Organismen läuft die Glykolyse im Cytosol ab. Höhere Zellen ziehen entscheidende

Vorteile daraus, dass sie über mehrere Kompartimente verfügen. Die Photoautotrophie grüner

Pflanzen ist ein beeindruckendes Beispiel für den Vorteil der Kompartimentierung, denn sie

schafft die energetische Voraussetzung für den größten Teil des heterotrophen Lebens auf der

Erde. Dabei nutzt die Pflanze die Lichtenergie der Sonne für die Bildung von ATP und

NADPH und für die Umwandlung atmosphärischen Kohlenstoffdioxids in Biomasse. Beide

Prozesse sind gekoppelt und verdanken sich hochgeordneten Strukturen im

photosynthetischen Kompartiment, dem Chloroplasten. Dieser ist von einer doppelten

Hüllmembran vom Cytosol getrennt und besteht aus dem Stroma und den

Thylakoidmembranen, die den Thylakoidinnenraum umschließen. Das Auftreffen von Licht

auf die Photosysteme in den Thylakoidmembranen führt zur Reduktion von NADP und zur

Ausbildung eines Protonengradienten über die Thylakoidmembran, der die ATP-Synthese

antreibt. Im Stroma findet die ATP- und NADPH-getriebene Kohlenstoffdioxidfixierung im

Calvin-Zyklus statt.

In höheren Pflanzen existiert neben dem cytosolischen (glykolytischen) Pool von DHAP und

GAP ein weiterer im Chloroplasten. Im Fall des plastidären GAP sind Kinasen des Calvin-

Zyklus für die Phosphorylierung verantwortlich. Phosphoribulosekinase stellt das zweifach

phosphorylierte Pentosephosphat Ribulose-1,5-Bisphosphat (RuBP), das CO2-

Akzeptormolekül, her. Die Kohlenstoffdioxidfixierungsreaktion setzt aus einem

hypothetischen zweifach phosphorylierten C6-Körper zwei einfach phosphorylierte C3-

Körper, d. h. zwei Moleküle 3-PGA, frei. Diese werden durch Phosphoglyceratkinase und

Glycerolaldehydphosphat-Dehydrogenase unter ATP- und NADPH-Verbrauch zu zwei

Molekülen GAP reduziert. GAP trägt im Chloroplasten zur Regeneration des Akzeptor-

Moleküls bei, beschreitet also den Calvin-Zyklus, oder gelangt ins Cytosol, wo es

beispielsweise in die Glykolyse eingespeist wird (Abb. 1.1).

Die Triosephosphate DHAP und GAP können wie G3P (vgl. 1.1.1) Membranen nur mithilfe

geeigneter Transportsysteme passieren, zwischen einzelnen Kompartimenten höherer Zellen

also nur über spezifische Transporter wechseln. Gemäß der Endosymbiontentheorie verlief

die Evolution der grünen Pflanzen mit ihren Chloroplasten ausgehend von der Phagocytose

11

eines Cyanobakterien-ähnlichen Vorläufers, der die Fähigkeit zur Photosynthese besaß, durch

eine heterotrophe eukaryontische Wirtszelle. Die Umwandlung des Endosymbionten zum

Plastiden war durch drei notwendige Ereignisse bestimmt: (1) die Auslagerung des größten

Teils seiner Gene in den Kern der Wirtszelle, (2) die Entstehung von Transportsystemen für

kerncodierte plastidäre Proteine in der selektiven inneren Hüllmembran des Plastiden und

dazu passender Signalsequenzen, die für die Sortierung plastidärer Proteine zu diesen

Systemen sorgen, und (3) die Entwicklung von Transportern, mit denen intrazelluläre

Metabolite zwischen Chloroplast und Cytosol ausgetauscht werden können (Knappe et al.

2003). Im Rahmen der Endosymbiontentheorie kann der Export von Triosephosphaten aus

dem Chloroplasten also sinnvoll als Import von Triosephosphaten ins Cytosol betrachtet

werden.

GAP, das primäre Produkt der Kohlenstoffdioxidfixierung im Chloroplasten während der

Photosynthese, ist das natürliche Substrat des Triosephosphat-Phosphat-Translokators TPT.

Der Transporter ist das häufigste Protein der inneren Chloroplastenmembran, doch erst 1991

wurde endgültig nachgewiesen, dass er nicht für den Import kerncodierter Proteine in den

Chloroplasten, sondern für den Import von Metaboliten ins Cytosol verantwortlich ist (Flügge

et al. 1991). Sein N-terminales Transitpeptid ist rund 70 Aminosäuren lang und enthält einen

kurzen helikalen Abschnitt, der an mitochondriale Transitpeptide erinnert. Es wird von einer

spezifischen Protease abgetrennt (Flügge et al. 1989). Im Cytosol können aus

Triosephosphaten NADH und ATP gewonnen werden. Dies erfolgt im Zug ihrer Oxidation

durch glykolytische Enzyme zu 3-PGA. In dieser Reaktionsfolge arbeitet der Triosephosphat-

Translokator als Shuttle für freie Enthalpie und Reduktionsäquivalente zwischen Chloroplast

und Cytosol. Alternativ wird aus GAP im Cytosol NADPH für Synthesen gebildet. 3-PGA

wird durch den TPT in den Chloroplasten zurücktransportiert (Fliege et al. 1978). Im

Gegensatz zum mitochondrialen L-G3P-DHAP-Shuttle für NADH passieren hier die

phosphorylierten C3-Körper die Endomembran.

Außerdem erfolgt im Cytosol aus Triosephosphaten die Synthese höherwertiger

Monosaccharide, Disaccharide und Aminosäuren. Die dabei abgespaltete Phosphatgruppe

wird im TPT-vermittelten Antiport ins Stroma des Chloroplasten zurückgeschleust, wo sie für

die ATP-Synthese gebraucht wird.

So sind nicht nur Lichtreaktionen und Kohlenstoffdioxidfixierung innerhalb des

Chloroplasten gekoppelte Prozesse, sondern auch der Stoffaustausch zwischen Chloroplast

und Cytosol. Die Rate des Triosephosphat-Pi-Antiports entspricht experimentell der Rate der

Kohlenstoffdioxidfixierung (Lilley et al. 1977; Fliege et al. 1978).

12

1.1.3 Charakterisierte und mutmaßliche Transporter für L-G3P

1.1.3.1 Bakterien

Neben dem bereits beschriebenen L-G3P-Transporter GlpT verfügt E. coli noch über einen

weiteren, UgP (Uptake of Glycerol 3-Phosphate). Die beiden Transporter gehören

verschiedenen Transporter-Klassen an – MFS (Major Facilitator Superfamily) und ABC

(ATP Binding Cassette Superfamily) – und weisen große strukturelle Unterschiede auf, die

sich in unterschiedlichen Transporteigenschaften niederschlagen.

GlpT (Glycerol 3-Phosphate-Transporter) gehört zu den sekundäraktiven Transportern, die

die Energie für den Transport ihres Substrats gegen das Konzentrationsgefälle aus einem

elektrochemischen oder chemischen Gradienten eines zweiten Substrats beziehen. Kleine,

lösliche organische und anorganische Moleküle werden von dieser Proteinklasse transportiert.

Typisch für MFS ist, dass die funktionale Einheit von GlpT durch ein Monomer gebildet

wird, das aus einer N- und einer C-terminalen Hälfte ähnlicher Konformation besteht. Jede

Hälfte umfasst sechs relativ dicht gepackte Transmembrandomänen. Verbunden sind die

beiden Hälften durch eine längere cytosolische Schleife. N- und C-Terminus von GlpT liegen

im Cytosol (Abb. 4.1) (Huang et al. 2003; Abramson et al. 2004; Lemieux et al. 2004). Die

Transporteigenschaften von GlpT wurden durch langjährige Untersuchungen an Zellen und

Proteoliposomen bestimmt (1), während kürzlich die hoch aufgelöste Röntgenstrukturanalyse

eines GlpT-Kristalls ohne gebundenes Substrat strukturelle Einblicke lieferte (2).

(1) Natürliche Substrate von GlpT sind G3P und Pi, wobei die Affinität für G3P deutlich über

der für Pi liegt. Das Substratspektrum von GlpT umfasst außerdem G2P, Arsenat und

Fosfomycin (Elvin et al. 1985), Glycerol hingegen ist kein Substrat. Pi und G3P sind

kompetitive Inhibitoren für den Transport des jeweils anderen Substrats (Hayashi et al. 1964;

Ambudkar et al. 1986). Der Transport erfolgt ohne externe Energiequelle, d. h. ohne ATP

oder einen H+- oder Na+-Gradienten (Ambudkar et al. 1986). Unabdingbar ist dagegen die

Anwesenheit von Substrat auf der gegenüberliegenden Seite der Membran, was den Antiport

als Transport-Mechanismus etablierte (Elvin et al. 1985; Ambudkar et al. 1986).

Sekundäraktiven Transportern wird üblicherweise das mechanistische Modell zugeschrieben,

dass ihre Substratbindungsstelle durch eine Konformationsänderung des Proteins

abwechselnd auf der einen und auf der anderen Seite der Membran zugänglich ist. Dieses

Modell ist mit sämtlichen experimentellen Befunden zu GlpT sehr gut vereinbar. Die Affinität

der Bindungsstelle für seine Substrate ändert sich bei der Konformationsänderung nur

geringfügig, so dass von einer funktionalen Symmetrie ausgegangen werden kann (Lemieux

et al. 2004). Die Bindung des Substrats erniedrigt bei einem Antiporter die energetische

13

Barriere, die zwischen beiden Konformationen liegt, und erhöht so die Wahrscheinlichkeit des

Umschlagens der einen Konformation in die andere (Huang et al. 2003; Lemieux et al. 2004).

In der inneren Membran von E. coli bindet GlpT bevorzugt extrazelluläres G3P, da seine

Affinität für G3P größer ist als für Pi. Nach der Konformationsänderung wird G3P im Cytosol

durch Pi von der Substratbindungsstelle verdrängt, da Pi in wesentlich höheren

Konzentrationen als G3P vorliegt (Huang et al. 2003). Je größer die Konzentration von Pi im

Cytosol, desto größer die Transportrate für G3P, da die Konformationsänderung rascher

erfolgt. G3P wird im Cytosol von E. coli sehr effizient metabolisiert, so dass es auch bei

hohen Transportraten nicht akkumuliert und die Aufnahme weiteren G3Ps durch GlpT nicht

bremst. Wird extrazellulär viel mehr Pi als G3P vorgelegt, katalysiert GlpT die Aufnahme von

Pi (Xavier et al. 1995).

Trotz des gut etablierten phosphatneutralen G3P:Pi-Antiports kann den Zellen GlpT-

transportiertes G3P auch als einzige Phosphatquelle dienen; Xavier et al. sprechen für diesen

Fall von einem H+-Symport (Xavier et al. 1995). Ambudkar et al. (1986) und Maloney et al.

(1990) stellten ein Modell vor, nach dem mechanistischer Pi-Antiport thermodynamisch als

H+-Symport erscheint. Dieses Modell berücksichtigt, dass die Stöchiometrie des Antiports in

Abhängigkeit vom pH-Wert schwankt (Ambudkar et al. 1986).

(2) Die hoch aufgelöste 3.3-Angström-Röntgenstruktur eines Kristalls von GlpT ohne

gebundenes Substrat und in einer Konformation, in der die Bindungsstelle der cytosolischen

Seite zugewandt ist (Huang et al. 2003), bestätigte frühere Studien zur Topologie mit

topologischen Markern (Gött & Boos 1988; Fann et al. 2003). Der Transporter bildet eine

hockerförmige Struktur aus, die periplasmatisch kaum aus der Membran hervorragt, während

sich die zwölf unterschiedlich langen Helices, die die Transmembrandomänen bilden, leicht

nach außen gestellt und teilweise verbogen und umeinander verdrillt, ins Cytosol erstrecken.

Die Substratbindungsstelle liegt wahrscheinlich in einem hydrophilen Spalt zwischen der N-

und der C-terminalen Hälfte von GlpT und zeichnet sich durch ein positives elektrostatisches

Oberflächenpotenzial aus, was den bei physiologischem pH-Wert negativ geladenen

Substraten entspricht. Sie wird insbesondere von zwei Arginin-Resten in der ersten und

siebten Transmembrandomäne gebildet, die etwa auf halbem Weg vom Cytosol zum

Periplasma in der Mitte der Membran liegen. Zum Periplasma hin ist der Spalt durch die enge

Interaktion der ersten und siebten Transmembrandomäne mit ihren großen aromatischen

Seitenketten geschlossen.

Diese Struktur führte zu einer überzeugenden Konkretisierung des Transport-Modells. Die

Bindung von G3P an die Substratbindungsstelle über seine negativ geladene Phosphatgruppe

14

oder die Bindung von Pi würde mit der Ausbildung von Wasserstoffbrücken zu beiden

Arginin-Resten einhergehen. Dadurch würden die N- und C-terminalen Hälften dichter

zusammengezogen und in eine kompaktere, gespanntere Konformation versetzt. Da die

beteiligten Transmembrandomänen gebogen sind, könnte ein Zusammenziehen auf der

cytosolischen Seite ein Auseinanderklaffen auf der periplasmatischen Seite bewirken. Eine

Rotation der beiden Hälften um lediglich 10° würde dann den Weg des Substrats ins

Periplasma freigeben, während sich der Spalt auf der cytosolischen Seite durch einen Riegel

aus zwei Tryptophan-Resten schließen würde (Huang et al. 2003).

Von größter struktureller und funktionaler Ähnlichkeit zu GlpT ist Uhp (Uptake of Hexose

Phosphate). Bevorzugte Substrate sind Hexose-6-Phosphate. Der Austausch von G3P gegen

Pi wurde zunächst als möglich bezeichnet (Dietz 1976), von Ambudkar et al. aber nicht

bestätigt (1986). Maloney et al. erklären die Befunde von Dietz et al. mit der

periplasmatischen Umwandlung von G3P in Hexosephosphate (1990). In Proteoliposomen

bestimmten sie eine 30-fach höhere Michaeliskonstante für G3P als für G6P, was dagegen

spricht, dass Uhp G3P mit nennenswerten Raten transportiert (Maloney et al. 1990).

GlpT und UhpT von E. coli gehören zur SLC37-Familie der MFS. GlpT-Aktivität wurde bei

gram-negativen (Escherichia coli, Salmonella typhimurium) und gram-positiven (Bacillus

subtilis, Streptococcus lactis, Staphylococcus aureus) Bakterien nachgewiesen. Aufgrund von

Sequenzähnlichkeit wurde außerdem bei Proteobakterien (Haemophilus influenza) und

einigen Arten der Gattung Borrelia (Spirochaeten) ein GlpT-Gen identifiziert.

Im Gegensatz zu GlpT gehört der zweite G3P-Transporter von E. coli, Ugp (Uptake of

Glycerol 3-Phosphate), zur ABC-Superfamily. Solche Transporter sind Heterooligomere, die

kleine Moleküle oder Makromoleküle unter ATP-Hydrolyse – d. h. primäraktiv – über eine

Membran translozieren. Das Tetramer besteht aus einem periplasmatischen G3P-Rezeptor

(ugpB), zwei verschiedenen Transmembrandomänen (ugpA, ugpE) und einem cytosolischen

ATP-Bindeprotein (ugpC). Ugp gehört zum pho-Regulon und wird bei Phosphatmangel durch

den Aktivator PhoB verstärkt transkribiert (Argast & Boos 1980). Im Gegensatz zu GlpT

senkt intrazelluläres Phosphat die Transportrate. Eine steigende extrazelluläre Konzentration

von L-G3P bewirkt zwar eine Steigerung der Transportrate, allerdings ist die maximale

Transportrate bei kleineren L-G3P-Konzentrationen erreicht, als es bei GlpT der Fall ist.

Lediglich bei kleinen L-G3P-Konzentrationen und ausschließlich bei kleinen

Phosphatkonzentrationen auf der gegenüberliegenden Seite der Membran übersteigt die G3P-

Transportrate von Ugp die von GlpT, was auf die höhere Affinität von Ugp für L-G3P

zurückzuführen ist (Xavier et al. 1995).

15

1.1.3.2 Chloroplasten

Grüne Pflanzen transportieren im Zug der Photosynthese ein breites Spektrum

phosphorylierter Metabolite über die innere Hüllmembran grüner und nicht-grüner Plastiden.

Alle plastidären Phosphattransporter sind als Homodimere aktiv. Die Monomere können

keiner der großen Transporterklassen zugeordnet werden. Sie verfügen wahrscheinlich über

acht Transmembrandomänen, N- und C-Terminus liegen im Spalt zwischen innerer und

äußerer Hüllmembran (Weber et al. 2005). Kristallisation und hochaufgelöste Strukturanalyse

stehen noch aus. Trotz großer funktionaler Ähnlichkeit zu den Organophosphattransportern

der MFS ist keine Sequenzähnlichkeit vorhanden. Der plastidäre Triosephosphat-Phosphat-

Translokator (TPT) transportiert außer DHAP, GAP und 3-Phosphoglycerat, die bei der

Kohlenstoffdioxidfixierung entstehen, auch G3P. Zwar ist die Affinität des Transporters für

DHAP und 3-PGA größer als für G3P, seine Affinität für G3P übersteigt aber bei weitem die

Affinität für C3-Körper, die die Phosphorylierung am C2-Atom tragen sowie für Tetrose-,

Pentose- und Hexosephosphate, die nicht zum Substratspektrum zählen. Eine mittlere

Affinität hat der TPT gegenüber Pi und Arsenat. An isolierten Chloroplasten im Dunkeln

wurde mit verschiedenen Kombinationen radioaktiv markierter Substrate eine strenge

Kopplung von Import und Export festgestellt, verbunden mit der Fähigkeit, Substrat gegen

das Konzentrationsgefälle zu akkumulieren. Damit wurde gezeigt, dass der

Transportmechanismus wie bei GlpT ein Antiport ist, der nicht von einer primären

Energiequelle abhängt. In der Zelle erfolgt dabei die Aufnahme eines phosphorylierten C3-

Körpers ins Cytosol und die Abgabe von Pi ins Stroma. Die Transportraten sind so hoch, dass

kinetische Transportkonstanten lediglich bei 4 °C abgeleitet werden konnten (Fliege et al.

1978).

Wie bei GlpT erfolgt der Transport eines C3-Körpers mit Phosphorylierung am C3-Atom im

Antiport gegen Pi in einer Art und Weise, bei der die gemeinsame Bindungsstelle für beide

Substrate abwechselnd auf den beiden Seiten der Membran zugänglich ist und ein Substrat

den Transporter verlassen muss, ehe das andere binden kann. In jedem funktionalen Dimer

existiert eine einzige Bindungsstelle für die zweifach negativ geladenen phosphorylierten

Substrate, vermutlich repräsentiert durch die beiden positiv geladenen Aminosäurereste im

Transmembranbereich, Lysin und Arginin. Die Affinität der Bindungsstelle für die Substrate

3-PGA und Pi auf der Stroma-Seite der Membran ist nur ein Fünftel so groß wie auf der

cytosolischen Seite. Zudem inseriert der Transporter in Liposomen nur in einer bevorzugten

Orientierung (Flügge 1992). Diese funktionale Asymmetrie des Transporters könnte auf

unterschiedlichen Eigenschaften des Zugangs zur Substratbindungsstelle beruhen, der in

16

beiden Konformationen aus verschiedenen Bereichen des Proteins gebildet wird. Während des

Transports durchläuft der Transporter Konformationsänderungen, die als Rotationen sichtbar

gemacht wurden (Wagner et al. 1989).

Der TPT ist nur ein Vertreter der Familie der plastidären Phosphattransporter. Er kommt

ausschließlich in grünem Blattgewebe vor. Die Arbeitsteilung zwischen grünen und nicht-

grünen Pflanzenteilen sowie die Anpassungen des photosynthetischen Systems an

verschiedene äußere Bedingungen und ökologische Nischen gehen mit einer großen

Spezialisierung von Zellen und Organellen einher. Zwei weitere strukturell ähnliche

Transporter aus der Familie der plastidären Phosphattransporter, der Glucosephosphat-

Phosphat-Translokator (GPT), der in zwei Isoformen vorkommt, und der

Xylulosephosphat-Phosphat-Translokator (XPT), transportieren unter anderem auch

Triosephosphate, möglicherweise also auch G3P (Kammerer et al. 1998; Eicks et al. 2002).

1.1.3.3 Pilze

Der erste eukaryontische Transporter für Glycerophosphoinositol und verwandte Substrate,

der Glycerophosphoinositol-Transporter Git1p, wurde in S. cerevisiae nach chemischer

Mutagenese einer Inositol-auxotrophen Mutante entdeckt. 12 mutmaßliche

Transmembrandomänen und ein Zuckertransport-Motiv weisen ihn der MFS zu. Sein

Substratspektrum wurde analysiert, indem die Hemmung des hochaffinen

Glycerophosphoinositol-Transports durch einen 40-fachen molaren Überschuss verwandter

Substanzen bestimmt wurde. Während Inositol und Glycerol den Transport kaum behinderten,

hemmten andere deacylierte Glycerophospholipide und G3P abgestuft den Transport, am

stärksten die negativ geladenen. Kompetitive Hemmung vorausgesetzt, ist die Affinität von

Git1p für G3P etwa halb so groß wie für Glycerophosphoinositol. Wahrscheinlich katalysiert

der Transporter einen H+-Symport, da er durch Pi nicht kompetitiv gehemmt werden kann.

GIT1 wird in einer Phosphatmangel-Situation verstärkt transkribiert, dann können Hefen auf

Glycerophosphoinositol als einziger Phosphatquelle wachsen (Almaguer et al. 2004). Ist viel

Phosphat im Medium vorhanden, wird der Transporter endocytiert und in der Vakuole

degradiert (Almaguer et al. 2006).

Basierend auf DNA-Sequenzvergleichen erstellten Paulsen et al. ein Inventar etablierter und

mutmaßlicher Transporter unter allen ORFs im Genom von S. cerevisiae (Paulsen et al.

1998). Git1p bildet dabei zusammen mit dem hochaffinen Phosphat-Transporter Pho84p die

Familie der Phosphat-H+-Symporter innerhalb der MFS. Außerdem wurden drei ORFs als

Gene für mutmaßliche Triosephosphat-Translokatoren anhand ihrer Ähnlichkeit mit dem

pflanzlichen Triosephosphat-Translokator TPT benannt. Genprodukte von zweien dieser

17

ORFs sind bislang beschrieben. Eines davon, SLY41p, gehört nach wie vor zu einer

Transporterfamilie mit ansonsten ausschließlich pflanzlichen (plastidären) Homodimeren. Es

ist möglicherweise an der Transportmaschinerie des sekretorischen Weges vom ER zum

Golgi-Apparat beteiligt (Dascher et al. 1991), neuere Untersuchungen existieren nicht. Die

genaue Funktion des Proteins ist unbekannt. Die globalen Studien zur Expression und

Lokalisierung von Hefeproteinen ergaben 784 Moleküle pro Zelle (Ghaemmaghami et al.

2003) und eine Lokalisierung im ER (Huh et al. 2003). Ob der zweite ORF, YJL193w, ein

Protein codiert, ist unklar. Es existiert eine Ähnlichkeit zu SLY41. Die globale Studie zur

Expression von Hefeproteinen ergab keine Expression (Ghaemmaghami et al. 2003). Das

besagt allerdings nicht unbedingt, dass der ORF nicht transkribiert wird, denn auch für das

hochexprimierte Gen ADH1 fanden Ghaemmagami et al. keine Expression. Die mutmaßliche

Funktion des Genprodukts des dritten ORFs, YML038c, wird heute als Nucleotid-Zucker-

Transporter angegeben, der aktivierte Monosaccharide für die Glykosylierung von Proteinen

oder Lipiden in den Golgi-Apparat oder das ER transportieren könnte. Diese

Funktionszuweisung geschah, weil Lokalisierung und Funktion seines ähnlichsten

Verwandten, Vrg4p, mittlerweile etabliert sind (Dean et al. 1997; Abe et al. 1999). Die

globale Studie zur Lokalisierung von Hefeproteinen ergab eine Kolokalisierung mit COPI-

Vesikeln (Huh et al. 2003). Insgesamt ist es eher unwahrscheinlich, dass eines dieser

Transmembranproteine Triosephosphate transportiert.

Die Datenbank SGYD weist den Funktionen Glycerol-3-Phosphat-Transport, Glycerol-3-

Phosphat-Phosphat-Antiport bzw. Hexosephosphat-Phosphat-Antiport und Triosephosphat-

bzw. Hexosephosphat-Transport kein Gen von S. cerevisiae zu; GIT1 ist das einzige Gen, das

der Funktion „Transport eines organischen Anions“ zugeordnet wird

(http://db.yeastgenome.org, Stand 16.5.2006) und ist somit nach heutigem Kenntnisstand der

aussichtsreichste Kandidat für einen funktionalen G3P-Transporter bei S. cerevisiae.

1.1.3.4 Säugetiere

Unter den Zuckerphosphat-Transportern des Menschen mit Sequenzähnlichkeit zu GlpT ist

lediglich der Glucose-6-Phosphat-Transporter 1, das Genprodukt von SLC37A4, gut

charakterisiert. Er wird besonders stark in Leber, Niere und blutbildenden Zellen exprimiert

und lokalisiert dort im ER. G6P wird beim Glycogenabbau freigesetzt und bei der

Gluconeogenese gebildet. Da das katalytische Zentrum der Glucose-6-Phosphatase ins Lumen

des ER reicht, muss G6P zur Dephosphorylierung ins ER geschleust werden. Der Transporter

vermittelt einen G6P:Pi-Antiport. Sein Ausfall durch Mutation ruft das Krankheitsbild einer

Glycogenspeicherkrankheit hervor.

18

Dem Genprodukt von humanem SLC37A1 wurde die Funktion einer Glycerol-3-Phosphat-

Permease (G3PP) zugewiesen. Das Gen wird in verschiedenen Geweben exprimiert,

besonders stark in solchen mit Gluconeogenese-Aktivität. Es trägt eine mitochondriale

Signalsequenz und gehört daher möglicherweise zum Glycerol-3-Phosphat-Shuttle. G3P

entsteht beim Menschen durch Glycerolkinase (GK). Es wurde erwartet, dass eine Mutation

der G3PP ein ähnliches Krankheitsbild wie das einer GK-Insuffizienz hervorrufen sollte.

Doch keine klinisch relevante Störung konnte einer Mutation in diesem Gen zugewiesen

werden. Außerdem existiert noch kein Knockout-Modell der Maus für

Funktionsuntersuchungen (Bartoloni & Antonarakis 2004).

Der Transporter PepT1 (SLC15a1) hat Sequenzähnlichkeiten mit GlpT und LacY (Meredith

& Price 2006). Er ist an der Resorption von Di- und Tripeptiden aus dem Dünndarm und dem

Primärharn in der Niere beteiligt. Der Transportmechanismus ist ein H+-Symport. Da sich

seine Substrate stark von G3P und Triosephosphaten unterscheiden, ist eine entsprechende

Transportaktivität unwahrscheinlich.

1.2 Biotechnologische Produktion von L-Glycerol-3-Phosphat (L-G3P) mit

Saccharomyces cerevisiae: Motivation und Stand der Technik

Zucker und ihre Derivate spielen in vielen biologischen, darunter medizinisch relevanten

Prozessen eine entscheidende Rolle. Die Synthese von definierten Kohlenhydraten ist die

Voraussetzung, um sie als Diagnostika und Therapeutika nutzen zu können. Die enzymatische

Synthese organischer Moleküle ist immer dann der chemischen überlegen, wenn stabile regio-

und stereospezifische Enzyme sowie die benötigten Substrate in ausreichender Menge zur

Verfügung stehen. Im Fall der DHAP-abhängigen Aldolasen, die C-C-Bindungen zwischen

einem Akzeptor-Aldehyd und DHAP knüpfen, sind alle für die vier möglichen

Konformationen (Stellung der Hydroxylgruppen) am C3-C4-Atom benötigten Enzyme

bekannt. Aus über 100 verschiedenen Akzeptor-Aldehyden wurden mit diesen vier Aldolasen

Monosaccharide und ihre Derivate produziert. Der obligate C3-Donor für alle diese

Reaktionen ist DHAP, nur einzelne DHAP-Analoga konnten mit geringer Effizienz eingesetzt

werden (Takayama et al. 1997). Da die Aldolasen in Mikroorganismen produziert werden

können, begrenzt in erster Linie die Verfügbarkeit des Substrates DHAP die Anwendung

dieser Enzymklasse. Es stehen weder mikrobielle noch enzymatische, aber auch keine

rationellen chemischen Verfahren zur Verfügung, welche die Nachfrage decken könnten.

Wolf-Dieter Fessner ist es gelungen, ein Verfahren zu entwickeln, bei dem anstelle von

DHAP das wesentlich stabilere L-Enantiomer von G3P für die Aldolasereaktionen eingesetzt

19

wird (Abb. 1.2). Aus L-G3P und den entsprechenden Akzeptor-Aldehyden konnten in Single-

pot-Reaktionen beispielsweise 13C-markierte D-Fructose-1,6-Bisphosphat, D-Xylulose-1-

Phosphat, D-Ribulose-1-Phosphat, L-Fructose-1-Phosphat und L-Fructose produziert werden

(Fessner 1997). Indem L-G3P durch diesen Prozess als Baustein für die enzymatische

Synthese hunderter Monosaccharide verwendet werden kann, steigt der Bedarf weit über den

einer einzelnen Feinchemikalie. Eine zusätzliche mögliche Anwendung von L-G3P ist die

enzymatische Synthese von Glycerophospholipiden.

R

OOH

OH OPO32-

R

OOH

OH OPO32-

R

OOH

OH OPO32-

R

OOH

OH OPO32-

O

OH OPO32-

OH

OH OPO32-

+RCHO

O2H2O2

1/2 O2

O2OH2 +

+

GPO

Katalase

FruA

RhuA

FucA

TagAL-G3P DHAP

Abb. 1.2. Prozess zur enzymatischen Synthese von Monosacchariden und ihren Derivaten aus L-G3P und passenden Akzeptor-Aldehyden in Single-pot-Reaktionen von Wolf-Dieter Fessner (1997, US-Patent 5.683.897). Die eingesetzte Aldolase bestimmt die Konformation an der neu geknüpften C3-C4-Bindung.

Abkürzungen: DHAP: Dihydroxyacetonphosphat, FruA: Fructose-1,6-Bisphosphat-Aldolase, FucA: Fuculose-1-Phosphat-Aldolase, GPO: Glycerophosphat-Oxidase, L-G3P: L-Glycerol-3-Phosphat, RCHO: beliebiges Akzeptor-Aldehyd, RhuA: Rhamnulose-1-Phosphat-Aldolase, TagA: Tagatose-1,6-Bisphosphat-Aldolase.

Chemische und enzymatische Produktionsverfahren für L-G3P weisen erhebliche Nachteile

auf, wie bei Nguyen et al. zusammengefasst (2004). Derzeit gibt es kein Verfahren, mit dem

diese Substanz zu einem günstigen Preis produziert werden kann.

L-G3P ist ein Zwischenprodukt der Glycerolbiosynthese. Die Bäckerhefe S. cerevisiae ist ein

Organismus, bei dem dieser Stoffwechselweg einen Hauptweg des Kohlenstoffflusses

darstellt. Er wurde bereits auf verschiedene Weise erfolgreich künstlich verstärkt, wie in

Überblicksdarstellungen zusammengefasst (Bakker et al. 2001; Overkamp et al. 2002; Kern et

20

al. 2007) (Abb. 1.3). Daher bietet sich eine fermentative Produktion von L-G3P, dem

unmittelbaren Vorläufer von Glycerol, mit S. cerevisiae an. Diese Hefe ist zudem ein

etablierter und sicher zu handhabender Produktionsorganismus (GRAS (Generally

Recognized As Safe)-Status), von dem zahlreiche Industriestämme mit hoher

Prozessrobustheit existieren.

Glucose

GAP

Ethanol

NADHNAD

DHAP

Glycerol

NADH

NAD

PDC1/2/5/6

GPP1/2

GPD1/2

NADHNAD

NDE1/2FBP

GUT2NADHNAD

Mitochondrium

TPI1

ADH1

Pyruvat

Acetaldehyd

L-G3P

Acetat

Formiat CO2

NADHNAD

FDH1/2

ALD4/5/6

NAD(P)NAD(P)H

Glucose

GAP

Ethanol

NADHNAD

DHAP

Glycerol

NADH

NAD

PDC1/2/5/6

GPP1/2

GPD1/2

NADHNAD

NDE1/2FBP

GUT2NADHNAD

Mitochondrium

TPI1

ADH1

Pyruvat

Acetaldehyd

L-G3P

Acetat

Formiat CO2

NADHNAD

FDH1/2

ALD4/5/6

NAD(P)NAD(P)H

Abb. 1.3. Ausschnitt aus dem Stoffwechsel von S. cerevisiae. Gezeigt sind Metabolite, Gene und Redoxfaktoren, die in den derzeit publizierten Strategien zur Steigerung der Glycerolbiosynthese von Bedeutung sind.

Abkürzungen: ADH1: Alkoholdehydrogenase, ALD4/5/6: cytosolische und mitochondriale Acetaldehyd-Dehydrogenase, DHAP: Dihydroxyacetonphosphat, FBP: Fructose-1,6-Bisphosphat, FDH1/2: Formiatdehydrogenase, GAP: Glycerolaldehyd-3-Phosphat, GPD1/2: cytosolische Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase, GPP1/2: Glycerol-3-Phosphatase, GUT2: mitochondriale Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase, L-G3P: L-Glycerol-3-Phosphat, NAD(H): oxidierte und reduzierte Form von Nicotinamidadenindinucleotid, NADP(H): oxidierte und reduzierte Form von Nicotinamidadenindinucleotidphosphat, NDE1/2: Externe mitochondriale NADH-Dehydrogenase, PDC1/2/5/6: Pyruvatdecarboxylase, TPI1 Triosephosphat-Isomerase.

Zur Steigerung der Glycerolproduktion wurde im letzten Jahrhundert Bisulfit zu gärenden

Hefezellen gegeben. Dieser Prozess wurde unter dem Namen Neuberg-Gärung bekannt

(Neuberg & Reinfurth 1918). Bisulfit bildet dabei einen Komplex mit Acetaldehyd und

entzieht so der Zelle den Akzeptor für das glykolytische Reduktionsäquivalent NADH. Bei

21

der alkoholischen Gärung wird NAD während der Reduktion von Acetaldehyd regeneriert

und so das Redoxgleichgewicht hergestellt. Beim Neuberg-Prozess akkumuliert NADH im

Cytosol, worauf S. cerevisiae mit verstärkter Glycerolbiosynthese reagiert. Dabei wird

alternativ zur alkoholischen Gärung NAD regeneriert und das Reduktionsäquivalent auf

DHAP übertragen. Bei diesem Schritt entsteht L-G3P, das anschließend zu Glycerol

dephosphoryliert wird.

Im Rahmen der Erhöhung der Glycerolproduktion auf gentechnischem Weg, d. h. durch

Metabolic Engineering, wurde der Neuberg-Prozess mit zwei unterschiedlichen Strategien

nachgeahmt: mit einer Verminderung der Aktivität der Pyruvatdecarboxylase (PDC: ∆pdc2

(Nevoigt & Stahl 1996), ∆pdc1 (Remize et al. 2000)), was einer Verringerung des

Acetaldehydspiegels entspricht, oder mit einer Verminderung der Aktivität der

Alkoholdehydrogenase (ADH: ∆adh1, (Johansson & Sjöström 1984; Cordier et al. 2007),

∆adh1/2/3/4 (Drewke et al. 1990)), was den NADH-konsumierenden Schritt der

alkoholischen Gärung langsamer ablaufen lässt und dadurch einen erhöhten NADH-Spiegel

im Cytosol bewirkt. Beide Gruppen von Hefe-Mutanten erlangten jedoch keine industrielle

Relevanz, da sie eine niedrige Glycerolproduktivität zeigen (Overkamp et al. 2002).

