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Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. Klaus Golka
Dienstort: Institut für Arbeitsphysiologie an der Universität Dortmund Zentrale Einrichtung Arbeitsmedizin
Die UDP-Glucuronosyltransferase 2B7 C802T (His268Tyr) bei Harnblasenkarzinompatienten
Kumulative Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von Anna Zimmermann
aus Heidelberg 2008
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Prof. Dr. med. K. Golka
Koreferent: Prof. Dr. med. T. Brüning
Tag der mündlichen Prüfung: 16.10.2008
INHALTSVERZEICHNIS 1. EINLEITUNG ………………………………………………………………….. 1
2. ZIELSETZUNG ……………………………………………………………….. 11
3. ERGEBNISSE ………………………………………………………………… 12
4. DISKUSSION …………………………………………………………………. 18
5. LITERATURVERZEICHNIS ………………………………………………… 21
6. DANKSAGUNG
7. LEBENSLAUF
8. VERÖFFENTLICHUNG
I
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS BK Berufskrankheit
cDNA Copy-Desoxyribonukleinsäure
DFG Deutsche Forschungsgemeinschaft
DNA Desoxyribonukleinsäure
DNT Dinitrotoluol
GEKID Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland
GSTP1 Glutathion-S-Transferase P1
HVBG Hauptverband der gewerblichen Berufsgenossenschaften
IARC International Agency for Research on Cancer
KI Konfidenzintervall
NAT N-Acetyltransferase
OR Odds Ratio
PAK Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe
PCR Polymerase-Kettenreaktion
RFLP Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus
s Standardabweichung
SNP Single nucleotide polymorphism
TNT Trinitrotoluol
UDP Uridindiphosphat
UGT UDP-Glucuronosyltransferase
II
TABELLENVERZEICHNIS Tabelle 1: Verteilung der UGT2B7 C802T (His268Tyr) Genotypen und
Allele im Kollektiv der klinischen Harnblasenkarzinomfälle,
der urologischen Kontrollen und der Gutachtenfälle ................... 12
Tabelle 2: Verteilung der UGT2B7 C802T (His268Tyr) Genotypen und
Allele im Teilkollektiv der Raucher (klinische Harnblasen-
karzinomfälle, urologische Kontrollen und Gutachtenfälle) ......... 13
Tabelle 3: Verteilung der UGT2B7 C802T (His268Tyr) Genotypen und
Allele im Teilkollektiv der Nichtraucher (klinische Harnblasen-
karzinomfälle, urologische Kontrollen und Gutachtenkollektiv) ... 14
Tabelle 4: Odds Ratios für klinische Harnblasenkarzinomfälle (Fälle)
und urologische Kontrollen (Kontr.) mit und ohne
Berücksichtigung des UGT2B7 C802T (His268Tyr) Genotyps ....... 15
Tabelle 5: Verteilung der UGT2B7 C802T (His268Tyr) Genotypen und
Allele in verschiedenen Altersgruppen des
Gutachtenkollektivs ..................................................................... 17
III
ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abbildung 1: Stark vereinfachtes Stoffwechselschema eines
bioverfügbaren Azofarbstoffes …………………………………… 4
Abbildung 2: Stammbaum der humanen UDP-Glucuronosyltransferasen
(nach GUILLEMETTE, 2003) …………………………………………8
IV
1. EINLEITUNG Harnblasenkarzinomerkrankungen gehören mit registrierten 260 000
Neuerkrankungen pro Jahr zu den siebthäufigsten Karzinomerkrankungen
weltweit (EBLE ET AL., 2004). In Deutschland erkranken jedes Jahr 28 750
Menschen an einer Tumorerkrankung der Harnblase. Männer sind knapp
dreimal so häufig betroffen wie Frauen. Das mittlere Erkrankungsalter beim
Mann liegt in Deutschland bei 71 Jahren, bei der Frau liegt es bei 74 Jahren
(GEKID, 2008).
Bei bösartigen Erkrankungen der Harnblase handelt es sich in den westlichen
Industrieländern nahezu immer um Urothelkarzinome, die häufig multifokal
vorkommen. Sie können auch im Nierenbecken oder im Harnleiter auftreten.
Seltene Harnblasenkarzinome sind Plattenepithelkarzinome oder
Adenokarzinome. Metastasen treten bevorzugt in den benachbarten
Lymphknoten auf. Fernmetastasen werden vor allem in der Leber und der
Lunge gefunden. Harnblasenkarzinome zeigen häufig lokale Rezidive. Als
Haupt- und Erstsymptom ist die schmerzlose Mikrohämaturie mit
Makrohämaturieepisoden zu nennen. Bisweilen veranlassen auch
Beschwerden beim Wasserlassen die Patienten einen Arzt aufzusuchen.
Fremdstoffe können bei der Genese des Harnblasenkarzinoms eine
wesentliche Rolle spielen. Interindividuelle Variation und Wechselwirkungen
zwischen Genen und Umwelt können zudem das Risiko an einem
Harnblasenkarzinom zu erkranken beeinflussen. Auch die Reaktion auf
Chemikalien am Arbeitsplatz und Umweltnoxen kann durch interindividuelle
genetische Dispositionen beeinflusst werden (SCHULZ, 2006). Ein
Polymorphismus in fremdstoffmetabolisierenden Genen kann die Fähigkeit
karzinogene Fremdstoffe zu verstoffwechseln zum Teil wesentlich verändern.
Unter einem genetischen Polymorphismus versteht man die Variabilität an
einem Genort, die nicht auf zufälligen Mutationen beruht und mit einer Frequenz
von mehr als 1% in der Population auftritt. Bei den meisten Polymorphismen
handelt es sich um eine Variation eines einzigen Nukleotids (single nucleotide
polymorphism; SNP). Die Häufigkeit bestimmter Allelvarianten kann zwischen
ethnischen Gruppen verschieden sein. Dadurch können Unterschiede in
1
Wirkung und Nebenwirkungen bei Arzneimitteln aber auch anderen
Fremdstoffen zwischen z. B. Europäern und Asiaten erklärt werden.
Bisher spielt in der arbeitsmedizinischen Begutachtung hinsichtlich eines
Einflusses polymorpher Enzyme lediglich die Beurteilung der N-
Acetyltransferase 2 (NAT2) eine Rolle (GOLKA ET AL., 2007). Der NAT2-Status
wird in die gutachterliche Entscheidungsfindung miteinbezogen, da ein
Zusammenhang zwischen einem „langsamen“ Acetyliererstatus und einem
erhöhten Risiko an einem Harnblasenkarzinom zu erkranken besteht (GARCIA-
CLOSAS ET AL., 2005; GOLKA ET AL., 2002a). Neben genetisch bedingten
Einflussfaktoren an einem Harnblasenkarzinom zu erkranken, gibt es weitere
verschiedene Risikofaktoren, die zu einer Erhöhung des Harnblasenkarzinom-
Erkrankungsrisikos führen. Bei der Frage nach den möglichen Auslösern eines
Harnblasenkarzinoms müssen eine Reihe von möglichen Ursachen
gegeneinander abgewogen werden. Die wichtigsten Risikofaktoren werden im
Folgenden aufgeführt.
Rauchen
Zigarettenrauchen ist für die Allgemeinbevölkerung der mit Abstand wichtigste
außerberufliche Risikofaktor für das Harnblasenkarzinom (IARC, 2004). Bis zu
50% der Harnblasenkarzinomfälle lassen sich durch den Zigarettenkonsum
erklären (DOLIN ET AL., 1991). Tabakrauch enthält über 50 krebserzeugende
Stoffe (IARC, 2004). Speziell für Verbrennungsprodukte und aromatische Amine
wie ß-Naphthylamin, 4-Aminodiphenyl und o-Toluidin ist eine
karzinomerzeugende Wirkung in der Harnblase eindeutig belegt. Starke
Raucher haben ein deutlich erhöhtes Risiko an einem Harnblasenkarzinom zu
erkranken (BRENNAN ET AL., 2000; 2001). Aromatische Amine werden auch bei
Rauchern, die als Träger des bereits erwähnten Isoenzyms „langsame“
Acetylierer der N-Acetyltransferase 2 sind, vermehrt zu Harnblasenkarzinom
erzeugenden Stoffwechselprodukten umgesetzt (VINEIS ET AL., 2001; GOLKA ET
AL., 2002b).
