unterlagen zum Übungsbeispiel - boku.ac.at · eine enzym-katalysierte reaktion, die der...
TRANSCRIPT
BIOCHEMISCHEÜBUNGENI
UnterlagenzumÜbungsbeispiel
ENZYMKINETIK
FürdenInhaltverantwortlich:KlaraSoukup,Bakk.techn.
Wien,Juli2012(ergänztOktober2018)
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
2
INHALTSÜBERSICHT
EINLEITUNG 3
ZIELDESBEISPIELS 3DIEVERWENDETENENZYMEUNDAKTIVITÄTSASSAYS 3
THEORETISCHERHINTERGRUND 6
MICHAELIS-MENTEN-KINETIK 6MÖGLICHKEITENDERLINEARISIERUNGVONDATEN(PLOTS) 7
PRAKTISCHERTEIL 10
1–ERMITTLUNGDERENZYMVERDÜNNUNG 112–ZEITABHÄNGIGKEITSEXPERIMENT(VARIIERENDERINKUBATIONSZEIT) 113–MICHAELIS-MENTEN-EXPERIMENT/KM-WERTBESTIMMUNG(VARIIERENDERSUBSTRATKONZENTRATION) 134–TEMPERATURABHÄNGIGKEITSEXPERIMENT/TEMPERATUR-OPTIMUM(VARIIERENDERINKUBATIONSTEMPERATUR) 155–LAGERSTABILITÄTSEXPERIMENT/TEMPERATUR-STABILITÄT(VARIIERENDERLAGERBEDINGUNGEN) 18
ZEITPLAN 21
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
3
Einleitung
ZieldesBeispielsImRahmendiesesÜbungsbeispielssolleineEnzymkinetik-Bestimmungdurchgeführtwerden.Dabeisollermitteltwerden,wiesichdieAktivitäteinesEnzymsdurchverschiedeneParameterbeeinflussenlässt.DiedafürzurVerfügungstehendenParametersind:
ü dieInkubationszeit–d.h.waspassiert,jelängerdasEnzymZeithat,mitseinemSubstratzuinteragieren?WirddieReaktionsgeschwindigkeithöher,jelängerdasEnzymSubstratinProduktumwandelt?
ü dieSubstratkonzentration–d.h.waspassiert,jemehrSubstratdemEnzymzurVerfügungsteht?WirddieReaktionsgeschwindigkeithöher,jemehrSubstratimAnsatzvorhandenist?
ü dieInkubationstemperatur–d.h.waspassiert,jehöherdieTemperaturist,unterderdasEnzymdieSubstratumwandlungdurchführt?NimmtdieGeschwindigkeitgemäßthermodynamischerPrinzipienzu?
ü dieBedingungen,unterdenendasEnzymgelagertwird–d.h.waspassiert,wenndasEnzymnichtaufEissondernbeiRaumtemperaturaufbewahrtwird?BeeinträchtigtdieLagerungdieEnzymaktivität?
DieseParametersollenimLaufederÜbungenvariiertwerden,umanschließenddieeintretendenVeränderungenzuinterpretieren.
Dassogenannte„Herzstück“desBeispielsstelltdabeidieErmittlungderKinetikdar,d.h.inwelcherFormdieAktivitätdesEnzymsvonderihmzurVerfügungstehendenKonzentrationanSubstratabhängt.DabeisolluntergeeignetenVersuchsbedingungenüberprüftwerden,obessichumeineMichaelis-Menten-Kinetikhandelt.
DieverwendetenEnzymeundAktivitätsassaysDieuntersuchtenEnzymestammenausdemvorangegangenenBeispiel„Proteinaktivität“(beiProf.Altmann)undwurdenausverschiedenenQuellengereinigt.DabeisollteimmerimHinterkopfbehaltenwerden,dassdieReinigungnichtspezifischdurchgeführtwurdeunddaherimverwendetenProteinextraktnebendemzuuntersuchendenEnzymauchzahlreicheandereProteinevorhandensind,dieeventuellEinflussaufdieAktivitätsbestimmungnehmen.MancheErgebnissekönnendaherandersausfallen,alsmanesbeiUntersuchungeineshochreinenEnzymextrakteserwartenwürde.