Der Glycerolbiosynthese-Weg hat für die Hefe mindestens drei Funktionen: 1. Er dient der

Aufrechterhaltung des Redoxgleichgewichts während des Wachstums und ist insbesondere

unter anaeroben Bedingungen der einzige Weg, auf dem Reduktionsäquivalente, die bei der

Produktion von Biomasse und Carbonsäuren (beispielsweise Acetat) anfallen, regeneriert

werden können (Ansell et al. 1997; Björkqvist et al. 1997; Valadi et al. 2004). 2. Er stellt

Glycerol als eine Schutzsubstanz her, die das Überleben der Zelle in verschiedenen

Stresssituationen wie hohe Salz-, Citrat- oder Ethanolkonzentration, oxidativer Stress

(Nevoigt & Stahl 1996, Pahlmann et al. 2001), Hitzeschock, erhöhte Temperatur oder Kälte

(Izawa et al. 2004; Panadero et al. 2006), ermöglicht. 3. Er stellt L-G3P als Ausgangsbaustein

für die Synthese von Glycerophospholipiden und Triacylglycerolen bereit. Unter anaeroben

Bedingungen wird die Transkription des Isogens GPD2 für die cytosolische Glycerol-3-

Phosphat-Dehydrogenase (GPD) verstärkt (Ansell et al. 1997). Die rasche und effiziente

Reaktion der Zellen auf Stresssituationen wird durch den HOG-Signalweg (High Osmolarity

Glycerol) ausgelöst und wirkt auf die Transkription des Isogens GPD1 (Albertyn et al. 1994;

Wojda et al. 2003; O'Rourke & Herskowitz 2004).

Ansätze des Metabolic Engineering, die dieses Wissen darüber, wie S. cerevisiae selbst die

Glycerolbiosynthese reguliert, berücksichtigten, waren zunächst erfolgreicher als die

gentechnische Imitation des Neuberg-Prozesses. Eine Steigerung der Aktivität der GPD auf

22

gentechnischem Weg beschleunigte die Glycerolbiosynthese auf Kosten der alkoholischen

Gärung (Nevoigt & Stahl 1996). Derart modifizierte Hefe-Stämme bilden allerdings zugleich

mehr Acetat (Remize et al. 1999). Die zusätzliche Verminderung der Aktivität der

cytosolischen Acetaldehyd-Dehydrogenase (∆ald6) verminderte nicht nur die Produktion von

Acetat, sondern steigerte auch die Glycerolproduktion (Remize et al. 2000; Eglinton et al.

2002). Eine gentechnische Deregulation der GPD ist für die Glycerolproduktion so lange

förderlich, bis cytosolisches NADH limitierend wird. Der praktische Erfolg des Neuberg-

Prozesses könnte außer auf dem oben beschriebenen redoxbasierten Mechanismus auch auf

einer Induktion der GPD beruhen, da die Zellen durch die Zugabe von Sulfit einem hohen

Salzstress ausgesetzt sind.

Die theoretische Bilanz des Neuberg-Prozesses bei nicht-wachsenden Zellen beträgt 1 mol

Glycerol, 1 mol des Acetaldehyd-Sulfit-Komplexes und 1 mol CO2 pro mol Glucose.

Praktisch werden jedoch stets zusätzlich Ethanol, Biomasse und Acetat gebildet. Da die

Stöchiometrie von 1 mol Glycerol/mol Glucose durch Optimierung von

Fermentationsbedingungen nicht zu erreichen war, wurde angestrebt, sie auf gentechnischem

Weg herzustellen. Dazu wurde die Triosephosphat-Isomerase (TPI) ausgeschaltet. In einer

solchen Mutante wird der Kohlenstofffluss der Glykolyse durch die Aldolase-Reaktion zu

gleichen Teilen auf die NADH-konsumierende Glycerolbiosynthese und die NADH- und

ATP-bildende Synthese und Veratmung von Pyruvat aufgeteilt (∆tpi1 (Compagno et al. 2001;

Overkamp et al. 2002)). Dieser Stamm wächst jedoch nicht auf Glucose.

Ein Teil der metabolischen Störungen, die mit der Ausschaltung der TPI, der ADH oder der

PDC einhergehen, wurden zwischenzeitlich aufgedeckt. Teilweise konnten sie auf rationalem

Weg, teilweise durch Evolutionary Engineering gemildert werden.

Glucoselimitation und aerobe Bedingungen sind die Voraussetzungen für die Stöchiometrie

von 1 mol Glycerol/mol Glucose in der ∆tpi1-Mutante. Unter diesen Bedingungen

konkurrierten jedoch mitochondriale Dehydrogenasen erfolgreich mit der GPD um

cytosolisches NADH, was nicht nur die Glycerolbilanz schmälerte, sondern vor allem zu einer

toxischen Akkumulation von DHAP führte. Ausschaltung der externen mitochondrialen

NADH-Dehydrogenasen ergab den Stamm ∆tpi1∆nde1/2∆gut2, der während des Wachstums

0,83 mol Glycerol/mol Glucose produzierte. Seine maximale Wachstumsrate auf 5 % Glucose

betrug nur noch 12 % des Wildtyps (Overkamp et al. 2002). Eine weitere ungünstige

Eigenschaft war seine Sensitivität gegenüber höheren Glucose-Konzentrationen. Dies konnte

durch Evolutionary Engineering verbessert und die Ausbeute auf 0,9 mol Glycerol/mol

Glucose gesteigert werden.

23

Effektiver als die Ausschaltung der mitochondrialen Dehydrogenasen war die Überexpression

von GPD1 in einer ∆tpi1-Mutante: Der intrazelluläre Spiegel von DHAP wurde erfolgreich

reduziert und das Wachstum auf Glucose ermöglicht. In Kombination mit der Verringerung

der Aktivität der cytosolischen Alkoholdehydrogenase wurden 0,9 mol Glycerol/mol Glucose

mit wachsenden Zellen des Stammes ∆tpi1∆adh1 mit Überexpression von GPD1 und ALD3

erreicht, wobei angemerkt werden soll, dass Ald3p cytosolisches Acetaldehyd nicht oxidierte

(Cordier et al. 2007). Hier führte rein rationales Vorgehen zum Erfolg. Die maximale

Wachstumsrate des Stammes auf 2 % Glucose betrug noch 20 % des Wildtyps.

Die höchste Ausbeute wurde auf der Basis einer pdc-Mutante erzielt. In diesem Fall stand das

Evolutionary Engineering am Beginn des Vorhabens, so dass mit einem Stamm mit

vollständig ausgeschalteter Pyruvat-Decarboxylase gearbeitet werden konnte, der dennoch

hohe Glucosekonzentrationen tolerierte und nicht auf Acetat-Fütterung angewiesen war. Wie

bei Overkamp et al. (2002) wurden zusätzlich externe mitochondriale NADH-

Dehydrogenasen ausgeschaltet. Durch Formiat-Fütterung wurde eine externe NADH-Quelle

bereitgestellt, wodurch eine theoretische Ausbeute von 1,6 mol Glycerol/mol Glucose

ermöglicht wurde. Der Stamm ∆pdc1/5/6∆nde1/2∆gut2 mit Überexpression von FDH1,

einem Isogen für die NAD-abhängige Formiatdehydrogenase, lieferte 1,08 mol Glycerol/mol

Glucose (Geertman et al. 2006). Wahrscheinlich wurde durch die Batch-Kultur in 10 %

Glucose zusätzlich die GPD induziert.

Alle Ansätze, die zu einer Erhöhung der Glycerolproduktion führen, können prinzipiell auch

für die Produktion von L-G3P genutzt werden, wenn die Dephosphorylierung zu Glycerol

unterbunden wird. Allerdings unterscheidet sich die Produktion von G3P in einem Punkt

erheblich von der Glycerolproduktion: Anders als Glycerol trägt L-G3P eine Phosphatgruppe,

so dass zu erwarten ist, dass es von der Plasmamembran im Zellinnern zurückgehalten wird.

Da das Fließgleichgewicht von L-G3P im Cytosol natürlicherweise durch die effiziente

Dephosphorylierung durch die spezifische Glycerol-3-Phosphatase sehr niedrig ist, können

die Auswirkungen intrazellulärer L-G3P-Akkumulation auf die Physiologie der Hefe nicht

prognostiziert werden. Eine künstlich erhöhte intrazelluläre Konzentration von L-G3P könnte

über die Rückreaktion von G3P zu DHAP oder über anderweitige negative Rückkopplung den

Fluss durch den Glycerolbiosynthese-Weg vermindern. Die Akkumulation von L-G3P könnte

außerdem zu einem Mangel an intrazellulärem Phosphat führen oder für die Zelle toxisch

sein, beispielsweise durch eine Deregulation der Lipidsynthese. Es liegt daher nicht auf der

Hand, ob ein solches phosphoryliertes Stoffwechselzwischenprodukt angestaut und auf

fermentativem Weg ökonomisch sinnvoll produziert werden kann.

24

Den prinzipiellen Beweis für die Möglichkeit der fermentativen L-G3P-Produktion mit

S. cerevisiae erbrachten Nguyen et al. (2004). Ausgangspunkt der Konstruktion von L-G3P-

Produktionsstämmen war die Deletion der beiden Isogene für die spezifische Glycerol-3-

Phosphatase, GPP1 und GPP2. Diese Maßnahme, die für sich genommen eine intrazelluäre

Akkumulation von L-G3P nach sich zog (Pahlman et al. 2001; Nguyen et al. 2004) wurde

kombiniert mit einer Steigerung des Kohlenstoffflusses durch den Glycerolbiosynthese-Weg,

indem das Isogen GPD1 für die cytosolische Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase

überexprimiert wurde. Nguyen et al. stellten außerdem durch eine Verringerung des Flusses

durch den letzten Schritt der alkoholischen Gärung (∆pdc2) mehr NADH für den GPD-

abhängigen Reaktionsschritt bereit. Die intrazelluläre L-G3P-Konzentration wurde durch

diese Maßnahmen insgesamt auf das 100-fache der Ausgangssituation im Wildtyp gesteigert

(17 mg L-G3P pro g Hefetrockenmasse, Abb. 1.4). Der maximale Produkttiter war mit 13 mg

L-G3P pro Liter Kultur aber relativ niedrig. Als Ursachen dafür wurden erheblich

beeinträchtigtes anaerobes Wachstum der Produktionsstämme, niedrige absolute Zelldichten

und die intrazelluläre Akkumulation des Produkts angesehen.

Stämme mit Deletion des PDC2-Gens zeigten stark beeinträchtigtes Wachstum. Der Stamm

∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 ist darum aussichtsreicher für die fermentative

L-G3P-Produktion. Dieser Stamm stellt einen guten Kompromiss dar, indem er 65 % des

L-G3Ps des Stammes ∆gpp1/2∆pdc2 mit Überexpression von GPD1 akkumulierte (bezogen

auf die Trockenmasse), anders als dieser in Glucose jedoch relativ gut wuchs. Seine maximale

spezifische Wachstumsrate in aerober Batch-Fermentation betrug noch 73 % des Wildtyps.

Im Unterschied zu diesem akkumulierte er aber 11 mg L-G3P/g Hefetrockenmasse (Nguyen

et al. 2004). So steht ein Stamm zur Verfügung, der L-G3P akkumuliert und dabei eine

höhere spezifische Wachstumsrate auf Glucose aufweist als die glycerolproduzierenden

Stämme von Overkamp et al., Geertman et al. und Cordier et al. (2002, 2006, 2007). Zudem

wurde dieser Stamm auf rein rationalem Weg konstruiert und umfasst keinen Schritt des

Evolutionary Engineering, so dass sämtliche genetische Veränderungen bekannt sind und in

die Auswertung einbezogen werden können.

25

0 5 10 15 20

mg L-G3P/g Hefetrockenmasse

Ausgangssituation(Wildtyp)

Metabolic engineering(∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1)

Sauerstofflimitierung(∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1)

Metabolic engineering(∆gpp1/2/∆pdc2 mit Überexpression von GPD1)

0 5 10 15 20


0 5 10 15 20


Ausgangssituation(Wildtyp)

Metabolic engineering(∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1)

Sauerstofflimitierung(∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1)

Metabolic engineering(∆gpp1/2/∆pdc2 mit Überexpression von GPD1)

Abb. 1.4. Mikrobielle Produktion von L-G3P mit S. cerevisiae – Stand der Technik (Nguyen et al. 2004). Gentechnische Eingriffe bzw. die Anpassung der Kulturbedingungen und die erreichte intrazelluläre Akkumulation von L-G3P sind einander gegenüber gestellt.

Die Hefezellen wurden nach 6-stündiger Fermentation von 2 % Glucose, d. h. während des logarithmischen Wachstums, geerntet. Der Stoffwechsel wurde mit eiskaltem Methanol gequencht. L-G3P wurde anschließend mit einem Gemisch aus Ethanol, Chloroform und Formiat extrahiert und enzymatisch bestimmt. Die Extraktionsmethode unterscheidet sich von der der vorliegenden Arbeit (vgl. 2.2.4).

An dieser Stelle soll noch auf einen weiteren Aspekt aufmerksam gemacht werden, der für

diese Arbeit von Bedeutung ist. Nguyen et al. detektierten Spuren von extrazellulärem L-G3P,

wenn die Zellen mindestens 24 h lang in anaerober Batch-Kultur gehalten wurden. Unter

diesen Bedingungen war ein nicht zu vernachlässigender Teil der Zellen autolysiert. Es wurde

daher angenommen, dass diese geringen Mengen extrazellulären L-G3Ps aus toten Zellen

freigesetzt worden waren. Das Postulat, wonach lebende Hefezellen L-G3P nicht freisetzen

sollten, erhielt somit eine vorläufige experimentelle Bestätigung.

1.3 Problemstellung

Das Ziel der vorliegenden Arbeit besteht darin, die fermentative Produktion des

phosphorylierten Stoffwechselzwischenproduktes L-Glycerol-3-Phosphat (L-G3P) mit dem

Stamm S. cerevisiae ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 zu verbessern. Dieser Stamm

hat bereits in kleinformatigen Batch-Fermentationen gezeigt, dass er auf Glucose als einziger

C-Quelle wächst und gleichzeitig intrazellulär L-G3P akkumuliert. Allerdings wurde lediglich

ein geringer Produkttiter von 13 mg/l erzielt, was darauf zurückgeführt wurde, dass 1. nur

geringe Zelldichten erreicht wurden und 2. das Produkt in den Zellen festgehalten wurde.

26

Mehr Wissen über die Auswirkungen der L-G3P-Akkumulation auf den Zellstoffwechsel und

über die Bedingungen, die über das Ausmaß der L-G3P-Akkumulation entscheiden, ist

notwendig, um die Fermentationsparameter zukünftig an die Bedürfnisse des

Produktionsstammes anzupassen. Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit dieser

Fragestellung. Der zweite Teil der Arbeit umfasst das Vorhaben, den vorliegenden

Produktionsstamm so zu verändern, dass er L-G3P selektiv und kontinuierlich aus lebenden

Zellen ausscheidet. Das würde die Belastung des Zellstoffwechsels durch akkumuliertes

L-G3P verringern und verspricht eine höhere Produktion bezogen auf die Biomasse und ein

erleichtertes Downstream-Processing.

1. Fed-Batch-Fermentationen sollen im 2 Liter-Maßstab unter Bedingungen durchgeführt

werden, unter denen die Zellen über einen längeren Zeitraum lebensfähig und

stoffwechselaktiv sind. Anhand von Zeitkurven der Produktion von L-G3P, Biomasse und

anderen Fermentationsprodukten kann die Physiologie des Stammes hinsichtlich

produktionsrelevanter Eigenschaften beschrieben werden. Insbesondere ist von Interesse, ob

L-G3P wachstumsgekoppelt produziert wird. Letztlich sollen Fermentationsbedingungen

gefunden werden, unter denen der Stamm gleichzeitig eine hohe Biomasseproduktion und

eine hohe L-G3P-Produktion erreicht.

2. Der Produktionsstamm soll mit einem Transporter ausgestattet werden, der in der Lage ist,

intrazellulär akkumuliertes L-G3P zu exportieren. Von den bekannten L-G3P-

transportierenden Membranproteinen soll ein geeignetes ausgewählt und seine kodierende

DNA-Sequenz in einen Hefeexpressionsvektor kloniert werden. Um seine Expression und

Lokalisierung im Western Blot und mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie verfolgen zu

können, soll es mit einem c-Myc-Epitop versehen werden.

1.4 Auswahl eines G3P-Transporters für das Metabolic Engineering von

Saccharomyces cerevisiae zur Freisetzung von akkumuliertem L-G3P

Will man S. cerevisiae die Eigenschaft verleihen, L-G3P selektiv und kontinuierlich über die

Plasmamembran zu exportieren, stehen spezifische Transporter aus verschiedenen

Organismen zur Verfügung (vgl. 1.1.3). Bei der Auswahl gilt es, zwei Kriterien zu

berücksichtigen:

1. Ist die Transportrichtung umkehrbar und ist eine hinreichende Transportrate zu erwarten?

Wie bereits diskutiert (vgl. 1.1.1–1.1.2), ist zwar der Import von G3P für den Organismus

sinnvoll, nicht aber der Export. Umkehrbar scheint am ehesten die Transportrichtung des

sekundäraktiven Glycerol-3-Phosphat-Transporters GlpT, da sie vom

27

Konzentrationsverhältnis der beiden Substrate G3P und Pi zu beiden Seiten der Membran

abhängt und es trotz intensiver Forschung keine Hinweise auf funktionale Asymmetrie gibt.

Die Affinität von GlpT für G3P ist größer als für Pi, was garantiert, dass G3P bevorzugt

transportiert wird. Die Affinität des Transporters ist wiederum nicht so groß wie für das

unnatürliche Substrat G2P, so dass eine hinreichend große Transportgeschwindigkeit zu

erwarten ist. Die Geschwindigkeit des G3P-Exports kann gesteigert werden, indem im

Medium hohe Konzentrationen an Pi vorliegen. Dies ist eine Bedingung, die sich leicht

realisieren lässt, da Standard-Hefemedien mit Phosphat gepuffert sind. Insgesamt ist

anzunehmen, dass GlpT in der Plasmamembran eines G3P-akkumulierenden Hefestammes

G3P in ein phosphatreiches Medium freisetzen würde (Abb. 1.5).

extraintra

Pi G3P

A B C D

extraintra extraintra

Pi G3P

A B C DD

Abb. 1.5. Schematische Darstellung des L-G3P-Transports durch den L-G3P:Pi-Antiporter GlpT von E. coli. Die Konzentration der Substrate L-G3P (Karo-Schraffur) und Pi (wellenförmige Schraffur) zu beiden Seiten der Zellmembran ist qualitativ durch die Fläche der Felder angezeigt. Transportraten für G3P (durchgezogener Pfeil) und Pi (gestrichelter Pfeil) sind qualitativ durch die Dicke der Pfeile dargestellt.

A, B Initiale Transportraten V, wie sie von Xavier et al. (1995) bei unterschiedlichen intrazellulären Pi-Konzentrationen bei E. coli bestimmt wurden. A: [Pi] intra<1 mM, [G3P]extra=1 mM, V=5,5 nmol/min/109 Zellen. B: [Pi] intra=10 mM, [G3P]extra=1 mM, V=105 nmol/min/109 Zellen.

C Hypothetische Transportraten, wie sie ausgehend von B zu einem späteren Zeitpunkt zu erwarten sind. Das große negativ auswärts gerichtete Konzentrationsgefälle von Pi über die Zellmembran hat zu einer Akkumulation von L-G3P im Zellinnern geführt.

D Hypothetische Transportrichtungen und -raten in einem S. cerevisiae-Stamm, der intrazellulär L-G3P akkumuliert. L-G3P wird in Richtung seines Konzentrationsgefälles von innen nach außen transportiert. Eine hohe extrazelluläre Pi-Konzentration gewährleistet den Antiport.

28

Der bakterielle Glycerol-3-Phosphat-Transporter Ugp ist hingegen ein ABC-Transporter, eine

Umkehrung der Transportrichtung ist damit ausgeschlossen.

Die Verhältnisse bezüglich der Umkehrbarkeit der Transportrichtung für den plastidären

Triosephosphat-Phosphat-Translokator TPT sind weniger klar. Einerseits sollte seine

Transportrichtung lediglich von der Konzentration der Substrate abhängig sein, da er wie

GlpT ein sekundäraktiver Antiporter ist. Andererseits hat er asymmetrische Eigenschaften,

unter anderem weist seine Substratbindungsstelle in den beiden Konformationen verschiedene

Affinitäten für die Substrate auf. Seine Transporteigenschaften in einem nicht-nativen

Kontext können daher nicht prognostiziert werden.

Dass die Aufnahme von Glycerophosphoinositol durch den Glycerophosphoinositol-

Transporter Git1p in S. cerevisiae durch G3P stark gehemmt wird, ist ein deutlicher Hinweis

darauf, dass G3P zu den Substraten von Git1p gehört, der Beweis steht allerdings noch aus.

Negativ zu bewerten ist der Transportmechanismus, ein H+-Symport, da die Lebensvorgänge

von Hefe von einem ausgeprägten auswärtsgerichteten Protonengradienten abhängen. Die

Translozierung eines Protons über die Plasmamembran gegen das Konzentrationsgefälle

spricht gegen die Umkehrbarkeit der Transportrichtung.

2. Wird der Transporter funktional in S. cerevisiae exprimiert?

Die heterologe Expression eines Transmembranproteins in der Plasmamembran ist stets eine

Herausforderung, so dass unter diesem Gesichtspunkt dem Hefe-Transporter Git1p der

Vorzug gegeben werden müsste.

Plastidärer Triosephosphat-Phosphat-Translokator TPT, von dem die N-terminale

Signalsequenz für den Chloroplasten bereits entfernt worden war, blieb in Hefe in

Endomembranen, dem ER und/oder Mitochondrien, stecken und erreichte die

Plasmamembran nicht (Loddenkötter et al. 1993).

Der bakterielle Transporter GlpT wurde in S. cerevisiae noch nicht exprimiert. Für die

erfolgreiche funktionale Expression bakterieller Transmembranproteine in Hefe gibt es

allerdings nur wenige Beispiele, darunter den Glycerol-Facilitator von E. coli, GlpF (Bill et

al. 2001). Da bakterielle Transmembranproteine für die Rekonstitution oder Strukturanalyse

im Allgemeinen einfach und kostensparend in Bakterien überexprimiert werden können

(Saidijam et al. 2005), besteht wenig Anlass für entsprechende Versuche. Für die funktionale

Exprimierbarkeit von GlpT spricht, dass er als Monomer aktiv ist und Hefe strukturell

ähnliche Zuckertransporter aus der MFS aufweist. Aufgrund der Datenlage (zusammengefasst

in Tab. 1.1) ist GlpT aus E. coli somit der aussichtsreichste Transporter, um nach heterologer

Expression akkumuliertes L-G3P aus Hefezellen zu schleusen.

29

Tab. 1.1 Eigenschaften bekannter Transportproteine, die spezifisch oder unspezifisch G3P transportieren: biologische Aktivität, Transportmechanismus und Proteinstruktur.

E. coli GlpT E. coli Ugp Spinacia oleracea cTPT

S. cerevisiae Git1p

Aufnahme von G3P aus dem Periplasma

Aufnahme von G3P und Glycerophospho-diestern aus dem Periplasma

Aufnahme von Triosephosphaten aus dem Chloroplasten

Aufnahme von Glycerophospho-inositol

Antiport gegen cytosolisches Pi

ATP-Hydrolyse Antiport gegen cytosolisches Pi

H+-Symport

Monomer

12 TMD

Heterotetramer Homodimer

2x 8 TMD

Monomer

12 TMD

30

2. Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Primer

Einzelstrang-Oligonucleotide wurden von der Firma metabion GmbH (Martinsried)

synthetisiert.

Amplifizieren der Expressionskassetten für GlpT aus genomischer DNA von E. coli

A5-GlpT-myc-fw 5’-CGGAAGATCTAAAAATGTCTACGCGTGCCCTCGAGTTGAGTATTTTTAAACCAGCGCCACACAAAGC-3’

A5-GlpT-myc-re 5’-GCGGGGTACCTTACAAGTCTTCTTCAGAGATCAACTTTTGTTCGCCTCCGTTGCGTTCTTGC-3’

A5-myc-GlpT-fw 5’-CGGAAGATCTAAAAATGTCTGAACAAAAGTTGATCTCTGAAGAAGACTTGACGCGTGCCCTCGAGTTGAGTATTTTTAAACCAGCGCCACACAAAGC-3’

A5-myc-GlpT-re 5’-GCGGGGTACCTTAGCCTCCGTTGCGTTCTTGC-3’

Sequenzieren von Inserten in pFLAT1 durch Primer Walking

pFlat1-188up 5’-CTTCCAGTTACTTGAATTTGA-3’

Template für die DIG-markierte Sonde für den Northern Blot

GlpT-northern-Fwd 5’-CGCCGTGTGGTCGTACTATGGT-3’

GlpT-northern-Rev (mit T7-Promoter)

5’-CTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCATAAAGGAAGTAGGCCCAGGA-3’

Amplifizieren von Abschnitten von STE2 zur homologen Rekombination in den Hefe-Expressionsvektor pFLAT1-GlpT-Myc

HR-ste2p3A-fw 5’-CAAGGAATTCGAGCTAAGCGGCCGCAAAGATCTAATGTCTGATGCGGCTCCTTCATTGAGCAATCTA-3’

HR-ste2p(79)3A-rv 5’-GTAAGCGCGCTTTGTGTGGCGCTGGTTTAAAAATACTCAAATGGTGATGGTGATGGTGCGGCGTTTTTCTGCTTCTCGATGTCATCC-3’

HR-ste2p(303)3A-rv 5’-GTGTGGCGCTGGTTTAAAAATACTCAAATGGTGATGGTGATGGTGGGATGCATTATTAGCAGCCGTGGCCCACATTGAT-3’

Kontrolle der homologen Rekombination

TestSte2p3A-fw 5’-GTTCTCGTTCCCTTTCTTCC-3’

TestSte2p3A-rv 5’-AACAACAGTACAAACATCACCGC-3’

31

2.1.2 Plasmide

pFLAT1 2µ Shuttlevektor für E. coli und S. cerevisiae (8,7 Kb) mit AmpR, TetR, URA3, ADH1-Promoter, TRP1-Terminator

M. Veen, unveröffentlicht (2000)

pFLAT1-Myc-GlpT pFLAT1 mit glpT mit N-terminalem einfachen c-Myc-Epitop

diese Arbeit

pFLAT1-GlpT-Myc pFLAT1 mit glpT mit C-terminalem einfachen c-Myc-Epitop

diese Arbeit

pFLAT1-79Ste2-GlpT-Myc

pFLAT1 mit Fusion aus N-terminalen 237 Basen von STE2, einem His6-Linker und glpT mit C-terminalem einfachen c-Myc-Epitop

diese Arbeit

pFlat1-303Ste2-GlpT-Myc

pFLAT1 mit Fusion aus N-terminalen 909 Basen von STE2, einem His6-Linker und glpT mit C-terminalem einfachen c-Myc-Epitop

diese Arbeit

2.1.3 Stämme

E. coli

E. coli DH5α Alle Klonierungen wurden mit diesem Stamm durchgeführt.

S. cerevisiae

Zielstämme für die Überproduktion und Ausscheidung von L-G3P

S. cerevisiae W303-1A

MATa leu2-3/112 ura3-1 trp1-1 his3-11/15 ade2-1 can1-100 GAL SUC2 mal0

Wildtyp zur ∆gpp1/2-Mutante YA103

Thomas & Rothstein (1989)

S. cerevisiae YA103

MATa leu2-3/112 ura3-1 trp1-1 his3-11/15 ade2-1 can1-100 GAL SUC2 mal0

gpp1∆::kanMX4 gpp2∆::HIS3

Påhlman et al. (2001)

S. cerevisiae YA103 mit YEPKmR GPD1

L-G3P Produktionsstamm mit konstitutiver Multicopy-Expression von GPD1 (Plasmid publiziert bei Nevoigt & Stahl (1996))

Nguyen et al. (2004)

S. cerevisiae YA103 mit pFlat1

S. cerevisiae YA103 mit pFlat1-Myc-GlpT

S. cerevisiae YA103 mit pFlat1-GlpT-Myc

S. cerevisiae YA103 mit pFLAT1-79Ste2-GlpT-Myc

S. cerevisiae YA103 mit pFlat1-303Ste2-GlpT-Myc

diese Arbeit

32

Kontrollstamm für die Detektion und Lokalisierung von Proteinen mit c-Myc-Epitop

S. cerevisiae JJSY54 MATa, his3∆200 leu2∆1 met15∆0 trp1∆63 ura3-167 RDN1::Ty1-MET15 mURA3-HIS3 bna1∆::kanMX4 mit BNA1 mit fünffachem c-Myc-Epitop in einem 2µ TRP1-Shuttle-Vektor (cytosolisches Protein)

Sandmeier et al. (2002)

Diagnostische Stämme aus der Hefedeletionsbank

S. cerevisiae BY4741

MATa his3∆1 leu2∆0 met15∆0 ura3∆0

Brachmann et al. (1998)

S. cerevisiae BY4741 ∆pep4

BY4741; YPL154c::kanMX4 EUROSCARF

Nr. Y02098

S. cerevisiae BY4741 ∆prb1

BY4741; YEL060c::kanMX4 EUROSCARF

Nr. Y00302

S. cerevisiae BY4741 ∆kex2

BY4741; YNL238w::kanMX4 EUROSCARF

Nr. Y01974

S. cerevisiae

BY4741 ∆yps1

BY4741; YLR120c::kanMX4 EUROSCARF

Nr. Y02731

S. cerevisiae

BY4741 ∆yps2

BY4741; YDR144c::kanMX4 EUROSCARF

Nr. Y04078

S. cerevisiae

BY4741 ∆yps3

BY4741; YLR121c::kanMX4 EUROSCARF

Nr. Y02732

S. cerevisiae

BY4741 ∆yps6

BY4741; YIR039c::kanMX4 EUROSCARF

Nr. Y05974

S. cerevisiae

BY4741 ∆yps7

BY4741; YDR349c::kanMX4 EUROSCARF

Nr. Y04186

S. cerevisiae

BY4741 ∆axl1

BY4741; YPR122w::kanMX4 EUROSCARF

Nr. Y05537

S. cerevisiae

BY4741 ∆rpn14

BY4741; YGL004c::kanMX4 EUROSCARF

Nr. Y04372

S. cerevisiae

BY4741 ∆ysp3

BY4741; YOR003w::kanMX4 EUROSCARF

Nr. Y01779

S. cerevisiae

BY4741 ∆bar1

BY4741; YIL015w::kanMX4 EUROSCARF

Y01408

S. cerevisiae

BY4741 ∆prd1

BY4741; YCL057w::kanMX4 EUROSCARF

Nr. Y03464

S. cerevisiae

BY4741 ∆rim13

BY4741; YMR154c::kanMX4 EUROSCARF

Nr. Y06643

33

S. cerevisiae BY4741 ∆pmt1

BY4741; YDL095w::kanMX4 EUROSCARF

Nr. Y03792


BY4741; YAL023c::kanMX4 EUROSCARF

Nr. Y00385


BY4741; YOR321w::kanMX4 EUROSCARF

Nr. Y01618

Stammhintergründe

S. cerevisiae

AH22ura3 MATa leu2-3 leu2-112 his4-119 can1 ura3∆ Polakowski et al.

(1999)

S. cerevisiae

AH22ura3∆pep4

MATa leu2-3 leu2-112 his4-119 can1 ura3∆ pep4∆

Holz et al. (2003)

S. cerevisiae

GRF18ura3 MATa leu-2-3/112 his3-15 can1 mal ura3∆ Müller (2006)

S. cerevisiae

CEN.PK2-1D MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3/112 his3-∆1 MAL2-8C SUC2

Entian & Koetter (1998)

van Dijken et al. (2000)

S. cerevisiae

ENY.WA-1A MATα leu2-3/112 ura3-52 trp1-289 his3-∆1 MAL2-8C MAL3 SUC3

Eliasson et al. (2000)

2.1.4 Medien und Anzucht

Für E. coli (Anzucht bei 37 °C, geschüttelt bei 160 rpm):

1 % Bacto-Pepton; 0,5 % Hefeextrakt; 0,5 % NaCl;

für Platten zusätzlich 1,5 % Agar

LB

Dosierung von Ampicillin:

150 µg/ml in Agarplatten, 100 µg/ml in Flüssigmedium

Für S. cerevisiae (Anzucht bei 28 °C, geschüttelt bei 120 rpm):

YPD 1 % Hefeextrakt; 2 % Pepton; 2 % Glucose;


0,5 % Glucose;


Als Minimalmedium:

je nach Bedarf des Stammes 20 mg/l Adenin, 20 mg/l Uracil, 20 mg/l Histidin, 20 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Methionin, 60 mg/l Leucin

YNB (Difco)

Als synthetisches Vollmedium zur Selektion von Uracil-Prototrophie:

770 mg/l CSM-ura (Qbiogene)

34

Mineralmedien

Für die Wachstumskurven in 2 % Glucose

nach Verduyn et al. (1992)

Für die Fed-Batch-Fermentation in 2–5 % Glucose

nach Alfenore et al. (2002)

Makronährstoffe

Stickstoff 38 mM (NH4)2SO4 23 mM (NH4)2SO4

53 mM NaC5H8NO4*H2O

14 % (v/v) NH3 nach Bedarf

29,6 µM (NH4)2Fe(SO4)6*6 H2O

Phosphat 22 mM KH2PO4

22 mM KH2PO4

8 mM Na2HPO4*12 H2O

Sulfat 38 mM (NH4)2SO4

2 mM MgSO4*7 H2O

15,6 µM ZnSO4*7 H2O

10,8 µM FeSO4*7 H2O

1,7 µM Na2MoSO4*7 H2O

1,2 µM CuSO4*5 H2O

2 mM MgSO4*7 H2O

29,6 µM (NH4)2Fe(SO4)6*6 H2O

139,1 µM ZnSO4*7 H2O

22,5 µM MnSO4*H2O


3,6 µM CuSO4*5 H2O

Magnesium 2 mM MgSO4*7 H2O 2 mM MgSO4*7 H2O

Natrium 40,3 µM C10H14N2Na2O8*2 H2O


8 mM Na2HPO4*12 H2O

Kalium 22 mM KH2PO4

0,6 µM KI

22 mM KH2PO4

Mikronährstoffe

Eisen 10,8 µM FeSO4*7 H2O 29,6 µM (NH4)2Fe(SO4)6*6 H2O

Zink 15,6 µM ZnSO4*7 H2O 139,1 µM ZnSO4*7 H2O

Mangan 5,2 µM MnCl2*2 H2O 22,5 µM MnSO4*H2O

Calcium 30,6 µM CaCl2*2 H2O 156,4 µM CaCl2*2 H2O

Kupfer 1,2 µM CuSO4*5 H2O 3,6 µM CuSO4*5 H2O

Kobalt 1,3 µM CoCl2*6 H2O 2,1 µM CoCl2*6 H2O

Bor 16,2 µM H3BO3 48,5 µM H3BO3

Chlor 30,6 µM CaCl2*2 H2O

5,2 µM MnCl2*2 H2O

1,3 µM CoCl2*6 H2O

156,4 µM CaCl2*2 H2O

2,1 µM CoCl2*6 H2O

Molybdän 1,7 µM Na2MoSO4*7 H2O 0,2 µM Na2MoSO4*2 H2O

Jod 0,6 µM KI entfällt

35

Vitamine

Biotin 0,2 µM C10H16N2O3S 0,05 µM C10H16N2O3S

Pantothensäure 2,1 µM C18H32CaN2O10 10,5 µM C18H32CaN2O10

Nicotinsäure 8,1 µM C6H5NO2 40,6 µM C6H5NO2

Inositol 138,8 µM C6H12O6 693,8 µM C6H12O6

Thiaminhydrochlorid 3,0 µM C12H17ClN4OS*HCl 14,8 µM C12H17ClN4OS*HCl

Pyridoxol 4,9 µM C8H11NO3*HCl 29,6 µM C8H11NO3

4-Aminobenzoesäure 1,5 µM C7H7NO2 7,3 µM C7H7NO2

Wasser Entionisiertes Wasser, enthält alle notwendigen Spurenelemente

Stadtwasser, enthält alle notwendigen Spurenelemente

pH 6.0 4.0

Basen und Aminosäuren

Dosierung nach Pronk (2002) Dosierung nach Boulahya et al. (Manuskript in Vorbereitung)

Adenin 225 mg/l 1,2 g/l

Uracil – 1,2 g/l

L-Leucin 500 mg/l –

L-Tryptophan 75 mg/l 1,2 g/l

Ergosterol/Tween Herstellung und Dosierung nach Visser et al. (1990)

Ergosterol – 10 mg/l

Tween 80 – 420 mg/l

2.2 Methoden der Fermentation und Analyse der Fermentationsprodukte

2.2.1 Wachstumskurven

Wachstumskurven wurden als aerobe Batch-Fermentationen von 2 % Glucose im

Mineralmedium nach Verduyn et al. (1992) aufgenommen. 20 ml-Vorkulturen in 100 ml-

Erlenmeyerkolben mit Wattestopfen wurden von der Masterplatte beimpft und 2 Tage lang

geschüttelt, so dass sie durchgewachsen waren. 100 ml Medium in 500 ml-Erlenmeyerkolben

wurden aus den Vorkulturen so beimpft, dass beim Start eine optische Dichte bei 600 nm

Wellenlänge (OD600) von 0,1 eingestellt war (Spektrophotometer: UV-160A, Shimadzu). Die

Hauptkulturen wurden mit einem Wattestopfen verschlossen und bei 28 °C mit 120 rpm

geschüttelt. Zunächst stündlich, später seltener wurde die OD600 bestimmt. Das Experiment

wurde mit drei verschiedenen Klonen je Stamm durchgeführt, gezeigt ist ein repräsentatives

36

Beispiel. Trendlinien in Form von Exponentialfunktionen wurden von MS Excel für die

Fermentationszeit von 4 bis 9 Stunden berechnet (R2 = mindestens 0,998) und daraus die

spezifische exponentielle Wachstumsrate (µ) bestimmt.