2
Berufliche Faktoren
Die berufliche Exposition gegen aromatische Amine und/oder bioverfügbare
(wasserlösliche) Azofarbstoffe ist ein wichtiger Risikofaktor an einem
Harnblasenkarzinom zu erkranken.
REHN (1895) beschrieb zum ersten Mal ein vermehrtes Auftreten von
„Blasengeschwülsten“ bei Fuchsinarbeitern. Dies wurde zunächst auf das
aromatisches Amin Anilin, das bei der Herstellung von Fuchsin verwendet wird,
zurückgeführt. Später stellte sich heraus, dass das aromatische Amin Anilin,
wenn überhaupt, nur eine sehr schwache krebserzeugende Wirkung hat und
andere bei der Herstellung von Fuchsin verwendete aromatische Amine
anzuschuldigen sind.
Zu den klassischen Risikoberufen zählen Chemiearbeiter und Arbeiter in der
Farbstoffproduktion. Aber auch Maler, Lackierer, Färber, Friseure und Drucker
haben ein höheres Risiko an einem Harnblasenkarzinom zu erkranken.
Momentan werden durch die Senatskommission der Deutschen
Forschungsgemeinschaft zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe
(DFG, 2007) 5 aromatische Amine in die Kategorie 1 („Stoffe, die beim
Menschen Krebs erzeugen und bei denen davon auszugehen ist, dass sie
einen nennenswerten Beitrag zum Krebsrisiko leisten“) des Abschnitts III der
MAK-Liste eingestuft:
2-Naphthylamin (ß-Naphthylamin), 4-Aminodiphenyl, Benzidin, 4-Chlor-o-
toluidin (4-Chlor-2-Methylanilin) und, seit Juli 2006, o-Toluidin.
Krebserzeugende aromatische Amine können allerdings auch mittels
Stoffwechselvorgängen im Körper aus Fremdstoffen gebildet werden. So
können z. B. bioverfügbare (wasserlösliche) Azofarbstoffe zu aromatischen
Aminen durch reduktive Spaltung der Azobindung umgesetzt werden (DEWAN ET
AL., 1988; MYSLAK ET AL., 1991; GOLKA ET AL., 2004; Abb. 1).
Zudem können Nitrogruppen zu Aminogruppen im Organismus reduziert
werden. Das bekannteste Beispiel ist die Bildung von aromatischen Aminen
durch die Reduzierung der Nitrogruppen der Sprengstoffe Dinitrotoluol (DNT)
und Trinitrotoluol (TNT) (BRÜNING ET AL., 1999; RÖMER ET AL., 2002). Berufliche
3
Expositionen bestehen bei der Herstellung der Sprengstoffe und bei der
Sanierung von Altlasten. Kürzlich wurde auch die Freisetzung von aromatischen
Aminen aus dem Lokalanästhetikum Prilocain gezeigt (GABER ET AL., 2007).
R-N=N N=N-R
Azofarbstoff auf der Basis von Benzidin
Abbildung 1: Stark vereinfachtes Stoffwechselschema eines bioverfügbaren Azofarbstoffes
Einen weiteren Risikofaktor stellt die Arbeit in der Kabelindustrie
(Kabelproduktion/entsorgung) dar (CHECKOWAY ET AL., 1981), da hier
aromatische Amine als Antioxidantien eingesetzt werden. BOLM-AUDORFF ET AL.
(1993) beschrieben ein erhöhtes Erkrankungsrisiko für Harnblasenkarzinome
bei Gummiherstellern und Vulkaniseuren in Deutschland. In einer Studie an
über 11 000 Beschäftigten der deutschen Gummiindustrie fanden sich Risiken
für Lagerung und Versand und allgemeine Tätigkeiten (STRAIF ET AL., 1998).
Zudem wird auch bei Kontakt mit Epoxidharzen ein erhöhtes
Harnblasenkarzinomrisiko diskutiert (GOLKA ET AL., 2007).
Reduktive Spaltung
H2N NH2
Benzidin
Acetylierung Glucuronidierung
OxidationGlucuronidiertes aromatisches Amin
Acetyliertes aromatisches Amin
Arylnitreniumion
4
Ein zahlenmäßig weitaus weniger bedeutsamer Risikofaktor ist die Exposition
gegen hohe Konzentrationen polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe
(PAK), die bei Verbrennungsprozessen, vor allem unter Sauerstoffmangel
entstehen. HAMMOND ET AL. (1976) beschrieben ein vermehrtes Auftreten von
Harnblasenkarzinomen bei Dachdeckern, die gegen Teer exponiert waren.
DOLL ET AL. (1972) und MANZ ET AL. (1976) beschrieben ein erhöhtes
Harnblasenkarzinomrisiko bei Stadtgasarbeitern (Kokereiarbeitern).
Eine Berufsgruppe, für die in der Literatur ein erhöhtes Harnblasen-
karzinomrisiko ohne Identifizierung der auslösenden Noxe beschrieben wird, ist
die Tätigkeit als Bergmann im Steinkohlenbergbau unter Tage (GOLKA ET AL.,
2007).
Durch aromatische Amine bedingte Harnblasenkarzinome unterscheiden sich
nicht durch ihren klinischen oder histologischen Befund oder ihren Verlauf von
Harnblasenkarzinomen anderer Ursache. Der begründete Verdacht auf das
Vorliegen einer Berufskrankheit muss von Ärzten gemeldet werden (GOLKA ET
AL., 2007).
Als Berufskrankheit BK-Nr. 1301, d.h. Neubildungen der Harnblase durch
aromatische Amine, wurden im Zeitraum von 1978-2003 über 1200
Harnblasenkarzinomfälle von den gewerblichen Berufsgenossenschaften
anerkannt und entschädigt (HVBG, 2005). In den letzten Jahren sind mehr als
100 Fälle pro Jahr anerkannt und entschädigt worden.
Therapiebedingte Risiken
Es müssen auch therapiebedingte Risiken an einem Harnblasenkarzinom zu
erkranken berücksichtigt werden. Eine Therapie mit Cyclophosphamid
(Endoxan®), ein Arzneistoff der zur Behandlung von immunbedingten
Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis (BAKER ET AL., 1987), Wegener
Granulomatose (VLAOVIC ET AL., 1999), Leukämien, malignen Lymphomen
(PEDERSEN-BJERGAARD ET AL., 1988) sowie soliden Tumoren eingesetzt wird
(ROTE LISTE, 2007), erhöht das Risiko an einem Harnblasenkarzinom zu
erkranken. Langjähriger Phenacetinabusus kann zum Harnblasenkarzinom
führen (CASTELAO ET AL., 2000).
5
Aber auch eine Strahlentherapie im kleinen Becken, besonders nach
Zervixkarzinom (KLEINERMAN ET AL., 1995), erhöht das Risiko an einem
Harnblasenkarzinom zu erkranken.
Ernährungsbedingte Risiken
Der Verzehr von Obst und Gemüse kann protektiv auf die Entstehung eines
Harnblasenkarzinoms wirken (MURTA-NASCIMIENTO ET AL., 2007). Alkohol-
konsum hingegen scheint keinen Einfluss zu haben (ZEEGERS ET AL., 2001).
Eine hohe tägliche Flüssigkeitsaufnahme wird hinsichtlich der Verursachung
eines Harnblasenkarzinoms kontrovers diskutiert (GOLKA ET AL., 2007).
Enzympolymorphismus und Harnblasenkarzinom
CARTWRIGHT ET AL. (1982) haben den Einfluss von Isoenzymen der N-
Acetyltransferase 2 auf das Harnblasenkarzinomrisiko von gegen aromatische
Amine exponierten Arbeitern in Großbritannien beschrieben. Später konnte
diese Beobachtung in anderen Kollektiven bestätigt werden (GOLKA ET AL.,
2002a).