BereitsimBeispiel„Proteinaktivität“wurdeeineAktivitätsbestimmungdurchgeführt,umdieEnzymaktivitätimgereinigtenExtraktzuermitteln(Units/mL).Dabeiwurdenacheinemangegebenen„Kochrezept“vorgegangen–einemsog.Aktivitätsassay(z.B.pipettiere100µLEnzym+100µLSubstratzusammen,inkubiere15minbei37°CundbeendedieReaktiondurchZugabevon1mLStopplösung).DerinkubierteAnsatzwurdeanschließendphotometrischgemessen.
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
4
DieangegebeneneWellenlängerepräsentiertdasAbsorptionsmaximumdesgebildetetenProduktes.Dasbedeutet,dassdieAktivitätsbestimmungaufderMessungdesentstandenenProduktesberuht.DabeikanndieZunahmeanProduktmitderZeit(d.h.dieZunahmederAbsorption)alsMaßfürdieAktivität(d.h.eigentlichdie„Arbeitsgeschwindigkeit“)desEnzymsangenommenwerden.
v = dPdt
≅ A
UmeineandereFormdesAktivitätsassayskennenzulernen,sollenindiesemBeispieldieProteinextraktegetauschtwerden.DieentsprechendenAngabenwerdenvondenTutorenausgegeben.
EinigeBeispielefürverwendeteEnzyme:
ü SaurePhosphataseü Pyrophosphataseü Polyphenoloxidaseü Galactosidaseü Glucosidaseü Mannosidaseü Hexosaminidasenz.B.Glucosaminidase(„β-Hex“)ü Peroxidase
DabeiberuhensämtlicheAktivitätsassaysaufeinemähnlichenPrinzip:diekatalysierteReaktionresultiertdurchAbspaltungeinerbestimmtenGruppeinderBildungeineschromogenenProdukts,dessenFärbungphotometrischgemessenwird.AlsBeispielseihierdieReaktionsgleichungderPhosphataseangegeben,beideresdurchAbspaltungderPhosphatgruppevonpara-NitrophenylphosphatzurBildungvonpara-Nitrophenol(4-Nitrophenol)kommt.DiesesProduktliegtunterbasischenBedingungen(wirddurchZugabederStopplösungerreicht)indeprotonierterFormvor(Phenolat)undweisteineintensiveGelbfärbungauf.DiedeprotonierteFormkanndabeiinzweiGrenzformenvorliegen(benzoidevs.chinoideStruktur).DieAbsorptionwirdbei403nmgemessen.
Abbildung1DurchPhosphatasekatalysierteReaktion(Bildungvon4-Nitrophenol)
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
5
BeidenmeistenAktivitätsassaysbeträgtdieInkubationszeit15minbei37°CundanschließendwirddieProduktbildungphotometrischbestimmt.Ausnahmenstellenz.B.PolyphenoloxidaseundPeroxidasedar.BeidenvondiesenEnzymenkatalysiertenReaktionenerfolgtdieProduktbildungsorasch,dasseinenach15mingemesseneAbsorptionnichtmehrrepräsentativfürdieEnzymaktivitätwäre.DahererfolgtdieAktivitätsmessung„real-time“–d.h.laufendvomerstenKontaktdesEnzymsmitseinemSubstratanüber2min.DieseAssayswerdendirektimPhotometerdurchgeführt,wobeidasGerätalle20secdenentsprechendenAbsorptionswertaufzeichnet.
Abbildung2DieBildungvonTetraguaiacolausH2O2undGuaiacolalsBeispielfüreinevonPeroxidasekatalysierteReaktion
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
6
TheoretischerHintergrund
Michaelis-Menten-KinetikDiesesKapitelsollnurderkurzenWiederholungderGrundlagenderEnzymkinetikdienen,umdiewichtigstenGrundbegriffewiederinErinnerungzurufen.GenauereswurdebereitsinanderenLehrveranstaltungendurchgenommen.
Eineenzym-katalysierteReaktion,diederMichaelis-Menten-Theoriefolgt,lässtsichdarstellenwiefolgt:
DieReaktionskonstantedeserstenReaktionsschritts(BildungeinesEnzym-Substrat-KomplexesausfreiemEnzymEundSubstratS)istk1,diederRückreaktiondementsprechendk-1,unddiedeszweitenSchritts(ZerfalldesKomplexesinfreiesEnzymundProdukt)k2.