Zur Bestimmung des Konzentrationsgefälles in Abhängigkeit von der Expression von GlpT

wurden die Stämme in zwei aufeinander folgenden aeroben Vorkulturen in Mineralmedium

nach Verduyn et al. (1992) angezogen. Quasi anaerobe Batch-Fermentationen in 110 ml

frischem Medium wurden in 100 ml-Schott-Flaschen durchgeführt, die mit Gäraufsätzen

verschlossen wurden. Zu Beginn der anaeroben Fermentation wurde OD600=1 eingestellt.

Nach 18 h Fermentationszeit, in der die Kulturen kontinuierlich mit 300 rpm gerührt wurden,

wurden sie geerntet und Biomasse, Gesamt-L-G3P und extrazelluläres L-G3P bestimmt (vgl.

2.2.4).

2.2.2 Fed-Batch-Fermentationen

Fermentationen im 2 Liter-Maßstab wurden im 3 Liter-Biostat E-Fermentationssystem

(B. Braun) durchgeführt. Die Temperatur betrug 30 °C. Der pH-Wert wurde mit 14 % (v/v)

NH3 in A. dest. bei 4.0 gehalten. Mithilfe der Software MFCS/win 2.0 (Biostat B, B. Braun)

wurden Rührgeschwindigkeit, Temperatur, der Partialdruck des gelösten Sauerstoffs, Zugabe

der Base und Schaumverminderer verfolgt und reguliert.

Glucose wurde in einer Konzentration von 50 g/l vorgelegt. Wenn die Glucosekonzentration

im Fermenter auf 20 g/l abgefallen war, wurde sie durch manuelles Füttern mit konzentrierter

Glucoselösung (700 g/l) wieder auf 50 g/l aufgefüllt. Während der Fermentation wurde die

Glucosekonzentration mithilfe eines YSI-Geräts bestimmt (Modell 27A, Yellow Spring

Instruments). Vitamine wurden in den oben angegeben Konzentrationen vorgelegt (vgl.

2.1.4). Bei jeder Verdoppelung der Zellzahl erfolgte entsprechend die Zufütterung einer

verdoppelten Menge an Vitaminen (nach Alfenore et al. 2002).

Die erste Vorkultur erfolgte über Nacht im 30 ml-Maßstab, die zweite wiederum über Nacht

im 300 ml-Maßstab. Beimpft wurde der Fermenter mit 200 ml der zweiten Batch-Vorkultur,

so dass der Fermentationsansatz beim Start genau 2 Liter umfasste.

Die Belüftung wurde während der Zwei-Phasen-Fermentation (aerob/anaerob) zunächst durch

eine Belüftungsrate von 0,1 vvm und eine Rührgeschwindigkeit von 300 rpm festgelegt und

anschließend manuell angepasst, so dass 28 Stunden lang keine Sauerstofflimitierung erfolgte

(aerobe Phase). Nach 28 Stunden wurde der Reaktor mit elementarem Stickstoff begast, um

innerhalb weniger Minuten zur Anaerobiose überzugehen. Anschließend wurde die

Fermentation noch 20 Stunden lang fortgesetzt (anaerobe Phase).

37

Die Belüftung während der zweiten Fermentation (microaerob) wurde mit einer

Rührgeschwindigkeit von 300 rpm und minimaler, manuell eingestellter Belüftungsrate

unterhalb des Detektionslimits begonnen. Nach rund 7 h Fermentation hatten die Zellen den

Sauerstoff im Fermenter aufgezehrt. Die Belüftung wurde nun manuell stets so eingestellt,

dass der gemessene Sauerstoffpartialdruck 0 betrug, eine Erhöhung der Belüftungsrate aber

unmittelbar zu einem messbaren Anstieg führte. So wurde angestrebt, dass die Zellen den

eingebrachten Sauerstoff vollständig in oxidativen Synthesen und in der oxidativen

Phosphorylierung konsumierten.

2.2.3 Bestimmung von Biomasse und dem Anteil lebender Zellen

Die Zelldichte wurde während der Fermentation mit der Messung der Optischen Dichte bei

620 nm Wellenlänge (OD620) in einem Spektrophotometer (U-1100, Hitachi) verfolgt.

Für die Bestimmung der Biomasse als Hefetrockenmasse wurden definierte Volumina auf

einem gewogenen Nitrocellulose-Filter (0,45 µm Porendurchmesser, Sartorius) gesammelt,

bei 60 °C und unter partiellem Vakuum getrocknet und gewogen.

Der Anteil lebender Zellen an der Gesamtzellzahl wurde mit Methylenblau-Färbung

bestimmt (Postgate 1967). Gesunde Zellen bauen den blauen Farbstoff ab und erscheinen

unter dem Mikroskop weiß, schwer geschädigte und tote Zellen werden dauerhaft blau

angefärbt. Die zellhaltige Probe aus dem Fermenter wurde mit Wasser auf eine OD620=0,4–

0,7 verdünnt, zu gleichen Teilen mit der Färbelösung gemischt und nach 5 min Inkubation bei

Raumtemperatur unter dem Mikroskop betrachtet. 200–300 Zellen wurden ausgezählt und der

Anteil der ungefärbten Zellen an der Gesamtzellzahl bestimmt.

Färbelösung: 0,3 mM Methylenblau (Prolabo) in 68 mM Natriumcitrat, steril filtriert.

2.2.4 Enzymatische Bestimmung von L-G3P

Durch 5-minütiges Erhitzen einer Probe aus dem Fermenter auf 95 °C wird das gesamte

intrazellulär akkumulierte L-G3P aus den Zellen freigesetzt (E. Nevoigt, persönliche

Mitteilung). Auf diese Weise wurden intrazelluläres und extrazelluläres L-G3P vor der

enzymatischen Bestimmung zum Gesamt-L-G3P vereinigt. Extrazelluläres L-G3P wurde nach

dem Abzentrifugieren der Zellen im Probenüberstand bestimmt.

Die enzymatische Bestimmung erfolgte nach Lang (1974). Die Grundlage der Messung ist die

Oxidation von L-G3P zu DHAP in Gegenwart von NAD (GPD-Reaktion). Voraussetzung für

die quantitative Umsetzung von L-G3P ist die Entfernung der Reaktionsprodukte aus dem

Reaktionsgemisch. DHAP wird mit Hydrazin zu DAP-Hydrazon komplexiert, alkalischer

Puffer bindet die freigesetzten Protonen. Die Freisetzung von NADH ist proportional zur

38

Menge an L-G3P und wird spektrophotometrisch durch die Extinktionsänderung bei 340 nm

bestimmt. Ein L-G3P-Standard wurde eingesetzt (sn-Glycerol 3-phosphate

bis(Cyclohexylammonium salt), Sigma), da die publizierten Parameter zur Umrechnung der

Extinktionsänderung in L-G3P-Konzentration nicht der Realität entsprachen. Der Bereich der

linearen Korrelation von Extinktionsänderung und L-G3P-Konzentration war sehr klein (0–

0,2 mM), so dass eine passgenaue Verdünnung jeder Probe erforderlich war. Die Reaktion

erreichte bei Raumtemperatur innerhalb von 20 Minuten ihren Endpunkt.

Der Reaktionsansatz enthielt 0,189 M Hydrazinsulfat; 0,47 M Glycin (pH 9.8); 2,7 mM

EDTA; 2,3 mM β-NAD (Grade II, 98 %, Roche Diagnostics); 1 mM ATP; 0,9 mM MgSO4

und 1,3 U/ml Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase (from rabbit muscle, suspension, ca. 2700

U/ml, Fluka).

2.2.5 Bestimmung von Glucose und Fermentationsprodukten

Die Konzentrationen von Glucose, Glycerol und Ethanol im Kulturüberstand wurden im

Anschluss an die Fermentationen mit HPLC (Modell: Waters Alliance 2690) unter

Verwendung der Säule Aminex HPX-87H (300 mm*7,8 mm, Bio-Rad) bestimmt. Eluiert

wurde mit 5 mM H2SO4 bei einer Flussrate von 0,5 ml/min und 50 °C. Die Detektion erfolgte

bei RT mit einem Refraktometer (Modell: Waters RID 2414).

2.2.6 Zusammenführung und Darstellung der Daten

Direkt erhoben wurden die Konzentrationen von L-G3P insgesamt (intra- plus extrazellulär),

extrazellulärem L-G3P und Biomasse im Fermenter. Da die Fütterung von Glucose, Base,

Vitaminen und Spurenelementen eine unregelmäßig wiederkehrende Verdünnung bewirkte,

wurde anstelle der Konzentration die absolute Menge der Biomasse und

Fermentationsprodukte im Fermenter betrachtet (Multiplikation der Konzentration mit dem

aktuellen Volumen). Bei dieser Betrachtungsweise bleiben Störungen durch den Feed

unsichtbar, lediglich die kleinvolumigen und kontinuierlichen Probennahmen gehen als

Störungen in den Datenverlauf ein. Nur auf diese Weise war es möglich, sinnvolle

Produktionsraten zu bestimmen.

Intrazelluläres L-G3P und L-G3P pro Biomasse wurden als Differenz aus L-G3P insgesamt

und extrazellulärem L-G3P bzw. als deren Division durch die Biomasse bestimmt. Zuvor

wurden L-G3P insgesamt (mg), extrazelluläres L-G3P (mg) und Biomasse (g) durch

Polynomische Repräsentationen 3. Grades angenähert. Die Polynome wurden von MS Excel

als Trendlinien der Datenreihen berechnet. Die Komplexität der Kurvenverläufe machte es

39

notwendig, mehrere Polynome abschnittsweise aneinanderzufügen. Die arithmetischen

Operationen zur Ableitung nicht gemessener Daten wurden mit den Polynomen durchgeführt.

Die spezifischen Produktionsraten für L-G3P oder Glycerol wurden berechnet, indem der

Zuwachs an Produkt zwischen zwei Zeitpunkten der Probennahme, die 1–3 h auseinander

lagen, auf die Biomasse zum ersten Zeitpunkt der Probennahme bezogen wurde

((Pn-Pn-1)/Bn-1) mit B: Biomasse; n: Zeitpunkt der Probennahme; n-1: Zeitpunkt der

vorangegangenen Probennahme; P: Produkt (intra- + extrazelluläres L-G3P, oder

extrazelluläres Glycerol). Diese Rechnung wurde für alle Zeitpunkte n der Fermentation

durchgeführt und die ermittelten Werte als Liniendiagramm dargestellt.

Die Berechnung von extrazellulärem L-G3P aus lebenden Zellen erfolgte nach folgenden

Überlegungen: Gemessenes extrazelluläres L-G3P setzt sich aus dem L-G3P, das aus

lebenden Zellen und dem, das aus toten Zellen freigesetzt wurde, zusammen (lE=E-tE). Je

nach Fermentationszeit weisen die Zellen unterschiedliche intrazelluläre L-G3P-

Konzentrationen auf. Zu jedem Zeitpunkt n setzt der Zuwachs der toten Biomasse seit dem

vorangegangen Zeitpunkt der Probennahme somit die Menge an intrazellulärem L-G3P frei,

die derzeit darin enthalten war (tEn=(tBn-tBn-1)*I n-1). Tote Biomasse wurde aus der

gemessenen Biomasse und dem Anteil lebender Zellen bestimmt ((100-Anteil lebender

Zellen)n*Bn). Extrazelluläres L-G3P aus lebenden Zellen zum Zeitpunkt n bestimmt sich

somit als lEn=En-(tE0+tE1+tE2+…+tEn) mit B: Biomasse; lB: lebende Biomasse; tB: tote

Biomasse; E: extrazelluläres L-G3P; lE: extrazelluläres L-G3P aus lebender Biomasse; tE:

extrazelluläres L-G3P aus toter Biomasse; I: intrazelluläre L-G3P-Konzentration; n: Zeitpunkt

der Probennahme; n-1: Zeitpunkt der vorangegangenen Probennahme; 0, 1, 2: erster, zweiter,

dritter Zeitpunkt der Probennahme überhaupt.

Die spezifische Freisetzungsrate für L-G3P wurde berechnet, indem der Zuwachs an

extrazellulärem L-G3P zwischen zwei Zeitpunkten der Probennahme, die 1–3 h auseinander

lagen, auf die Biomasse zum ersten Zeitpunkt der Probennahme bezogen wurde

((En-En-1/Bn-1)) mit B: Biomasse; E: extrazelluläres L-G3P; n: Zeitpunkt der Probennahme; n-

1: Zeitpunkt der vorangegangenen Probennahme. Diese Rechnung wurde für alle Zeitpunkte n

der Fermentation durchgeführt und die ermittelten Werte als Liniendiagramm dargestellt.

Für die Konzentration von L-G3P im Cytosol war eine Hypothese über das

durchschnittliche Volumen einer Hefezelle nötig. Für den Wassergehalt von Hefezellen und

mithin den Lösungsraum für intrazelluläres L-G3P wurden 1,4 ml/g Hefetrockenmasse zu

Grunde gelegt, wie von Uribellarea et al. (1985) thermogravimetrisch bestimmt.

40

2.3 Methoden der Manipulation und Analyse von Nucleinsäuren

2.3.1 Puffer, Agarose-Gelelektrophorese

AE-Puffer 50 mM Natriumacetat; 10 mM EDTA (pH 5.0)

Mit diesem Puffer wurde sauer gepuffertes Phenol hergestellt.

Agarose-Gele für DNA Je nach Größe der aufzutrennenden DNA-Fragmente 0,8–1,5 % Agarose in TBE-Puffer.

Der Lauf erfolgte bei 50-80 mA.

Agarose-Gele für RNA 0,8 % (w/v) Agarose in MOPS-Puffer; 2 % Formaldehyd.

Der Lauf erfolgte bei 100 V.

Ethidiumbromid-Lösung 2 mg/l Ethidiumbromid in TBE-Puffer

Größenstandard GeneRulerTM DNA-Ladder Mix (100-10000 bp, Fermentas)

Probenpuffer für DNA 20 mM EDTA (pH 8.0); 0,025 % Bromphenolblau; 60 % Saccharose

DNA-Proben wurden mit 1/5 ihres Volumens an Probenpuffer versetzt, bevor sie auf das Gel geladen wurden.

Probenpuffer für RNA 45 % (v/v) Formamid; 16,25 % Formaldehyd (37 %); 22,5 % Glycerol; 0,025 % (w/v) Bromphenolblau, 0,025 % Xylencyanol in MOPS-Puffer (pH 7.0)

RNA-Proben (5 µg/10 µl) wurden mit der Hälfte ihres Volumens an Probenpuffer versetzt, bevor sie auf das Gel geladen wurden.

MOPS-Puffer 20 mM MOPS, 5 mM Natriumacetat, 10 mM EDTA (pH 7.0)

Natriumacetat 3 M (pH 4.9), zur Fällung zusammen mit Isopropanol eingesetzt

TBE-Puffer 89 mM Tris-HCl; 89 mM Borsäure; 2 mM EDTA (pH 8.0)

TBE-Puffer wurde zum Gießen der Agarose-Gele für DNA und als Laufpuffer für die Gelelektrophorese verwendet.

2.3.2 Spektrophotometrische Bestimmung von Nucleinsäuren

Die Extinktion der Proben bei 260, 280 und 310 nm wurden im Spektrophotometer (UV-

160A, Shimadzu) bestimmt. Von der Extinktion bei 260 nm wurde die Extinktion bei 310 nm

subtrahiert. Eine Einheit dieser Differenz entsprach 50 µg/ml DNA oder 40 µg/ml RNA. Der

Messbereich lag zwischen 5 und 90 µg/ml Nucleinsäure.

Die Reinheit wurde durch Bildung des Quotienten aus der Extinktion bei 260 nm und der

Extinktion bei 280 nm kontrolliert. Dieser Quotient sollte ca. 2 betragen.

2.3.3 Präparation der Gesamt-DNA aus E. coli

Von einer deutlich getrübten Über-Nacht-Kultur wurde 1 ml geerntet, die Zellen pelletiert, in

50 µl Lysispuffer (Biotecon Diagnostics, enthält Glasperlen) nach Anleitung des Herstellers

41

aufgenommen und 10 min bei 100 °C inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt von 30–

60 s bei maximaler Geschwindigkeit war die DNA im Überstand enthalten.

2.3.4 PCR (Polymerase Chain Reaction), Aufreinigung der Produkte

Die PCR wurde nach Standardprotokoll (Sambrook & Russell 2001) im 50 µl-Maßstab

durchgeführt (GeneAmp9600, PerkinElmer). Eingesetzt wurden in dem jeweiligen Taq-Puffer

(enthielt Magnesium) je 200 µmol dATP, dCTP, dGTP, dTTP, je 50 pmol jedes Primers, 1 U

Taq-Polymerase und 1–10 ng Template-DNA.

Für das Amplifizieren von genomischen DNA-Abschnitten für die Klonierung oder die

homologe Rekombination wurde eine Taq-Polymerase mit Proofreading-Funktion eingesetzt

(TaKaRa Ex TaqTM 5 U/µl, TaKaRa). Für das Amplifizieren von Vektor-DNA zum Testen

von Klonen nach der Transformation wurde einfache Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl, Roche

Diagnostics) verwendet. Zur Amplifizierung durchliefen die Proben 20–30 Zyklen des

folgenden Schemas:

Denaturierung 30 s 94 °C

Annealing 30 s 5 °C unter der Schmelztemperatur des niedrigeren Primers

Polymerisierung 1 min pro 1000 bp 72 °C

Anschließend wurde die amplifizierte DNA meist über Nacht bei 4 °C gehalten. Die

Aufreinigung der PCR-Produkte erfolgte mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen)

nach Anweisung des Herstellers. DNA wurde in Wasser aufgenommen und bei -20 °C

gelagert.

2.3.5 Klonierung (Restriktion, Ligation)

Restriktionen von Plasmid-DNA und PCR-Produkten wurden im 200–600 µl-Maßstab

durchgeführt. Kpn I und Bgl II wurden gemeinsam eingesetzt.

Restriktionsenzym(e) Puffer Inkubation Inaktivierung

Kpn I (10 U/µl)

(New England Biolabs)

Bgl II (10 U/µl)

(Roche Diagnostics)

SuRE/Cut Buffer A

(Roche Diagnostics)

BSA

Je 5 Units/µg aufgereinigte Plasmid-DNA oder PCR-Produkt

2–4 h 37 °C

20 min 65 °C

Mlu I (13 U/µl)

(Pharmacia Biotech)

NEB3

(New England Biolabs)

9 Units/µg aufgereinigte Plasmid-DNA

2–4 h 37 °C

20 min 65 °C

42

Die Ligation erfolgte im 5 µl-Maßstab mit T4-DNA-Ligase (1 U/µl, Roche Diagnostics) im

zugehörigen Ligationspuffer (enthielt ATP) mit 0,5 U/60 ng DNA bei 4 °C über Nacht.

Vektor und Fragment wurden im molaren Verhältnis 1:6 eingesetzt.

2.3.6 E. coli-Transformation

E. coli-Transformationen wurden nach dem Hitzeschock-basierten Protokoll von Himeno

(1984) durchgeführt. Kompetente Zellen wurden wie folgt hergestellt und in Aliquots bei -

70 °C gelagert: Aus einer Übernachtkultur wurden 100 ml LB beimpft. Bei OD600=0,4 wurde

das Wachstum der Kultur auf Eis abgebrochen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation

geerntet, einmal mit gut gekühlter Lösung 1 (0,1 M MgCl2; 0,01 M Tris-HCl (pH 7.6)) und

zweimal mit gut gekühlter Lösung 2 (0,1 M CaCl2; 0,01 M Tris-HCl (pH 7.6)) gewaschen und

dabei schrittweise über 50 ml auf 4 ml eingeengt. Kompetente Zellen wurden in Aliquots mit

1/5 des Volumens an Glycerol bei -70 °C gelagert.

Für die Transformation wurden je Ansatz 40–50 ng DNA in 100 µl Lösung 3 (1 mM EDTA;

0,2 mM NaCl; 8 % PEG; 10 mM Tris-HCl (pH 7.6)) vorgelegt und mit 240 µl der

tiefgekühlten kompetenten Zellen gemischt. Vor dem Hitzeschock erfolgte eine 30-minütige

Inkubation auf Eis. 60 s Hitzeschock bei 42 °C führte zur Aufnahme der DNA in die Zellen.

Diese erholten sich nach Zugabe von je 1 ml gut gekühltem LB und unter Belüftung und

leichtem Schütteln und begannen den Selektionsmarker (Ampicillinresistenz) zu exprimieren.

Nach 90 min wurden die Zellen zur Selektion auf ampicillinhaltigem LB (150 µg/ml)

ausplattiert.

2.3.7 Plasmid-Präparationen aus E. coli („Minipräp“, „Maxipräp“)

Präparationen von Plasmid-DNA in kleinem Maßstab für diagnostische Restriktionen

(„Minipräp“) wurden nach der modifizierten Methode von Birnboim & Doly (1979)

durchgeführt. Jeder Klon wurde in 1,5 ml Medium über Nacht angezogen, geerntet und in 0,1

ml Lösung 1 (10 mM EDTA; 50 mM Glucose; 25 mM Tris-HCl (pH 8.0)) resuspendiert. Mit

0,2 ml Lösung 2 (200 mM NaOH; 1 % SDS (frisch angesetzt)) wurde chromosomale DNA

während einer Inkubation von 5 min bei RT, dann 2 min auf Eis in Einzelstränge überführt.

Die Neutralisierung und Fällung der chromosomalen DNA erfolgte mit 0,15 ml 5 M

Kaliumacetat (pH 5.2) während einer 30-minütigen Inkubation auf Eis. Aus dem Überstand

wurde doppelsträngige Plasmid-DNA mit 0,3 ml Isopropanol gefällt, das DNA-Pellet mit

70 % eiskaltem Ethanol gewaschen und in 0,05 ml A. dest. aufgenommen.

43

Präparationen aufgereinigter Plasmid-DNA für Klonierung, homologe Rekombination und

Sequenzierung („Maxipräp“) wurden mit NucleoBondR AX 500 (Machery-Nagel) nach

Anweisung des Herstellers durchgeführt.

2.3.8 Hefe-Transformationen

Als gut geeignet erwies sich die Transformationsmethode mit Lithium/PEG nach Gietz &

Woods (2001). Das Wachstum der Kultur wurde in der logarithmischen Wachstumsphase

(OD600<1,5) auf Eis abgestoppt. Nach der Ernte von 100 ml Kultur wurden die Zellen in

mehreren Schritten mit sterilem Wasser gewaschen, auf 2 ml eingeengt und in Portionen zu je

0,1 ml aufgeteilt. Mit denaturierter Heringssperma-DNA wurde ein eiskalter T-Mix

hergestellt. 0,360 ml T-Mix mit der zu transformierenden DNA wurden zu einer Portion

Hefezellen gegeben. Die Aufnahme der DNA erfolgt während einer 60-minütigen Inkubation

bei 42 °C. Die transformierten Zellen wurden pelletiert, in Wasser aufgenommen und auf

selektivem Medium ausplattiert.

T-Mix für einen Transformationsansatz:

240 µl PEG 4000, 50 % (w/v)

36 µl 1 M Lithiumacetat

50 µl denaturierte Carrier-DNA (2 mg/ml, 5 min bei 95 °C inkubiert, bei -20 °C gelagert)

0,1–10 µg Plasmid-DNA in 34 µl A. dest.

High-throughput-Transformationen wurden mit dem Kit Frozen-EZ Yeast Transformation

IITM (Zymo Research) nach Anweisung des Herstellers durchgeführt. Hefezellen wurden bei

OD600=0,8–1,0 geerntet, kompetent gemacht und bei -70 °C gelagert. Die Inkubation erfolgte

im Wasserbad bei 28 °C für ca. 2 h. Es wurden 100 ng aufgereinigte und mikrodialysierte

Plasmid-DNA in 1µl A. dest. eingesetzt. Die Transformationsrate betrug zwischen 10 und

20000 cfu/µg DNA.

2.3.9 Homologe Rekombination in Hefe

Fusionsproteine aus S. cerevisiae Ste2p und E. coli GlpT wurden nach der Methode von

Raymond et al. (1999) hergestellt. Der Expressionsvektor pFLAT1-GlpT-Myc wurde mit

Mlu I kurz hinter dem Startcodon AUG in der codierenden Sequenz geöffnet (vgl.

Plasmidkarte, Abb. 3.2.1B; für die Restriktion vgl. 2.3.5). Linearisierter Vektor wurde auf

einem Agarose-Gel von nicht linearisiertem getrennt, als Bande ausgeschnitten und mit dem

QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) aus dem Gel extrahiert. Der einzufügende DNA-

Abschnitt wurde mit PCR aus einer Präparation von Hefe-DNA amplifiziert und mit dem

QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt (für DNA-Präparation aus Hefe vgl.

44

2.3.10, für PCR vgl. 2.3.4). Die Transformation in S. cerevisiae ∆gpp1/2 erfolgte nach der

Lithium/PEG-Methode (vgl. 2.3.8). Je Ansatz wurden 200 ng Vektor und je nach Größe 200–

600 ng PCR-Fragment verwendet. Das entspricht einem molaren Verhältnis von

linearisiertem Vektor und PCR-Fragment von 1:10.

2.3.10 Präparation der Gesamt-DNA aus Hefe

Diese Methode eignet sich zur Gewinnung von Plasmiden zur Rücktransformation in E. coli

und zur Gewinnung von Template-DNA für die diagnostische PCR, sie wurde nach dem

Protokoll von Hoffman & Winston (1987) durchgeführt. Je Hefeklon wurden über Nacht 5 ml

Kultur angezogen, geerntet, und in 0,4 ml Lysispuffer (2 % Triton-X-100; 1 % SDS; 100 mM

NaCl; 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA (pH 8.0)) und 0,4 ml basisch gepuffertes

Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) mit Glasperlen (Durchmesser 0,4–0,6 mm)

aufgeschlossen. Dazu wurde 2 min lang gevortext, anschließend wurden Proteine und

Zellreste abzentrifugiert. Zur Abtrennung des Phenols und Aufkonzentrierung erfolgte eine

Fällung der DNA aus dem Überstand mit 0,04 ml Natriumacetat-Lösung und 0,22 ml

Isopropanol über Nacht bei -20 °C. Die pelletierte DNA wurde zweimal mit eiskaltem 70 %

Ethanol gewaschen, in 0,03 ml Lösung 1 aufgenommen und bei -20 °C gelagert.

2.3.11 DNA-Sequenzierung

Sequenzierungen aufgereinigter Plasmid-DNA wurden von Dr. Martin Meixner (Humboldt-

Universität zu Berlin) nach der Kettenabbruchmethode durchgeführt. Rohdaten wurden mit

der Software Chromas 1.55 begutachtet und die Sequenzen gegebenenfalls editiert.

2.3.12 Präparation und Auftrennung der Gesamt-RNA aus Hefe

Je Hefeklon wurden über Nacht 10 ml Hauptkultur bis OD600=1,5 angezogen und bei 0 °C

geerntet. Aufgrund der Omnipräsenz von RNasen wurde in RNase-freien DEPC

(Diethylpyrocarbonat)-behandelten Gefäßen und mit RNase-freien Puffern gearbeitet. Das

Zellpellet wurde in 350 µl eiskalten AE-Puffer aufgenommen, mit 0,1 Volumen 10 % SDS

versetzt, in 400 µl sauer gepuffertes Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (125:24:1) überführt

und die Zellen durch 30 s heftiges Vortexen aufgeschlossen. Es erfolgte eine 5-minütige

Inkubation bei 65 °C, bevor die Proben in flüssigem Stickstoff konserviert wurden. Die

schrittweise Abtrennung der Zellreste und Proteine erfolgte durch Zentrifugation bei RT.

Dabei wurde der Überstand zunächst mit Phenol/Chloroform (1:5), dann mit Chloroform

alleine behandelt. Die Nucleinsäuren wurde aus der wässrigen Phase mit 0,1 Volumen 3 M

Natriumacetat, pH 5.2 und 0,7 Volumen Isopropanol bei -20 °C gefällt, das Pellet mit 70 %

45

eiskaltem Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in DEPC-behandeltem A. dest gelöst (3 min

65 °C). Anschließend wurde RNasefreie DNase zugegeben und die RNA bei -80 °C

aufbewahrt.

5 µg RNA in Probenpuffer je Spur wurden in Formaldehyd-Agarose-Gelen aufgetrennt. Vor

dem Auftragen auf das Gel wurden die Proben und der Probenpuffer 5 min bei 65 °C erhitzt

und auf Eis abgekühlt.

2.3.13 Northern Blot und Immundetektion der mRNA

Beim Northern Blot wird die RNA aus dem Formaldehyd-Gel auf Nylonmembran überführt.

Vor dem Transfer wurde das Gel zweimal 5 min in 20x SSC äquilibriert und auf 3 Lagen

Filterpapier (Chromatography Paper 3MM, Whatman) gelegt, die mit dem Pufferreservoir in

Kontakt standen. Die Nylonmembran (Hybond-N+, Amersham) wurde mit 20x SSC

befeuchtet, auf das Gel gelegt und mit 3 Lagen befeuchteten Filterpapiers abgedeckt. Darauf

wurde ein Filterpapierstapel von 5–10 cm Dicke, eine Glasplatte und ein Gewicht gelegt. Der

Transfer erfolgte mit dem kapillaren Anstieg von 20x SSC über Nacht bei RT. Anschließend

wurde die Membran auf mit SSC 2x getränktem Filterpapier mit der RNA durch UV-

Bestrahlung kovalent vernetzt (UV StratalinkerR 2400, Stratagene), hernach folgte eine

Spülung mit DEPC-behandeltem A. dest.

Die RNA auf der Membran konnte mit einem UV-Transiluminator sichtbar gemacht und

fotografiert werden (RNA-Seite nach unten, sog. UV-Shadowing). Der RNA-Transfer aus

dem Gel wurde durch Färbung des Gels mit Ethidiumbromid-Lösung (1 µg/l) kontrolliert.

Die Amplifizierung der DIG-markierten Sonde, die Hybridisierung und die Immundetektion

erfolgten mit dem DIG Northern Starter Kit (Roche Diagnostics) nach Anweisung des

Herstellers. Bei der Amplifizierung der Sonde mit der T7-RNA-Polymerase wurde DIG-

markiertes UTP eingesetzt. Das DNA-Template wurde nach 1 h Polymerisation bei 42 °C mit

RNase-freier DNase degradiert und die Reaktion mit EDTA gestoppt. Die Hybridisierung der

Nitrocellulose-Membran mit der markierten Sonde erfolgte über Nacht im

Hybridisierungsofen (Compact Line OV4, Biometra) bei 68 °C. Waschschritte erfolgten

zweimal 5 min in 2x SSC, 0,1 % (w/v) SDS bei RT und zweimal 15 min in 0,1x SSC, 0,1 %

(w/v) SDS bei 68°C. Anschließend wurde die Membran mit Waschpuffer gespült und 30 min

in Blocking-Lösung inkubiert. Gebundene Sonde wurde mit Anti-DIG-IgG (1:10000 in

Blocking-Lösung), an den alkalische Phosphatase gekoppelt war, detektiert. Nach zwei 15-

minütigen Waschschritten in Waschpuffer und zwei 5-minütigen Äquilibrierungsschritten in

Detektionspuffer wurde die Alkalische Phosphatase-Reaktion mit Chemilumineszenz (CDP-

Star) sichtbar gemacht und auf Röntgenfilm (SuperRX, Fujifilm) aufgenommen.

46

Puffer, die nicht im Kit enthalten waren, sind im Folgenden aufgelistet. Alle Puffer wurden

mit DEPC-behandeltem A. dest. in RNase-freien Glaswaren hergestellt.

20x SSC 3 M NaCl; 0,3 M Natriumcitrat.

Für das Entfernen überschüssiger Sonde nach der Hybridisierung wurden 2x SSC und 0,1x SSC mit je 0,1 % (w/v) SDS eingesetzt.

Blocking-Lösung

Verdünnen von Blocking-Lösung 10x (Roche Diagnostics) mit 0,1 M Malat; 0,15 M NaCl (pH 7.5).

Waschpuffer 0,1 M Malat; 0,15 M NaCl (pH 7.5); 0,3 % (v/v) Tween 20.

Detektionspuffer 0,1 M Tris-HCl; 0,1 M NaCl (pH 9.5).

2.4 Methoden der Protein-Analyse

2.4.1 Puffer, Lösungen und Antikörper

Antikörper:

Primärer Antikörper Monoklonaler Antikörper gegen das c-Myc-Epitop (Purified Mouse IgG clone 9E10, Sigma-Aldrich)

Arbeitslösungen:

1:5000 in PBST (pH 7.4) für Western Blot

1:400 in PBST (pH 6.5) für Immunfluoreszenz

Sekundärer Antikörper für Western Blot

Peroxidase-konjugierter Antikörper gegen Maus-IgG (Rabbit, DAKO A/S)

Arbeitslösung: 1:10000 in PBST (pH 7.4) mit 5 % Magermilch

Sekundärer Antikörper für Immunfluoreszenz

FITC-konjugierter Antikörper gegen Maus-IgG (H+L , Jackson ImmunoResearch)

Arbeitslösung: 1:400 in PBST (pH 6.5)

Puffer und Lösungen:

APS-Lösung 10 % Ammoniumpersulfat (Merck) in A. dest.

Aufschlusspuffer 1–2 mM Pefabloc SC (Fluka) in PBS (pH 7.4), teilweise 1 % (v/v) Protease Inhibitor Mix (100x solution, Amersham Biosciences).

Blocking-Lösung 5 % (w/v) Magermilch in PBS (pH 7.4).

Chemilumineszenz A 0,1 M Tris-HCl (pH 8.5); 0,44 % (v/v) Coumarsäure-Stammlösung (90 mM p-Coumarsäure (Sigma-Aldrich) in DMSO), 1 % (v/v) Luminol-Stammlösung (250 mM 5-Amino-2,3-Dihydro-1,4 Phtalazinedione (Sigma) in DMSO).

Chemilumineszenz B 0,1 M Tris-HCl (pH 8.5); 0,062 % (v/v) H2O2 (30 %).

Coomassie-Färbelösung

10 % Eisessig; 45 % Ethanol; 0,2 % (w/v) Coomassie-Blue R-250.

Coomassie-Entfärbelösung

7 % Eisessig; 10 % Ethanol.

DAPI-Stammlösung 0,1 % (w/v) 4’,6-Diamidino-2-phenylindol*2 HCl in A. dest.

47

KP (pH 6.5) 73 mM K2HPO4; 27 mM KH2PO4.

KPS (pH 6.5) 73 mM K2HPO4; 27 mM KH2PO4; 1,2 M Sorbitol.

Probenpuffer (4x) 0,25 M Tris-HCl (pH 6.8); 8 % (w/v) SDS; 20 % Glycerol; 400 mM DTT; 0,002 % (w/v) Bromphenolblau.

Laufpuffer 25 mM Tris; 192 mM Glycin; 0,1 % SDS (ca. pH 8.3).

Mounting-Medium (pH 9.0)

90 % (v/v) Glycerol; 9 mM N-Propylgallat; 0,00225 % DAPI-Stammlösung in PBS (pH 9.0).

PBS (pH 7.4) 150 mM NaCl; 8,4 mM Na2HPO4; 1,6 mM KH2PO4.

PBS (pH 9.0) 90 mM K2HPO4; 10 mM KH2PO4; 150 mM NaCl.

PBST (pH 6.5) 36 mM K2HPO4; 14 mM KH2PO4; 150 mM NaCl; 0,1 % (v/v) Tween 20.

PBST (pH 7.4) 150 mM NaCl; 8,4 mM Na2HPO4; 1,6 mM KH2PO4; 0,05 % Tween 20.