Das Harnblasenkarzinom wird, im Gegensatz zu vielen anderen Tumoren, zu
einem erheblichen Teil durch Exposition gegen Fremdstoffe ausgelöst. Eine
wichtige Funktion des Fremdstoffmetabolismus besteht darin, die biologische
Aktivität von Stoffen zu beenden und z. B. schwer ausscheidbare, lipophile
(unpolare) Stoffe zu leichter ausscheidbaren hydrophilen (polaren) Stoffen zu
metabolisieren. Durch den Fremdstoffmetabolismus können aber auch vormals
nicht kanzerogene Metabolite in kanzerogene Stoffe umgewandelt („gegiftet“)
werden.
Enzyme der Phase 1 Reaktion oxidieren oder reduzieren, während Enzyme der
Phase 2 Reaktion Molekülgruppen übertragen. Als wichtigste Enzymgruppe der
Phase 1 Reaktion sind die Cytochrom P450 abhängigen Monooxygenasen zu
nennen. Zu den Phase 2 Enzymen zählen unter anderem die Glutathion-S-
Transferasen, die N-Acetyltransferasen, die Sulfotransferasen und die
Glucuronosyltransferasen.
6
Von erheblicher Bedeutung ist, dass sowohl der Anteil der einzelnen Isoenzyme
als auch die biologische Bedeutung der Isoenzyme ethnisch bedingte
Unterschiede aufweisen kann. So ist z. B. der Anteil der „langsamen“ NAT2-
Acetylierer bei Chinesen mit ca. 20% deutlich geringer als bei Mitteleuropäern
mit ca. 50-60%. Zudem ist der „langsame“ NAT2-Genotyp bei Mitteleuropäern
und nicht bei Asiaten ein Risikofaktor für das Harnblasenkarzinom, wenn eine
Exposition gegen aromatische Amine bestand (GOLKA ET AL., 2002a). Kürzlich
wurde auch für die Glutathion-S-Transferase P1 (GSTP1) ein, wenn auch
deutlich geringer ausgeprägter, ethnischer Unterschied hinsichtlich der
Modulation des Harnblasenkarzinomrisikos beschrieben (KELLEN ET AL., 2007).
UDP-Glucuronosyltransferasen (UGT)
Glucuronosyltransferasen übertragen eine Glucuronsäuregruppe. Als Kofaktor
dient Uridindiphosphoglucuronsäure (UDP-Glucuronsäure). Das Wirkprinzip der
Glucuronidierung besteht in einer Veränderung der Wasserlöslichkeit (meist
Erhöhung) und der damit verbundenen Wirkungsbeendigung des Fremdstoffes.
Die Stoffe, darunter zahlreiche Arzneimittel wie Paracetamol und Oxazepam,
werden dann „glucuronidiert“ über den Harn ausgeschieden.
Die UGT-Familie hat ein breites Substratspektrum mit tausenden endogener
und exogener Stoffe. Einzelne Enzyme weisen häufig einen breiten und
überlappenden Bereich von Substratspezifität auf (RADOMINSKA-PANDYA ET AL.,
1999).
Die UDP-Glucuronosyltransferasen (UGT) (EC 2.4.1.17) bilden eine
Superfamilie. Sie kommen als Bestandteile der Membranen des
endoplasmatischen Retikulums vor (BOCK, 1994; RADOMINSKA-PANDYA, 2001).
Beim Menschen sind seit längerem 2 Familien, UGT1 und UGT2, und 3
Subfamilien, UGT1A, UGT2A und UGT2B, bekannt (MACKENZIE ET AL., 1997). In
einer neueren Übersichtsarbeit führen MACKENZIE ET AL. (2005) 2 weitere
Subfamilien beim Menschen, UGT3 und UGT8, auf. Isoenzyme der UGT1
Familie verstoffwechseln hauptsächlich Phenole und Bilirubin, die der UGT2
Familie hingegen vor allem Steroide und Gallensäuren (BURCHELL ET AL., 1991).
7
UGT 2
UGT1A1
UGT1A3
UGT1A5
UGT1A2p UGT1A4 UGT1A6 UGT1A7 UGT1A8
UGT1A10
UGT1A9 UGT1A13p
UGT1A11p UGT1A12p
UGT 1
B
A
UGT2B7 UGT2B11
UGT2B28 UGT2B10 UGT2B15
UGT2B17 UGT2B4
UGT2A1
UGT2A2
Abbildung 2: Stammbaum der humanen UDP-Glucuronosyltransferasen (nach GUILLEMETTE, 2003).
Die Gene der humanen UGT2B Subfamilie sind auf dem Chromosom 4q 13
lokalisiert (RIEDY ET AL., 2000). UGT2B7 ist ein wichtiger Vertreter der UGT2B
Subfamilie beim Menschen (COFFMANN ET AL., 1998). Morphin, Codein und
deren Derivate werden durch UGT2B7 verstoffwechselt (RADOMINSKA-PANDYA
ET AL., 2001; COURT ET AL., 2003). Weitere typische Substrate der UGT2B7 sind
endogene Substrate wie hydroxylierte Metabolite von Steroidhormonen und
Gallensäuren (JIN ET AL., 1993). Bislang sind für UGT2B7 insgesamt 12
verschiedene Mutationen beschrieben (HOLTHE ET AL., 2003).
8
In in vitro Experimenten konnte an exprimierter cDNA (CIOTTI ET AL., 1999a) und
an humanen Leberschnitten (ZENSER ET AL., 2002) die Verstoffwechslung des
aromatischen Amins Benzidin durch UGT2B7 gezeigt werden.
Allelische Variationen können bei UDP-Glucuronosyltransferasen zu erheblicher
Beeinflussung des Stoffwechsels führen. So beeinflusst ein Polymorphismus in
UGT1A1*28 die Verstoffwechslung von Irinotecan®, ein Zytostatikum das zur
Therapie bei metastasierendem kolorektalem Karzinom eingesetzt wird (IYER ET
AL., 2002).
UDP-Glucuronosyltransferasen und Stoffwechselerkrankungen
UGT1A1 katalysiert die Glucuronidierung des Häms zu Bilirubin. Ein Defekt des
UGT1A1 Gens kann durch Akkumulation von Bilirubin ein Crigler-Najjar
Syndrom oder ein Gilbert Syndrom bewirken (CIOTTI ET AL., 1999b; LIN ET AL.,
2003).
Bei dem Crigler-Najjar Syndrom Typ I, bei dem keine messbare Bilirubin-UDP-
Glucuronosyltransferaseaktivität nachgewiesen werden kann, kommt es zu
einer starken Hyperbilirubinämie, die unbehandelt zum Kernikterus und zum
Tod im frühen Kindesalter führt. Das Crigler-Najjar Syndrom Typ II verläuft
weniger stark, da eine Teilaktivität des Enzyms vorhanden ist. Das Gilbert
Syndrom, auch als M. Meulengracht bekannt, weist eine meist schwache
Ausprägung der Hyperbilirubinämie auf, da bis zu 60 % der UGT-Enzymaktivität
trotz Mutation erhalten bleibt (TUKEY ET AL., 2000).
UDP-Glucuronosyltransferasen und Karzinomerkrankungen
Bislang sind Studien zu Glucuronidierung und Suszeptibilität gegenüber
chemischen Kanzerogenen rar (WALLIG, 2004).
GUILLEMETTE ET AL. (2000) zeigten eine Verbindung zwischen
prämenopausalem Mammakarzinom bei Afro-Amerikanerinnen und UGT1A1
Polymorphismus. ZHENG ET AL. (2001) zeigten eine Assoziation von
Tabakrauch, UGT1A7 und dem Auftreten von orolaryngealen Tumoren. Für den
UGT1A7 Genotyp wurde eine Modulation des Risikos an einem
Pankreaskarzinom zu erkranken beschrieben (OCKENGA ET AL., 2003).