NachMichaelis-MentenlässtsichdieReaktionsgeschwindigkeitnachfolgenderGleichungermitteln:
BeieinerenzymatischkatalysiertenReaktionnachdemMichaelis-Menten-ModellherrschteinhyperbolischerZusammenhangzwischenderReaktionsgeschwindigkeitundderzurVerfügungstehendenSubstratkonzentration.ImAnfangsbereichnimmtdieGeschwindigkeitlinearmitderSubstratkonzentrationzu.AbeinergewissenKonzentrationbeginntdieKurveabzuflachenunderreichtschließlicheinPlateau–d.h.estrittSättigungauf.IndiesemBereichnimmtdieKonzentrationkeinenweiterenEinflussaufdieGeschwindigkeit–diesehatihrMaximumerreicht.
DiewichtigenParameterimZusammenhangmitderCharakterisierungderKinetikeinesEnzymssinddiemaximaleReaktionsgeschwindigkeit(vmax)unddieMichaelis-Konstante(KM-Wert),welchejeneSubstratkonzentrationdarstellt,beiderdasEnzymmithalb-maximalerGeschwindigkeitarbeitet.DerKM-WertbeschreibtdieAffinitätdesEnzymszumSubstrat–jeniedrigerderKMeinesEnzymsfüreinSubstratist,destospezifischererfolgtdieReaktiond.h.esgenügenbereitsniedrigeSubstratkonzentrationen,umdasEnzymmithalbmaximalerGeschwindigkeitarbeitenzulassen.
Abbildung3Michaelis-Menten-KurveZusammenhangReaktionsgeschwindigkeitundSubstratkonzentrationbeieinerenzymatischkatalysiertenReaktion
DieMichaelis-Konstanteistdefiniertals:
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
7
MöglichkeitenderLinearisierungvonDaten(Plots)UmanhandeinerKinetik-KurvecharakteristischeWertewieKModervmaxzuermitteln,mussdieaufgenommeneKurvemittelskompliziertermathematischerProzesseexaktangepasstwerden.DavmaxeinenWertdarstellt,demsichdieKurvenurasymptotischnähert,isteinesolcheAuswertungkeineswegstrivial.EsstehendazudiverseSoftware-ToolszurVerfügung.
ImFalleunseresBeispielssolleineeinfacheAuswertungmittelsMSExceldurchgeführtwerden.ZudiesemZweckkönnendiegemessenenDatenlinearisiertwerden,d.h.eserfolgteinerechnerischeUmformung,welchedieAuswertungerleichtert.DieseVorgangsweisewirdauchindertäglichenLaborpraxisoftgewählt,damansoraschzuziemlichgenauenErgebnissenkommt.
Lineweaver-BurkPlotAmbekanntestenistdiedoppeltreziprokeLinearisierungmittelsLineweaver-BurkPlot.DabeiwirdderKehrwertdergemessenenArbeitsgeschwindigkeitinAbhängigkeitvomKehrwertdereingesetztenSubstratkonzentrationaufgetragen.KMundvmaxkönnenwiedargestelltabgelesenwerden.
Abbildung4Lineweaver-BurkPlot
DerLineweaver-BurkPlothatjedocheinensignifikantenNachteil:aufgrundderdoppeltreziprokenUmformungderDatenkommteszueinerimmergrößerenFehlerzunahme,jekleinerdieMesswertesind.AußerdemistdieVerteilungderMesspunkteimPlotnichtmehräquidistant,wasauchzugroßenUngenauigkeitenführenkann.
AusdiesenGründensolltebevorzugteineandereMethodederDatenlinearisierunggewähltwerden.
HanesPlotEineguteAlternativestelltderHanesPlotdar,beidemdieeingesetztenSubstratkonzentrationendirektaufderx-Achseaufgetragenwerden.Fürdiey-AchsewerdendieSubstratkonzentrationendurchdiejeweilsgemessenenGeschwindigkeitendividiert.
Abbildung5HanesPlot
DanureinemathematischeUmformungderDatenerfolgt,bleibtderAbstandzwischendenMesspunktengleich(wenndieeingesetztenSubstratkonzentrationenäquidistantgewähltwurden)
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
8
undauchdieGrößedesFehlersverändertsichnichtmitderGrößedergemessenenDaten.EinNachteildieserDarstellungliegtinderTatsache,dassdieeingesetzteSubstratkonzentrationaufbeidenAchsenauftritt.DadurchfließenFehler,diedurchPipettierungenauigkeitenentstehen,doppeltindieBerechnungein.