Sammelgelpuffer (4x) 0,5 M Tris-HCl (pH 6.8); 0,4 % SDS.

Solubilisierungspuffer für Membranproteine

1–2 mM Pefabloc SC (Fluka) in PBS (pH 7.4); 2 % SDS; teilweise 1 % (v/v) Protease Inhibitor Mix (100x solution, Amersham Biosciences).

Transferpuffer für den Western Blot

48 mM Tris; 39 mM Glycin (pH 9.2).

Trenngelpuffer (4x) 1,5 M Tris-HCl (pH 8.8); 0,4 % SDS.

2.4.2 Proteinaufarbeitung und -fraktionierung

Die Zellernte erfolgte bei OD600=0,5–1,0. Das Pellet einer OD-Einheit an Zellen wurde in je

500 µl Aufschlusspuffer aufgenommen und bei -20 °C eingefroren. Für den Zellaufschluss

wurden 500 µl Glasperlen (Durchmesser 0,4–0,6 mm) hinzugefügt und 10 min mit maximaler

Geschwindigkeit bei 4 °C gevortext (Vortex Genie 2 mit passendem Adapter für Eppendorf-

Reaktionsgefäße, Scientific industries). Die Aufschlusseffizienz konnte lichtmikroskopisch im

Phasenkontrast kontrolliert werden und betrug rund 100 %. Nach Abtrennung der Glasperlen

wurde das Lysat zentrifugiert (14000 g; 35 min; 4 °C), der Überstand meistens verworfen und

das Pellet in 400 µl Solubilisierungspuffer mit einem Zahnstocher möglichst fein verteilt. Die

Extraktion der Membranproteine aus den Membranen erfolgte auf einem Eppendorfschüttler

(900 rpm; 45 min; RT). Nach dem Abzentrifugieren der Zellreste wurde der Überstand

abgenommen, gemischt, und bei -20°C eingefroren; ein Aliquot wurde für die

Proteinbestimmung zurückbehalten. Das Pellet wurde meistens verworfen, teilweise aber in

400 µl Solubilisierungspuffer gelöst wie oben für die Membranfraktion beschrieben. Je nach

Stamm und Aufarbeitung wurden 1,5–5 mg Gesamtprotein/ml erreicht. 60 µl proteinhaltigen

48

Überstandes wurden mit 20 µl Probenpuffer (4x) 10 min bei 40 °C denaturiert und sofort für

die Elektrophorese verwendet. Reste konnten bei -20 °C eingefroren werden.

2.4.3 Spektrophotometrische Proteinbestimmung

Wegen des SDS-haltigen Puffers wurde die quantitative Proteinbestimmung nach Lowry

durchgeführt. Hierzu wurden die Reagenzien des Bio-Rad DC Protein Assay (Bio-Rad) nach

Anweisung des Herstellers eingesetzt. Die Eichgerade wurde mit 240–1440 µg/ml BSA

erstellt und wies ein Bestimmtheitsmaß nicht unter 0,990 auf. Proteinfraktionen wurden vor

der Messung 1:5 verdünnt.

2.4.4 SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)

Für die Gele wurde käufliche Acrylamidlösung verwendet (40 % acrylamide/bisacrylamide

(29:1) Liqui-Gel, ICN Biomedicals). Es wurden große Trenngele (Dicke 1 bzw. 1,5 mm) und

Minigele (Dicke 0,75 mm, Hoefer) mit 13 % T, 3 % C und 10 % T, 3 % C verwendet; Trenn-

und Sammelgel (4 % T, 3 % C) wurden spätestens am Vortag gegossen und bei 4 °C

aufbewahrt. Für das Polymerisieren jedes Gelteils wurde mindestens 1 h veranschlagt. Die

Oberfläche des Trenngels wurde mit einem Isopropanol-Wasser-Gemisch (1:1) vor Oxidation

und Austrocknung geschützt, welches vor dem Gießen des Sammelgels mit reichlich A. dest.

abgespült und -gezogen wurde. Das Volumen der unter den gut gekühlten Laufpuffer

geschichteten Proben wurde anhand der Proteinbestimmung festgelegt (normalisiert);

üblicherweise wurde neben den Proben ein gefärbter Größenstandard PageRulerTM

Prestained Protein Ladder (Fermentas) aufgetragen. Minigele wurden teilweise bei 4 °C

Umgebungstemperatur betrieben.

Spannungen:

Sammelgel Trenngel

großes Gel 80 V 250 V

Minigel 60 V 150 V

Der Lauf wurde beendet, wenn die Lauffront die untere Gelkante erreicht hatte.

2.4.5 Western Blot (semi-dry) und Immundetektion der Proteine

Beim Blotten werden die Proteine aus dem Gel auf eine Membran transferiert. Es wurde eine

Blot-Apparatur (H. Hölzel) verwendet. Vor dem Blotten wurde das Trenngel 30 min, die

PVDF-Membran (Hybond-P, Amersham Biosciences) 5 min in Transferpuffer äquilibriert.

49

Der Blot wurde folgendermaßen aufgebaut: die Anode, 6 Lagen mit Transferpuffer getränktes

Filterpapier (Chromatography Paper 3 MM, Whatman), die Membran, das Trenngel, 6 Lagen

getränktes Filterpapier. Vor dem Auflegen der Kathode wurde überschüssiger Puffer entfernt.

Der Transfer der Proteine aus dem Gel auf die Membran erfolgte bei konstanter Stromstärke

(1 mA/ cm2 Membran) 1,5–2 h lang. Danach wurde die Membran zwei Mal 5 min mit PBS

gewaschen.

Die Membran wurde mindestens 2 h in Blocking-Lösung geschwenkt und anschließend 3x

5 min in PBST (pH 7.4) gewaschen. Die Membran wurde mit primärer Antikörperlösung

luftblasenfrei in ein Foliensäckchen passender Größe eingeschweißt, und so zwischen zwei

Glasplatten gelegt, dass sie gleichmäßig in Kontakt mit der Lösung war. Die Inkubation

erfolgte über Nacht bei 4 °C. Primäre Antikörperlösung wurde bis zu drei Mal

wiederverwendet. Vier 10-minütige Waschschritte entfernten die primäre Antikörperlösung

von der Membran. Sekundäre Antikörperlösung wurde stets frisch hergestellt und die

Membran darin 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Vier weitere 10-minütige Waschschritte in

PBST (pH 7.4) entfernten ungebundenen sekundären Antikörper.

Die zwei Komponenten des Chemilumineszenz-Systems wurden in der Dunkelkammer

gemischt und 1 min auf der Membran belassen. Die Membran wurde in Folie gewickelt und

ein Röntgenfilm (SuperRX, Fujifilm) aufgelegt. Die Belichtungsdauer wurde je nach

Schwärzung der Proteinbanden gewählt.

2.4.6 Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Immunfluoreszenz-Mikroskopie wurde in Anlehnung an die Methode von Berkower et al.

(1994) durchgeführt. Die Felder der Objektträger wurden mit Poly-L-Lysin-Lösung

vorbehandelt, da so die Ladungsdichte auf Oberflächen erhöht wird (0,01 % (w/v) Poly-L-

Lysin (70000-150000*HBr reinst, Serva Electrophoresis) in A. dest.), drei Mal in A. dest.

gewaschen und an der Luft getrocknet. Vor Staub geschützt, konnten die behandelten

Objektträger ein Jahr lang bei RT gelagert werden. Die Zellernte von fünf OD-Einheiten

erfolgte in der logarithmischen Phase bei OD600=0,5–1,0. Die Zellen wurden in 5 ml KP (pH

6.5) aufgenommen und tropfenweise mit 0,6 ml 35 % Formaldehyd fixiert. Die Inkubation

erfolgte 40 min bei 28 °C auf dem Schüttler. Die Zellen wurden zwei Mal mit KP gewaschen

und zur Protoplastierung in 1 ml KPS (pH 6.5) aufgenommen. 0,25 ml Zymolyase 20T,

5 mg/ml A. dest. (Arthrobacter Luteus 20000 U/g, ICN Biomedicals), wurden hinzugefügt

und bei 30 °C 60 min lang mit den Zellen geschüttelt. Das Ziel waren 70–80 %

Sphäroblasten, die bei mikroskopischer Kontrolle im Phasenkontrast dunkel erschienen. Nach

einem Waschschritt in 5 ml KPS wurden die Sphäroblasten in 1 ml KPS aufgenommen. Je

50

15 µl wurden auf ein Objektträgerfeld pipettiert und adsorbierten 15 min lang in einer

feuchten Kammer. Nicht adsorbierte Zellen wurden 15 min mit PBST (pH 6.5) gewaschen.

13 µl der primären Antikörperlösung wurden auf jedes Feld aufgebracht und in einer feuchten

Kammer bei RT über Nacht inkubiert. Nicht gebundener primärer Antikörper wurde mit vier

15-minütigen Waschschritten in PBST entfernt. Alle weiteren Handgriffe wurden im Dunkeln

durchgeführt. Die Inkubation mit der sekundären Antikörperlösung erfolgte 3 h lang in einer

feuchten Kammer bei RT, ungebundener Antikörper wurde entfernt (wie oben), anschließend

wurden die Objektträger an der Luft weitgehend getrocknet. Das Mounting-Medium enthielt

den Farbstoff für die Chromatin-Färbung; ein kleiner Tropfen wurde auf jedes Feld

aufgebracht und vier Felder zusammen mit einem Deckglas abgedeckt. Überschüssiges

Mounting-Medium wurde mit Filterpapierstreifen abgesaugt, und die Deckgläser wurden mit

Nagellack abgedichtet. Die Zellen wurden bei 1000-facher Vergrößerung unter Immersionsöl

mit dem Zeiss Axioskop 40 FL mikroskopiert (Objektiv: Fluar 100x). Für die DAPI-

Fluoreszenz wurde der Zeiss-Filtersatz 49, für die FITC-Fluoreszenz der Zeiss-Filtersatz 10

verwendet. Fotos wurden mit der Fluoreszenz-Kamera CC-12 (Soft Imaging Systems)

aufgenommen und mit der Software analySIS übereinandergelegt.

51

3. Ergebnisse

3.1 Fermentationen mit dem Stamm ∆∆∆∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1

3.1.1 Wachstum und L-G3P-Produktion in zwei Fermentationen mit

unterschiedlicher Belüftungsstrategie

Maßgeblich für die fermentative Produktion eines intrazellulären Metaboliten sind das

Zellvolumen sowie die Konzentration, die der Metabolit dort erreicht. Die Tauglichkeit des

Stammes S. cerevisiae ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 für die L-G3P-Produktion

hängt davon ab, ob es möglich ist, Fermentationsbedingungen zu finden, unter denen

Biomasse- und Produktbildung in ausreichendem Maß erfolgen. Um über die geringe

Zelldichte der Vorgängerstudie hinauszukommen, wurde die Fermentationszeit verlängert und

durch ein Fed-Batch-Verfahren die nicht-limitierende Versorgung mit Glucose, Vitaminen

und Spurenelementen sichergestellt. Für die Wahl der Belüftungsstrategie waren mehrere

bekannte Phänomene zu berücksichtigen: Einerseits zeigte die S. cerevisiae ∆gpp1/2-Mutante

in anaerober Batch-Fermentation einen Wachstumsdefekt (Pahlman et al. 2001; Nguyen et al.

2004), andererseits verstärkt das Wachstum unter anaeroben Bedingungen den

Kohlenstofffluss durch den Glycerolbiosynthese-Weg (Ansell et al. 1997), und die

intrazelluläre Akkumulation von L-G3P ist in der ∆gpp1/2-Mutante unter anaeroben

Bedingungen weit höher als unter aeroben (Pahlman et al. 2001; Nguyen et al. 2004). Dieser

Ausgangslage wurde mit zwei unterschiedlichen Strategien Rechnung getragen. (1) Zum

einen wurde der Versuch unternommen, Biomasseproduktion und Produktbildung zeitlich zu

trennen. Dazu wurde eine Zwei-Phasen-Fermentation durchgeführt, bei der auf anfängliche

starke Belüftung (aerobe Phase, Biomasseproduktion) eine Begasung mit Stickstoff folgte

(anaerobe Phase, L-G3P-Bildung). Da in allen vorherigen Studien nur während des

logarithmischen Wachstums Daten gesammelt wurden und die Glycerolbiosynthese mit dem

Redoxgleichgewicht während des Wachstums in Zusammenhang gebracht wird, konnte nicht

ausgeschlossen werden, dass die Produktbildung – auch unter anaeroben Bedingungen – nur

in wachsenden Zellen erfolgt. In diesem Fall würde mit der ersten Belüftungsstrategie nur

wenig L-G3P produziert, da die Kultur nach der Begasung mit Stickstoff nicht mehr wächst.

(2) Als zweite Belüftungsstrategie wurde daher eine kontinuierliche, aber minimale

Sauerstoffversorgung angestrebt, bei der die Zellen den zur Verfügung stehenden Sauerstoff

vollständig konsumieren (microaerobe Fermentation).

52

Beide Fermentationen wurden über eine Dauer von rund 50 Stunden durchgeführt. Auf eine

hohe zeitliche Auflösung bei der Erhebung der Daten wurde Wert gelegt. Verfolgt wurden

Biomasse, der prozentuale Anteil lebender Zellen, Glucose, sowie relevante intra- und

extrazelluläre Fermentationsprodukte (L-G3P, Glycerol, Ethanol).

Bestimmte Muster im Verlauf der Biomasse- und L-G3P-Produktion prägten sich in beiden

Fermentationen aus, obwohl sich die Fermentationen aufgrund der unterschiedlichen

Belüftungsstrategie insgesamt unterschieden. Diese Muster bilden den Phänotyp des Stammes

∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 und werden im Folgenden beschrieben.

3.1.1.1 Biomasse-Produktion

Während der Zwei-Phasen-Fermentation wurden innerhalb von 24 h im 2 Liter-Ansatz 24 g

Biomasse produziert mit einer maximalen spezifischen Wachstumsrate von µ=0,17 h-1. Nach

rund 24 h erreichte die Biomasse ein Plateau (Abb. 3.1.1A). In der microaeroben

Fermentation war die Biomasseproduktion mit 18 g etwas geringer, vor allem aber wurde das

Plateau später, nämlich nach 30 h erreicht (Abb. 3.1.1B). Dies ging mit einer maximalen

spezifischen Wachstumsrate von µ=0,14 h-1 einher.

3.1.1.2 L-G3P-Produktion insgesamt (intra- plus extrazellulär)

Intrazelluläres L-G3P wird durch Kochen der Zellsuspension vollständig in das Medium

freigesetzt (E. Nevoigt, persönliche Mitteilung). Auf diese Weise wurde in jeder Probe intra-

und extrazelluläres Produkt vereinigt und seine Gesamtkonzentration bestimmt. Die

Produktion von L-G3P insgesamt (intra- plus extrazellulär) zeigte als besondere Eigenschaft

die Ausbildung von Maxima: Bei der Zwei-Phasen-Fermentation trat ein Maximum während

der aeroben und ein Plateau während der anaeroben Phase auf, bei der microaeroben

Fermentation ein Maximum. Die Akkumulation von L-G3P erfolgte in der Zwei-Phasen-

Fermentation etwas rascher als in der microaeroben Fermentation. Am Ende der aeroben

Phase fiel L-G3P deutlich ab, woraufhin mit Stickstoff begast wurde. L-G3P stieg dann erneut

rasch an, um schließlich ein Plateau zu erreichen (Abb. 3.1.1A). In der microaeroben

Fermentation akkumulierte L-G3P nicht nur etwas langsamer, sondern nahm auch wesentlich

langsamer ab als in der aeroben Phase der Zwei-Phasen-Fermentation. Die Stabilität des

Produktes in der Kultur war also unter microaeroben Bedingungen größer als unter aeroben.

Die L-G3P-Ausbeute hing offensichtlich von der Belüftungsstrategie ab.

Relevante Aspekte für die Produktion von L-G3P insgesamt (intra- plus extrazelluläres

L-G3P) sind in Tabelle 3.1 vergleichend zusammengestellt.

53

A

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 10 20 30 40 50 60

Fermentationszeit (h)

L-G

3P (

mg)

0

5

10

15

20

25

Bio

mas

se (

g)

L-G3P

Biomasse

B

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 10 20 30 40 50 60


L-G

3P (

mg)

0

5

10

15

20

25

Bio

mas

se (

g)L-G3P

Biomasse

Abb. 3.1.1. L-G3P- und Biomasse-Produktion mit S. cerevisiae ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1. Gezeigt sind die erhobenen Daten (Punkte) und ihre Repräsentationen durch gestückelte Polynome 3. Grades (durchgezogene Linien).

A Zwei-Phasen-Fermentation im Fed-Batch-Verfahren (2–5 % Glucose). Nach 27 h Fermentationszeit (gestrichelte Linie) wurde die Kultur statt mit Luft mit Stickstoff begast.

B Microaerobe Fermentation im Fed-Batch-Verfahren (2–5 % Glucose). Nach 10 h Fermentationszeit ohne Belüftung war kein Sauerstoff mehr detektierbar. Anschließend erfolgte minimale Belüftung, die Sauerstoffkonzentration blieb unter dem Detektionslimit.

54

Tabelle 3.1. Eigenschaften der L-G3P-Produktion mit dem S. cerevisiae Produktionsstamm ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 im 2 l-Maßstab. Gezeigt sind Daten zum Zeitpunkt des maximalen Titers (intra- plus extrazelluläres L-G3P) in verschiedenen Phasen von Fed-Batch-Fermentationen von 2–5 % Glucose.

Zwei-Phasen-Fermentation

Aerobe Phase Anaerobe Phase

Microaerobe Fermentation

Fermentationszeit (h), zu der der maximale Titer erreicht wird

20 45 32

Maximaler Titer insgesamt (intra- plus extrazelluläres L-G3P, mg/l)

215

325

288

Ausbeute pro Biomasse (mg/g Hefetrockenmasse)

21 23 24

Stabilität des Produktes – + +

Steigerung des maximalen Titers gegenüber Nguyen et al. (2004)

17-fach 25-fach 22-fach

Die Ausbeuten der L-G3P Produktion insgesamt (intra- plus extrazellulär) bezogen auf

Biomasse, Glucose und Fermentationszeit waren zu unterschiedlichen Zeiten maximal, wie in

Tabelle 3.2 zusammengestellt. Während der höchste Produkttiter in der anaeroben Phase

erreicht wurde, war die Ausbeute bezogen auf Biomasse oder Glucose in der microaeroben

Fermentation am größten. Hinsichtlich der maximalen Ausbeute pro Zeit unterschieden sich

die drei Phasen kaum.

Tabelle 3.2. Maximale Ausbeuten von L-G3P bezogen auf Biomasse, Glucose und Fermentationszeit bei der fermentativen Produktion von L-G3P mit dem S. cerevisiae Produktionsstamm ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1. Gezeigt sind Daten aus verschiedenen Phasen von Fed-Batch-Fermentationen von Glucose im 2 l-Maßstab.

Zwei-Phasen-Fermentation

Aerobe Phase Anaerobe Phase


Maximale Ausbeute pro Biomasse (mg L-G3P/g Hefetrockenmasse)

28

(13-17 h)

23

(37-48)

31

(13-22 h)

Maximale Ausbeute pro Glucose (mg L-G3P/g Glucose)

6,4

(12 h)

1,6

(29 h)

17,6

(14 h)

Maximale Produktionsrate (mg L-G3P/h)

17

(18 h)

15

(32 h)

16

(20 h)

Durch die Stabilität des Produktes sind die anaerobe Phase der Zwei-Phasen-Fermentation

und die microaerobe Fermentation grundsätzlich für die Ernte von L-G3P geeignet.

55

Außerdem ist es möglich, in der aeroben Phase der Zwei-Phasen-Fermentation zu ernten,

bevor L-G3P das Maximum erreicht hat und seine rasche Abnahme zu erwarten ist (<< 20 h).

Allerdings liegt zu diesem Zeitpunkt noch kein hoher Titer vor.

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 10 20 30 40 50 60


Spe

zifis

che

Pro

dukt

ions

rate

(mg

L-G

3P/(

h*g

Bio

mas

se))

Zwei-Phasen-Fermentation(aerob/anaerob)


Abb. 3.1.2. Spezifische L-G3P-Produktionsrate von S. cerevisiae ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 in Zwei-Phasen-Fermentation und microaerober Fermentation. * Zeitpunkt hoher spezifischer Produktionsrate unmittelbar nach dem Shift zur Anaerobiose.

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 0,05 0,1 0,15 0,2

µ (h -1)

Spe

zifis

che

Pro

dukt

ions

rate

(m

g L-

G3P

/(h*

g B

iom

asse

)) Zwei-Phasen-Fermentation(aerobe Phase)

Zwei-Phasen-Fermentation(anaerobe Phase)


Abb. 3.1.3. Korrelation von spezifischer L-G3P-Produktionsrate und spezifischer Wachstumsrate µ von S. cerevisiae ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1.

*

56

3.1.1.3 Gegenüberstellung von spezifischer L-G3P-Produktionsrate und Wachstumsrate

Die spezifische Produktionsrate wies in beiden Fermentationen deutliche Schwankungen auf

(Abb. 3.1.2). In der Zwei-Phasen-Fermentation stieg sie nach der Begasung mit Stickstoff

stark an (Wert nicht ermittelbar). Zu diesem Zeitpunkt (*) wurde schnell

wachstumsentkoppelt L-G3P gebildet. Ansonsten wiesen beide Fermentationen Phasen der

Kopplung von L-G3P-Produktion und Wachstum auf, was sich am linearen Zusammenhang

von spezifischer Produktionsrate und spezifischer Wachstumsrate ablesen lässt (Abb. 3.1.3).

In der Zwei-Phasen-Fermentation bestand wachstumsgekoppelte Produktion während des

gesamten Wachstums, d. h. ausschließlich in der aeroben Phase und nur bevor das Plateau der

Biomasse erreicht war (während der ersten 24 h Fermentationszeit). In der microaeroben

Fermentation bestand durchweg Wachstumskopplung.

3.1.2 Unterscheidung in extra- und intrazelluläres L-G3P

3.1.2.1 Extrazelluläres L-G3P: zeitlicher Verlauf und Herkunft

Bei der Messung von L-G3P im zellfreien Kulturüberstand wurden überraschenderweise

nennenswerte, im Lauf beider Fermentationen kontinuierlich zunehmende Mengen des

Produktes gefunden (Abb. 3.1.4). Am Ende beider Fermentationen lag der bei weitem größte

Teil des produzierten L-G3Ps außerhalb der Zellen vor.

Extrazelluläres L-G3P könnte aus toten Zellen mit zerstörter Plasmamembran entlassen

worden sein. Da in dieser Arbeit der Anteil lebender Zellen an der Gesamtzellzahl mittels

Methylenblau-Färbung über den gesamten Fermentationszeitraum verfolgt wurde, konnte der

Anteil des extrazellulären L-G3Ps, das aus toten Zellen stammte, abgeschätzt werden. In der

Zwei-Phasen-Fermentation sank der Anteil lebender Zellen innerhalb der ersten 13 h von

100 % auf rund 87 %, um dann stabil zu bleiben und auch nach dem plötzlichen Einsetzen der

Anaerobiose nicht weiter abzunehmen (Abb. 3.1.5A). In der microaeroben Fermentation

wurde 40 h lang ein Anteil lebender Zellen nahe 100 % aufrecht erhalten, der dann bis zum

Ende der Fermentation auf 70 % abfiel (Abb. 3.1.5B). L-G3P aus lebenden Zellen wurde als

Differenz des extrazellulären L-G3Ps und des aus toter Biomasse freigesetzten L-G3Ps

bestimmt und machte den größten Teil des extrazellulären L-G3Ps aus (Abb. 3.1.5A/B). L-

G3P aus toten Zellen konnte demnach das Vorkommen extrazellulären L-G3Ps in keiner der

beiden Fermentationen erklären.

57

A

0

100

200

300

400

500

0 10 20 30 40 50 60


L-G

3P (

mg)

Intrazelluläres L-G3P

Extrazelluläres L-G3P

B

0

100

200

300

400

500

0 10 20 30 40 50 60


L-G

3P (

mg)

Intrazelluläres L-G3P

Extrazelluläres L-G3P

Abb. 3.1.4. Verteilung der L-G3P-Produktion mit S. cerevisiae ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 auf intrazelluläres und extrazelluläres L-G3P. Extrazelluläres L-G3P wurde im Kulturüberstand bestimmt, gezeigt sind die erhobenen Daten (Punkte) und ihre Repräsentation durch gestückelte Polynome 3. Grades (Linien). Intrazelluläres L-G3P wurde arithmetisch aus Gesamt-L-G3P und extrazellulärem L-G3P bestimmt und ist daher lediglich als Linie dargestellt.

A Zwei-Phasen-Fermentation im Fed-Batch-Verfahren (2–5 % Glucose). Nach 27 h Fermentationszeit wurde die Kultur statt mit Luft mit Stickstoff begast.

B Microaerobe Fermentation im Fed-Batch-Verfahren (2–5 % Glucose). Nach 10 h Fermentationszeit ohne Belüftung war kein Sauerstoff mehr detektierbar. Anschließend erfolgte minimale Belüftung mit pO2 unter dem Detektionslimit.

58

A

0

100

200

300

400

500

0 10 20 30 40 50 60


L-G

3P (

mg)

0

20

40

60

80

100

Ant

eil l

eben

der

Zel

len

(%)

Extrazelluläres L-G3P(gemessen)

Extrazelluläres L-G3Paus lebenden Zellen(errechnet)

Anteil lebender Zellen ander Gesamtzellzahl

B

0

100

200

300

400

500

0 10 20 30 40 50 60


L-G

3P (

mg)

0

20

40

60

80

100A

ntei

l leb

ende

r Z

elle

n (%

)

Extrazelluläres L-G3P(gemessen)

Extrazelluläres L-G3Paus lebenden Zellen(errechnet)

Anteil lebender Zellenan der Gesamtzellzahl

Abb. 3.1.5 Vergleich des gemessenen extrazellulären L-G3Ps mit dem extrazellulären L-G3P, das aus lebenden Zellen freigesetzt wurde, und dem prozentualen Anteil lebender Zellen an der Gesamtzellzahl. Dieser wurde durch Lebendfärbung mit Methylenblau bestimmt (Punkte). Extrazelluläres L-G3P ist als polynomische Repräsentation dargestellt (durchgezogene Linie). Extrazelluläres L-G3P aus lebenden Zellen wurde arithmetisch aus Biomasse, dem Anteil lebender Zellen, Gesamt-L-G3P und extrazellulärem L-G3P ermittelt und ist als unterbrochene Linie dargestellt (vgl. 2.2.6).

A Zwei-Phasen-Fermentation im Fed-Batch-Verfahren.

B Microaerobe Fermentation im Fed-Batch-Verfahren.

59

3.1.2.2 Intrazelluläres L-G3P: zeitlicher Verlauf

Da L-G3P bei jeder Probennahme sowohl in der Kultur insgesamt (vgl. Abschnitt 3.1.1) als

auch im zellfreien Kulturmedium gemessen wurde (extrazelluläres L-G3P), war es möglich,

durch Bildung der Differenz den Verlauf des intrazellulären L-G3Ps darzustellen (Abb. 3.1.4).

Die Gegenüberstellung von extra- und intrazellulärem L-G3P lieferte eine Erklärung dafür,

warum sich die Stabilität von L-G3P insgesamt (intra- plus extrazellulär) im Fermenter in den

verschiedenen Phasen der Fermentation unterschied (vgl. Abschnitt 3.1.1). Am Maximum der

aeroben Phase der Zwei-Phasen-Fermentation lag L-G3P zum großen Teil intrazellulär vor

und wurde degradiert. Am Maximum der anaeroben Phase und am Maximum der

microaeroben Fermentation lag der größte Teil des L-G3Ps extrazellulär vor und wurde nicht

degradiert. Extrazelluläres L-G3P nahm in allen Phasen kontinuierlich zu. Die Maxima von

L-G3P insgesamt (Abb. 3.1.1A/B und Abschnitt 3.1.1) waren daher Maxima des

intrazellulären L-G3Ps.

3.1.2.3 Konzentrationsgefälle von L-G3P über die Plasmamembran

Die Abbildungen 3.1.4A/B zeigen die Verteilung des gesamten L-G3Ps im Fermenter auf

extrazelluläre und intrazelluläre Anteile. Sie sagen nichts über die Konzentrationsverhältnisse

aus. Während die extrazelluläre L-G3P-Konzentration direkt gemessen wurde, wurde die

Darstellung des Verlaufs der intrazellulären Konzentration durch eine zweite arithmetische

Operation möglich: Die Menge an intrazellulärem L-G3P wurde durch die Menge der

Biomasse geteilt (Abb. 3.1.6). Die Maxima der intrazellulären Konzentration lagen in der

Zwei-Phasen-Fermentation bei 13 h (aerobe Phase) und 32 h (anaerobe Phase), in der

microaeroben Fermentation bei 17 h. In beiden Fermentationen machte die Biomasse nur

einen kleinen Teil des Volumens aus. Das Konzentrationsgefälle war also stets groß (vgl.

Tabelle 3.3) und reichte somit als Triebkraft für einen diffusionsgetriebenen Prozess aus.

Dieser Befund entsprach der erwarteten Barrierefunktion der Plasmamembran für L-G3P.

60

Tabelle 3.3. Konzentrationsverhältnisse von L-G3P innerhalb und außerhalb der Zellen in verschiedenen Phasen von Fed-Batch-Fermentationen von Glucose im 2 l-Maßstab mit dem S. cerevisiae Produktionsstamm ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1.

Fermentations-Phase

Zeitpunkt (h) Intrazelluläre L-G3P-

Konzentration (mM)

Extrazelluläre L-G3P-

Konzentration (mM)

Innen:Außen

Aerob 13

(maximale L-G3P-Innenkonzentration)

96,5

0,1

843:1

Aerob 20

(maximaler L-G3P-Titer) 65,0 0,3 205:1

Aerob 27

(minimaler L-G3P-Titer) 15,4 0,5 34:1

Anaerob 45

(maximaler L-G3P-Titer) 33,2 1,2 26:1

Microaerob 17

(maximale L-G3P-Innenkonzentration)

107,6

0,2

560:1

Microaerob 32

(maximaler L-G3P-Titer 47,9 0,9 53:1

Microaerob 54

(Ende der Fermentation) 8,5 1,2 7:1

3.1.2.4 Freisetzung von L-G3P aus den Zellen

Um die Freisetzung von L-G3P aus den Zellen zu beschreiben, müssen die

Konzentrationsverhältnisse an der einzelnen Zelle betrachtet werden. Eine sinnvolle

Erklärung der Freisetzung von L-G3P aus lebenden Zellen hat als Mindestvoraussetzung, dass

ein Zusammenhang zwischen dem Konzentrationsgefälle von L-G3P über die

Plasmamembran und der Freisetzungsrate hergestellt werden kann. Dies würde für eine

diffusionsgetriebene Ausscheidung – sei es über die Plasmamembran, sei es durch eine

Permease – sprechen.

Freisetzungsraten von L-G3P aus den Zellen wurden nicht gemessen, sondern aus den

Polynomen für L-G3P und Biomasse ermittelt. Einschränkungen sind Unsicherheit im

Bereich kleiner Werte und über die absoluten Werte von Maxima und Minima sowie

Unschärfe der zeitlichen Auflösung. Daher kann Abb. 3.1.6 aus methodischen Gründen nur

ein grobes und qualitatives Bild der Zusammenhänge liefern.

61

A

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60


L-G

3P (

mg/

g B

iom

asse

)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Spe

zifis

che

Fre

iset

zung

srat

e(m

g L-

G3P

/(h*

g B

iom

asse

))

Intrazelluläre L-G3P-Konzentration

SpezifischeFreisetzungsrate

B

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60


L-G

3P (

mg/

g B

iom

asse

)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4S

pezi

fisch

e F

reis

etzu

ngsr

ate

(mg

L-G

3P/(

h*g

Bio

mas

se))

Intrazelluläre L-G3P-Konzentration

SpezifischeFreisetzungsrate

Abb. 3.1.6. Zeitlicher Zusammenhang der spezifischen L-G3P-Freisetzungsrate und der spezifischen intrazellulären L-G3P-Akkumulation von S. cerevisiae ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1. Die spezifische Freisetzungsrate wurde arithmetisch aus Biomasse und extrazellulärem L-G3P bestimmt und ist als gestrichelte Linie dargestellt. Die intrazelluläre L-G3P-Konzentration wurde arithmetisch aus Biomasse, Gesamt-L-G3P und extrazellulärem L-G3P bestimmt und ist als durchgezogene Linie dargestellt.



62

Dennoch konnten die Graphen der spezifischen Freisetzungsrate und der intrazellulären

L-G3P-Konzentration in der aeroben Phase der Zwei-Phasen-Fermentation überraschend gut

zur Deckung gebracht werden: Anstieg und Abfall der intrazellulären Konzentration gingen

mit einer Beschleunigung bzw. Verlangsamung der Freisetzung einher (Abb. 3.1.6A). In der

anaeroben Phase der Zwei-Phasen-Fermentation folgte die spezifische Freisetzungsrate dem

Anstieg des intrazellulären L-G3Ps (Abb. 3.1.6A). In der microaeroben Fermentation

korrespondierte ein Maximum der cytosolischen L-G3P-Konzentration ebenfalls mit einem

Maximum der spezifischen Freisetzungsrate. Der zeitliche Zusammenhang war hier aber

weniger deutlich. (Abb. 3.1.6B).

3.1.3 Limitationen der L-G3P-Produktion

Die L-G3P-Produktion wurde maßgeblich limitiert durch das eingeschränkte Wachstum des

Produktionsstammes und durch die Bildung von Glycerol.

3.1.3.1 Gegenüberstellung von intrazellulärer L-G3P-Konzentration und

Wachstumsrate

Das exponentielle Wachstum des Produktionsorganismus mit maximalem µ bestand in beiden

Fermentationen nur kurzzeitig, beispielsweise in der microaeroben Fermentation lediglich

über einen Zeitraum von 1–2 h (Abb. 3.1.7). Der Vergleich des zeitlichen Verlaufs von

intrazellulärer L-G3P-Konzentration und spezifischer Wachstumsrate sollte darüber

Aufschluss geben, ob die hohe L-G3P-Konzentration im Cytosol für die

Wachstumsbegrenzung verantwortlich war. Die entsprechenden Graphen der microaeroben

Fermentation weisen ein nahezu zeitgleiches Maximum auf und verlaufen im Anstieg

annährend parallel, was bedeutet, dass eine hohe intrazelluläre L-G3P-Konzentration mit

einer hohen spezifischen Wachstumsrate vereinbar war. Was diese förderlichen Bedingungen

sein könnten, wird durch das Auseinanderlaufen der Graphen im Abfall deutlich: Im

Unterschied zur intrazellulären L-G3P-Konzentration verlief die spezifische Wachstumsrate µ

nicht achsensymmetrisch zu ihrem Maximum, sondern nahm schneller ab, als sie angestiegen

war; die gleiche intrazelluläre L-G3P-Konzentration im Anstieg und Abstieg fiel zeitlich mit

zwei sehr verschiedenen spezifischen Wachstumsraten zusammen (Abb. 3.1.7 und Tab. 3.4).

Asymmetrische Bedingungen im Fermenter, die für den Wachstumsstopp des Stammes

verantwortlich sein könnten, sind die abfallende Sauerstoffkonzentration und die ansteigende

Ethanolkonzentration. Die Akkumulation von L-G3P im Cytosol ist also nicht die einzige

Ursache für die rasche und frühzeitige Abnahme der Wachstumsrate.

63

Da nicht ausgeschlossen ist, dass G3P ebenso wie DHAP und GAP in erhöhten

Konzentrationen die De-novo-Synthese von Inositol hemmt (Shi et al. 2005), wurde eine

wachstumsabhängige Fütterung mit Inositol vorgenommen (vgl. 2.2.2). Der Inositolgehalt des

Mediums war daher keine asymmetrische Bedingung im Fermenter, die für den frühen

Einbruch der spezifischen Wachstumsrate hätte verantwortlich sein können.

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60

Fermentationszeit

L-G

3P (

mg/

g H

efet

rock

enm

asse

)

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

µ (h

-1)

Intrazelluläres L-G3P(microaerob)

µ

Abb. 3.1.7. Zeitlicher Zusammenhang der spezifischen Wachstumsrate µ und der spezifischen intrazellulären L-G3P-Akkumulation von S. cerevisiae ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 in microaerober Fermentation im Fed-Batch-Verfahren. Die spezifische Wachstumsrate ist in Form von Punkten dargestellt. Die intrazelluläre L-G3P-Konzentration wurde arithmetisch aus Biomasse, Gesamt-L-G3P und extrazellulärem L-G3P bestimmt und ist als Linie dargestellt. Die Zeitpunkte, zu denen Vitamine inklusive Inositol gefüttert wurden, sind mit Pfeilen angezeigt (11, 15 und 24 h Fermentationszeit).