9
Bislang wurde zu einem möglichen Zusammenhang zwischen einer
Karzinomerkrankung der Harnblase und einem Polymorphismus der UDP-
Glucuronosyltransferase nur eine Arbeit publiziert (LIN ET AL., 2005). Sie zeigt,
dass chinesische Träger des homozygot mutierten Genotyps (T/T) der UGT2B7
C802T (His268Tyr) ein erhöhtes Harnblasenblasenkarzinom-Erkrankungsrisiko
aufweisen (OR 3,30; 95% KI [1,37-7,98]), wenn sie in der Vergangenheit
beruflich gegen Benzidin exponiert waren.
10
2. ZIELSETZUNG LIN ET AL. (2005) beschrieben bei chinesischen Benzidinarbeitern einen Einfluss
des UDP-Glucuronosyltransferase 2B7 (UGT2B7) (C802T) His268Tyr Genotyps
auf das Risiko, an einem Harnblasenkarzinom zu erkranken. In der
vorliegenden Arbeit war zu untersuchen, ob diese Beobachtung auf
Harnblasenkarzinompatienten mitteleuropäischen Ursprungs („Kaukasier“) mit
und ohne berufliche Exposition gegen aromatische Amine übertragbar ist.
Da aufgrund der Einstellung der Benzidinproduktion in Deutschland in den
1960er Jahren keine erkrankten Benzidinarbeiter zur Verfügung standen, waren
Harnblasenkarzinompatienten mit laufendem Berufskrankheitenverfahren
aufgrund einer beruflichen Exposition gegen aromatische Amine
(Berufskrankheit BK-Nr. 1301) das am besten geeignete Kollektiv. Im Institut für
Arbeitsphysiologie an der Universität Dortmund begutachtete Patienten waren
daher hinsichtlich eines modulierenden Einflusses des UGT2B7 Genotyps auf
das Harnblasenkarzinom-Erkrankungsrisiko zu untersuchen.
Zudem war abzuklären, ob bei klinischen Harnblasenkarzinompatienten, im
Vergleich zu einer Kontrollgruppe aus der gleichen Klinik, der Einfluss des
UGT2B7 Genotyps auf das Erkrankungsrisiko von Relevanz ist. Zigarettenrauch
enthält krebserzeugende aromatische Amine wie ß-Naphthylamin und o-
Toluidin. Daher war abzuklären, ob die UGT2B7 Genotypen unterschiedliche
Anteile bei an Harnblasenkarzinom erkrankten Rauchern und an
Harnblasenkarzinom erkrankten Nichtrauchern aufweisen, wie es für die N-
Acetyltransferase 2 Geno- und Phänotypen eindrucksvoll belegt ist.
Hierfür war eine auf Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und
Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) basierende Methode zur
Bestimmung der UGT2B7 (C802T) His268Tyr Genotypen am Institut für
Arbeitsphysiologie an der Universität Dortmund zu etablieren und an den drei
zuvor genannten Kollektiven anzuwenden.
11
3. ERGEBNISSE Die in der Literatur beschriebene Methode zum Nachweis des Polymorphismus
der UGT 2B7 am Locus (C802T) (His268Tyr) (HOLTHE ET AL., 2002) konnte nur in
einer erarbeiteten Modifikation angewandt werden. Die Annealingtemperatur
wurde von 65°C auf 63°C erniedrigt um die bestmögliche Amplifikation zu
erreichen. Zudem wurde die Konzentration der Primer von 0,32 µM auf 0,2 µM
verringert, um die Bildung von Primerdimeren zu vermeiden.
Der Anteil der UGT2B7 T/T Genotypen („mutierte Form“) in den untersuchten
Kollektiven der Harnblasenkarzinomfälle (T/T=27%), der urologischen
Kontrollen (T/T=35%) und der Gutachtenfälle mit angezeigter BK-Nr. 1301
(T/T=25%) entsprach in etwa der bisher bekannten Verteilung bei
Mitteleuropäern („Kaukasier“) (Tabelle 1).
Tabelle 1: Verteilung der UGT2B7 C802T (His268Tyr) Genotypen und Allele im Kollektiv der klinischen Harnblasenkarzinomfälle, der urologischen Kontrollen und der Gutachtenfälle
Harnblasen-karzinom-
fälle (n=211)
UrologischeKontrollen
(n=210)
OR 95% KI
Gutachten-kollektiv (n=171)
Genotypen C/C 24%
(n=51) 22%
(n=47) 1,00 26%
(n=44) C/T 48%
(n=102) 43%
(n=90) 0,96 [0,57-
1,61] 50%
(n=85) T/T
27%
(n=58) 35%
(n=73) 1,36 [0,78-
2,34] 25%
(n=42) Allele (n=422) (n=420) (n=342)
C 48% (n=204)
44% (n=184)
1,00 51% (n=173)
T 52% (n=218)
56% (n=236)
1,20 [0,92-1,57]
49% (n=169)
Zusätzlich wurden die Untergruppen der Raucher und Nichtraucher untersucht.
Als „Raucher“ wurden diejenigen bezeichnet, die zum Zeitpunkt der Diagnose
geraucht haben oder vor weniger als 10 Jahren mit dem Rauchen aufgehört
haben. Als „Nichtraucher“ wurden die Nieraucher und diejenigen, die zum
12
Zeitpunkt der Diagnose mehr als 10 Jahre nicht mehr geraucht haben,
bezeichnet.
Der Anteil der Raucher bei den Harnblasenkarzinomfällen betrug 42%, davon
waren 24% C/C, 48% C/T und 28% T/T Merkmalsträger („Carrier“). Eine
vergleichbare Verteilung ergab sich in der urologischen Kontrollgruppe (Tabelle
2).
Tabelle 2: Verteilung der UGT2B7 C802T (His268Tyr) Genotypen und Allele im Teilkollektiv der Raucher (klinische Harnblasen-karzinomfälle, urologische Kontrollen und Gutachtenfälle)
Harnblasen-karzinom-
fälle, Raucher (n=88)
Urologische Kontrollen,
Raucher (n=29)
OR 95% KI
Gutachten-Kollektiv, Raucher (n=86)
Genotypen C/C 24%
(n=21) 28% (n=8)
1,00 24% (n=21)
C/T 48% (n=42)
38% (n=11)
0,69 [0,21-2,29]
53% (n=46)
T/T 28% (n=25)
34% (n=10)
1,05 [0,31-3,67]
22% (n=19)
Allele (n=176) (n=58) (n=172) C 48%
(n=84) 47%
(n=27) 1,00 51%
(n=88) T 52%
(n=92) 53%
(n=31) 1,05 [0,58-
1,90] 49%
(n=84)
Die Verteilung der UGT2B7 Genotypen und Allele im Teilkollektiv der
Nichtraucher ergab ein ähnliches Ergebnis (Tabelle 3).
13
Tabelle 3: Verteilung der UGT2B7 C802T (His268Tyr) Genotypen und Allele im Teilkollektiv der Nichtraucher (klinische Harnblasen-karzinomfälle, urologische Kontrollen und Gutachtenkollektiv)
Harnblasen-karzinom-
fälle, Nichtraucher
(n=123)
Urologische Kontrollen,
Nichtraucher (n=181)
OR 95% KI
Gutachten- Kollektiv,
Nichtraucher (n=78)
Genotypen C/C 24%
(n= 30) 22%
(n=39) 1,00 27%
(n=21) C/T 49%
(n=60) 44%
(n=79) 1,01 [0,54-
1,89] 46%
(n=36) T/T 27%
(n=33) 35%
(n=63) 1,47 [0,74-
2,91] 27%
(n=21) Allele (n=246) (n=362) (n=156)
C 49% (n=120)
43% (n=157)
1,00 50% (n=78)
T 51% (n=126)
57% (n=205)
1,24 [0,90- 1,72]
50% (n=78)
Zusätzlich wurde im Kollektiv der Harnblasenkarzinomfälle und der
urologischen Kontrollen die UGT2B7 Genotypverteilung in den einzelnen
Berufen untersucht (Tabelle 4).