Tabelle 3.4. Asymmetrische Bedingungen im Fermenter während der microaeroben Fed-Batch-Fermentation von Glucose im 2 l-Maßstab mit dem S. cerevisiae Produktionsstamm ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1. Verglichen sind die Bedingungen, die bei der intrazellulären L-G3P-Konzentration von 21 mg/g Hefetrockenmasse vorlagen (Zeile 2).

Fermentationszeit (h) 11 24

Intrazelluläre L-G3P-Konzentration (mg/g Hefetrockenmasse) 21

Spezifische Wachstumsrate µ 0,11 0,04

pO2 (% O2-Sättigung) 2,2 0,0

Ethanolkonzentration im Fermenter (% (w/v)) 0,44 3,13

64

3.1.3.2 Korrelation von Ethanolkonzentration und Wachstumsrate

0

2

4

6

8

10

12

0 10 20 30 40 50 60


Gly

cero

l (g)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Eth

anol

(g)

Glycerol Zwei-Phasen-Fermentation(aerob/anaerob)

Glycerol MicroaerobeFermentation

Ethanol Zwei-Phasen-Fermentation(aerob/anaerob)

Ethanol MicroaerobeFermentation

Abb. 3.1.8. Glycerol- und Ethanolproduktion mit S. cerevisiae ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 in Zwei-Phasen-Fermentation und microaerober Fermentation im Fed-Batch-Verfahren. Gezeigt sind die erhobenen Daten (Punkte) und ihre Repräsentationen durch gestückelte Polynome 3. Grades (Linien, nur für Glycerol).

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

0 20 40 60 80 100 120

Ethanolkonzentration (g/l)

µ (h

-1) Zwei-Phasen-Fermentation

(aerob/anaerob)


Abb. 3.1.9. Korrelation der spezifischen Wachstumsrate µ mit der Ethanolkonzentration in Zwei-Phasen-Fermentation und microaerober Fermentation.

65

Durch den fermentativen Energiestoffwechsel entstand in beiden Fermentationen als ein

Hauptfermentationsprodukt kontinuierlich Ethanol (Abb. 3.1.8). Die Ethanolsensitivität von

S. cerevisiae ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 war groß: Halbmaximal wurde die

spezifische Wachstumsrate in der aeroben Phase der Zwei-Phasen-Fermentation und in der

microaeroben Fermentation bei rund 3 % (w/v). Unabhängig vom Sauerstoffangebot kam das

Wachstum des Stammes ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 unter aeroben und

microaeroben Bedingungen bei 7–8 % (w/v) Ethanol vollständig zum Erliegen (Abb. 3.1.9).

3.1.3.3 Gegenüberstellung von Glycerolproduktion und intrazellulärer L-G3P-

Konzentration

Trotz der Deletion beider Isogene für die Glycerol-3-Phosphatase wurden in beiden

Fermentationen überraschenderweise nennenswerte Mengen an Glycerol produziert (Abb.

3.1.8), möglicherweise direkt auf Kosten der L-G3P-Produktion. Der Weg, auf dem dies

geschah, muss zunächst als unbekannt bezeichnet werden. Die erhobenen Daten geben jedoch

Hinweise auf den Mechanismus. Zum einen wiesen die spezifische Glycerolproduktionsrate

und die spezifische Wachstumsrate µ keine lineare Korrelation auf, die Glycerolproduktion

erfolgte also – im Gegensatz zur L-G3P-Produktion – nicht wachstumsgekoppelt (Abb.

3.1.10). Stattdessen zeigten die intrazelluläre L-G3P-Konzentration und die spezifische

Glycerolproduktionsrate zeitgleich ein Maximum (Abb. 3.1.11). Beides ist mit dem

Mechanismus vereinbar, dass Glycerol intrazellulär durch Dephosphorylierung von L-G3P

entstand.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 0,05 0,1 0,15 0,2

µ (h -1)

Spe

zifis

che

Gly

cero

lpro

dukt

ions

rate

(mg/

h*g

Hef

etro

cken

mas

se)

Zwei-Phasen-Fermentation(aerobe Phase)

Zwei-Phasen-Fermentation(anaerobe Phase)


Abb. 3.1.10 Korrelation von spezifischer Glycerolproduktionsrate und spezifischer Wachstumsrate µ von S. cerevisiae ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1.

66

A

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60


L-G

3P (

mg/

g H

efet

rock

enm

asse

)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Spe

zifis

che

Gly

cero

lpro

dukt

ions

rate

(m

g/h*

gHef

etro

cken

mas

se)

Intrazelluläres L-G3P(aerob/anaerob)

Glycerolproduktionsrate

B

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60

Fermentationszeit

L-G

3P (

mg/

g H

efet

rock

enm

asse

)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Spe

zifis

che

Gly

cero

lpro

dukt

ions

rate

(mg/

h*g

Hef

etro

cken

mas

se)

Intrazelluläres L-G3P(microaerob)

Glycerolproduktionsrate

Abb. 3.1.11. Zeitlicher Zusammenhang der spezifischen Glycerolproduktionsrate und der spezifischen intrazellulären L-G3P-Akkumulation von S. cerevisiae ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1. Die spezifische Glycerolproduktionsrate wurde arithmetisch aus Biomasse und Glycerol ermittelt und ist als gestrichelte Linie dargestellt. Die intrazelluläre L-G3P-Konzentration wurde arithmetisch aus Biomasse, Gesamt-L-G3P und extrazellulärem L-G3P bestimmt und ist als durchgezogene Linie dargestellt.



67

3.2 Expression des Glycerol-3-Phosphat-Transporters (GlpT) aus E. coli in

S. cerevisiae ∆∆∆∆gpp1/2

Trotz erheblicher intrazellulärer Akkumulation von L-G3P erfolgte die Ausscheidung aus

S. cerevisiae langsam (vgl. 3.1.2). Da extrazelluläres L-G3P nicht degradiert wurde, kann die

fermentative Produktion von L-G3P mit S. cerevisiae wahrscheinlich gesteigert werden, wenn

es vom Produktionsstamm schneller, kontinuierlich und spezifisch ausgeschieden wird.

Zudem verspricht eine schnellere Ausscheidung die Produktion von mehr L-G3P pro

Biomasse und möglicherweise auch ein besseres Wachstum des Produktionsstammes (vgl.

3.1.3.1).

Homologe L-G3P-Transporter sind nicht bekannt (vgl. 1.1.3). Bei der Wahl eines geeigneten

heterologen Transporters wurden sowohl die Transporteigenschaften als auch die

Wahrscheinlichkeit erfolgreicher Expression in S. cerevisiae berücksichtigt. Wie begründet

(vgl. 1.4), fiel die Wahl auf den Glycerol-3-Phosphat-Transporter GlpT von E. coli.

Um zunächst kein Zwei-Vektor-System handhaben zu müssen, wurde für die Expression von

GlpT die ∆gpp1/2-Mutante von S. cerevisiae ohne Überexpression von GPD1 gewählt. Dieser

Stamm akkumuliert so viel L-G3P, dass die Aktivität von GlpT anhand einer möglichen

Veränderung des Konzentrationsgefälles von L-G3P über die Plasmamembran geprüft werden

kann (E. Nevoigt, persönliche Mitteilung). Im Erfolgsfall sollten GlpT und GPD1 später

gemeinsam überexprimiert werden.

3.2.1 Klonierung und Nachweis der Expression von GlpT auf Proteinebene

Das Gen glpT wurde aus einer Gesamt-DNA-Präparation von E. coli DH5α mit PCR

amplifiziert. Um die Expression und Lokalisierung des heterologen Membranproteins in

S. cerevisiae zu verfolgen und gleichzeitig möglichst wenig zu stören, wurde dabei das kleine

c-Myc-Epitop mithilfe verlängerter Primer C- oder N-terminal angehängt. Der Bereich um

das Startcodon wurde für eine verbesserte Expression leicht modifiziert (Miyasaka 1999) und

die Expressionskassette über Kpn I und Bgl II hinter den ADH1-Promoter des Multicopy-

Plasmids pFLAT1 kloniert (Abb. 3.2.1A/B).

68

A

3,0 Kb

1,5 Kb

0 0Konzentration derTemplate-DNA

C GeneRulerTM NA

3,0 Kb

1,5 Kb


C GeneRulerTM NA

3,0 Kb

1,5 Kb


C GeneRulerTM N

3,0 Kb

1,5 Kb


C GeneRulerTM N

3,0 Kb

1,5 Kb


C GeneRulerTM N

B

Mlu IKpn I Bgl II

…ATG…c-Myc GlpT

…ATG…c-MycGlpT N

C

BB

Mlu IMlu IKpn I Bgl II

…ATG…c-Myc GlpT

…ATG…c-MycGlpT N

C

Abb. 3.2.1. Klonierung der GlpT-Kassetten in einen Expressionsvektor für die heterologe Expression mit c-Myc-Epitop in S. cerevisiae.

A Amplifikation der Expressionskassetten aus einer Präparation genomischer DNA von E. coli nach 20 Zyklen PCR. Schnittstellen für Restriktionsendonucleasen und die codierende Sequenz für das c-Myc-Epitop wurden über verlängerte Primer angefügt. Die Bande ist etwas kleiner als 1500 Kb (errechnete Größe 1359 Kb). C: Expressionskassette mit C-terminalem c-Myc-Epitop, N: Expressionskassette mit N-terminalem c-Myc-Epitop. Gezeigt sind je zwei verschiedene Konzentrationen der Template-DNA (ca. 10 ng, 1 ng) sowie die Negativkontrolle ohne Template-DNA (0). Als Größenstandard wurde GeneRulerTM DNA-Ladder Mix (100–10000 bp, Fermentas) verwendet.

B Plasmidkarte. Die Expressionskassetten wurden über die Schnittstellen für Kpn I und Bgl II in das Multicopy-Plasmid pFLAT1 zwischen den ADH1-Promoter und den TRP1-Terminator kloniert. Das Plasmid pFLAT1 (unveröffentlicht) wurde

69

freundlicherweise von Markus Veen zur Verfügung gestellt. ATG: optimierter Bereich um das Startcodon (Miyasaka 1999) mit einer zusätzlichen Schnittstelle für Mlu I, c-Myc: Sequenz für das c-Myc-Epitop, GlpT: E. coli glpT ohne Startcodon. Schnittstellen für Kpn I und Bgl II.

Die DNA-Sequenz von glpT in den Expressionsplasmiden pFLAT1-GlpT-Myc (C-terminales

c-Myc-Epitop) und pFLAT1-Myc-GlpT (N-terminales c-Myc-Epitop) wich an vier Positionen

vom Datenbankeintrag (GenBank gi:41586; gi:1788570; gi:1799578; gi:16127994) ab. Da

sich die Abweichungen in den beiden Amplifikationen derselben Template-DNA

unterschieden, sind die Basenaustauschreaktionen auf die verwendete Taq-Polymerase

zurückzuführen, obwohl für die Amplifizierung ein Enzym mit 3’>5’-Exonuclease

(Proofreading)-Funktion und lediglich 20 PCR-Zyklen gewählt wurden (ca. 1 Austausch pro

700 Basen). Drei der Basenaustauschreaktionen ereigneten sich in der Wobble-Position und

waren damit irrelevant. Ein einzelner Aminosäurenaustausch von Glycin nach Serin fand im

cytosolischen Schwanz des Transporters mit C-terminalem c-Myc-Epitop statt.

3.2.1.1 Kofraktionierung von GlpT mit Membranen von S. cerevisiae

Aus den mit GlpT transformierten Hefezellen wurden zwei Fraktionen von Proteinen

präpariert: Cytosolische Proteine, die direkt nach dem Zellaufschluss in wässriger Lösung

vorlagen (Cytosolische Fraktion), und Proteine, die aus dem 14000 g-Pellet mit 2 % SDS

extrahiert wurden (Membranfraktion). Für einen effizienten Transfer des Transporters mit

einem theoretischen pI von 8.7 beim Blotten wurde ein Transferpuffer mit pH 9.2 gewählt.

Transporter mit C- und N-terminalem c-Myc-Epitop wurden durch das gewählte Protokoll

erfolgreich präpariert und im Western Blot ausschließlich in der zweiten Fraktion

nachgewiesen, in der Membranproteine angereichert waren (Abb. 3.2.2).

70

2500 g-Pelletmit SDS

- C N +- C N +- C N +

ZelltrümmerMembranfraktionCytosolischeFraktion

14000 g-Pellet

mit SDSohne SDS


- C N +- C N +- C N +


14000 g-Pellet

mit SDSohne SDS


- C N +- C N +- C N +


14000 g-Pellet

mit SDSohne SDS

Abb. 3.2.2. Fraktionierung von Hefe-Proteinextrakten zum Nachweis von heterologem GlpT mit c-Myc-Epitop im Western Blot.

Durch Zentrifugation des Rohextraktes bei 14000 g wurden hydrophile lösliche Proteine weitgehend abgetrennt (Cytosolische Fraktion). Extraktion des 14000 g-Pellets mit SDS und Abtrennung nicht-extrahierbarer Zelltrümmer bei 2500 g ergab eine Aufkonzentrierung von membrangebundenen Proteinen (Membranfraktion). Erneute Extraktion des 2500 g-Pellets mit SDS kontrolliert die Effizienz der Extraktion der Membranfraktion (Zelltrümmer). Von jeder Fraktion wurden 85 µg Protein in einer Spur des SDS-Gels aufgetrennt, auf PVDF-Membran transferiert und mit Antikörpern gegen das c-Myc-Epitop detektiert.

–: S. cerevisiae mit leerem Vektor (Negativkontrolle), C: S. cerevisiae mit Expressionsvektor für GlpT mit C-terminalem c-Myc-Epitop, N: S. cerevisiae mit Expressionsvektor für GlpT mit N-terminalem c-Myc-Epitop, + : Proteine aus einem S. cerevisiae-Stamm, der ein cytosolisches Protein mit einem fünffachen c-Myc-Epitop überexprimiert (Positivkontrolle, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Jeffrey Smith).

71

3.2.1.2 Apparentes Molekulargewicht von heterolog exprimiertem GlpT

100 mM DTT im Probenpuffer ergaben im SDS-Gel ein apparentes Molekulargewicht von ca.

50 KDa, entsprechend dem theoretischen Wert. Ein nicht reduzierender Puffer ohne DTT oder

die Hitzeinaktivierung von DTT hatten ein apparentes Molekulargewicht von ca. 38 KDa zur

Folge, weshalb auf eine intramolekulare Brücke geschlossen wurde (Abb. 3.2.3).

72 KDa55 KDa40 KDa33 KDa

NC-

72 KDa55 KDa40 KDa33 KDa

NC-

Abb. 3.2.3. Veränderung des apparenten Molekulargewichts von GlpT durch unterschiedliche Reduktionskapazität des Probenpuffers.

Kein DTT im Probenpuffer, Inkubation 5 min bei 95 °C.

100 mM DTT im Probenpuffer, Inkubation 10 min bei 40 °C (Standardprotokoll).

100 mM DTT im Probenpuffer, Inkubation 5 min bei 95 °C (Hitzeinaktivierung von DTT, Kontrolle).

–: Proteine aus S. cerevisiae mit leerem Vektor (Negativkontrolle), C: Proteine aus S. cerevisiae mit Expressionsvektor für GlpT mit C-terminalem c-Myc-Epitop, N: Proteine aus S. cerevisiae mit Expressionsvektor für GlpT mit N-terminalem c-Myc-Epitop.

3.2.1.3 Abhängigkeit der Expressionsstärke von der Position des c-Myc-Epitops

Die Expressionsstärke von heterologem GlpT war von der Position des c-Myc-Epitops

abhängig: Das N-terminale Epitop bewirkte eine deutlich höhere Expressionsstärke im

Western Blot als das C-terminale. Mehrere unabhängige Experimente erlaubten aber nicht, das

Verhältnis im Western Blot reproduzierbar zu quantifizieren: Die Ergebnisse reichten von

doppelter bis zu achtfacher Expressionsstärke für GlpT mit N-terminalem Epitop (für ein

Beispiel vgl. Abb. 3.2.4A).

Northern Blots wurden durchgeführt, um zu prüfen, ob bereits die mRNA der beiden GlpT-

Konstrukte unterschiedliche Steady-State-Niveaus zeigte. Das war nicht der Fall; der

Unterschied in der Expressionsstärke lag also nicht auf Transkriptionsebene, sondern ging auf

einen posttranskriptionalen Mechanismus zurück (Abb. 3.2.4B).

72

18 µg 7µg 4µg35 µg

NC

A B

- C C N


NC


NC


NC

A B

- C C N- C C N

Abb. 3.2.4. Expressionsniveaus von GlpT in S. cerevisiae in Abhängigkeit von der Position des c-Myc-Epitops.

A Proteine (Western Blot). 35 µg Protein aus der Membranfraktion ergaben für GlpT mit C-terminalem c-Myc-Epitop (C) eine schwächere Bande als 18 µg Protein aus der Membranfraktion für GlpT mit N-terminalem c-Myc-Epitop (N).

B mRNA (Northern Blot). Aufgetragen wurden jeweils 5 µg Gesamt-RNA. Die Stärken der Banden von GlpT-mRNA mit C- und N-terminalem c-Myc-Epitop sind nicht zu unterscheiden. In der Gesamt-RNA eines mit leerem Expressionsvektor transformierten Hefestamms (-) war keine mRNA für GlpT nachweisbar.

3.2.1.4 Abhängigkeit der Expressionsstärke vom S. cerevisiae-Stammhintergrund

Da die Expressionsstärke des heterologen Transporters möglicherweise durch den gewählten

Stammhintergrund beeinflusst wurde, wurden verschiedene gebräuchliche Laborstämme

getestet, um einen möglicherweise besser geeigneten zu finden. Der Stammhintergrund

W303-1A, der dem hier verwendeten L-G3P-akkumulierenden Stamm ∆gpp1/2 mit oder ohne

Überexpression von GPD1 zu Grunde liegt, wies zwar geringere Transformationsraten auf als

beispielsweise der Stammhintergrund BY4741 (Daten nicht gezeigt), produzierte aber

zusammen mit dem CEN.PK2-1D am meisten GlpT. BY4741, ENY.WA-1A und AH22ura3

produzierten deutlich weniger GlpT, wobei AH22ura3 im verwendeten Medium störendes

Flockulationsverhalten an den Tag legte. GRF 18 zeigte eine mittlere Expression von GlpT

(Abb. 3.2.5). Die Expressionsstärke in den verschiedenen Stämmen erwies sich zudem als

stark davon abhängig, ob das jeweils passende Minimalmedium oder ein Vollmedium zur

Kultivierung verwendet wurde (Daten nicht gezeigt). Für eine gute Vergleichbarkeit wurden

die Stämme in dieser Versuchsreihe in synthetischem Dropout-Medium kultiviert.

BY4741AH22ura3GRF18ura3CEN.PK2ENY.WA-1AW303-1A BY4741AH22ura3GRF18ura3CEN.PK2ENY.WA-1AW303-1A

Abb. 3.2.6. Produktion von heterologem GlpT mit N-terminalem c-Myc-Epitop in verschiedenen Stammhintergründen von S. cerevisiae. Die Anzucht der Stämme erfolgte in synthetischem Vollmedium CSM-ura. Aufgetrennt wurden in jeder Spur 22,5 µg Protein aus der Membranfraktion.

73

3.2.2 Wachstumskurven des Wirtsstammes mit und ohne Expression des

heterologen Transmembranproteins

Da bei der Überexpression eines Transmembranproteins nicht ausgeschlossen werden kann,

dass eine förderliche Expressionsstärke überschritten wird, wurden Wachstumskurven mit der

∆gpp1/2-Mutante des W303-1A-Stammhintergrundes bei der Expression von GlpT mit

N- und C-terminalem c-Myc-Epitop aufgenommen. Den Vergleich bildete ein Kontrollstamm

mit dem leeren Plasmid pFLAT1 im gleichen Minimalmedium. Alle drei Stämme zeigten das

gleiche Wachstumsverhalten. Die maximale spezifische Wachstumsrate lag bei µ=0,26 h-1,

die stationäre Phase bei einer OD600=7. Übermäßiger zellulärer Stress und gegen die

heterologe Proteinexpression gerichteter Selektionsdruck durch Toxizität des Genprodukts

wurden damit ausgeschlossen (Abb. 3.2.6).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 20 40 60 80 100 120


OD

600 pFLAT1

pFLAT1-GlpT-Myc

pFLAT1-Myc-GlpT

Abb. 3.2.6. Wachstumskurven des Stammes S. cerevisiae W303-1A ∆gpp1/2 mit und ohne Überexpression von GlpT in Mineralmedium nach Verduyn et al. (2002) als aerobe Batch-Fermentationen von 2 % Glucose bei 28 °C.

20 ml-Vorkulturen wurden von der Masterplatte beimpft und 2 Tage lang geschüttelt. 100 ml-Hauptkulturen wurden zum Zeitpunkt 0 aus durchgewachsenen Vorkulturen auf eine Start-OD600 von 0,1 eingestellt.

Verglichen wurde S. cerevisiae mit leerem Vektor pFLAT1, S. cerevisiae mit Expressionsvektor für GlpT mit C-terminalem c-Myc-Epitop (pFLAT1-GlpT-Myc) und S. cerevisiae mit Expressionsvektor für GlpT mit N-terminalem c-Myc-Epitop (pFLAT1-Myc-GlpT).

Gezeigt ist ein repräsentatives Beispiel dreier unabhängiger Experimente.

74

3.2.3 Konzentrationsgefälle von L-G3P über die Plasmamembran von

S. cerevisiae ∆∆∆∆gpp1/2 mit Expression von GlpT

Um herauszufinden, ob heterolog exprimiertes GlpT in der Plasmamembran von S. cerevisiae

∆gpp1/2 hinreichend aktiv ist, wurden anaerobe 18-stündige Batch-Fermentationen von 2 %

Glucose durchgeführt. Unter diesen Bedingungen wird zu diesem Zeitpunkt ein stabiles

großes Konzentrationsgefälle von L-G3P über die Plasmamembran erreicht (E. Nevoigt,

persönliche Mitteilung). Ein Stamm mit funktionalem Glycerol-3-Phosphat-Transporter sollte

ein signifikant vermindertes Konzentrationsgefälle und/oder einen höheren Produkttiter

insgesamt (intra- plus extrazelluläres L-G3P) aufweisen als ein Kontrollstamm. Weder das

eine noch das andere konnte nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).

3.2.4 Diagnostische Transformationen von GlpT in Single-Knockout-Mutanten

des Stammes S. cerevisiae BY4741 mit Deletionen in Genen für

Mannosyltransferasen und Endoproteinasen

Hefespezifische posttranslationale Ereignisse können dafür verantwortlich sein, dass ein

bakterielles Protein nicht funktional ist. Daher wurde GlpT mit N-terminalem c-Myc-Epitop

in ausgewählten Single-Knockout-Mutanten aus dem Hefe-Deletionsprojekt von

EUROSCARF und im zugehörigen Wildtyp exprimiert und Expressionsstärke und apparentes

Molekulargewicht im Western Blot verfolgt.

Membranproteine werden in S. cerevisiae sequenzspezifisch glykosyliert. GlpT weist zwar

keine Sequenzmotive für die N-Glykosylierung, jedoch mehrere mutmaßliche Anker für die

O-Glykosylierung auf. Die O-Glykosylierung erfolgt im ER durch Mannosyltransferasen, die

in Komplexen arbeiten. Die Expression von GlpT in den Knockout-Mutanten pmt1, pmt2 und

pmt3 ergab keinen Hinweis auf Glykosylierung, da die Proteine im SDS-Gel mit

unverändertem apparenten Molekulargewicht liefen (Abb. 3.2.7A).

Single-Knockout-Mutanten von 13 Endoproteinasen und mutmaßlichen Endoproteinasen (vgl.

2.1.3) wurden eingesetzt, um mögliche Hinweise auf posttranslationale Degradierung und die

Lokalisierung von GlpT in S. cerevisiae zu erhalten. Kein Knockout schlug sich in einem

größeren apparenten Molekulargewicht im SDS-Gel nieder. Eine deutliche Steigerung der

Expressionsstärke wurde jedoch durch die Deletion von PEP4, dem Gen für die vakuoläre

Proteinase A, erzielt.

GlpT weist außerdem zwei spezifische, in der nativen Konformation allerdings cytosolische

Schnittstellen für Kexin auf. Dennoch war nach Deletion des KEX2-Strukturgens die

Expressionsstärke von GlpT reduziert statt erhöht (Daten nicht gezeigt). Das stark

75

beeinträchtigte Wachstum der Mutanten, wie es auch von B. Y. Zhang et al. (2001)

beobachtet wurde, legt nahe, dass es sich um einen unspezifischen Effekt handelte (Abb.

3.2.7B).

Die übrigen elf Knockouts von Endoproteinase-Genen, einschließlich von PRB1 für die

vakuoläre Proteinase B, beeinflussten die Expression von GlpT nicht (Daten nicht gezeigt).

A ∆pmt3∆pmt2∆pmt1wt ∆pmt3∆pmt2∆pmt1wt ∆pmt3∆pmt2∆pmt1wt

AH22 BY4741AH22 BY4741

∆pep4wtB

AH22 BY4741AH22 BY4741

∆pep4wt

AH22 BY4741AH22 BY4741

∆pep4wtB

Abb. 3.2.7. Test auf posttranslationale Modifikation und Degradation von GlpT in S. cerevisiae.

A Western Blot von GlpT mit N-terminalem c-Myc-Epitop aus je drei Klonen von BY4741 mit Deletion eines Strukturgens für Mannosyltransferasen des ER (∆pmt1, ∆pmt2, ∆pmt3). Die Bande zeigt im Vergleich mit dem zugehörigen Wildtyp BY4741 (wt) kein verändertes Molekulargewicht. Aufgetrennt wurden in jeder Spur 22,5 µg Protein aus der Membranfraktion.

B Western Blot von GlpT mit N-terminalem c-Myc-Epitop in Stämmen mit Deletion des Strukturgens für Proteinase A (∆pep4) im Vergleich mit dem zugehörigen Wildtyp AH22ura3 bzw. BY4741 (wt). Aufgetrennt wurden in jeder Spur 22,5 µg Protein aus der Membranfraktion.

76

3.2.5 Lokalisierung von GlpT in S. cerevisiae-Transformanten mittels

Immunfluoreszenz-Mikroskopie

GlpT mit N- oder C-terminalem c-Myc-Epitop wurde in fixierten Sphäroblasten von

S. cerevisiae ∆gpp1/2 mit primären und sekundären Antikörpern mit FITC markiert, die

Position des Zellkerns wurde mit DAPI-Färbung angezeigt.

Bei GlpT mit N-terminalem c-Myc-Epitop zeigte sich die FITC-Fluoreszenz (grün) bei

100-facher Vergrößerung an der Kernoberfläche, als davon ausgehende Strahlen sowie

diskontinuierlich an der Zelloberfläche (Abb. 3.2.8A). Dieses Muster ist typisch für das

endoplasmatische Reticulum (ER) mit seinen perinukleären und corticalen Bereichen.

Plasmamembranlokalisierung hingegen kann nur bei kontinuierlicher Färbung der

Zelloberfläche angenommen werden. Weniger eindeutig war die Situation bei GlpT mit

C-terminalem c-Myc-Epitop. Der geringeren Expressionsstärke entsprechend, war die

Immunfärbung weniger effizient und zeigte neben der ER-Färbung auch die Anfärbung

punktförmiger Strukturen (Abb. 3.2.8B). In Sphäroblasten, die kein GlpT exprimierten,

wurden auch keine Strukturen angefärbt (nicht gezeigt).

AA

BB

Abb. 3.2.8. Immunfluoreszenz-Mikroskopie von GlpT in S. cerevisiae. Die Zellen wurden fixiert, protoplastiert und permeabilisiert und mit primärem Anti-c-Myc-Antikörper und sekundärem FITC-konjugierten Anti-Maus-Antikörper detektiert (grüne Fluoreszenz). DAPI-Färbung zeigt die Lage des Kerns an (blaue Fluoreszenz). Die Proteinverteilung zeigt eine typische Lokalisierung im perinukleären und corticalen ER. Übereinandergelegte Einzelfotos, Vergrößerung des Objektivs 100-fach.

A N-terminales c-Myc-Epitop

B C-terminales c-Myc-Epitop

77

Dass L-G3P aus GlpT-exprimierenden Zellen nicht effizienter freigesetzt wurde als aus Zellen

ohne GlpT lag demnach daran, dass sich der größte Teil des Transporters in Endomembranen

(insbesondere dem ER) befand.

3.2.6 Konstruktion und Expression von Fusionsproteinen aus GlpT und N-

terminalen Abschnitten des Alpha-Faktor-Rezeptors (Ste2p) von S. cerevisiae

Weil GlpT in ER-Membranen von S. cerevisiae akkumulierte, erschien es plausibel, den

N-Terminus des Transporters mit C-terminalem c-Myc-Epitop an eine hefeeigene Sequenz zu

koppeln, die den sekretorischen Weg mit großer Effizienz passiert.

Als Kandidat wurde der Alpha-Faktor-Rezeptor (Ste2p) ausgewählt. Der G-Protein-

gekoppelte Rezeptor mit sieben Transmembrandomänen wird in der Plasmamembran von

haploiden MATa-Zellen exprimiert, bindet das Alpha-Pheromon und löst eine Signalkaskade

aus (Konopka & Fields 1992; Herskowitz 1995; Slessareva & Dohlman 2006). Auch bei

starker Überexpression von einem Multicopy-Plasmid ruft er keine Unfolded Protein

Response (UPR) hervor (Griffith et al. 2003). Der hydrophile N-Terminus ist luminal bzw.

extrazellulär orientiert, enthält aber kein abtrennbares Signalpeptid für den sekretorischen

Weg. Wird der cytosolische C-Terminus durch ein Stop-Codon nach der 300. oder der 303.

Aminosäure abgetrennt, wird der Rezeptor nicht mehr internalisiert und in der Vakuole

degradiert, die Zahl der Moleküle pro Zelle steigt (Rohrer et al. 1993).

Aufgrund der extrazellulären Orientierung des N-Terminus von Ste2p wurden seine erste

Transmembrandomäne (Aminosäuren 1–79) oder alle sieben Transmembrandomänen

(Aminosäuren 1–303) über eine hydrophile Hexahistidinsequenz mit GlpT verbunden (Abb.

3.2.9A). Eine gerade Anzahl von Transmembrandomänen wurde nicht verwendet, da sie nicht

über eine cytosolische Schleife an den N-Terminus fusioniert werden konnte. Aus dem

gleichen Grund schied die Verwendung des hydrophilen N-Terminus von Ste2p allein (ohne

Transmembrandomäne) aus. In positiven und negativen Klonen wurden Fragmente der

erwarteten Größe mit PCR nachgewiesen (Abb. 3.2.9B)

Die Plasmide wurden erfolgreich rücktransformiert, Restriktionsanalysen lieferten Fragmente

der erwarteten Größen in allen positiven Klonen, und eine eventuelle Unsinn-Mutation wurde

durch Sequenzierung ausgeschlossen. Dennoch konnten die Konstrukte auf Proteinebene

nicht nachgewiesen werden, weder im Western Blot noch in der Immunfluoreszenz und weder

über das C-terminale c-Myc-Epitop noch über das interne His6-Epitop (Daten nicht gezeigt).

Eine Verbesserung der Plasmamembranlokalisierung von GlpT in S. cerevisiae war also auf

diesem Weg nicht möglich.

78

A

…ATG…c-Myc GlpT STE2 TM16x His

STE2 TM1-7 …ATG…c-Myc GlpT 6x His

…ATG…c-Myc GlpT

pFLAT1-GlpT-Myc

ADH1-PromoterTRP1-Terminator

GlpT STE2 TM16x His …ATG…

STE2 TM1-7GlpT 6x His …ATG…

A



…ATG…c-Myc GlpT

pFLAT1-GlpT-Myc






…ATG…c-Myc GlpT

pFLAT1-GlpT-Myc




2,0 Kb

1,5 Kb

0,7 Kb0,6 Kb0,5 Kb

TM1-GlpTTM1-7-GlpTGlpTB

2,0 Kb

1,5 Kb

0,7 Kb0,6 Kb0,5 Kb

TM1-GlpTTM1-7-GlpTGlpT

2,0 Kb

1,5 Kb

0,7 Kb0,6 Kb0,5 Kb

TM1-GlpTTM1-7-GlpTGlpTB

Abb. 3.2.9. Homologe Rekombination N-terminaler Sequenzen des Gens für den Alpha-Faktor-Rezeptor STE2 in den Expressionsvektor für GlpT mit C-terminalem c-Myc-Epitop.

A Schematische Darstellung der Integration und der vollständigen Expressionskassetten für das Fusionsprotein. Der Vektor ist nur im Ausschnitt gezeigt (vgl. Abb. 3.2.1B). Kleine Pfeile geben die Positionen der Primer an, die zu den in 3.2.9B gezeigten Amplifikaten führten.

6x His: Sequenz für das Hexahistidin-Epitop, ATG: Modifizierter Bereich um das Start-Codon, c-Myc: DNA-Sequenz für das c-Myc-Epitop, GlpT: glpT aus E. coli, STE2 TM1: Sequenz für den N-Terminus mit einer Transmembrandomäne von Ste2p aus S. cerevisiae, STE2 TM1-7: Sequenz für den N-Terminus mit allen Transmembrandomänen von Ste2p aus S. cerevisiae.

B Unterscheidung positiver und negativer Klone von S. cerevisiae mit PCR. Die Amplifikation einer codierenden Sequenz für GlpT mit unmodifiziertem N-Terminus (GlpT) aus einer 1:100-Verdünnung einer Gesamt-DNA-Präparation ergab eine Bande von rund 0,5 Kb, GlpT mit sieben Transmembrandomänen von Ste2p (TM1-7 GlpT) rund 1,4 Kb, GlpT mit einer Transmembrandomäne von Ste2p (TM1-GlpT) rund 0,7 Kb. Die Positionen der Primer in den Expressionsvektoren sind in 3.2.9A durch kleine Pfeile angezeigt.

79

4. Diskussion

4.1 L-G3P-Metabolismus und Wachstum des Stammes ∆∆∆∆gpp1/2 mit

Überexpression von GPD1

4.1.1 Auf welchem Weg bildet ein Stamm ohne spezifische Glycerol-3-

Phosphatase Glycerol?

Die spezifische Glycerol-3-Phosphatase-Aktivität von S. cerevisiae ist durch die Isoenzyme

Gpp1p und Gpp2p vollständig repräsentiert (Norbeck 1996), die entsprechenden Isogene sind

im verwendeten Stamm deletiert, und der korrekte Sitz der Deletionskassetten wurde mit PCR

bestätigt. Da Pahlman et al. mit einer ∆gpp1/2-Mutante in 4-stündigen Batch-Fermentationen

nahezu kein Glycerol nachweisen konnten (2001), wurde erwartet, dass auch der in dieser

Arbeit verwendete Produktionsstamm ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 kein Glycerol

bilden sollte. In den hier beschriebenen Fed-Batch-Fermentationen wurde Glycerol jedoch

nach 4–8 h Fermentationszeit bzw. ab Zelldichten von 1–2 g/l nachgewiesen und

akkumulierte zu Mengen im einstelligen Grammbereich. Die Deletion der beiden Isogene für

die spezifische Glycerol-3-Phosphatase äußerte sich nicht, wie erwartet, in fehlender

Glycerolproduktion, sondern lediglich in der Entkopplung der Glycerolproduktion vom

Wachstum.

Die hier beschriebenen Fermentationen liefern ein wichtiges Indiz dafür, dass in der ∆gpp1/2-

Mutante mit Überexpression von GPD1 Glycerol intrazellulär durch limitierende,

wahrscheinlich unspezifische Dephosphorylierung von L-G3P gebildet wird. In diesem Fall

muss die spezifische Glycerolproduktionsrate von der intrazellulären L-G3P-Konzentration

abhängen. In der Tat weisen die intrazelluläre L-G3P-Konzentration und die spezifische

Glycerolproduktionsrate Maxima auf, die zeitlich zusammenfallen (Abb. 3.1.11). Wenn also

die Glycerolproduktion in der ∆gpp1/2-Mutante mit Überexpression von GPD1 von der

veränderlichen intrazellulären L-G3P-Konzentration abhängig ist, ist sie automatisch vom

Wachstum entkoppelt.