Dabei stellen die Personen mit Bürotätigkeit die Referenzberufsgruppe dar, da
hier keine beruflichen Expositionen gegenüber Stoffen zu erwarten sind, die ein
Harnblasenkarzinom auslösen können. Dabei zeigten sich keine relevanten
berufliche Risiken für das Odds Ratio 1 (Beruf vs. Referenzberuf), wenn man
von der „ Berufsgruppe“ der ehemaligen Wehrmachtsangehörigen absieht.
Bei Einbeziehung von Einflussfaktoren ergaben sich vereinzelt Signifikanzen,
die jedoch, aufgrund der kleinen Fallzahlen der Untergruppen, mit großer
Zurückhaltung zu interpretieren sind.
14
Tabelle 4: Odds Ratios für klinische Harnblasenkarzinomfälle (Fälle) und urologische Kontrollen (Kontr.) mit und ohne Berücksichtigung des UGT2B7 C802T (His268Tyr) Genotyps
Parameter Fälle Kontr. OR 1
OR 2a
OR 2b
OR 3a
OR 3b
OR 3c
OR 4
OR 5
Landwirtschaft 42 34 1,26 1,90 4,00* 1,47 1,41 3,26* 2,72 1,12 Bergleute 19 13 1,64 0,67 0,75 1,77 0,82 1,77 15,00* 1,19 Chemieberufe 27 27 1,05 1,14 4,67* 1,05 1,26 4,15* 2,22 0,90 Chemieschlosser 2 11 0,22 - - 0,20 0,99 1,81 - 0,16*Metallverbindung 6 12 0,58 0,33 0,40 0,47 0,69 1,60 - 0,31 Metallbauberufe 33 27 1,31 0,50 0,58 1,26 0,60 1,40 11,40* 0,88 Maschinenbau/ Wartungsberufe
17 12 1,38 2,50 3,33 1,50 1,28 3,46* - 1,33
Fahrzeugbau 11 18 0,65 0,38 1,33 0,65 0,77 2,11 6,25 0,56 Elektroberufe 20 17 1,17 0,67 0,33 1,15 1,23 1,50 5,25 1,00 Hochbauberufe 12 12 1,10 0,44 0,22 1,14 0,85 1,42 7,50 0,96 Tiefbauberufe 15 12 1,31 4,00 1,07 1,37 1,41 2,00 13,33* 1,01 Ausbauberufe 10 9 1,15 2,00 1,00 1,08 0,85 1,79 2,40 0,97 Holz-/Kunststoff- verarbeitung
10 10 1,13 5,00 0,50 1,14 1,06 1,70 0,86 1,10
Maler 7 5 1,26 - - 1,36 0,77 2,01 - 0,97 Maschinenführer 10 8 1,21 - 1,00 1,02 0,64 2,14 0,45 1,03 Ingenieure 6 25 0,20* - 0,17 0,19* 0,61 1,52 - 0,21*Verkaufs-personal
17 8 2,47 - - 2,73 0,62 1,44 7,00 1,83
Landverkehrs- berufe
38 21 2,05 0,32 1,26 2,04 0,66 2,03 1,32 1,90
Lager-/ Transportarbeiter
14 4 3,24 - - 3,46* 0,78 1,57 4,20 2,42
Dienst-/ Wachberufe
11 5 2,37 - - 2,80 0,80 2,25 - 2,20
Sicherheitsberufe 11 11 1,11 - - 0,96 1,07 2,13 2,33 0,93 Wehrmacht 52 25 2,90* 4,00 1,33 2,91* 1,43 1,79 1,30 2,82*Nationale Volks-armee (NVA)
9 11 1,07 0,10 1,25 0,99 0,76 2,30 3,75 0,78
*signifikant zum 5% Niveau
- aufgrund geringer Anzahl keine Berechnung
OR1: Beruf vs. Referenzberuf (Bürotätigkeit); Personen, die beide Berufe ausgeübt haben, wurden nicht berücksichtigt
OR2a: T/T Genotyp vs. C/C Genotyp innerhalb des untersuchten Berufs OR2b: C/T Genotyp vs. C/C Genotyp innerhalb des untersuchten Berufs
OR3a: untersuchter Beruf vs. Referenzberuf adjustiert nach UGT2B7; Personen, die beide Berufe ausgeübt haben, wurden nicht berücksichtigt
OR3b: T/T Genotyp vs. C/C Genotyp adjustiert nach Beruf (untersuchter / Referenz-Beruf); Personen, die beide Berufe ausgeübt haben, wurden nicht berücksichtigt
OR3c: C/T Genotyp vs. C/C Genotyp adjustiert nach Beruf (untersuchter / Referenz-Beruf); Personen, die beide Berufe ausgeübt haben, wurden nicht berücksichtigt
OR4: Raucher vs. Nichtraucher innerhalb des untersuchten Berufs
OR5: untersuchter Beruf vs. Referenzberuf adjustiert nach Rauchen; Personen, die beide Berufe ausgeübt haben, wurden nicht berücksichtigt
15
Bei dem Teilkollektiv der Gutachtenfälle (mit Anzeige einer BK-Nr. 1301)
wurden Untergruppen in Bezug auf die berufliche Exposition gegenüber
kanzerogenen Stoffen gebildet.
Bei den Versicherten, die angaben, gegenüber aromatische Amine exponiert
gewesen zu sein, zeigte sich folgende Verteilung: 24% C/C Genotypträger vs.
28% T/T Genotypträger. Bei den gegenüber Azofarbstoffen Exponierten zeigten
sich 17% C/C Genotypträger vs. 29% T/T Genotypträger.
Bei einer weiteren Untergruppe wurde der Einfluss polyzyklischer aromatischer
Kohlenwasserstoffe (PAK) untersucht. Die Verteilung der C/C Genotypen vs.
T/T Genotypen war 28% C/C vs. 22% T/T.
Zusätzlich wurde beispielhaft die Berufsgruppe der Maler herausgegriffen und
der Einfluss der verschiedenen Genotypen der UGT2B7 untersucht. Auch hier
zeigte sich mit 22% C/C Genotypträgern und 23% T/T Genotypträgern ein
homogenes Bild.
Im Gutachtenkollektiv wurde zusätzlich das Alter der Patienten zum Zeitpunkt
der Harnblasenkarzinomerkrankung ausgewertet.
Der jüngste Patient war zum Zeitpunkt der Diagnosestellung 33 Jahre alt, der
älteste Patient 77 (25. Perzentil: 51; Median: 57; Mittelwert: 56,4, s=9,3; 75.
Perzentil: 62).
Zusätzlich ist die Verteilung der verschiedenen Genotypen in den
unterschiedlichen Altersgruppen bestimmt worden. Auch hier ergab sich ein
relativ homogenes Bild (Tabelle 5).
16
Tabelle 5: Verteilung der UGT2B7 C802T (His268Tyr) Genotypen und Allele in verschiedenen Altersgruppen des Gutachtenkollektivs
< 40
(n=12) 40 - 50 (n=27)
50 - 60 (n=74)
60 - 70 (n=44)
> 70 (n=7)
Genotypen C/C 25%
(n=3) 19% (n=5)
32% (n=24)
16% (n=7)
43% (n=3)
C/T 50% (n=6)
60% (n=16)
43% (n=32)
55% (n=24)
43% (n=3)
T/T 25% (n=3)
22% (n=6)
24% (n=18)
30% (n=13)
14% (n=1)
Allele C 50%
(n=12) 48%
(n=26) 54%
(n=80) 43%
(n=38) 64% (n=9)
T 50% (n=12)
52% (n=28)
46% (n=68)
57% (n=50)
36% (n=5)
Bei dem Gutachtenkollektiv (n=171) ergab sich folgende Aufteilung bezogen auf
beide Geschlechter: Bei den Männern (n=167) waren 26% C/C Merkmalsträger,
49% C/T Merkmalsträger und 25% T/T Merkmalsträger. Bei den Frauen (n=4)
fanden sich 1 C/C Merkmalsträgerin und 3 C/T Merkmalsträgerinnen.
17
4. DISKUSSION Bei der Entstehung des Harnblasenkarzinoms spielen ethnische Unterschiede
bei der interindividuellen Suszeptibilität eine erhebliche Rolle. So ist der NAT2
Status bei Mitteleuropäern bei Exposition gegen aromatische Amine am
Arbeitsplatz und/oder durch Rauchen ein genetisch bedingter Risikofaktor an
einem Harnblasenkarzinom zu erkranken.
Hingegen ist bei Chinesen kein erhöhtes Harnblasenkarzinom-
Erkrankungsrisiko hinsichtlich des „langsamen“ NAT2 Status und der
beruflichen Exposition festzustellen (GOLKA ET AL., 2002a). Der NAT2 Status
und der Einfluss des Rauchverhaltens an einem chinesischen Kollektiv ist
bisher nicht untersucht worden.
Das Harnblasenkarzinom-Erkrankungsrisiko kann sowohl bei Mitteleuropäern
(„Kaukasiern“) als auch bei Asiaten nicht hinreichend durch den NAT2 Status
erklärt werden. Es ist daher anzunehmen, dass weitere Enzympolymorphismen,
insbesondere im Bereich der Phase 2 Enzyme, beteiligt sind.
Die Familie der UDP-Glucuronosyltransferasen (UGT) spielt bei der
Verstoffwechslung endogener und exogener Substanzen eine bedeutende
Rolle. Die Wirkung der Glucuronosyltransferasen gegenüber endogenen
Substraten und/ oder Fremdstoffen kann durch Mutation moduliert werden. In
der bislang einzigen Arbeit, in der ein Zusammenhang zwischen einem UDP-
Glucuronosyltransferase-Polymorphismus und Harnblasenkarzinom untersucht
wurde, konnte für den UGT2B7 Polymorphismus am Locus C802T (His268Tyr) ein
erhöhter Anteil des T/T Genotyps bei an Harnblasenkarzinom erkrankten
chinesischen Benzidinarbeitern gezeigt werden (LIN ET AL., 2005).
Da ein gegen Benzidin beruflich exponiertes Kollektiv aufgrund der Beendigung
der Benzidinproduktion in Deutschland durch die chemische Industrie Ende der
sechziger Jahre nicht verfügbar war, wurde ein Kollektiv von ehemals gegen
aromatische Amine exponierten Harnblasenkarzinompatienten, bei denen der
Verdacht auf das Vorliegen einer Berufskrankheit angezeigt wurde, für die
Studie ausgewählt und untersucht.
18
Aufgrund der langen Latenzzeit von durch aromatische Amine ausgelöste
Harnblasenkarzinome (bis zu 40 Jahre und länger) kommt dieses Kollektiv den
chinesischen Benzidinarbeitern am nächsten, da Expositionen früherer
Jahrzehnte erfasst werden. In jener Zeit waren auch in Deutschland die
Expositionen gegen krebserzeugende aromatische Amine höher.
Allerdings war das beruflich gegen aromatische Amine exponierte Kollektiv von
Gutachtenpatienten im Vergleich zu den chinesischen Benzidinarbeitern
geringeren Konzentrationen von aromatischen Aminen ausgesetzt, da die
untersuchten Mitteleuropäer im Rahmen der Anwendung Arylamin-basierter
Produkte und nicht bei der Herstellung Benzidin-basierter Produkte exponiert
waren.
Daher muss auch in Betracht gezogen werden, dass der UGT2B7 Status nur
bei hohen Expositionen gegenüber aromatischen Aminen eine Rolle bei der
Modulation des Harnblasenkarzinom-Erkrankungsrisikos spielt.
Die Verteilung der Gene der bei der Verstoffwechslung aromatischer Amine
beteiligten Enzyme UGT2B7 (BHASKER ET AL., 2000; LAMPE ET AL., 2000) und N-
Acetyltransferase 2 (GOLKA ET AL., 2002a) in der Normalbevölkerung ist bei
Europäern und Chinesen unterschiedlich.
Es ist daher auch zu diskutieren, ob Asiaten möglicherweise eine höhere
Empfindlichkeit gegenüber (bestimmten) aromatischen Aminen aufweisen als
Mitteleuropäer.
Da auch Zigarettenrauch aromatische Amine wie z. B. ß-Naphthylamin und o-
Toluidin enthält (STABBERT ET AL., 2003), wurde untersucht, ob Unterschiede
hinsichtlich des Anteils der verschiedenen UGT2B7 Genotypen zwischen
Harnblasenkarzinompatienten mit und ohne Raucheranamnese bestehen. Dies
war nicht der Fall. Somit kann auch für die in Zigarettenrauch enthaltenen
aromatischen Amine eine Risikomodulation durch UGT2B7 C802T (His268Tyr)
nicht belegt werden.
Dass eine Untersuchung von Harnblasenkarzinompatienten mit und ohne
Raucheranamnese ein sinnvoller Untersuchungsansatz ist, wird durch die
19
unterschiedliche Verteilung von „schnellen“ und „langsamen“ NAT2-Acetylierern
in drei verschiedenen Harnblasenkarzinom-Patientenkollektiven in Deutschland
(GOLKA ET AL., 2002b) und in einer gepoolten Studie aller verfügbaren NAT2
genotypisierten Harnblasenkarzinompatienten (VINEIS ET AL., 2001) belegt.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass der bei chinesischen
Benzidinarbeitern von LIN ET AL. (2005) beobachtete modulierende Einfluss des
polymorphen Enzyms Glucuronosyltransferase 2B7 (UGT2B7) weder bei dem
beruflich exponierten Harnblasenkarzinompatientenkollektiv mit angezeigter
BK-Nr. 1301 noch bei den hinsichtlich der beruflichen Exposition
unausgewählten Klinikpatienten mit Harnblasenkarzinom beobachtet werden
konnte.
20
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26
6. DANKSAGUNG Herrn Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Hermann M. Bolt und Herrn Prof. Dr. med. Jan
G. Hengstler danke ich für die Bereitstellung von Ressourcen.
Herrn Prof. Dr. med. K. Golka danke ich für die Vergabe des Themas und die
vorbildliche Betreuung.
Herrn Dr. rer. nat. M. Blaszkewicz danke ich für die Einarbeitung in die
Methoden der Genotypisierung und die Bereitstellung des Laborarbeitsplatzes.
Frau Dipl.-Stat. O. Schutschkow danke ich für die statistische Beratung.
7. LEBENSLAUF PERSÖNLICHE ANGABEN
Name: Anna Zimmermann
Geburtsdatum: 26. Juni 1979
Geburtsort: Heidelberg
Staatsangehörigkeit: deutsch
SCHULISCHE AUSBILDUNG
1985-1989 Grundschule Unterheinriet
1989-1998 Mönchsee Gymnasium, Heilbronn
1998 Allgemeine Hochschulreife
UNIVERSITÄRE AUSBILDUNG
1999–2005 Medizinstudium an der Universität Würzburg
2001 Physikum
2002 Erstes Staatsexamen
2004 Zweites Staatsexamen
2005 Drittes Staatsexamen
11/2005 Approbation als Ärztin
BERUFLICHE AUSBILDUNG
Seit 02/2006 Wissenschaftliche Mitarbeiterin und
Assistenzärztin im Institut für
Arbeitsphysiologie an der Universität
Dortmund (Direktor: Prof. Bolt) in der
Zentralen Einrichtung Klinische Arbeitsmedizin
(Leiter: Prof. Golka)
8. VERÖFFENTLICHUNG Zimmermann A. et al. UDP-Glucuronosyltransferase 2B7 C802T (His268Tyr)
Polymorphism in Bladder Cancer Cases
Zur Publikation angenommen am 20.11.2007 in Journal of Toxicology and
Environmental Health Part A: Current Issues durch Dr. Sam Kacew, Editor-in-
Chief, Ottawa.