Es ist durchaus vorstellbar, dass aufgrund des im Vergleich mit dem Wildtyp stark erhöhten

intrazellulären G3P-Spiegels in der Mutante ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 auch

Phosphatasen angreifen können, deren Affinität für L-G3P weitaus geringer ist als die der

spezifischen Glyerol-3-Phosphatase. Die größte Ähnlichkeit zur Sequenz der Isogene für die

Glycerol-3-Phosphatase weisen die beiden Isogene für die Deoxyglucose-6-Phosphatase auf.

80

Ihr natürliches Substrat ist noch unbekannt. Beide Isoenzyme, Dog1p und Dog2p, waren aber

nicht in der Lage, aus L-G3P anorganisches Phosphat freizusetzen (Martin & Heredia 1977).

Eine Glycerolbildung aus L-G3P über den Umweg des Auf- und Abbaus von

Glycerophospholipiden und Neutralfetten oder ihren Vorstufen ist ebenfalls denkbar. Hier

gibt es Lipidphosphatasen Lpp1p und Dpp1p, deren Aktivität gegenüber L-G3P zwar noch

nicht getestet wurde, die aber ein breites Substratspektrum aufweisen (Wu et al. 1996;

Faulkner et al. 1999). Eine magnesiumabhängige Lipidphosphatase-Aktivität in S. cerevisiae

ist ebenfalls bekannt; vor kurzem wurde das erste Gen für die magnesiumabhängige

Phosphatidat-Phosphatase identifiziert (PAH1, (Han et al. 2006)).

Unter dem GO-Term „Phosphatester-Hydrolase-Aktivität“ weist die Hefedatenbank SGD

(Saccharomyces Genome Database) 80 bekannte Gene auf (http://db.yeastgenome.org,

Zugriff 24.4.2007), deren Produkte jedoch nicht alle im Cytosol aktiv sind, sondern zum Teil

durch den sekretorischen Weg in den extrazellulären Raum oder in die Vakuole geschleust

werden. Andererseits decken sie aller Wahrscheinlichkeit nach die Phosphatase-Aktivität von

S. cerevisiae nicht vollständig ab.

Zwar müssten unter ihnen die unspezifischen reprimierbaren sauren und alkalischen

Phosphatasen Pho5p, Pho10p=Pho12p, Pho11p und Pho8p in dem verwendeten Medium, das

mit 30 mM Phosphat gepuffert war, reprimiert sein, doch besteht die Möglichkeit, dass die

intrazelluläre Akkumulation eines phosphorylierten Metaboliten mit dem Phosphathaushalt

der Zelle wechselwirkt und beispielsweise die Repression aufhebt. Pho3p, Pho5p, Pho11p und

Pho12p werden allerdings durch den sekretorischen Weg geschleust, und Pho8p gehört zur

Ausstattung der Vakuole, so dass fraglich ist, ob diese Genprodukte mit cytosolischem L-G3P

in Kontakt kommen. Dass insbesondere die konstitutiven sauren und alkalischen

Phosphatasen Pho3p und Pho13p im Wildtyp zur Glycerol-3-Phosphatase-Aktivität beitragen,

scheint nach den Daten von Norbeck et al. zur Enzymaktivität im Wildtyp und im Knockout-

Stamm dieser Phosphatasen durchaus möglich (Norbeck et al. 1996). Pho13p ist darüber

hinaus im Cytosol aktiv.

Eine andere mögliche Erklärung besteht darin, dass das gemessene Glycerol nicht aus bzw.

über L-G3P entsteht. Hier rückt der DHA-Weg ins Blickfeld (Norbeck & Blomberg 1997),

der als Erklärung dafür vorgeschlagen wurde, dass die ∆gpp1/2-Mutante nach einer

verlängerten Anlaufphase auch unter anoxischen Bedingungen wachsen kann (Pahlman et al.

2001). Wenn allerdings Hefezellen auf diesem Weg Glycerol produzieren könnten, müsste

eine Doppeldeletionsmutante der cytosolischen Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase GPD

(∆gpd1/2) ebenfalls unter anoxischen Bedingungen wachsen und vergleichbare Mengen an

81

Glycerol bilden wie die ∆gpp1/2-Mutante. Das tut sie auch bei längeren Fermentationszeiten

definitiv nicht (Björkqvist et al. 1997; Nissen et al. 2000). Stattdessen können die hier

beschriebenen Fermentationen die Anpassungsfähigkeit der ∆gpp1/2-Mutante an anoxische

Bedingungen befriedigend damit erklären, dass die ∆gpp1/2-Mutante nicht „dicht“ ist und

Glycerol in nennenswerten Mengen gebildet wird.

4.1.2 Fluss durch den Glycerolbiosynthese-Weg in einem Stamm mit

deregulierter Aktivität der Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase und

ausgeschalteter spezifischer Glycerol-3-Phosphatase

L-G3P ist Zwischenprodukt der Glycerolbiosynthese und das erwünschte Produkt der

Fermentation von Glucose mit dem Stamm ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1. Um den

Fluss durch den Glycerolbiosynthese-Weg in diesem Produktionsstamm zu erklären, werden

im folgenden die Kenntnisse über die Flusskontrolle des Glycerolbiosynthese-Wegs in

Wildtyp-Hefe zusammengefasst und auf die Verhältnisse in dem verwendeten Stamm mit

manipulierten Enzymaktivitäten angewendet.

Glycerol wird vom S. cerevisiae-Wildtyp bei aerober, microaerober und anaerober

Fermentation von Glucose gebildet (Cronwright et al. 2002; Aldiguier et al. 2004; Alfenore et

al. 2004; Valadi et al. 2004). Der Fluss durch den Glycerolbiosynthese-Weg ist dabei

abhängig vom Sauerstoffangebot. Unter typischen Bedingungen der Hefe-Fermentation, die

auch in dieser Arbeit zur Anwendung kamen (nicht-limitierende Glucosekonzentration mit

oder ohne Belüftung), erfolgt die Glycerolproduktion außerdem wachstumsgekoppelt

(Aldiguier et al. 2004; Alfenore et al. 2004).

Sauerstoffabhängigkeit und Wachstumskopplung der Glycerolproduktion werden durch das

Modell, dass die Menge an cytosolischem NADH den Fluss durch den Glycerolbiosynthese-

Weg bestimmt, erklärt. Demnach trägt die Glycerolproduktion unter aeroben, microaeroben

und anaeroben Bedingungen zum Redoxgleichgewicht während des Wachstums bei, indem

cytosolisches NADH, das bei der Bildung von Biomasse und organischen Säuren aus Glucose

anfällt, von der Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase reoxidiert wird. Dieser

wachstumsgekoppelte Schritt führt zur Bildung von L-G3P.

Unter anaeroben Bedingungen ist Glycerol nach derzeitigem Kenntnisstand das einzige

reduzierte Endprodukt, das die bei der Biomasseproduktion entstehenden

Reduktionsäquivalente aufnimmt (Ansell et al. 1997; Björkqvist et al. 1997; Valadi et al.

2004). Das Cytosol weist dann eine erhöhte NADH-Konzentration auf, wie experimentell

bestätigt (Rigoulet et al. 2004), und das Verhältnis von Glycerolproduktion zu

82

Biomasseproduktion ist größer als in belüfteten Kulturen. Bei zunehmendem

Sauerstoffangebot kann ein Teil der Reduktionsäquivalente über die Atmungskette auf

Sauerstoff übertragen werden, da die externen mitochondrialen NADH-Dehydrogenasen

Nde1p und Nde2p durch nicht-limitierende Glucosekonzentrationen nicht vollständig

reprimiert sind (Rigoulet et al. 2004), das Verhältnis von Glycerolproduktion zu

Biomasseproduktion wird kleiner (Alfenore et al. 2004). Ein Spezialfall ist das Verschwinden

der Wachstumskopplung der Glycerolproduktion, wenn Wachstum und Respiration so

aufeinander abgestimmt sind (durch Sauerstoff- oder Glucoselimitation), dass sich kein bzw.

wenig überschüssiges NADH im Cytosol ansammelt, während die Energiegewinnung

redoxneutral über die alkoholische Gärung erfolgt. In der Tat kann bei der praktischen

Annäherung an solche Bedingungen die Glycerolproduktion verschwinden bzw. fast zum

Erliegen kommen (Weusthuis et al. 1994; Bideaux et al. 2006). Solche Bedingungen sind für

die Produktion von Bioethanol von Interesse.

Dass die Verfügbarkeit von cytosolischem NADH für den Fluss durch den

Glycerolbiosynthese-Weg unter verschiedenen Fermentationsbedingungen entscheidend war,

zeigten Nevoigt & Stahl (1996), Overkamp et al. (2002) und Geertman et al. (2006).

In den Fermentationen dieser Arbeit war die Produktion von L-G3P und Glycerol

sauerstoffabhängig: Unter microaeroben Bedingungen ging die Produktion von 13 g

Biomasse mit der Bildung von 382 mg L-G3P und 1,7 g Glycerol einher, während unter

aeroben Bedingungen die Produktion von 13 g Biomasse lediglich zur Bildung von 202 mg L-

G3P und 0,8 g Glycerol führten. Nach dem oben beschriebenen Modell erklärt die

Verfügbarkeit von NADH für die GPD-Reaktion diesen experimentellen Befund. Das gilt für

einen Stamm mit deregulierter GPD-Aktivität nicht anders als für den Wildtyp, denn durch

die Überexpression von GPD1 ist lediglich der Anteil der GPD-Reaktion an allen NADH-

konsumierenden Prozessen des Cytosols vergrößert, die Limitation durch cytosolisches

NADH aber nicht aufgehoben. Solange cytosolisches NADH, das beim Wachstum entsteht,

für den Fluss durch den Glycerolbiosynthese-Weg limitierend ist, wirkt es als

„Kopplungsfaktor“ zwischen Wachstumsrate und G3P-Produktionsrate, wie unter aeroben

und microaeroben Bedingungen gezeigt. Während der anaeroben Bedingungen im zweiten

Teil der Zwei-Phasen-Fermentation fand nahezu kein Wachstum mehr statt, so dass keine

Wachstumskopplung beobachtet wurde.

Als wachstumsgekoppelt erwies sich in den hier beschriebenen Fermentationen unter aeroben

und microaeroben Bedingungen die Produktion des Intermediaten L-G3P, nicht aber die des

Endproduktes Glycerol. Dass die apparente Wachstumskopplung vom Endprodukt auf das

83

Zwischenprodukt des Stoffwechselweges übergegangen ist, überrascht nicht. Der

wachstumsgekoppelte Schritt ist auch im Wildtyp die G3P-Bildung. Im Unterschied zum

Wildtyp ist in dem verwendeten Produktionsstamm die effiziente, nicht flusskontrollierende

Dephosphorylierung des Zwischenproduktes (Remize et al. 2001) durch Deletion der beiden

Isogene für die spezifische Glycerol-3-Phosphatase aufgehoben. Die Bildung von Glycerol

erfolgte in der ∆gpp1/2-Mutante entweder nicht durch die Dephosphorylierung von L-G3P

oder – wie oben diskutiert (vgl. 4.1.1) – zwar aus L-G3P, aber mit verminderter und damit

flusskontrollierender Effizienz.

Sauerstoffabhängigkeit und Wachstumskopplung sprechen dafür, dass im Stamm ∆gpp1/2 mit

Überexpression von GPD1 unter den hier verwendeten Bedingungen die Bildung von L-G3P

direkt durch die Verfügbarkeit von cytosolischem NADH limitiert wird, wie es das oben

beschriebene Modell für den Fluss durch den Glycerolbiosynthese-Weg in Wildtyp-Hefe

besagt.

4.1.3 Wodurch wird die intrazelluläre Akkumulation von L-G3P im

Produktionsstamm begrenzt?

In den hier beschriebenen Fermentationen stoppt die intrazelluläre Akkumulation bei

unterschiedlichen Werten (Tabelle 4.1) und bildet Maxima aus.

Tab. 4.1. Maxima der intrazellulären L-G3P-Konzentration in verschiedenen Phasen von Fed-Batch-Fermentationen von Glucose im 2 l-Maßstab mit dem S. cerevisiae Produktionsstamm ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1.

Zwei-Phasen-Fermentation Maximale intrazelluläre Konzentration von L-G3P Aerobe Phase

13 h

Anaerobe Phase

32 h


17 h

mg/g Hefetrockenmasse 23 14 26

mM 97 58 108

Der intrazelluläre L-G3P-Spiegel ist zu jedem Zeitpunkt von mindestens drei

Geschwindigkeitskonstanten abhängig: der Syntheserate, der Degradationsrate und der

Freisetzungsrate. Maxima werden ausgebildet, wenn die Geschwindigkeitskonstanten der

beiden von der Innenkonzentration abhängigen Prozesse, Degradation und Freisetzung, im

Vergleich mit der Syntheserate zu klein sind, um zu einem Gleichgewichtszustand (einem

Plateau) zu führen. Maxima werden außerdem ausgebildet, falls Degradations- und/oder

Freisetzungsrate im Lauf der Fermentationszeit zunehmen, beispielsweise durch Induktion

84

einer Phosphatase oder eines Transporters. Zunächst soll jedoch angenommen werden, dass

Degradations- und Freisetzungsrate nur von der intrazellulären L-G3P-Konzentration

abhängen (Abb. 3.1.11, 3.1.6) und sich diese Abhängigkeit im Lauf der Fermentationszeit

nicht verändert. Das heißt, dass Degradation und Freisetzung über die gesamte

Fermentationszeit nach dem gleichen Mechanismus ablaufen.

Im Folgenden wird der Versuch unternommen, die unterschiedliche maximale intrazelluläre

L-G3P-Konzentration in den drei verglichenen Fermentationsphasen (Tab. 4.1) mit

unterschiedlichen Syntheseraten zu erklären, die aus den Bedingungen im Fermenter und dem

physiologischen Zustand der Zellen hergeleitet werden können. Dazu wird das Modell

herangezogen, dass der Fluss in den Glycerolbiosynthese-Weg der ∆gpp1/2-Mutante mit

Überexpression von GPD1 durch die Verfügbarkeit von cytosolischem NADH kontrolliert

wird (vgl. 4.1.2).

Die niedrigste Marke wird in der anaeroben Phase der Zwei-Phasen-Fermentation unter

Bedingungen erreicht, unter denen die Zellen – bedingt durch die hohe Ethanolkonzentration

und die plötzliche Anaerobiose – kaum wachsen. Allerdings zeigen sie durch anhaltende

Ethanolproduktion an, dass sie weiterhin stoffwechselaktiv sind. Unter diesen Bedingungen

ist die Konzentration von NADH im Cytosol als niedrig anzunehmen, und es ist

wahrscheinlich, dass NADH-Mangel für das Limit von 14 mg L-G3P/g Hefetrockenmasse

verantwortlich ist. Deutlich höher liegen die Werte, die in der aeroben Phase der Zwei-

Phasen-Fermentation und in der microaeroben Fermentation erreicht werden. Da die Zellen in

beiden Fällen wachsen und die Glykolyse auf höheren Touren läuft, wird kontinuierlich

NADH geliefert, so dass L-G3P schneller gebildet werden kann als in der anaeroben Phase

der Zwei-Phasen-Fermentation. Gegenläufig wirkt allerdings die Respiration auf den NADH-

Pool im Cytosol. Dass sie aerob schneller erfolgt als microaerob, könnte für die leicht erhöhte

intrazelluläre L-G3P-Konzentration in der microaeroben Fermentation verantwortlich sein.

An dieser Stelle ist es sinnvoll, zusätzlich einen unbekannten sauerstoffabhängigen

intrazellulären Degradationsprozess für L-G3P anzunehmen. Vorläufige Ergebnisse unserer

Arbeitsgruppe weisen in diese Richtung.

Die in dieser Arbeit ermittelten unterschiedlich hohen Maxima der intrazellulären L-G3P-

Konzentration werfen die Frage auf, wo das Maximum für den Stamm ∆gpp1/2 mit

Überexpression von GPD1 tatsächlich liegt und ob Bedingungen gefunden werden können,

unter denen eine höhere intrazelluläre L-G3P-Akkumulation erreicht werden kann. Bei der

Abschätzung der oberen Grenze muss berücksichtigt werden, dass bei zunehmender

intrazellulärer Akkumulation von L-G3P die Rückreaktion von G3P zu DHAP ein immer

85

größeres Gewicht erhält. Im Gleichgewichtszustand findet keine Nettoreaktion statt, Hin- und

Rückreaktion verlaufen gleich schnell. Auch eine gesteigerte GPD-Aktivität kann die

intrazelluläre G3P-Akkumulation dann nicht weiter steigern. Obwohl die Gleichgewichts- und

Geschwindigkeitskonstanten von Gpd1p von S. cerevisiae bekannt sind, können für die

theoretischen intrazellulären Maxima nur Abschätzungen getroffen werden, da die

Konzentration aller vier Reaktionspartner (G3P, NAD, DHAP, NADH) für die Netto-

Reaktionsrichtung und -geschwindigkeit verantwortlich sind, in dieser Arbeit aber lediglich

die Konzentration von L-G3P bestimmt wurde. Die apparente Gleichgewichtskonstante des

aufgereinigten Enzyms bei pH 7.2 beträgt 35000:1 für die Bildung von G3P und NAD aus

DHAP und NADH (Cai et al. 1996). Publizierte Angaben für die DHAP-Konzentration im

Wildtyp bewegen sich um 1 mM (Shi et al. 2005; Cordier et al. 2007). Dass in dem

verwendeten Produktionsstamm DHAP nicht angestaut wird, kann angenommen werden, da

die Triosephosphat-Isomerase aktiv ist, und die Zellen bis zum Ende beider Fermentationen

aktiv gären. Für die Grenze, bis zu welcher G3P dann aufgrund der Enzymeigenschaften der

GPD akkumulieren kann, ist das Verhältnis von NAD:NADH von Bedeutung. Beträgt es rund

20:1 wie im Wildtyp unter aeroben Bedingungen (Cai et al. 1996; Cronwright et al. 2002;

Cordier et al. 2007), könnten theoretisch 1750 mM L-G3P erreicht werden. Ist das Cytosol an

NADH verarmt und beträgt das Verhältnis von NAD:NADH nur noch beispielsweise 100:1,

sind 350 mM L-G3P das theoretische Maximum. Da in den hier beschriebenen

Fermentationen Maxima dieser Größenordnung ausgeprägt werden, läuft die Nettoreaktion

von DHAP zu G3P in der Nähe der Maxima wahrscheinlich bereits verlangsamt ab. Diese

Überlegungen unterstreichen die Bedeutung der Verfügbarkeit von cytosolischem NADH: Je

mehr NADH im Cytosol vorhanden ist, desto höher kann die maximale theoretische L-G3P-

Konzentration im Cytosol sein, und desto schneller erfolgt die G3P-Bildung bei maximal

gesteigerter GPD-Aktivität. Die höchste tatsächlich gemessene intrazelluläre L-G3P-

Konzentration von 48,6 mg/g Hefetrockenmasse (204 mM) erzielte unsere Arbeitsgruppe in

anaeroben Batch-Fermentationen bei niedriger absoluter Zelldichte (0,8 g/l) nach 20 h

Fermentationszeit (Popp et al. im Druck).

Eine zweite Frage betrifft den raschen Anstieg der intrazellulären L-G3P-Konzentration nach

dem Wechsel von Aerobiose zu strikter Anaerobiose (Abb. 3.1.4): Wodurch wird er

ermöglicht und welche Bedingungen oder Zustände beeinflussen sein Ausmaß? Innerhalb des

hier angewandten Modells lautet die Frage: Woher kommt plötzlich das NADH? Dass ein

plötzlicher Stopp der Respiration einen derartigen „Rückstau“ an cytosolischem NADH

verursachen kann, spricht für eine hohe Aktivität der externen NADH-Dehydrogenasen. Da

86

S. cerevisiae auf plötzliche anoxische Bedingungen mit der verstärkten Transkription des

Isogens GPD2 reagiert (Ansell et al. 1997), muss auch an eine Enzyminduktion von Gpd2p

gedacht werden. Der Anstieg der intrazellulären NADH-Konzentration erscheint für diesen

Mechanismus aber viel zu schnell.

Nur wenn die Maxima der intrazellulären L-G3P-Konzentration nicht mit der Veränderung

der Syntheserate und der Innenkonzentrationsabhängigkeit von Freisetzungsrate und

Degradationsrate erklärt werden können, sollten Erklärungen wie eine beschleunigte

Degradation, beispielsweise zu Glycerol durch Induktion einer Phosphatase oder eine

beschleunigte Freisetzung durch die Induktion eines Transporters, beides möglicherweise

hervorgerufen durch unphysiologisch hohe L-G3P-Konzentrationen, hinzugezogen werden.

Da die Geschwindigkeitskonstanten der Synthese und Freisetzung klein sind im Vergleich mit

den sich ändernden Bedingungen im Fermenter, die aller Kenntnis nach zu einer

veränderlichen Syntheserate führen müssen, kann diese wichtige Frage wahrscheinlich erst

nach kontinuierlicher Kultivierung im Chemostaten beantwortet werden.

4.1.4 Wodurch wird das Wachstum des Produktionsstammes limitiert?

Da der maximale Produkttiter (intra- plus extrazelluläres L-G3P) in erster Linie von der

erreichten Zelldichte abhängt, stellt sich die Frage, wodurch in den beiden Fermentationen das

Wachstum des Stammes ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 begrenzt wurde. Der

wachstumsabhängige Feed von Glucose und Vitaminen (inklusive Inositol) schließt einen

Mangel an diesen Nährstoffen aus (vgl. 2.2.2). Das gilt auch für den Fall, dass intrazellulär

akkumuliertes G3P wie DHAP eine Inositol-Auxotrophie der Hefe hervorruft (Shi et al.

2005).

Wenn die unphysiologisch hohe intrazelluläre Akkumulation von L-G3P direkt das

Wachstum begrenzt, würde das für die zukünftige Produktion des weitgehend in den Zellen

zurückgehaltenen Metaboliten keine günstige Prognose darstellen. Eine Korrelation von

spezifischer Wachstumsrate µ und intrazellulärer L-G3P-Konzentration brachte für die hier

beschriebenen Fermentationen jedoch kein sinnvolles Ergebnis, weil hohe intrazelluläre

L-G3P-Konzentrationen zu Beginn mit einer höheren spezifischen Wachstumsrate vereinbar

waren als im weiteren Verlauf der Fermentationen.

Hingegen zeigte die Korrelation von spezifischer Wachstumsrate µ und Ethanolkonzentration

im Fermenter für beide Fermentationen einen sinnvollen, kontinuierlichen Verlauf:

Unabhängig vom Sauerstoffangebot kommt das Wachstum in aerober und microaerober

Fermentation bereits bei 7–8 % (w/v) Ethanol völlig zum Erliegen. Entsprechend waren die

87

erreichten Zelldichten sauerstoffabhängig: In aerober Fermentation wurde eine geringfügig

höhere Zelldichte erreicht als in microaerober Fermentation. Diese Reaktion auf das

Sauerstoffangebot zeigt auch ein S. cerevisiae Wildtyp, der kein L-G3P akkumuliert

(Alfenore et al. 2004). Das ist ein Indiz dafür, dass die erreichbare Zelldichte auch im Stamm

∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 von der Ethanolkonzentration im Fermenter

determiniert wurde. Bei einem respirofermentativen Stoffwechsel (aerobe Phase der Zwei-

Phasen-Fermentation) entsteht ein kleiner Anteil der Biomasse ohne Ethanoläquivalente im

Unterschied zum überwiegend fermentativen Stoffwechsel (microaerobe Fermentation), so

dass bezogen auf die Biomasse weniger Ethanol im Medium akkumuliert.

Wie von den Kooperationspartnern unserer Arbeitsgruppe ermittelt, ist die Ethanoltoleranz

des Wildtyps W303-1A wesentlich größer als die des hier verwendeten Produktionsstammes

(S. Guillouet, persönliche Mitteilung). Die gentechnischen Manipulationen, die zur L-G3P-

Akkumulation führten, setzten also die Ethanoltoleranz deutlich herab. Da L-G3P der

Ausgangspunkt für die Synthese von Glycerophospholipiden ist, könnte eine deregulierte

Phospholipidsynthese eine Erklärung dafür sein. Es ist denkbar, dass eine Veränderung der

Membranzusammensetzung, eine zunehmende „Verdünnung“ der ursprünglichen

sphingolipid- und ergosterolreichen Plasmamembran im Lauf der Fermentation, zur

Ethanolsensitivität beiträgt. Zwar zeigte der hier verwendete Produktionsstamm nach

6-stündiger Batch-Fermentation von 2 % Glucose im Schüttelkolben kein verändertes

Lipidmuster (Nguyen et al. 2004), dieser Befund kann aber nicht ohne weiteres auf die hier

beschriebene Situation übertragen werden, da weit niedrigere intrazelluläre L-G3P-

Konzentrationen herrschten und eine Deregulation der Lipidsynthese möglicherweise erst bei

höheren L-G3P-Konzentrationen zu beobachten ist.

Der von Pahlman et al. beschriebene anaerobe Wachstumsdefekt der ∆gpp1/2-Mutante war

im Widerspruch zu der im vorigen Abschnitt gegebenen Erklärung reversibel und ließ sich

durch die Degradation von intrazellulärem L-G3P aufheben. Erreicht wurde dies durch die

Zugabe von Acetaldehyd, nicht aber von Acetoin, des zweiten etablieren NADH-Fängers

(2001). Ein Mangel an NAD im Cytosol konnte somit nicht für den Wachstumsstopp

verantwortlich sein. Gegen L-G3P als direkte Ursache des Wachstumsstopps spricht, dass bei

Pahlman et al. der Wildtyp und die ∆gpp1/2-Mutante mit Acetaldehyd unter anaeroben

Bedingungen 3 h lang gleiches Wachstum zeigten, obwohl die ∆gpp1/2-Mutante auch unter

diesen Bedingungen 80-mal mehr L-G3P enthält als der Wildtyp (2001). Außerdem war

anaerobes Wachstum der ∆gpp1/2-Mutante auch ohne Acetaldehyd-Zugabe nach einer

Anlaufphase möglich (Pahlman et al. 2001).

88

Es ist ebenfalls denkbar, dass ein hoher intrazellulärer L-G3P-Spiegel einen Phosphatmangel

hervorruft, obwohl durch die Pufferung des Mediums mit Phosphat prinzipiell genügend

davon zur Verfügung steht. Akkumuliertes L-G3P bindet intrazelluläres Pi, das beispielsweise

für die Synthese von ATP benötigt wird. Der innere Phosphatsensor von S. cerevisiae, der

Aufschluss über die intrazelluläre Phosphatkonzentration gibt und die Mobilisierung von

Polyphosphaten aus der Vakuole oder die Aufnahme von Phosphat aus dem Medium auslöst,

ist nicht bekannt. Außer auf cytosolisches Pi und Polyphosphat reagiert er auf bestimmte

Inositolphosphate (Mouillon & Persson 2006). Falls er außerdem mit L-G3P interagiert,

könnte er eine „falsch hohe“ Versorgung der Zelle mit Phosphat anzeigen, was die

Phosphataufnahme herunterregulieren würde, während Phosphatmangel bereits das

Wachstum begrenzt.

Neben dem Wachstum und dieses bedingend ist auch das Überleben der Zellen von großer

Bedeutung für die Produktivität. Der Anteil lebender Zellen an der Gesamtzellzahl von

S. cerevisiae ∆gpp1/2 in der microaeroben Fermentation ist von 0–7 % (w/v) Ethanol

praktisch konstant nahe 100 %, um dann relativ steil abzuknicken und bei 9 % (w/v) Ethanol

70 % zu erreichen. Während ein Wildtypstamm bei aerober Fermentation von Glucose in

gleichem Maß lebensfähig ist wie bei microaerober (Alfenore et al. 2004), ist der Anteil

lebender Zellen des L-G3P-akkumulierenden Stammes unter aeroben Bedingungen schon bei

niedrigsten Ethanolkonzentrationen um 1 % (w/v) auf 85 % erniedrigt. Deshalb kann mit

gutem Grund angenommen werden, dass ein anderer Faktor als die Ethanolkonzentration im

Fermenter unter aeroben Bedingungen die Lebensfähigkeit begrenzt. Dieser Faktor ist nicht

die intrazelluläre Akkumulation von L-G3P allein, die unter aeroben Bedingungen bei 1 %

(w/v) Ethanol genauso groß ist wie unter microaeroben (23 bzw. 24 mg L-G3P/g

Hefetrockenmasse), er kann anhand der in dieser Arbeit erhobenen Daten aber auch nicht

näher bestimmt werden. Bei hohen Ethanolkonzentrationen wird in der Zwei-Phasen-

Fermentation möglicherweise deshalb kein weiteres Abknicken des Anteils lebender Zellen

beobachtet, weil die Zellen in einer stationären Phase und damit weniger empfindlich sind.

Insgesamt deuten weder die Daten von Pahlman et al. (2001) noch die aus dieser Arbeit

darauf hin, dass intrazelluläres L-G3P im Sinn einer Dosis-Antwort-Beziehung toxisch ist, es

könnte aber einen Phosphatmangel oder eine Deregulation der Phospholipidsynthese

bewirken.

89

4.1.5 Auf welchem Weg wird das phosphorylierte Stoffwechselzwischenprodukt

L-G3P aus den Zellen freigesetzt?

Erwartet worden war, dass L-G3P als phosphoryliertes Intermediat des zentralen

Kohlenstoffwechsels die Barriere der Plasmamembran nicht passiert. Dies wurde durch

Messungen von Nguyen et al. erhärtet, bei denen extrazelluläres L-G3P erst nach 24 h Batch-

Fermentation in geringen Mengen nachgewiesen und durch die Freisetzung aus toten Zellen

befriedigend erklärt werden konnte (2004). Durch den durchweg höheren Anteil lebender

Zellen während der hier beschriebenen Fermentationen konnte jetzt jedoch quantitativ

ausgeschlossen werden, dass das gesamte extrazelluläre L-G3P aus toten Zellen stammt.

Andererseits bestätigt das große Konzentrationsgefälle von L-G3P über die Plasmamembran,

das in allen untersuchten Fermentationsphasen beobachtet wurde, dass L-G3P anders als

Glycerol effizient in den Zellen zurückgehalten wird. Die Freisetzung erfolgte also sehr

langsam.

Die spezifische Freisetzungsrate von L-G3P aus den Zellen in ihrem zeitlichen Verlauf ließ

sich aufgrund der arithmetischen Bestimmung nur grob darstellen (vgl. Abb. 3.1.6). Die

Ausprägung einer entsprechenden Anzahl von Maxima und Minima legt aber nahe, dass sie

von der intrazellulären L-G3P-Konzentration abhing. Dies spricht für einen

Freisetzungsmechanismus, der durch das Konzentrationsgefälle zwischen innen und außen

angetrieben wird. Ob darüber hinaus im Lauf der Zeit die Permeabilität der Zellen zunahm,

lässt sich aufgrund der Unschärfe der Darstellung nicht ermitteln.

Ethanol im Fermenter könnte unter Umständen die Zellen für L-G3P durchlässiger machen,

ohne sich in reduzierter Lebensfähigkeit niederzuschlagen. Eine beschleunigte Freisetzung

von Glycerol aus Hefezellen wurde von Oliveira et al. (2003) zwar erst ab einer

Ethanolkonzentration von 12 % (w/v) gemessen, ein Wert, der in den beiden hier

beschriebene Fermentationen gar nicht erreicht wurde, jedoch gehört eine stark erhöhte

Ethanolsensitivität unbekannter Ursache zum Phänotyp des L-G3P akkumulierenden

Stammes. Möglicherweise geht sie auf eine in ihrer Zusammensetzung veränderte

Plasmamembran zurück, die sehr wohl die Freisetzung von L-G3P bei weitaus geringeren

Ethanolkonzentrationen als 12 % (w/v) erlauben könnte.

Eine oder mehrere Permeasen der Plasmamembran könnten ebenfalls für die unspezifische

Freisetzung von L-G3P verantwortlich sein, beispielsweise durch die Vermittlung

erleichterter Diffusion. Es wurde bereits gezeigt, dass der Glycerophosphoinositol-

Transporter Git1p L-G3P bindet (Patton-Vogt & Henry 1998), der Transport über die

Plasmamembran würde allerdings mit der gegenläufigen Translozierung eines Protons

90

einhergehen, was angesichts des bei pH 4.0 gepufferten Mediums eher unwahrscheinlich ist.

Nach heutigem Kenntnisstand können auch keine anderen überzeugenden Kandidaten unter

den bekannten Transmembranproteinen von S. cerevisiae benannt werden, die für die

Freisetzung von L-G3P aus lebenden Zellen verantwortlich sein könnten (vgl. 1.1.3).

4.1.6 Derzeitige Leistung und wahrscheinliches Potenzial von S. cerevisiae

∆∆∆∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 für die Produktion von L-G3P

Mit dem Stamm ∆gpp1/2 mit Überexpression von GPD1 wurde mit verschiedenen

Fermentationsstrategien L-G3P produziert. Der höchste erreichte Produkttiter betrug mit

325 mg/l das 25-fache der Ausgangssituation (Nguyen et al. 2004), wozu zu 30 % die

Erhöhung der Produktbildung pro Biomasse und zu 70 % die Erhöhung der Zelldichte beitrug.

Dieser Produkttiter wurde in der anaeroben Phase einer Zwei-Phasen-Fermentation erreicht,

bei der Biomasse- und Produktbildung teilweise entkoppelt waren. Die Raum-Zeit-Ausbeute

war nach dem Shift zur Anaerobiose optimal (9,4 mg L-G3P/l*h nach 32 h

Fermentationszeit).

Extrazelluläres L-G3P hat gegenüber intrazellulärem entscheidende Vorteile. Es lässt sich

ohne Zellaufschluss gewinnen, so dass es nicht von anderen intrazellulären Metaboliten

getrennt werden muss; das Downstream-Processing wird also wesentlich erleichtert. Zudem

erwies sich extrazelluläres L-G3P in der Kultur als stabiler: Es nahm kontinuierlich zu und

wurde nicht degradiert. Da die Freisetzung von L-G3P aus den Zellen nicht sehr effizient

erfolgte, lag der optimale Erntezeitpunkt um einige Stunden nach der optimalen Raum-Zeit-

Ausbeute (nach 45 h Fermentationszeit).

Ein möglichst günstiges Verhältnis von L-G3P und Biomasse bzw. von L-G3P und

verbrauchter Glucose ist dann wichtig, wenn die C-Quelle den höchsten Kostenfaktor

darstellt. Unter diesen Umständen sind die microaerobe Fermentationsstrategie und ein

Erntezeitpunkt am Ende der anaeroben Phase der Zwei-Phasen-Fermentation vorzuziehen.

Die Ethanolsensitivität des Produktionsstammes verhinderte in den beiden durchgeführten

Fermentationsstrategien höhere Zelldichten. Da das Produkt wachstumsentkoppelt produziert

werden konnte, liegt eine versuchsweise Abwandlung der Zwei-Phasen-Fermentation nahe.

Die aerobe Phase mit respirofermentativem Stoffwechsel könnte durch eine Glucose-

limitierte, rein respirative Phase der Biomasseproduktion ersetzt werden. Durch die fehlende

Ethanolproduktion sollten sich weit höhere Zelldichten erreichen lassen, so dass nach dem

Shift zur Anaerobiose noch mehr L-G3P gebildet und ausgeschieden werden könnte. Auf

genetischem Wege könnte die Ethanoltoleranz außerdem durch die Deletion von FPS1

91

verbessert werden. Dieses Gen codiert den Glycerolkanal, der für die Permeabilität der

Plasmamembran für Glycerol verantwortlich ist (Oliveira et al. 2003). Die Ergebnisse von

Kong et al. zeigen allerdings, dass durch die künstlich erhöhte intrazelluläre

Glycerolkonzentration in einem ∆fps1-Stamm durch einen unbekannten

Rückkopplungsmechanismus auch die Glycerolproduktion abnehmen würde (Kong et al.

2006) – möglicherweise mit negativen Folgen für die G3P-Produktion.

Die Glycerolproduktion begrenzt derzeit die L-G3P-Ausbeute bezogen auf Glucose erheblich.

Das molare Verhältnis von Glycerol und L-G3P lag zum Zeitpunkt des maximalen L-G3P-

Titers je nach Fermentationsphase bei 6:1 bis 14:1 und nach rund 50 Stunden

Fermentationszeit bei 16:1 bzw. 26:1, so dass man im Stamm ∆gpp1/2 mit Überexpression

von GPD1 zwar die Staustufe für das Stoffwechselzwischenprodukt L-G3P erhöht hat, sein

Zwischenproduktcharakter aber keineswegs aufgehoben ist.

Solange der Weg für die intrazelluläre Degradation von L-G3P nicht bekannt ist und diese

nicht gestoppt werden kann, besteht die beste Maßnahme in einer effizienteren Freisetzung

von L-G3P aus den Zellen. Eine effizientere Freisetzung würde auch aufgrund des

Massenwirkungsgesetzes die Bildung von L-G3P im Cytosol begünstigen und lässt somit eine

höhere Produktionsrate pro Biomasse erwarten. Geringere cytosolische L-G3P-

Konzentrationen sollten außerdem einen weniger negativen Einfluss auf das Wachstum des

Produktionsstammes haben. Da keine geeigneten hefeeigenen L-G3P-Transporter für eine

Überexpression zur Verfügung stehen (vgl. 1.1.3), besteht die Herausforderung darin, ein

fremdes Protein zu exprimieren und funktional in die Plasmamembran zu integrieren (vgl.

4.2).

92

4. 2 Heterologe Expression eines bakteriellen Transporters in S. cerevisiae

4.2.1 Bedingungen und Methoden der heterologen Expression

GlpT ist eine bakterielle Permease aus der inneren Membran, die bevorzugt Glycerol-3-

Phosphat gegen anorganisches Phosphat austauscht. Bei der heterologen Expression des

Transporters in der Hefe S. cerevisiae erfolgt der Wechsel von einem prokaryontischen zu

einem eukaryontischen Expressionssystem mit einer Vielzahl von Implikationen: Translation,

Integration in die Membran, Ausbildung der Topologie und Lokalisierung laufen unter

veränderten Bedingungen ab und sind damit störanfällig.

Dennoch ist S. cerevisiae für die Expression von Membranproteinen zur funktionalen und

strukturellen Analyse häufig das Expressionssystem der Wahl, weil große Mengen

membranintegrierten Proteins erreicht werden können (David et al. 1997; Bonander et al.

2005; Froissard et al. 2006). Während Membranproteine aus Pilzen und mittlerweile hunderte

pflanzliche Transporter erfolgreich in S. cerevisiae exprimiert wurden, sind es deutlich

weniger Rezeptoren und Transporter tierischen Ursprungs oder solche aus Chloroplasten,

Mitochondrien und Bakterien. Beispiele für bakterielle Proteine der inneren Membran, die

nach heterologer Expression in der Plasmamembran von S. cerevisiae Aktivität zeigen, sind

der Na+/H+-Antiporter NhaA (Ros et al. 1998) und der Glycerol-Facilitator GlpF (Bill et al.

2001). Der Nachweis der funktionalen Expression wurde in den meisten Fällen über

phänotypische Komplementierung einer S. cerevisiae Knockout-Mutante erbracht, d. h.

Nachweis und erfolgreiche Expression bedingen sich gegenseitig. Hinter solchen

Expressionssystemen stecken umfangreiche Kenntnisse der entsprechenden Transport- und

Stoffwechselvorgänge des Wirtsorganismus. So blockieren beispielsweise erst 20 Knockouts

die Aufnahme von Glucose (Wieczorke et al. 1999) oder drei das Wachstum auf

Monocarboxylaten (Makuc et al. 2004) oder sechs den effizienten Export von Alkaliionen

(Maresova & Sychrova 2005). Wenn die Selektion funktionaler Revertanten nicht möglich ist,

kann man zwar das Zielprotein mit einem fluoreszierenden Epitop versehen und mittels FACS

(Fluorescence Activated Cell Sorting) die am stärksten exprimierenden Hefeklone aus einer

Bibliothek mit abgestufter Gendosis selektieren (Niebauer et al. 2004), eine Selektion auf

Funktionalität erreicht man damit aber nicht. Im Fall des von GlpT vermittelten Antiports

findet kein Netto-Transport von Phosphat statt, was ein Pluspunkt hinsichtlich der zu

erwartenden Fitness des exprimierenden Hefestammes ist, ein phosphatbasiertes

Selektionssystem aber unmöglich macht.

93

4.2.2 Codon usage von S. cerevisiae und E. coli – limitiert die Translation die

Expressionsstärke?

Vom Multicopy-Plasmid und unter dem Regime des konstitutiven ADH1-Promoters in

S. cerevisiae exprimiert, konnte der heterologe Transporter GlpT im Western Blot über das

angehängte c-Myc-Epitop nachgewiesen werden. Der Hefestamm W303-1A zeigte dabei

unter den getesteten Stammhintergründen die stärkste Expression von GlpT, vergleichbar nur

mit dem CEN.PK-1D, der in einer Vergleichsstudie verschiedener Stammhintergründe als

exzellenter Produzent heterologen Proteins aufgefallen war (van Dijken et al. 2000). Mit guter

Proteinexpression in Verbindung gebracht werden können das verstärkte Vorkommen eines

Initiationsfaktors der Translation (Cdc33p) und eines Chaperonins (Hsp82p) und das

verringerte Vorkommen einer Komponente des Proteasoms (Rpn12p) im Proteom von W303

(Rogowska-Wrzesinska et al. 2001). Dass die Unterschiede der GlpT-Expression

verschiedener Stammhintergründe in Minimalmedium deutlicher ausfielen als in

Komplettmedium (Daten nicht gezeigt), zeigt, dass das Zusammenspiel vieler Prozesse für die

Unterschiede verantwortlich ist.

Trotz seiner geringen Größe beeinflusste die Position des c-Myc-Epitops die

Expressionsstärke merklich: Das N-terminale Epitop bewirkte eine deutliche Verbesserung

gegenüber dem C-terminalen. Da die Menge an GlpT-mRNA, die im Northern Blot detektiert

wurde, unabhängig von der Position des c-Myc-Epitops war, muss ein posttranskriptionaler

Mechanismus die Expression von GlpT mit C-terminalem c-Myc-Epitop begrenzen.

Unterschiedliche Geschwindigkeiten bei der Translation von GlpT in Abhängigkeit von der

Position des c-Myc-Epitops kommen als Mechanismus in Frage. Möglicherweise bildet die

mRNA für GlpT mit N-terminalem Epitop eine für die Translation günstigere

Sekundärstruktur aus als die mRNA für GlpT mit C-terminalem Epitop. Da sich die beiden

Transporter-Konstrukte nur in der Position des Epitops unterscheiden, ist die

Zusammensetzung ihrer Codons auf die gesamte Sequenz gesehen zwar die gleiche,

mindestens drei Befunde aus der Literatur sprechen allerdings dafür, dass dem Abschnitt, der

den N-Terminus codiert, besondere Bedeutung für die Expressionsstärke zukommt. (1) Im

Bereich um das Startcodon AUG existiert in S. cerevisiae eine Consensus-Sequenz für

hochexprimierte Gene (Miyasaka 1999), an die beide Expressionsvektoren angepasst wurden

(vgl. Abb. 3.2.1). (2) Andere Autoren konnten die Expressionsstärke von heterologen

Transmembranproteinen in S. cerevisiae ebenfalls durch das N-terminale Anfügen von

hefeeigenen Sequenzen, beispielsweise des Alpha-Pheromons (Shusta et al. 1998), des Alpha-

Faktor-Rezeptors (Andersen & Stevens 1998; Sugiyama et al. 2004) oder der

94

Plasmamembran-ATPase (Reis et al. 1999), oder einer beliebigen Abfolge von Aminosäuren

(Reis et al. 1999; Yelin & Schuldiner 2001) verbessern. (3) Es konnte gezeigt werden, dass

unvorteilhafte Codons bei S. cerevisiae am Anfang der wachsenden Polypeptidkette größeren

Einfluss auf die Expression haben als im Innern (Yelin & Schuldiner 2001). Generell

unterscheiden sich die Muster bevorzugter Codons von S. cerevisiae und E. coli deutlich

(Sharp et al. 1986). GlpT besteht zu 26 % aus Codons, die in den hoch exprimierten Genen

ADH1, ENO2, TDH3 und PMA1 von S. cerevisiae gar nicht vorkommen; das betrifft

insbesondere Codons für Alanin, Arginin, Leucin und Prolin. Mangelnde Verfügbarkeit der

zugehörigen Aminoacyl-tRNAs könnte die Geschwindigkeit der Translation von GlpT

generell begrenzen (Bennetzen & Hall 1982; Ikemura 1985; Friberg et al. 2004). Ein Indiz

dafür ist, dass das Proteom verschiedener Stammhintergründe, die GlpT unterschiedlich stark

exprimieren, unterschiedliche Expressionsstärken mehrerer tRNA-Synthetasen aufweist

(Rogowska-Wrzesinska et al. 2001).

Die Bedeutung des N-Terminus für die Expressionsstärke spricht dafür, dass die Initiation der

Translation, die Assoziation zwischen Ribosom und mRNA, der wichtigste

geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Translation ist. In der Tat maskiert das

synthetische c-Myc-Epitop den unvorteilhaften N-Terminus von GlpT (Abb. 4.1).

C: ATG TCT ACG CGT GCC CTC GAG TTG …

N: ATG TCT GAA CAA AAG TTG ATC TCT GAA GAA GAC TTG ACG CGT GCC CTC GAG TTG …

c-Myc-Epitop



c-Myc-Epitop



c-Myc-Epitop

Abb. 4.1. Codon-Zusammensetzung der N-Termini der in dieser Arbeit verwendeten GlpT-Konstrukte

C: N-Terminus von GlpT mit C-terminalem c-Myc-Epitop

N: N-Terminus von GlpT mit N-terminalem c-Myc-Epitop

Vorteilhafte Codons in S. cerevisiae Unvorteilhafte Codons in S. cerevisiae

Als unvorteilhaft wurden alle Codons angesehen, die in den hoch exprimierten Genen ADH1, ENO2, TDH3 und PMA1 (insgesamt 2039 Codons) nicht mehr als fünf Mal vorkommen.

95

Die Hypothese, dass die Codon-Zusammensetzung des N-Terminus für die geringere

Expression von GlpT mit C-terminalem c-Myc-Epitop verantwortlich ist, wäre dann

bewiesen, wenn sie durch das N-terminale Anfügen anderer bevorzugter Codons ebenfalls

hätte gesteigert werden können. Proteinchimären aus dem hefeeigenen Alpha-Faktor-Rezeptor

und GlpT mit C-terminalem c-Myc-Epitop konnten aber mit den verwendeten Methoden nicht

detektiert werden, so dass der Beweis noch aussteht. Anders als für Pichia pastoris gibt es für

S. cerevisiae kaum Berichte über die Verbesserung der Expression heterologer Proteine durch

Codon-Optimierung (Fuglsang 2004).

4.2.3 Nimmt GlpT in der ER-Membran von S. cerevisiae seine native

Konformation ein?

In der nativen Konformation reichen beide hydrophilen Termini von GlpT ins Zellinnere von

E. coli, dazwischen durchspannt die Polypeptidkette zwölf Mal die innere Membran und

bildet eine kompakte, hockerförmige Struktur aus (Huang et al. 2003). Stark positiv geladene

hydrophile helikale und nicht-helikale Bereiche kommen am N- und C-Terminus des

polytopen Membranproteins vor. Sie liegen jeweils im Cytosol und geben durch die streng

alternierende Orientierung der Transmembrandomänen die Topologie des mittleren Bereichs

des Proteins ohne ausgeprägte topogene Ladungsverteilung vor (Abb. 4.2A). So folgt GlpT

wie viele andere Transmembranproteine der Positive-inside-rule (von Heijne 1992): die

extrazellulären Domänen tragen insgesamt keine Nettoladung, während die cytosolischen

Domänen insgesamt einen Überschuss von 17 positiven Ladungen aufweisen. Die

mechanistische Erklärung für die Positive-inside-rule ist das negativ einwärts gerichtete

Membranpotenzial (Andersson & von Heijne 1994) und der Ausschluss eines Transfers

positiver Ladung über die Membran durch anionische Phospholipide (van Klompenburg et al.

1997). Zwei Umstände könnten also dazu führen, dass GlpT in dem gewählten

Expressionssystem nicht seine native Topologie ausprägt: (1) die Veränderung der

Aminosäurensequenz und damit der Ladungsverhältnisse durch das c-Myc-Epitop und (2) die

veränderten Bedingungen an und in der Membran aufgrund des Wirtswechsels.

(1) Eine direkte Konsequenz der Positive-inside-rule besteht darin, dass das Einbringen

zusätzlicher Ladungen in bestimmte Bereiche die natürliche Topologie eines polytopen

Transmembranproteins stören kann. Genau das ist bei der Markierung von GlpT mit dem

c-Myc-Epitop der Fall. Die zusätzliche negative Nettoladung in den cytosolischen Termini

könnte eine Invertierung von Teilen des Transporters und/oder eine veränderte Anzahl von

Transmembrandomänen bewirken. Es ist möglich, dass sich N- und C-Terminus hinsichtlich

96

ihrer Empfindlichkeit gegenüber dem topogenen Signal unterscheiden, so dass GlpT je nach

Position des Epitops zwei verschiedene Konformationen einnimmt. Eine Invertierung von

Teilen des Transporters geht unter Umständen mit einer Verringerung der Anzahl der

Transmembrandomänen zugunsten größerer cytosolischer oder luminaler Schleifen einher.

Besonders die siebte und achte Transmembrandomäne weisen eine erhebliche Ladungsmenge

und damit eine geringere Hydrophobizität auf (Abb. 4.2A). Solche Abschnitte eines Proteins

können von einer Position innerhalb der Membran in eine Position außerhalb der Membran

umspringen (Zhao & London 2006), so dass sich ein kleinerer Teil der Proteinsequenz

innerhalb und ein größerer außerhalb der Membran befindet. Eine derart aufgelockerte

Struktur des Proteins würde wahrscheinlich mit einer geringeren Stabilität einhergehen, da die

Angriffsfläche für Proteasen und die Anzahl zugänglicher Ubiquitinierungsstellen erhöht

würde. Insgesamt stehen viele Lysin-Reste als Anker für Ubiquitinierung und anschließende

Degradation zur Verfügung, die in der nativen Konformation teilweise durch ihre Lage in der

Membran abgeschirmt sind (Abb. 4.2B). Eine nicht native, weniger stabile Konformation

stellt eine plausible Erklärung für das geringere Expressionsniveau von GlpT mit

C-terminalem c-Myc-Epitop verglichen mit GlpT mit N-terminalen c-Myc-Epitop in

S. cerevisiae und eine Alternative zur Bedeutung der Codon-Zusammensetzung des

N-Terminus dar (vgl. 4.2.2).

(2) Der Wechsel von einem prokaryontischen Expressionssystem zu einem eukaryontischen

geht außerdem mit einer deutlichen Veränderung der Membranzusammensetzung einher. Die

Membranen von E. coli und S. cerevisiae unterscheiden sich erheblich. Das

Hauptphospholipid der inneren Membran von E. coli mit 70–80 % ist zwitterionisches

Phosphatidylethanolamin (PE), der Anteil von PE an den Phospholipiden von S. cerevisiae ist

mit 20 % deutlich geringer. Phosphatidylcholin und Phosphatidylserin kommen bei E. coli

nicht oder nur in Spuren vor, während sie bei S. cerevisiae zusammen 40–55 % der

Phospholipide ausmachen (Morein et al. 1996; Pichler et al. 2001; Opekarova & Tanner

2003). Zudem liegen bei S. cerevisiae ergosterol- und sphingolipidreiche Microdomänen, die

Lipid rafts, vor, die in Prokaryonten generell fehlen (Opekarova & Tanner 2003).

In E. coli-Mutanten mit einer stark veränderten Membranzusammensetzung bilden einige

polytope Transmembranproteine, Lactose-Permease LacY, die wie GlpT zur Major

Facilitator Superfamily (MFS) gehört, Phenylalanin-Permease (PheP), GABA-Permease

(Gamma-Aminobutyrat-Permease, GabP) und wahrscheinlich etliche weitere, nicht-native

Konformationen aus. Abschnitte der Proteine zeigen eine invertierte Lage in der Membran,

d. h. Bereiche, die in natürlicher Konformation cytosolische Schleifen und Termini bilden,

97

befinden sich nun im Periplasma und umgekehrt, was mit einer Veränderung der Anzahl der

Transmembrandomänen einhergeht (Bogdanov et al. 2002; Wang et al. 2002) oder damit,

dass eine Transmembrandomäne eine Haarnadelschleife ausbildet, statt die Membran zu

durchspannen (Zhang et al. 2003; Zhang et al. 2005). Allerdings kann ein Mangel des

Hauptphospholipids PE durch eine dem Organismus fremde Molekülspezies kompensiert

werden (Wikström et al. 2004). Für die natürliche Konformation und Funktion eines

Transmembranproteins sind also in erster Linie die physikalischen Eigenschaften

entscheidend, die PE der Membran verleiht. Entsprechend könnten die zwitterionischen oder

neutralen Molekülspezies von S. cerevisiae fehlendes PE ersetzen.

Auch das Membranpotenzial unterscheidet sich. Während es am ER nahezu 0 ist und an der

Plasmamembran von S. cerevisiae lediglich -60 mV beträgt, liegen an der inneren Membran

von E. coli -150 mV vor (Geller et al. 1996).

Trotz der Unterschiede in Membranzusammensetzung und -potenzial nimmt man an, dass die

Integration eines polytopen Transmembranproteins in die eukaryontische ER-Membran

prinzipiell nach den gleichen Gesetzmäßigkeiten erfolgt wie in die innere Membran Gram-

negativer Bakterien. Dafür spricht, dass der N-Terminus des ABC-Transporters Ste6p von

S. cerevisiae in S. cerevisiae und E. coli gleichermaßen sechs Transmembrandomänen

ausbildet, die gleich und gemäß der Positive-inside-rule orientiert sind (Geller et al. 1996),

dass sich auch viele eukaryontische Proteine gemäß der Positive-inside-rule verhalten (van

Klompenburg et al. 1997) und dass sich eine weitgehend homologe

Translokationsmaschinerie nachweisen lässt (van Dalen & de Kruijff 2004; Robson &

Collinson 2006). Allerdings existieren auch gegenläufige Berichte. So prägt Säuger-P-

Glycoprotein, ein Multidrug-Resistance-Transporter, in E. coli weniger als seine nativen

zwölf Transmembrandomänen aus (Linton & Higgins 2002) und der bakterielle

Citrattransporter (CitS) von Klebsiella pneumoniae bildet in der inneren Membran von E. coli

neun und in Mikrosomen aus ER-Membranen elf Transmembrandomänen aus (van Geest et

al. 1999). Erschwert werden solche vergleichenden topologischen Studien dadurch, dass

gängige topogene Marker wirtsspezifisch sind.

Beim Vergleich von E. coli und S. cerevisiae wird insgesamt deutlich, dass die

Ladungsverteilung und damit die Einbringung des c-Myc-Epitops die Topologie von GlpT in

Hefe möglicherweise weniger stark beeinflusst als es in E. coli der Fall wäre. Intramolekulare

Wechselwirkungen zwischen Abschnitten des polytopen Moleküls spielen in Hefe eine

wichtige Rolle, was durch die Tatsache reflektiert wird, dass verkürzte Proteine und solche

mit topologischen Markern in S. cerevisiae anders als in E. coli uneindeutige, gemischte

98

Topologien aufweisen (Geller et al. 1996; Kreft et al. 2006). Längst nicht alle relevanten

topogenen Signale sind bekannt, so dass keiner der gängigen Algorithmen zuverlässig in der

Lage ist, die natürliche Konformation eines polytopen Transmembranproteins von

S. cerevisiae vorauszusagen (Kreft et al. 2006).

In dieser Arbeit wurden keine topologischen Daten erhoben, es gibt lediglich topologische

Indizien. GlpT fand sich in S. cerevisiae nach der differenziellen Proteinpräparation in der

Membranfraktion und zeigte bei der Immunfluoreszenz-Mikroskopie typische ER-

Lokalisierung. GlpT integrierte daher höchstwahrscheinlich mit seinen hydrophoben

Domänen cotranslational in die ER-Membran.

Eine konformationstabilisierende intramolekulare Brücke wird durch das Laufverhalten von

GlpT aus S. cerevisiae im SDS-Gel nahe gelegt, das von der Reduktionskapazität des

verwendeten Probenpuffers abhing. Die apparente Größe von GlpT änderte sich durch die

Erhöhung der Reduktionskapazität, nicht jedoch durch die Erhöhung der SDS-Konzentration

von 38 KDa auf 50 KDa. Möglicherweise bildet sich anders als in der nativen Konformation

(Fann et al. 2003) eine Disulfidbrücke aus (Abb. 4.2C). Es kann sich auch um eine Salzbrücke

zwischen positiv und negativ geladenen Aminosäureresten in benachbarten

Transmembrandomänen handeln (Abb. 4.2A).

Dass der Transporter in S. cerevisiae an keiner seiner möglichen luminalen

O-Glykosylierungsstellen glykosyliert wird (gezeigt durch fehlenden Shift der Bande im

Western Blot bei Expression in einem ∆pmt1-, ∆pmt2- oder ∆pmt3-Stamm), spricht nicht

gegen seine natürliche Topologie. Er erhebt sich nämlich extrazellulär bzw. luminal kaum aus

der Membran, so dass die Serin- und Threonin-Reste für die Glykosyltransferasen des ER

wahrscheinlich nicht zugänglich sind (Abb. 4.2C).

4.2.4 Wie interagiert GlpT mit der Qualitätskontrol le des ER?

Mit der Integration in die Membran befindet sich GlpT im Bereich der Faltung und

Qualitätskontrolle für sekretorische Proteine, dem ER. Das Endoplasmatische Reticulum ist

ein einzelnes, zusammenhängendes Kompartiment, das in Verbindung mit der Kernmembran

steht (perinukleäres ER) und über einige ausgeprägte Tubuli in Kontakt mit einem tubulären

Netzwerk steht, das dicht unter der Plasmamembran liegt (corticales ER) (Prinz et al. 2000;

Voeltz et al. 2002). Perinukleäres und corticales ER unterscheiden sich nicht in ihrer

Ausstattung mit Ribosomen, Translokasen und Chaperonen und nehmen die gleichen

Funktionen wahr (Fehrenbacher et al. 2002). Eine Hauptfunktion des ER ist die Rückhaltung

vorübergehend oder unwiederbringlich ungefalteter oder falsch gefalteter Proteine und ihr

99

Ausschluss von der weiteren Passage durch den sekretorischen Weg. Chaperone nehmen

dabei die Aufgabe von Faltungssensoren wahr (Ellgaard & Helenius 2003) Je nach ihren

Eigenschaften verbleiben Proteine mehr oder weniger lange im ER. Ein längerer Aufenthalt

kann die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass sich ein Transmembranprotein – auch ein

manipuliertes – noch richtig faltet und anschließend in die Plasmamembran statt zur

Degradation in die Vakuole transferiert wird (Luo et al. 2002).

So findet im ER eine Qualitätskontrolle für Proteine statt. Die meisten unwiederbringlich

falsch gefalteten Transmembranproteine können ins Cytosol rücktransloziert und dort

degradiert werden. Diese ’Räumungsfunktion’ des ER wird als Endoplasmic Reticulum

Associated Degradation (ERAD) bezeichnet (Meusser et al. 2005; Römisch 2005). Außerdem

ist das ER in der Lage, große luminale Proteinaggregate abzubauen (Umebayashi et al. 2001).

Bei der Überexpression heterologer oder manipulierter Proteine, insbesondere wenn die

Kapazität von ERAD nicht ausreicht und UPR induziert wird, proliferiert das ER innerhalb

weniger Stunden bis zum Fünffachen seines ursprünglichen Volumens und verändert seine

Struktur von Tubuli hin zu lamellenförmigen Membranstapeln (Bernales et al. 2006).

Abnorme Kompartimente können entstehen (Umebayashi et al. 1997; Sagt et al. 2002),

beispielsweise lichtmikroskopisch sichtbare punktförmige Strukturen, die das ER-

Markerprotein Kar2p enthalten und sich in elektronenmikroskopischen Bildern als tubuläre

und vesikuläre Membranen in der Nachbarschaft des perinukleären ER erweisen (Fu & Sztul

2003) oder ERACs (Endoplasmic Reticulum-Associated Compartment, Begriff von Huyer et

al. (2004)), die mit einer Vergrößerung des mittleren Zelldurchmessers einhergehen können

(Shusta et al. 1998). Auch in diesem Fall werden die Auslöser dieser Reaktion, manipulierte

hefeeigene oder heterologe Plasmamembranproteine, zum größten Teil in den erweiterten

Membranen festgehalten (Loayza et al. 1998; Fu & Sztul 2003; Makuc et al. 2004).

Griffith et al. identifizierten die UPR als geeigneten Monitor, um die förderliche

Expressionsstärke zu bestimmen: Wird sie nicht oder kaum ausgelöst, geht das mit einer

verbesserten Expression des heterologen Transmembranproteins (Griffith et al. 2003) oder

sekretorischer Proteine (Rakestraw & Wittrup 2006) einher. Feinabstimmung der

Expressionsstärke lässt sich mittels kontrollierter Mehrfachintegration in Delta-Sequenzen

erreichen, dadurch wurde die Expression eines sekretierten Antikörperfragments im Vergleich

mit einem Multicopy-Plasmid deutlich verbessert und die Ausbildung von ER-Artefakten

vermieden (Shusta et al. 1998).

Zwar hatte die Überexpression von GlpT keine Verringerung der spezifischen Wachstumsrate

der ∆gpp1/2-Mutante zur Folge (vgl. 3.2.2), daraus kann aber nicht geschlossen werden, dass

100

UPR nicht stattfindet, im Gegenteil: UPR ist eine effiziente Stressreaktion, die mit gutem

Wachstum vereinbar bzw. Voraussetzung für gutes Wachstum bei Proteinüberexpression ist

(Umebayashi et al. 1999; Kauffman et al. 2002). Andererseits lösen auch andere heterologe

oder manipulierte hefeeigene polytope Transmembranproteine, die im ER festgehalten und

durch ERAD degradiert werden, keine UPR aus, vermutlich, wenn sie – wie GlpT in seiner

nativen Konformation – nur kurze luminale Abschnitte aufweisen, an denen der

Faltungssensor BiP nicht binden kann (Huyer et al. 2004). Dennoch könnten durch UPR

ausgelöste Prozesse die ER-Rückhaltung von GlpT verstärken und seine Expression

begrenzen, so dass der Einsatz eines UPR-Sensors für die zukünftige Identifizierung von

Bottlenecks der GlpT-Expression in S. cerevisiae sinnvoll sein kann.

Andere Autoren evaluierten den Nutzen einer Überexpression der allgemeinen ER-Chaperone

BiP und/oder PDI für die heterologe Proteinexpression in Hefe, um auf diesem Weg die

Expressionsstärke an die Faltungskapazität des ER anzupassen. Simultane Überexpression,

wie sie auch durch die UPR induziert wird, beseitigte den Expressionsdefekt, der sich

aufgrund einer zu hohen Gendosis einstellte, in einer synergistischen Weise (Robinson et al.

1994; Shusta et al. 1998; Bao & Fukuhara 2001; Smith et al. 2004; Lodi et al. 2005),

allerdings ohne eine stärkere Expression als bei abgestimmter Gendosis zu erreichen (Shusta

et al. 1998). Erfolgreich war diese Strategie auch bei der heterologen Expression eines

Transmembranproteins, des humanen Adenosinrezeptors Aa2 (Niebauer et al. 2004). In

anderen Fällen war die Faltungskapazität des ER offensichtlich nicht der limitierende Faktor,

da die Überexpression von BiP und/oder PDI keinen positiven Effekt für die Expression

sekretierter Proteine (Robinson et al. 1996; Bao & Fukuhara 2001; Lodi et al. 2005) oder

Transmembranproteine (Butz et al. 2003) hatte. Anstelle der Chaperone wurde auch der

übergeordnete Transkriptionsfaktor HAC1p, der die Transkription der 380 Gene der UPR

reguliert, überexprimiert, was die Sekretion homologer und heterologer löslicher Enzyme

nicht deutlich verbesserte (Valkonen et al. 2003). Insgesamt scheinen heterologe Proteine, bei

denen Disulfidbrücken gebildet werden müssen, insbesondere Antikörperfragmente,

besonders von der Koexpression mit Hefe-Chaperonen zu profitieren. GlpT in der nativen

Konformation weist jedoch keine Disulfidbrücken auf.

Eine sehr hohe Gendosis ist nicht in jedem Fall von Nachteil für die Expression eines

heterologen Transmembranproteins. Die Passage durch den sekretorischen Weg kann

unabhängig von der Anzahl der Genkopien sein (Butz et al. 2003). Einige Autoren berichten

sogar, dass ER-Rückhaltung und ERAD von Transmembranproteinen gesättigt werden

können (Arvan et al. 2002; Kruse et al. 2006) und bei hinreichender Expressionsstärke

101

(stärkerer Promoter, Multicopy-Plasmid) ein Teil des heterologen oder manipulierten Proteins

die Plasmamembran erreicht (Chang & Fink 1995; Figler et al. 2000; Nakatsukasa et al. 2004;

Froissard et al. 2006).

Obwohl es also durchaus möglich ist, dass das gewählte Multicopy-Plasmid mit konstitutivem

ADH1- Promoter für die heterologe Expression von GlpT das günstigste Verfahren darstellt,

wäre dennoch der Versuch lohnend, GlpT unter der Kontrolle einer Kollektion von

Promotoren abgestufter Stärke zu exprimieren, wie sie von Nevoigt et al. (2006) bereitgestellt

wurde, und Expressionsstärke und Lokalisierung zu vergleichen. Denn die Expressionsstärke

bewirkt nicht per se, wohl aber im Zusammenspiel mit der Qualitätskontrolle den ER-

Rückhalt.

Dass der größte Teil von GlpT im ER festgehalten wird, wurde mit Immunfluoreszenz

nachgewiesen. Eine solche biochemische Methode ist jedoch wenig sensitiv, verglichen mit

dem Nachweis funktionalen heterologen Proteins an der Zelloberfläche durch phänotypische

Komplementierung, wie er von vielen Autoren verwendet wird. Auch wenn die Anwesenheit

von funktionalem heterologen Protein in der Plasmamembran durch Selektion und sensitive

Bioassays wie messbare Transportraten oder Bindungskinetiken einwandfrei bestätigt werden

kann, wird zumeist der größte Teil des heterologen Proteins mit Fluoreszenz-Mikroskopie und

Dichtegradientenfraktionierung im ER nachgewiesen, beispielsweise bei Makuc et al. (2004).

Der in dieser Arbeit verwendete Assay entspricht in seiner Sensitivität der anvisierten

Anwendung und zeigt damit an, dass die Menge an funktionalem GlpT in der

Plasmamembran nicht ausreichend ist. Er ist nicht sensitiv genug, um auszuschließen, dass

GlpT die Plasmamembran erreicht und dort aktiv ist.

4.2.5 Fehlt eine hefetypische Signalsequenz für die Plasmamembran?

Insgesamt erreicht höchstens ein kleiner Anteil von GlpT die Plasmamembran. Mechanismen

für das Verlassen des ER könnten die Sättigung der zellulären Qualitätskontrollsysteme (vgl.

4.2.4) oder die Interaktion mit der Proteinsortierungs-Maschinerie von S. cerevisiae sein. Die

Plasmamembranproteine dieses Eukaryonten durchlaufen die Stationen des so genannten

sekretorischen Weges (Begriff von R. Schekman für Hefe als nicht-sekretorischen Zelltyp

gebraucht (Novick et al. 1980)). Transmembranproteine reisen dabei in den Membranen der

Kompartimente raues Endoplasmatisches Reticulum (rER), COPII-Vesikel, Golgi-Apparat

mit Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) und sekretorische Vesikel. Die Plasmamembran (PM) ist

die Endstation des sekretorischen Weges für Transmembranproteine. Es stellt sich die Frage,

ob eine entsprechende hefeeigene Signalsequenz die Passage des bakteriellen Transporters

102

durch den sekretorischen Weg verbessern kann (1) oder ob bestimmte Abschnitte von GlpT

seine Lokalisierung in die Plasmamembran verhindern (2).

(1) Im generellen Modell trägt der N-Terminus des zu sekretierenden löslichen Proteins oder

des Transmembranproteins eine hydrophobe Signalsequenz, die vom SRP-Protein (Signal

Recognition Particle) gebunden und zu einem SRP-Rezeptor an der ER-Membran dirigiert

wird. Dort erfolgt die Translokation durch eine Translokase und die Abtrennung des

Signalpeptids durch die essentielle Signalpeptidase im Lumen des ER. Für die Translokation

hydrophiler Abschnitte der wachsenden Polypeptidkette durch die hydrophobe Membran ist

Aufwendung von Energie nötig. Hydrophobe Abschnitte hinreichender Länge verlassen die

Translokase hingegen seitlich und treten in die Membran über (Wickner & Schekman 2005).

Hefeeigene Signalpeptide und ihre Derivate, beispielsweise das Signalpeptid der Invertase

oder die Pre-pro-Sequenz des Alpha-Faktors, sowie synthetische Signalpeptide werden

routinemäßig und oft mit gutem Erfolg für die heterologe Expression löslicher, zu

sekretierender Proteine eingesetzt (Baldari et al. 1987; Kjeldsen et al. 1997; Arnold et al.

1998; Shusta et al. 1998; Sagt et al. 2000; Schuster et al. 2001; Zhang et al. 2001). Bei

integralen Proteinen verbessern solche Signalpeptide teilweise die Expression (Reis et al.

1999; Butz et al. 2003). Die meisten Transmembranproteine von Hefe haben aber selbst keine

abtrennbaren Signalpeptide (Haguenauer-Tsapis & André 2004). Das gilt für solche, deren

N-Termini luminal bzw. extrazellulär liegen, beispielsweise der A-Faktor-Transporter Ste6p

(Geller et al. 1996) oder der Alpha-Faktor-Rezeptor Ste2p, und erst recht für solche, deren

N-Termini im Cytosol liegen, wie die meisten hefeeigenen Transporter, beispielsweise die

Plasmamembran-ATPase (Pma1p) und die Allgemeine Aminosäuren-Permease (Gap1p). Die

Daten dieser Arbeit sprechen ebenfalls dafür, dass nicht mangelnde Integration in die ER-

Membran, sondern die mangelnde Passage durch den sekretorischen Weg für die

unerwünschte Lokalisierung und Inaktivität von GlpT verantwortlich ist.

Zur Verbesserung der Lokalisierung wurden im Rahmen dieser Arbeit Chimären aus längeren

N-terminalen Sequenzen des Alpha-Faktor-Rezeptors Ste2p und GlpT mit C-terminalem

c-Myc-Epitop exprimiert. Lokalisierungsvoraussagen mit den Online-Algorithmen TargetP

und PSORTII ergaben für die Chimären aus einer beziehungsweise sieben

Transmembrandomänen von Ste2p und GlpT eine höhere Wahrscheinlichkeit, in die

eukaryontische Plasmamembran zu gelangen als für GlpT allein (Abb. 4.3). Der

Folgealgorithmus von PSORTII, WoLF PSORT (http://wolfpsort.org/ Parameter: Fungi,

Zugriff am 5.12.2006), weist GlpT allein sowie beide Chimären eindeutig der

Plasmamembran zu (Nakai & Kanehisa 1992; Nakai & Horton 1999; Emanuelsson et al.

103

2000; Emanuelsson et al. 2007; Horton et al. 2007). Experimentell konnte diese Prognose

jedoch nicht bestätigt werden. TargetP ist allerdings auch nicht in der Lage, die

Plasmamembranständigkeit homologer Hefeproteine vorauszusagen, beispielsweise von

Pma1p und Gap1p.

0.794: other0.318: secretory pathway

0.058: mitochondrial

73.9 73.9 %: plasma membrane13.0 %: endoplasmic reticulum

8.7 %: vacuolar

4.3 %: nuclear

TM1-7 Ste2p - GlpT

0.789: other

0.3560.356: secretory pathway

0.055 mitochondrial

69.6 69.6 %: plasma membrane

13.0 %: endoplasmic reticulum

8.7 %: vacuolar

4.3 %: Golgi4.3 %: nuclear

TM1 Ste2p - GlpT

0.521; mitochondrial

0.357: other



13.0 %: vacuolar8.7 %: endoplasmic reticulum

4.3 %: Golgi

4.3 %: mitochondrial

4.3 %: nuclear

GlpT

TargetPPSORTII

0.794: other0.318: secretory pathway

0.058: mitochondrial

73.9 73.9 %: plasma membrane13.0 %: endoplasmic reticulum

8.7 %: vacuolar

4.3 %: nuclear

TM1-7 Ste2p - GlpT

0.789: other


0.055 mitochondrial


13.0 %: endoplasmic reticulum

8.7 %: vacuolar

4.3 %: Golgi4.3 %: nuclear

TM1 Ste2p - GlpT

0.521; mitochondrial

0.357: other



13.0 %: vacuolar8.7 %: endoplasmic reticulum

4.3 %: Golgi

4.3 %: mitochondrial

4.3 %: nuclear

GlpT

TargetPPSORTII

Abb. 4.3. Voraussagen der Lokalisierungs-Algorithmen PSORT II (http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form2.html, Zugriff am 5.12.2006) und TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/, Zugriff am 5.12.2006) für die Lokalisierung von GlpT alleine bzw. Fusionsproteinen aus Ste2p und GlpT.