1
UDP-Glucuronosyltransferase 2B7 C802T (His268Tyr) Polymorphism in Bladder
Cancer Cases
Anna Zimmermann1, Meinolf Blaszkewicz1, Gerhard Roth2, Thilo Seidel2, Holger
Dietrich2, Olga Schutschkow3, Hermann M. Bolt1,
Klaus Golka1
1Institute for Occupational Physiology at the University of Dortmund, Dortmund,
Germany, 2Dept. of Urology, Lutherstadt Wittenberg, Germany, 3Dept. of Statistics of
the University of Dortmund, Dortmund, Germany
Running head: UGT2B7 POLYMORPHISM IN BLADDER CANCER CASES
Corresponding author:
Anna Zimmermann
Institute for Occupational Physiology at the University of Dortmund, Ardeystr. 67, D-
44139 Dortmund, Germany
Phone: ++49 231 1084 216, Fax: ++49 231 1084 308
E-mail: [email protected]
Dr. Meinolf Blaszkewicz
Phone: ++49 231 1084 396, Fax: ++49 231 1084 308
E-mail: [email protected]
2
Gerhard Roth
Phone: ++49 3491 693 183, Fax: ++49 3491 693 184
E-mail: [email protected]
Dr. Thilo Seidel
Phone: ++49 3491 668 668, Fax: ++49 3491 668 667
E-mail: [email protected]
PD Dr. Holger Dietrich
Phone: ++49 3491 50 3301, Fax: ++49 3491 50 3280
E-mail: [email protected]
Olga Schutschkow
Phone: ++49 231 1084 216, Fax: ++49 231 1084 308
E-mail: [email protected]
Prof. Hermann M. Bolt
Phone: ++49 231 1084 234, Fax: ++49 231 1084 308
E-mail: [email protected]
Prof. Klaus Golka
Phone: ++49 231 1084 344, Fax: ++49 231 1084 308
E-mail: [email protected]
3
Abstract
A study on Chinese benzidine workers indicated an elevated risk of UDP-
glucuronosyltransferase (UGT) 2B7 T/T carriers for bladder cancer. The present
study was designed to investigate the possible impact of the UGT2B7 genotype on
bladder cancer risk in Caucasians. UGT2B7 polymorphism at locus C802T (His268Tyr)
was detected using a PCR-RFLP based procedure. The study group consisted of 211
bladder cancer cases and 210 controls suffering from different urological diseases,
but without any history of cancer. Both groups were recruited from a department of
urology located in a center of former chemical and rubber industries. Furthermore,
171 bladder cancer cases with a history of occupational exposure to aromatic amines
surveyed for compensation of an occupational disease were investigated. T/T
genotype frequencies in bladder cancer cases, urological controls and exposed
patients appeared similar (27% vs. 35% vs. 25%). This study indicates ethnic
differences between Caucasian and Chinese general populations regarding the
UGT2B7 genotype. Furthermore, in contrast to the earlier investigation in benzidine-
exposed Chinese bladder cancer patients, no relevant differences between the
bladder cancer patients and the urological hospital controls were observed.
Key words Bladder cancer, Glucuronosyltransferase 2B7, Occupational exposure,
Aromatic amines, Caucasians
4
Introduction
Most important risk factors for urinary bladder cancer are exposures to aromatic
amines at the workplace or in cigarette smoke. The polymorphic enzyme N-
acetyltransferase 2 (NAT2) modulates the arylamine-related bladder cancer risk in
occupationally exposed workers of Caucasian descent (Golka et al., 2002) as well as
in Caucasian cigarette smokers (Vineis et al., 2001). However, the slow NAT2 state
does not increase bladder cancer risk in Chinese. Thus, other polymorphic enzymes,
especially phase 2 enzymes, could also influence the individual susceptibility of
subjects exposed to arylamines.
Such possible candidate enzymes are UDP-glucuronosyltransferases (UGT).
Members of this superfamily transfer the glucuronic acid moiety of UDP-glucuronic
acid to the substrate (Guillemette, 2003). At least 2 UGT gene families were
described conjugating drugs and endobiotics in mammalian species: UGT1 and
UGT2 (Mackenzie et al., 1997; 2005). UGT2B7, a major isoform of UGT2B
(Radominska–Pandya et al., 2001), catalyzes glucuronidation of a wide range of
compounds. Jin and coworkers (1993a,b) showed that UGT2B7 is involved in the
glucuronidation of polycyclic aromatic hydrocarbon B[a]P, carboxylic acids
(nonsteroidal anti-inflammatoric drugs (NSAID), clofibric acid and valproic acid),
aliphatic alcohols, and tetrazoles. Furthermore, Bhasker and coworkers (2000) and
Lampe et al. (2000) reported on ethnic related differences between Asians and
Caucasians.
Using cDNA expressed glucuronosyltransferase, Ciotti and coworkers (1999)
showed that UGT2B7 is involved in the metabolism of benzidine. Zenser and
coworkers (2002) investigated benzidine metabolism using liver slices. They
5
described the metabolic activities of UGT as follows:
UGT1A9>UGT1A4>>UGT2B7>UGT1A6≈UGT1A1.
Recently, a study on Chinese benzidine workers indicated an elevated risk of
the UDP-glucuronosyltransferase (UGT) 2B7 T/T carriers (Lin et al., 2005). The
present study was designed to determine a possible impact of this UGT2B7 genotype
on bladder cancer risk in Caucasian bladder cancer patients from a urological
department and in Caucasian bladder cancer patients occupationally exposed to
aromatic amines.
Materials and Methods
We investigated 211 bladder cancer cases and 210 controls suffering from
different benign urological diseases and without any history of cancer from a
department of urology, located in a center of former chemical and rubber industries.
Furthermore, 171 bladder cancer cases with a history of occupational exposure to
carcinogenic aromatic amines surveyed for compensation of an occupational disease
were investigated. These surveyed persons were exposed to aromatic amines, azo
dyes based on carcinogenic aromatic amines, and/or combustion products containing
very low amounts of aromatic amines.
From the 2 clinical study groups, information on occupational history,
occupational exposures to potential carcinogenic substances and smoking habits
was obtained via a questionnaire. For the occupationally exposed group, information
was taken from the records.
The group of smokers included current smokers at the time of bladder cancer
6
diagnosis and those having ever regularly smoked within the last 10 years prior to
diagnosis. Non-smokers were defined as having never smoked or having stopped
smoking for ten and more years prior to diagnosis.
Blood sampling and DNA extraction
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) was used as blood anticoagulant.
Genomic DNA was prepared from blood using standard methods (QIAamp DNA Maxi
Kit Qiagen, Hilden, Germany). Samples were stored at -20°C.
UGT2B7 genotyping
The PCR-RFLP procedure described by Holthe and coworkers (2002) was used
and slightly modified. Fifty µl PCR-reaction volume contained 150-300 ng of genomic
DNA, 0.2 µM of each primer (5´-GAC AAT GGG GAA AGC TGA CG-3` and 5´-GTT
TGG CAG GTT TGC AGT G-3`; MWG-Biotech AG, Ebersberg, Germany), 5.00 µl of
10x PCR-buffer (incl. MgCl2) (Qiagen, Hilden, Germany), 200 µM of each
deoxynucleoside (dNTP) (Biolabs, Frankfurt, Germany) and 2.0 U of Taq DNA
Polymerase (Qiagen, Hilden, Germany). PCR was performed in a thermal cycler
(TGradient Biometra Thermocycler, Göttingen, Germany). The initial denaturation
step (94°C for 10 min) was followed by 35 cycles [94°C for 30 s (denaturation), 62°C
for 30 s (annealing) and 72°C for 30 s (extension)], followed by a final extension at
72°C for 10 min leading to a 116 bp long DNA strand. An aliquot (10 µl) of the
resultant PCR product was then digested with 10 units of BseG1 (Fermentas Life
Science, St. Leon-Rot, Germany) in a final 20 µl volume for 180 min at 55°C,
resulting in a 116 bp fragment (mutant) or in a 56 bp and a 60 bp fragment (wild
type).
7
Restriction digestion fragments were then analyzed by electrophoresis in an
ethidium bromide-stained 4% NuSieve Agarose (3:1 NuSieve-Agarose: Agarose) gel.
It is noteworthy that the 56 bp and the 60 bp fragments appear as one single band
under the conditions described above.
To avoid dimerization of primers, we reduced the amount of primers from 0.32
µM (Holthe et al., 2002) to 0.2 µM. With gradient PCR, we evaluated an optimal
annealing temperature at 62°C for the Biometra Thermocyler, instead of 65°C for
Perkin Elmer Gen Amp PCR system 9600 or 2400 used by Holthe et al. (2002).
Statistical analysis
We calculated odds ratios (OR) and 95% confidence intervals (95% CI) to
estimate the risk due to different genotypes, alleles, smoking habits and occupational
exposures. P-values less than 0.05 were regarded as significant. The statistical
analysis was made with the software package R version1.9.0 (2004).
Results
Homozygous mutant T/T UGT2B7 genotype frequencies in the investigated
study groups of clinical bladder cancer cases, urological controls without a history of
cancer and exposed bladder cancer cases who claimed compensation of an
occupational disease appear similar (27% vs. 35% vs. 25%; Table 1).
For the clinical bladder cancer cases (control group: urological controls without
malignancies), odds ratios (OR) were OR=1.36 for T/T carriers and OR=0.96 for C/T
carriers, compared to C/C carriers (Table 1).
8
Within the subgroup of smokers, T/T carriers showed an OR of 1.05, and C/T
carriers an OR of 0.69 (Table 2). Within the subgroup of non smokers, the following
OR were detected: OR=1.47 for T/T carriers and 1.01 for C/T carriers (Table 3).
Homozygous C/C carriers were defined as 1.00 as reference. Mantel-Haenszel
estimates of the smoking adjusted odds ratio for C/T carriers were 0.93 (95% CI
0.56-1.54) and for T/T carriers 1.35 (95% CI 0.78-2.34).
We also calculated a possible influence of UGT2B7 polymorphism on bladder
cancer risk in all occupations performed for six months and more. In occupations
related to the relevant industries in the study area (performed by at least 10
individuals per group), in general no significant impact was observed. Following odds
ratios were detected: miners: OR for C/T carriers 0.75 (95% CI: 0.12-4.90); OR for
T/T carriers 0.67 (95% CI: 0.09-5.13); chemical workers: OR for C/T carriers 4.67
(95% CI: 1.01-21.65), OR for T/T carriers 1.14 (95% CI: 0.21-6.37); metal
construction workers: OR for C/T carriers 0.58 (95% CI: 0.14-2.43), OR for T/T
carriers 0.50 (95% CI: 0.10-2.60); mechanical engineering: OR for C/T carriers 3.33
(95% CI: 0.52-21.58), OR for T/T carriers 2.50 (95% CI: 0.25-24.72); vehicle
construction: OR for C/T carriers 1.33 (95% CI: 0.20-8.71), OR for T/T carriers 0.38
(95% CI: 0.04-3.34). Furthermore, no significant impact was observed for another 15
investigated occupations, such as painters and varnishers or electricians, performed
by at least 6 individuals per subgroup (data not shown).
In the occupational exposed bladder cancer group, the portions of the UGT2B7
T/T carriers were determined for painters and varnishers (n=60, T/T carriers: 23%),
for subjects occupationally exposed to aromatic amines (n=133; T/T carriers: 28%),
9
and for individuals exposed to polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) (n=67; T/T
carriers: 22%).
Discussion
This study of Caucasian bladder cancer cases was performed to evaluate a
possible bladder cancer risk of homozygous mutant UDP-glucuronosyltransferase
(UGT) 2B7 T/T carriers. Genotypic variation in detoxification enzyme systems is
known, and in the last years increased attention was paid to UGT polymorphisms in
relation to cancer. In some studies, pancreatic cancer (Ockenga et al., 2003) or
premenopausal breast cancer in African Americans (Guillemette et al., 2000) are
associated with variant UGT genotypes. Zheng and coworkers (2001, 2002) showed
that UGT, particularly UGT1A7, may play a role in the detoxification of tobacco
carcinogens. In total, studies concerning impact of UGT genotypes on the disposition
to cancer are scarce (Wallig, 2004).
In the present study, the portions of T/T carriers occupationally exposed to
aromatic amines, azo dyes, or PAH and the portions of T/T carriers in the bladder
cancer cases from a department of urology were quite close and within the
percentages reported for healthy Caucasian populations (Bhasker et al., 2000;
Lampe et al., 2000). Nevertheless, the portion of T/T carriers in the controls from a
department of urology was slightly higher. A possible limitation of our clinical bladder
cancer cases group regarding the differentiation of the two bladder cancer cases
groups is due to the fact that the department of urology is located in an area of former
chemical and rubber industry.
10
Regarding the different impact of the UGT2B7 state on Chinese and Caucasian
bladder cancer cases, several aspects may be considered. With termination of
benzidine production in Germany in the 1960s a study group occupationally exposed
to benzidine was not available in Germany. An exposed group coming close to those
exposed Chinese benzidine workers are subjects occupationally exposed to aromatic
amines and claiming for compensation of an occupational bladder cancer. Due to
long latency periods of aromatic amine-related bladder cancer up to 40 years and
longer, these individuals had been exposed to relevant amounts of aromatic amines
or, like the subgroup of painters and varnishers, to azo dyes mostly based on
benzidine.
The occupational exposure of the Chinese bladder cancer cases was mainly
due to benzidine. Benzidine shows a higher carcinogenic potential than other
aromatic amines commonly used in dyes. Furthermore, the exposure levels in dye
production in China were much higher than exposure levels to aromatic amines in
chemical productions facilities in Germany. Against this background it may be
discussed, if the genetic UGT2B7 status is relevant for very high exposures only.
Finally, it should be taken into account that Chinese workers may be more
susceptible to bladder cancer induced by aromatic amines than German workers.
In conclusion there is no relevant association between the detected UGT2B7
genotypes and bladder cancer in the two investigated Caucasian groups.
11
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Table 1 UGT2B7 polymorphism in the total study group: bladder cancer cases, urological controls and occupationally exposed bladder cancer patients
Bladder
cancer cases
(n=211)
Urologicalcontrols (n=210)
OR 95% CI Occupationally exposed
group (n=171)
Genotype C/C 24%
(n=51) 22%
(n=47) 1.00 26% (n=44)
C/T 48% (n=102)
43% (n=90)
0.96 [0.57-1.61] 50% (n=85)
T/T
27% (n=58)
35% (n=73)
1.36 [0.78-2.34] 25% (n=42)
Allele (n=422) (n=420) (n=342) C 48%
(n=204) 44%
(n=184) 1.00 51% (n=173)
T 52% (n=218)
56% (n=236)
1.20 [0.92-1.57] 49% (n=169)
16
Table 2 UGT2B7 polymorphism in the subgroup of smokers: bladder cancer cases, urological controls and occupationally exposed bladder cancer patients Bladder
cancer cases (n=88)
Urologicalcontrols (n=29)
OR 95% CI Occupationally exposed
group (n=86)
Genotype C/C 24%
(n=21) 28% (n=8)
1.00 24% (n=21)
C/T 48% (n=42)
38% (n=11)
0.69 [0.21-2.29] 53% (n=46)
T/T 28% (n=25)
34% (n=10)
1.05 [0.31-3.67] 22% (n=19)
Allele (n=176) (n=58) (n=172) C 48%
(n=84) 47%
(n=27) 1.00 51% (n=88)
T 52% (n=92)
53% (n=31)
1.05 [0.58-1.90] 49% (n=84)
17
Table 3 UGT2B7 polymorphism in the subgroup of non smokers: bladder cancer cases, urological controls and occupationally exposed bladder cancer patients Bladder
cancer cases
(n=123)
Urologicalcontrols (n=181)
OR 95% CI Occupationally exposed
group (n=78)
Genotype C/C 24%
(n= 30) 22%
(n=39) 1.00 27% (n=21)
C/T 49% (n=60)
44% (n=79)
1.01 [0.54-1.89] 46% (n=36)
T/T 27% (n=33)
35% (n=63)
1.47 [0.74-2.91] 27% (n=21)
Allele (n=246) (n=362) (n=156) C 49%
(n=120) 43%
(n=157) 1.00 50% (n=78)
T 51% (n=126)
57% (n=205)
1.24 [0.90-1.72] 50% (n=78)