PSORT II gibt für die verschiedenen Kompartimente eine Wahrscheinlichkeit in Prozent an. In der Suchmaske vorgegeben wurde der Zielorganismus: Yeast/Animal.

Die Wahrscheinlichkeiten, die TargetP ausgibt, summieren sich zu eins. In der Suchmaske vorgegeben wurden die Parameter: Non-plant, Perform cleavage site predictions, No cutoffs (default).

Fett gedruckt sind die Wahrscheinlichkeiten für die erwünschte Lokalisierung in der Plasmamembran bzw. im sekretorischen Weg.

Andere Experimentatoren waren ebenfalls mit Proteinchimären mit N-Termini von

hefeeigenen Plasmamembranproteinen nicht erfolgreich, selbst dann nicht, wenn die

Ubiquitinierungsanker daraus zuvor entfernt worden waren: Das Ersetzen des N-Terminus

führte dazu, dass kein Protein detektiert werden konnte (Reis et al. 1999; Flegelova et al.

2006). In beiden Fällen handelte es sich wie bei GlpT um cytosolische N-Termini.

104

(2) Rückhalte- oder Rückführungsmotive sind Bestandteil von Hefe-Proteinen, die zur

Ausstattung der Organellen des sekretorischen Weges gehören (beispielsweise Chaperone,

SNAREs, Glykosyltransferasen u. a.). Ein Plasmamembranprotein von S. cerevisiae ist nach

diesem Modell durch das Fehlen spezifischer Rückhaltemotive gekennzeichnet. Experimentell

wird das Modell dadurch gestützt, dass die Mutagenese eines kompartimentspezifischen

Rückhaltesystems eine Plasmamembranmisslokalisierung eines ER-Proteins zur Folge haben

kann (Nishikawa & Nakano 1993). Falls GlpT ein solches Motiv in seiner Sequenz trägt,

könnte dieses den ER-Rückhalt bewirken.

Ein mögliches Arginin-basiertes ER-Rückhaltemotiv in der Form RRLR befindet sich in GlpT

in der Nähe des N-Terminus an Position 24–27 (Abb. 4.2D). Dieses Motiv ist in homologen

Hefeproteinen unbekannt, funktioniert dort aber gleichwohl (Michelsen et al. 2006) und hat

sich in mehreren Reporterproteinen der verschiedensten Topologie als dominant erwiesen

(Michelsen et al. 2005). Ein Ansatzpunkt wäre es, dieses Motiv in GlpT zu mutagenisieren,

beispielsweise Leucin durch das kleinere Glycin oder Arginin durch Lysin zu ersetzen, und

die Lokalisierung zu überprüfen.

Di-basische Motive werden in Hefe sowohl mit ER-Recycling als auch mit ER-Exit in

Verbindung gebracht. Es ist fraglich, ob KK in der letzten cytosolischen Schleife, Position

378–379, trotz der großen Distanz zum C-Terminus als K(X)KXX-ER-Recyclingmotiv wie in

der Oligosaccharyl-Transferase-Untereinheit Wbp1p seine Wirkung entfaltet, das heißt mit

der COPI-Maschinerie interagiert. Möglich ist auch, dass beispielsweise KK, Position 378–

379 oder KRR, Position 439–441, als R/K(X)R/K-Motiv, das typisch für Glykosyltransferasen

des Golgi-Apparates ist (Giraudo & Maccioni 2003), im C-Terminus von GlpT und in

unmittelbarer Nähe einer Transmembrandomäne positiv mit der COPII-Maschinerie

interagieren kann und so für die Entlassung aus dem ER förderlich ist. An weiteren möglichen

COPII-wirksamen ER-Exit-Motiven ist im N-Terminus von GlpT, Position 18–20, ein

cytosolisches di-saures DXE-Element in der Form EID vorhanden. DXE-Elemente kommen in

Hefe beispielsweise im C-Terminus des integralen Golgi-Proteins Sys1p (Votsmeier &

Gallwitz 2001) und der Allgemeinen Aminosäuren-Permease Gap1p (Malkus et al. 2002) und

in beiden Termini des ABC-Transporters Yor1p (Epping & Moye-Rowley 2002) vor. Ein di-

aromatisches bzw. di-hydrophobisches ER-Exit-Motiv fehlt (Otte & Barlowe 2002; Sato &

Nakano 2002; Barlowe 2003).

Insgesamt ergibt sich so ein gemischtes Bild, das möglicherweise für die nicht eindeutigen

bzw. nicht zutreffenden Lokalisierungsprognosen der Algorithmen verantwortlich ist.

105

E

ME SL

QKLSD

TR

LA

E

IEE

E

ME SL

QKLSD

TR

LA

E

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B

E

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TR

LA

E

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Angefügte Sequenz

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Angefügte Sequenz

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ME SL

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TR

LA

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ER-Lumen

Cytosol

106

Abb. 4.2. Schematische Darstellung von GlpT mit N-terminalem c-Myc-Epitop in der ER-Membran von S. cerevisiae bei nativer Topologie (unter Verwendung einer Abbildung aus Huang et al., 2003). Markiert sind die Positionen, an denen mögliche posttranslationale Modifikationen stattfinden können, oder Bereiche, die als Signalsequenzen im sekretorischen Weg wirken können.

A Positiv geladene Aminosäure-Reste

Negativ geladene Aminosäure-Reste

B Lysin-Reste, die im Cytosol ubiquitiniert werden können

C Serin- und Threonin-Reste, an denen im Lumen des ER O-Glykosylierung stattfinden kann

Cystein-Reste, die im Lumen des ER Disulfidbrücken ausbilden können

Schnittstellen für Kexin im Lumen des Trans-Golgi-Netzwerks

D Mögliches ER-Rückhaltemotiv

Mögliches ER-Exit-Motiv

Rückhaltesequenzen anderer Art sind exponierte saure oder hydrophile Reste in

Transmembrandomänen polytoper Transmembranproteine. Sie signalisieren eine

unzureichende Faltung und können die Wahrscheinlichkeit der PM-Lokalisierung dieser

Proteine gleich an drei Stationen verhindern: durch Rückführung ins ER durch den Rezeptor

Rer1p, durch Sortierung in den endosomalen Weg im TGN nach Ubiquitinierung durch Tul1p

und durch beschleunigte Endocytose von der PM (Reggiori & Pelham 2002). Saure Reste

kommen in der ersten, zweiten, siebten, achten und elften Transmembrandomäne von GlpT

vor (Abb. 4.2A), in der nativen Konformation ist die Oberfläche des Transporters jedoch

ungeladen; geladene Reste bilden eine Höhle um die Substratbindungsstelle (Huang et al.

2003).

Der Ausschluss eines Proteins aus ER-Exit-Sites, an denen COPII-Vesikel in Richtung Golgi-

Apparat sprossen, kann noch auf andere Weise als über bekannte ER-Rückhaltemotive

erfolgen (Ellgaard & Helenius 2003). So benötigen einige hefeeigene Transmembranproteine

mit 12 Transmembrandomänen spezifische Chaperone in der ER-Membran, die ihre

Aggregation verhindern (Kota & Ljungdahl 2005). Bekannte Hilfsproteine des ER,

beispielsweise Sop4p, vermitteln nur einer sehr begrenzten Auswahl von

Transmembranproteinen das Verlassen des ER (Luo et al. 2002). Anders als für den Säuger-

Monocarboxylat-Transporter MCT1 (Makuc et al. 2004) ist für bakterielles GlpT kein

akzessorisches Protein bekannt, das positiv mit der Proteinsortierungs-Maschinerie von Hefe

107

interagieren oder ungünstige Bereiche von GlpT abschirmen könnte, so dass sich daraus kein

weiterer Anhaltspunkt für eine zukünftige Verbesserung der Lokalisierung ergibt.

4.2.6 Welche Rolle spielt die Membranzusammensetzung für die Lokalisierung

von GlpT?

Mehr und mehr rückt die Bedeutung der Membranzusammensetzung für die Lokalisierung

und Funktionalität von homologen und heterologen Transmembranproteinen in den Fokus.

Membranproteine müssen als Membran-Lipid-Komplexe angesehen werden, da spezifische

Lipide reproduzierbare Bestandteile der Proteinkristalle sind. Daraus folgt, dass viele

Transmembranproteine durch eine unpassende Lipidumgebung im heterologen Wirt in ihrer

Expression und/oder Funktion beeinträchtigt werden (Opekarova & Tanner 2003). Das Fehlen

von Cholesterol scheint stärker als die Anwesenheit von Ergosterol für die beeinträchtigte

Funktionalität von Säuger-Rezeptoren und -Transportern in Hefe verantwortlich zu sein

(Opekarova & Tanner 2003). Die Dicke der Membran kann ebenfalls die Konformation und

damit die Funktionalität des Proteins beeinflussen (Jensen & Mouritsen 2004).

Die bakterielle Innenmembran unterscheidet sich grundlegend von der Plasmamembran von

Hefe durch das Fehlen von Sphingolipiden und Sterolen. Daher ist unbekannt, ob und auf

welche Weise GlpT mit diesen Lipiden interagiert. Unterschiedliche Konzentrationen von

Sterolen und Triacyglycerolen in den Stammhintergründen W303, CEN.PK2 und dem zur

BY-Serie isogenen FY1679 (Daum et al. 1999) könnten zu den unterschiedlichen

Expressionsniveaus von GlpT beitragen.

Zumindest in einem Fall behinderte Ergosterol in der Plasmamembran von S. cerevisiae

nachweislich die Expression eines heterologen polytopen Transmembranproteins. Durch die

Ausschaltung des letzten reduzierenden Schrittes der Ergosterol-Synthese, die Deletion von

ERG4, wurde die Expression von Säuger-Glucosetransportern verbessert; dies war aber nicht

auf Na/H+-Antiporter übertragbar (Flegelova et al. 2006) und steht daher als weitere

Maßnahme für eine verbesserte Plasmamembranlokalisierung von GlpT nicht im

Vordergrund.

Andererseits könnte gerade die fehlende Interaktion von GlpT mit Ergosterol und/oder

Sphingolipiden zu seiner Misslokalisierung in Hefe führen. Man geht davon aus, dass in Hefe

wie in Säugerzellen Ergosterol und Sphingolipide nicht gleichmäßig in der Membran verteilt

sind, sondern verdickte Microdomänen, die so genannten Lipid rafts ausbilden (Wachtler &

Balasubramanian 2006). Die hefeeigene Plasmamembran-ATPase Pma1p und die

Tryptophan-Permease Tat2p assoziieren nachweislich bereits in frühen Kompartimenten des

108

sekretorischen Weges mit Sphingolipiden oder Ergosterol, was eine Voraussetzung für ihre

Plasmamembranlokalisierung ist (Bagnat et al. 2001; Umebayashi & Nakano 2003; Gaigg et

al. 2005).

Der pflanzliche Transporter Hup1p erreicht, wenn er in S. cerevisiae exprimiert wird, effizient

die Plasmamembran. Allem Anschein nach liegt er dort in Lipid rafts vor (Grossmann et al.

2006), obwohl die Existenz von rafts in Pflanzen nicht nachgewiesen ist. Lauwers & André

präsentierten jüngst ein Modell, nach dem sich alle Plasmamembranproteine der Hefe rafts

zuordnen lassen (2006). Demnach wäre GlpT von der Plasmamembranlokalisierung in Hefe

ausgeschlossen, wenn es nicht im Golgi-Apparat in diese Microdomänen eintritt.

Dass das Signal für Plasmamembranlokalisierung nicht in einer speziellen

Aminosäuresequenz, sondern in der Länge der Transmembrandomänen besteht, die mit der

zunehmenden Dicke der Membranen entlang des sekretorischen Weges (bedingt durch ihren

zunehmenden Sterolgehalt) korrespondiert, wurde als Modell der Proteinverteilung durch

Hydrophobic matching beschrieben (Munro 1991, 1995; Levine et al. 2000; Malinska et al.

2003; Jensen & Mouritsen 2004). In der Tat ließen sich originäre ER-Proteine auch in

S. cerevisiae durch die Verlängerung ihrer Transmembrandomäne in die PM translozieren,

allerdings könnte dieser Effekt mechanistisch darauf beruht haben, dass ein unbekanntes ER-

Rückhaltemotiv zerstört wurde (Rayner & Pelham 1997, Yang M JBC 1997). Dem Modell

der Proteinverteilung durch Hydrophobic matching widersprachen Mitra et al. (2004), deren

Experimente ergaben, dass die Dicke einer Membran, sei sie pro- oder eukaryontischen

Ursprungs, von der Konzentration der Transmembranproteine abhängt und nicht von ihrer

Lipidzusammensetzung. GlpT weist Transmembrandomänen von 18–22 Aminosäuren Länge

auf. Diese Längen entsprechen relativ gut den mutmaßlichen Längen der

Transmembrandomänen polytoper homologer Plasmamembranproteine von S. cerevisiae

(beispielsweise Hxt1p 17–21, Pma1p 17–22, Gap1p 19–21, Pho84p 21, Git1p 21–22,

Ste2p 23 Aminosäuren in einer TMD). Allerdings sagt die Anzahl der Aminosäuren in der

Primärsequenz der Transmembrandomäne nur dann etwas über den Abstand aus, den sie

überbrückt, wenn die Helix genau senkrecht zur Membran steht. In der nativen Konformation

von GlpT ist das nicht der Fall: Die Transmembrandomänen sind teilweise verdrillt (Huang et

al. 2003), ihre Länge würde demnach überschätzt und könnte unter Umständen den

Ausschluss des Proteins aus verdickten ergosterol- und sphingolipidreichen

Membranbereichen (Lipid rafts) im mittleren Golgi-Apparat und nachfolgend in der

Plasmamembran bewirken.

109

4.2.7 Auf welchem Weg gelangt GlpT in die Vakuole?

Die Expressionsstärke von GlpT mit N- oder C-terminalem c-Myc-Epitop ist in Stämmen, in

denen die vakuoläre Protease Proteinase A ausgeschaltet ist (∆pep4), verstärkt. Da diese

Erfahrung häufig bei der heterologen Expression von Membranproteinen gemacht wurde,

wurden viele proteasedefiziente Stämme konstruiert und sind heute in Stammsammlungen

zugänglich (Jones 2002). Die Verwendung solcher Stämme erleichtert die Proteinpräparation,

da hauptsächlich präparativ vakuoläre Proteasen mit ihren Substraten in Kontakt kommen.

Falls die Protease-Inhibition bei der Präparation von GlpT nicht vollständig gelang, ist die

PEP4-Abhängigkeit der Steady-State-Expression von GlpT darauf zurückzuführen.

Bei vollständiger Protease-Inhibition, wie sie durch die verwendeten Puffer und das Protokoll

angestrebt war, gibt die PEP4-Abhängigkeit der Steady-State-Expression von GlpT

Anhaltspunkte für sein Schicksal in Zellen von S. cerevisiae. Wird ein Protein effizient am

ER degradiert, hat eine Ausschaltung der vakuolären Protease keine Auswirkung auf seine

Degradationsrate (Kiser et al. 2001; Umebayashi et al. 2001). Proteine, die der

Qualitätskontrolle des Golgi-Apparates oder der Plasmamembran unterliegen, werden

hingegen zur Degradation in die Vakuole geschleust. Dass möglicherweise ein nennenswerter

Teil von GlpT die Vakuole erreicht, weist auf seine Entlassung aus dem ER hin. ∆pep4-

Mutanten zeigen stark erniedrigte Aktivitäten der anderen vakuolären Proteasen Proteinase B,

Carboxypeptidase Y und Aminopeptidase I. Dass die Ausschaltung der Proteinase B, des

Genprodukts von PRB1, keinen Einfluss auf die Expressionsstärke von GlpT hatte, kann

daran liegen, dass die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase geerntet wurden,

während der Proteinase B noch nicht aktiv ist (Jones 2002).

Studien zur Lokalisierung von mutierter Plasmamembran-ATPase Pma1p zeigen mögliche

Wege auf, auf denen ein Transmembranprotein, das die Qualitätskontrolle des Golgi-Apparats

oder der Plasmamembran nicht passiert, die Vakuole erreichen kann. Pma1-10 wird

temperaturabhängig rasch von der Plasmamembran endocytiert und in der Vakuole degradiert.

Pma1-7 hingegen erreicht die Vakuole temperaturabhängig ohne Umweg über die

Plasmamembran, sie wird vom Golgi-Apparat direkt in den endosomalen Weg geschleust

(Chang & Fink 1995; Luo & Chang 1997; Gong & Chang 2001; Toulmay & Schneiter 2007).

Interessant ist, dass die Lokalisierung in der Vakuole im Zusammenhang mit der

Lokalisierung in der Plasmamembran steht, ein retrograder Transport vom Endosom zum

Golgi-Apparat existiert (Bonifacino & Rojas 2006) und Eingriffe in die Wege zur Vakuole

eine verstärkte Plasmamembranlokalisierung zur Folge haben können. Pma1-7 erreicht in

mindestens 16 Single-Knockout-Mutanten bei nicht-permissiver Temperatur die

110

Plasmamembran, etliche davon sind vps-Mutanten (Vacuolar Protein Sorting, (Luo & Chang

1997; Luo et al. 2002)). Eine vps-Mutante, bei der ein vesikulärer Weg vom Golgi-Apparat

zur Vakuole gesperrt ist, weist eine verbesserte PM-Lokalisierung von manipuliertem Ste2p

auf (Jenness et al. 1997). Mutationen, die die Reifung des Endosoms zum Multivesicular

Body MVB unterbinden (Komponenten des ESCRT-Komplexes), zeigen eine verstärkte

Plasmamembranlokalisierung von GAP1p (Rubio-Texeira & Kaiser 2006). Sofern die

Qualitätskontrolle eines Proteins im Golgi-Apparat erfolgt, kann auf diese Weise

Plasmamembranlokalisierung doch noch erreicht werden.

Ein alternativer Eingriff setzt am übergeordneten Mechanismus der Ubiquitinierung an. Die

Ubiquitinierungsstellen im hydrophilen N-Terminus von manipulierter Gap1p durch Arginin

zu ersetzen, stabilisiert das Protein in der Plasmamembran (Soetens et al. 2001). Manipulierte

Gap1p mit verkürztem C-Terminus, die ins Trans-Golgi-Netzwerk sortiert wird und von dort

in Endosomen gelangt, kann durch die Entfernung von Ubiquitinierungsankern verstärkt in

die Plasmamembran lokalisiert werden (Gao & Kaiser 2006). GlpT trägt eine große Zahl von

cytosolischen Lysin-Resten, die als Anker für die Ubiquitinierung und nachfolgende

Degradation zur Verfügung stehen. Diese alle zu ersetzen, würde allerdings die Funktionalität

des Proteins in Frage stellen. Alternativ senkt die Deletion von DOA4 den zellulären

Ubiquitin-Pool. Ein Säuger-Na/H+-Antiporter ließ sich jedoch in einer doa4-Mutante nicht

verstärkt exprimieren (Flegelova et al. 2006).

Erfolge bei der heterologen Expression von Membranproteinen in S. cerevisiae wurden in

jüngster Zeit mit Mutationen erzielt, die die Rsp5-abhängige Ubiquitinierung beeinflussen.

Rsp5p ist eine multifunktionale Ubiquitinligase, die an verschiedenen Membranen aktiv

werden kann. Die Nullmutante ∆rsp5 ist nicht lebensfähig, weshalb die Promoter-Mutante

npi1-1 und eine verkürzte Lokalisierungs-Mutante Verwendung finden (Haguenauer-Tsapis &

André 2004). In diesen Mutanten wurde die Plasmamembranlokalisierung mutierter Pma1p

(Pizzirusso & Chang 2004) und dreier sehr verschiedener heterologer Transmembranproteine,

eines Na+/K+-Antiporters, der Uracil-Permease und von Ammoniumtransportern verstärkt

(Flegelova et al. 2006; Froissard et al. 2006). Die verbesserte Plasmamembranlokalisierung

wird zumindest in einem Fall auf Kosten der Vakuolenlokalisierung erreicht (Flegelova et al.

2006). Der Versuch, den gleichen Effekt durch Mutationen möglicher vor- oder

nachgeordneter Instanzen zu erreichen, misslang allerdings (Flegelova et al. 2006). Die

Expression von GlpT in rsp5-Mutanten stellt trotz des fehlenden Verständnisses des

Wirkmechanismus einen lohnenden Ansatz dar. Der zu erzielende Effekt könnte allerdings für

das Ziel dieser Arbeit nicht ausreichend sein.

111

Autophagie ist der andere wahrscheinliche Weg, auf dem GlpT in die Vakuole gelangen kann.

Damit werden alle Prozesse bezeichnet, bei denen subzelluläre Strukturen zunächst von einer

Doppelmembran umschlossen und dann nach Fusion der äußeren Hülle mit der

Vakuolenmembran in der Vakuole degradiert werden. Autophagie wurde zunächst als

Hungerreaktion der Zellen beschrieben, bei der in Ermangelung einer externen N- oder

C-Quelle zelleigenes Protein die überlebenswichtigen Elemente liefert. Dazu trägt nicht nur

das Cytosol bei, sondern auch das ER. Ein Leitprotein des ER kann in Autophagosomen und

in der Vakuole nachgewiesen werden (Hamasaki et al. 2005), wenn die Zellen nicht wachsen.

Im Unterschied dazu wurden die GlpT-exprimierenden Zellen in dieser Arbeit für die

Proteinpräparation stets während des logarithmischen Wachstums geerntet, so dass dieser

nicht-selektive Weg (Reggiori et al. 2005) wahrscheinlich nicht beschritten wird. Daneben

existieren aber noch selektive Formen der Autophagie, bei denen sehr verschiedene Substrate

wie Protein-Oligomere, Peroxisomen oder Mitochondrien in die Vakuole verbracht werden

können. Diese unterscheiden sich auch in ihrem Mechanismus von den nicht selektiven (Nair

& Klionsky 2005; Reggiori et al. 2005). Zu ihnen gehört möglicherweise die jüngst erstmals

beschriebene selektive Autophagie von ER. Diese steht im Zusammenhang mit UPR und ER-

Stress (Bernales et al. 2006; Kruse et al. 2006; Yorimitsu et al. 2006), bremst möglicherweise

überschießende ER-Proliferation ab und ist für das Überleben der Hefezellen unter

anhaltender UPR notwendig (Bernales et al. 2006). Da GlpT von einem Multicopy-Vektor

überexprimiert wurde (vgl. 4.2.4) und nicht die hefespezifischen topogenen Signale enthält

(vgl. 4.2.3), könnte es UPR auslösen, auf diesem Weg in die Vakuole gelangen und so ein

PEP4-abhängiges Expressionsniveau zeigen.

Wege der Qualitätskontrolle des Golgi-Apparates und der Plasmamembran sowie der

Qualitätskontrolle des ER (Autophagie) konvergieren somit in der Vakuole. Aus der PEP4-

Abhängigkeit der Steady-State-Expression von GlpT kann daher nicht darauf geschlossen

werden, welche Qualitätskontrollinstanzen wirksam werden.

4.2.8 Weitere mögliche Strategien für die Verbesserung der Expression und

Lokalisierung von GlpT in S. cerevisiae

Einzelne Mutationen haben sich für die heterologe Expression eines Transmembranproteins in

Hefe als förderlich erwiesen, beispielsweise die Deletion von CNE1 (Prinz et al. 2003) oder

fgy1-1 im uncharakterisierten Gen YMR212 (Wieczorke et al. 2003). Der Erfolg war jedoch

proteinspezifisch, da die Mutationen die Expression eines anderen Transmembranproteins

nicht beeinflussten (Flegelova et al. 2006).

112

Auch der Glykosylierung eines Proteins kommt Bedeutung für seine Passage durch den

sekretorischen Weg zu. Im Fall einer löslichen heterologen Lipase wurde die Sekretierung

durch die Einführung einer zusätzlicher N-Glykosylierungsstelle verbessert, wenn diese

N-terminal des kritischen hydrophoben Bereiches eingefügt wurde (Sagt et al. 2000). Auch

O-Glykosylierung durch die Mannosyltransferase Pmt2p vergrößert die Solubilität

hydrophober löslicher Proteine und erlaubt ihre Passage durch den sekretorischen Weg, was

als Schutzmechanismus der Zellen vor Aggregatbildung gedeutet wird (Nakatsukasa et al.

2004). O-Glykosylierung erscheint in diesem Zusammenhang als Alternative bzw. Überlauf

zur Bindung an die Chaperone BiP und PDI, die ERAD vorausgehen. Im Golgi-Apparat

zurückgehaltene Proteinchimären aus einer Transmembrandomäne und dem N-Terminus der

Invertase Suc2p konnten nach Einfügung nativer O-Glykosylierungssequenzen in die

Plasmamembran vordringen (Proszynski et al. 2004). Es gibt andererseits auch ein Beispiel

dafür, dass die Glykosylierung anders als in Säugerzellen keine Voraussetzung für die

Plasmamembranlokalisierung eines Säuger-Transporters in Hefe war (Butz et al. 2003).

Da GlpT in S. cerevisiae kein bevorzugtes Substrat für Mannosyltransferasen des ER ist,

könnte die Einbringung luminaler Konsensus-Sequenzen für die N-Glykosylierung die

Passage zur Plasmamembran ermöglichen. Hierzu bieten sich am ehesten die luminalen

Schleifen Nr. 1, 2, 3 und 5 an, da jeweils nur eine einzige Aminosäure ausgetauscht werden

müsste, um die eukaryontische Konsensus-Sequenz NXS/T für die cotranslationale N-

Glykosylierung zu erzeugen.

Unabhängig von bestimmten Mutationen oder der Glykosylierung konnte unter verschiedenen

Kultivierungsbedingungen eine verbesserte heterologe Proteinexpression erreicht werden

(Mattanovich et al. 2004). Beispielsweise erhöhten 5–10 % Glycerol im Medium die

Expression eines Säuger-ABC-Transporters und eines Fusionsproteins aus einem homologen

K+-Transporter und topologischen Markern, so dass Glycerol als chemisches Chaperone

bezeichnet wurde. Dabei stieg, wie gewünscht, vor allem der Anteil der Transporter in der

Plasmamembran (Figler et al. 2000; Zeng et al. 2004). Dieser positive Effekt ging mit einer

verminderten Wachstumsrate einher (Figler et al. 2000). Anders als GlpT erreichen diese

Transporter auch ohne Glycerol im Medium mit mittlerer Effizienz die Plasmamembran. War

dies nicht der Fall, konnten verschiedene Glycerolkonzentrationen im Medium nichts

ausrichten (Flegelova et al. 2006).

Eine niedrige Kultivierungstemperatur geht oft mit einer verbesserten Passage durch den

sekretorischen Weg einher, was mit günstigeren Faltungsbedingungen für das Protein im ER

erklärt wird: Ein langsamerer Faltungsprozess erhöht in vielen Fällen die Wahrscheinlichkeit

113

für optimale, möglichst kompakte Faltung (Ellgaard & Helenius 2003). Bonander et al. (2005)

fanden für S. cerevisiae eine gute Produktion membrangebundenen, heterologen

Membranproteins bei suboptimalen Wachstumsbedingungen, insbesondere bei niedriger

Kultivierungstemperatur. Proteinspezifisch kann auch das Gegenteil der Fall sein: ein

heterologes Protein aus einem hyperthermophilen Bakterium benötigte auch im mesophilen

Wirt hohe Temperaturen für die optimale Faltung (Smith et al. 2005).

Als Faustregel für eine verbesserte Proteinexpression in S. cerevisiae wird zudem ein

niedriger pH-Wert empfohlen (Kozlov et al. 1995; Mattanovich et al. 2004). Dies wurde von

Bonander et al. (2005) allerdings nicht bestätigt.

4.2.9 Ausblick

Im Rahmen der Diskussion wurden verschiedene erprobte Strategien vorgestellt, mit denen

die Expression des heterologen Transmembranproteins GlpT in S. cerevisiae möglicherweise

verstärkt und die Plasmamembranlokalisierung des im ER zurückgehaltenen Transporters

erreicht werden könnte: N-terminale Epitope und Signalsequenzen, Anpassung der Gendosis,

Koexpression von Chaperonen, Manipulation möglicher ER-Rückhaltesequenzen, Eingriffe in

die Membranzusammensetzung, die Wege zur Vakuole, die Ubiquitinierung oder die

Glykosylierung und veränderte Kultivierungsbedingungen. Von diesen Strategien wurde das

Anheften eines N-terminalen Epitops erprobt, mit dem die Expressionsstärke gegenüber

einem Transporter mit C-terminalem Epitop verbessert wurde; beide Konstrukte wurden aber

im ER zurückgehalten. Außerdem hatte die Fusion des N-Terminus des hefeeigenen Alpha-

Faktor-Rezeptors an den Transporter keinen positiven Effekt für die

Plasmamembranlokalisierung. Für darüber hinaus gehende Maßnahmen gibt es viele – zu

viele – Ansatzpunkte, so lange nicht geklärt ist, was die spezifischen Bottlenecks für die

Expression und Plasmamembranlokalisierung von GlpT sind. Studien zur Topologie, zur

optimalen Expressionsstärke, zum Zeitverlauf der intrazellulären Lokalisierung und zum

Turnover von GlpT in S. cerevisiae sind jedoch aufwändig und für ein angewandtes Projekt

wie dieses kaum zu rechtfertigen. Auch wenn S. cerevisiae nicht zuletzt wegen der

zahlreichen Ansatzpunkte für Manipulationen des sekretorischen Weges und der

Proteindegradation ein konkurrenzfähiges System für die Expression heterologer

Transmembranproteine ist (Bonander et al. 2005), bleibt der Einzelfall, die Expression eines

bestimmten Transporters, ein riskantes Unternehmen. Noch fehlt es an grundsätzlichen

Kenntnissen und Kriterien dafür, welche erfolgreichen Strategien anderer Kontexte sich auf

das gewünschte heterologe Protein übertragen lassen. Erst dann kann die funktionale

114

Expression heterologer, insbesondere bakterieller Transporter für die Stammoptimierung im

Rahmen des Metabolic Engineering mit Aussicht auf Erfolg eingesetzt werden.

Beim derzeitigen Stand des Wissens und mit dem Ergebnis dieser Arbeit scheint es nahe

liegend, die L-G3P-Produktion in einem Organismus in Angriff zu nehmen, der den

passenden Transporter GlpT exprimiert. Anders als in S. cerevisiae liegt die Bildung von

L-G3P dann nicht auf einem Hauptweg des glykolytischen Kohlenstoffflusses. E. coli

synthetisiert L-G3P lediglich als Baustein für die Lipidsynthese (vgl. 1.1.2), seine Glycerol-3-

Phosphat-Synthase (GpsA) wird durch das Endprodukt L-G3P stark gehemmt. Bereits bei

einer 20-fach erhöhten L-G3P-Konzentration im Cytosol wird die Synthese von G3P aus

glykolytischem DHAP durch negative Rückkopplung gebremst (Lin 1967). Erfolgreich war

jedoch die heterologe Expression der Enzyme des Hefe-Glycerolbiosynthese-Wegs in E. coli

(I. Meynial-Salles, C. Croux, P. Soucaille, Konferenzposter Metabolic Engineering VI, 1.–

5.10. 2006, Leeuwenhorst). Der Transporter GlpT kann in der inneren Membran von E. coli

funktional überexprimiert werden (Ambudkar et al. 1986; Auer et al. 2001). In einem E. coli-

Stamm, der die GPD von S. cerevisiae funktional exprimiert, könnte er

konzentrationsgesteuert einen spezifischen L-G3P-Export bewerkstelligen.

5. Zusammenfassung

L-G3P ist ein hauptsächlich intrazelluläres phosphoryliertes Stoffwechselzwischenprodukt

und zählte als solches bisher nicht zur Produktpalette von Hefe-Fermentationen. Um L-G3P

als Baustein für die enzymatische Synthese von Monosacchariden und für andere

Anwendungen zu gewinnen, wurden Bedingungen gesucht, unter denen ein S. cerevisiae-

Produktionsstamm mit ausgeschalteter Glycerol-3-Phosphatase (∆gpp1/2) und

Überexpression der cytosolischen Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase (GPD1) gleichzeitig

gute L-G3P-Produktion und akzeptable Biomasseproduktion zeigt.

In einer Zwei-Phasen-Fed-Batch-Fermentation von Glucose, bei der auf eine aerobe Phase

mit respirofermentativem Stoffwechsel und Biomasseproduktion von rund 14 g/l eine strikt

anaerobe Phase mit fermentativem Stoffwechsel und nahezu ohne Wachstum folgte, wurde

ein maximaler Produkttiter von 325 mg/l erreicht, was dem 25-fachen der Ausgangssituation

entspricht. Die maximale Raum-Zeit-Ausbeute betrug 9,4 mg L-G3P/l*h. Der Vergleich

zweier Fermentationen mit unterschiedlichem Belüftungsprofil (Zwei-Phasen-Fermentation

aerob/anaerob und microaerobe Fermentation) erbrachte außerdem als relevante

phänotypische Eigenschaften des Produktionsstammes eine teilweise wachstumsgekoppelte

L-G3P-Produktion und die sauerstoffabhängige Ausprägung von Maxima des intrazellulären

115

L-G3P-Spiegels. Die Abnahme von intrazellulärem L-G3P nach dem Erreichen der Maxima

beruhte auf mindestens zwei unerwarteten Phänomenen: der Produktion erheblicher Mengen

des Nebenproduktes Glycerol, wahrscheinlich durch unspezifische Degradation von L-G3P,

und der Freisetzung von L-G3P aus lebenden Zellen in den Kulturüberstand. Zum Phänotyp

des Produktionsstammes gehört außerdem eine ausgeprägte Ethanolsensitivität, die das

Wachstum bei relativ niedrigen Zelldichten begrenzte.

Da die Degradation von L-G3P anscheinend intrazellulär erfolgte, ist eine schnellere

spezifische Freisetzung von L-G3P aus den Zellen wünschenswert. Daher wurde der

sekundäraktive L-G3P-Transporter GlpT aus E. coli im S. cerevisiae-Produktionsstamm

überexprimiert und konnte in der membrangebundenen Fraktion der Proteine nachgewiesen

werden. Die Expressionsstärke des Transporters wurde posttranskriptional von der Position

des c-Myc-Epitops beeinflusst, möglicherweise durch translationale Selektion vorteilhafter

Codons im Bereich des N-Terminus oder eine Auswirkung auf Faltung und

Degradationsgeschwindigkeit. Verschiedene Stammhintergründe zeigten zudem

unterschiedliche Expressionsstärken. Der bakterielle Transporter trat in den sekretorischen

Weg der Hefezellen ein, indem er wahrscheinlich cotranslational in die ER-Membran

integrierte, er wurde nicht glykosyliert. Überexpression von GlpT führte dennoch nicht zur

verstärkten Ausscheidung von L-G3P aus dem Produktionsstamm. Grund dafür war die

Misslokalisierung des Transporters, der zum größten Teil im ER festgehalten wurde und die

Plasmamembran nicht erreichte. Dies wurde mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie gezeigt. Die

Fusion von N-terminalen Sequenzen des Hefe-Plasmamembranproteins Ste2p an GlpT

verbesserte die Lokalisierung nicht. Gründe für die Rückhaltung von GlpT im ER könnten

sein: eine nicht-native Konformation, die UPR auslöst, ein ER-Rückhaltemotiv oder fehlende

Assoziation mit Lipid rafts. Da zelluläre Qualitätskontrollsysteme des ER, des Golgi-Apparats

und der Plasmamembran bei der Degradation in der Vakuole konvergieren, gibt die

Abhängigkeit der Expressionsstärke von GlpT von der vakuolären Proteinase A (Pep4p) keine

Auskunft darüber, welche dieser Systeme GlpT angreifen. Eine Anpassung der Gendosis oder

die Manipulation der Ubiquitinierung könnten zukünftig möglicherweise die Lokalisierung

von GlpT positiv beeinflussen.

116

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produktion und freisetzung von l-glycerol-3-phosphat (l ... · glycerol-facilitator von e. coli...

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