DerHanesPlotgiltalsdiebevorzugteLinearisierungs-Methode.AuchimRahmendiesesÜbungs-BeispielssolldieKM-WertBerechnunganhandeinesHanesPlotdurchgeführtwerden.
Eadie-HofsteePlotAuchbeimEadie-HofsteePlotwirddasProblemderunregelmäßigenVerteilungderMesspunkteundderFehlervergrößerungüberwunden,indemaufdery-AchsedirektdieArbeitsgeschwindigkeitaufgetragenwird.Fürdiex-AchsewirddieArbeitsgeschwindigkeitdurchdieeingesetzteSubstratkonzentrationdividiert.
Abbildung6Eadie-HofsteePlot
DerNachteildesEadie-HofsteePlotsliegtdarin,dassdieGeschwindigkeitaufbeidenAchsenverwendetwirdundsichdaherbeiderAuswertungUngenauigkeitenderGeschwindigkeits-Bestimmung(Messung)vergrößern.DadurchsinktdieGenauigkeitdervmaxundKM-Berechnung.
BeiderErstellungvonPlotsdieserArtisteswichtigzubedenken,dasseineerfolgreicheDaten-Linearisierungnurdannmöglichist,wenndiegemesseneKinetik-KurvetatsächlichdemMichaelis-Menten-Verlauffolgt.BeimanchenEnzymenbzw.ProteinlösungenkanneszuAbweichungenkommenundeskanndaherschwierigsein,eine„schöne“Michaelis-Menten-Kurvezuerhalten.AußerdemfolgennichtalleEnzymederMichaelis-Menten-Kinetik.
BeiEnzymen,dieeinenextremgroßenKM-Wertaufweisen,kannessein,dassbeimerstenVersuchdasvmax-Plateaunochnichterreichtwurde,weildieeingesetzteSubstratkonzentrationnochnichthochgenugwar.DieaufgenommeneKurvezeigtdanneinenlinearenVerlauf,ohnedie„Abknick-Phase“zuerreichen.IndiesemFallmüssenhöhereSubstratkonzentrationenhergestelltwerden,umauchdenEndbereichderMichaelis-Menten-Kurvezuerreichen.NursokanneineerfolgreicheAuswertungmittelsPlot-Berechnungerfolgen.
Abbildung7HoherKM:eingesetzteSubstratkonzentrationensindzuniedrig,umdiegesamteKurvezuerfassen
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
9
UmgekehrtkannesbeiEnzymenmitsehrkleinemKM-Wertpassieren,dassdieniedrigstegemesseneSubstratkonzentrationnochzuhochist,umindenlinearenBereichderMichaelis-Menten-Kurvezufallen.Dannmussdiesenochweiterverdünntwerden,damitauchdieserKurvenbereichaufgezeichnetwerdenkann.
Abbildung8NiedrigerKM:eingesetzteSubstratkonzentrationensindzuhoch,umdiegesamteKurvezuerfassen
Quellen:
BERGJM,TYMOCZKOJL,STRYERL:Biochemie.5.Auflage.SpektrumAkademischerVerlag,HeidelbergBerlin(2003);S.222-228
http://www.ucl.ac.uk/~ucbcdab/enzass/substrate.htm(vom15.6.2012)
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
10
PraktischerTeilIndiesemKapitelsollGenauereszudeneinzelnenExperimentenerläutertwerden,dieimLaufederbeidenÜbungstagedurchgeführtwerden.
Ø Besonderswichtigistes,dieReihenfolgedieserExperimentezuverstehen,dameistdasErgebniseinesExperimentsdieweitereVorgangsweisebestimmtbzw.dieVoraussetzungfürweitereVersuchedarstellt.DaheristeswährendderÜbungenauchbesonderswichtig,nachjedemExperimentsofortdieAuswertungdurchzuführenunddiesemitdenTutorenzubesprechen,umgemeinsamdienächstenSchrittezuüberlegen.
Ø JederStudentführtseineeigeneVersuchsreihedurch.Dabeikannnatürlichzusammengearbeitetwerden–wichtigistjedoch,dassjederseineeigenenErgebnisseprotokolliertundinterpretiert.DieErfahrungzeigt,dassesempfehlenswertist,seineeigenenVersucheauchselbstzupipettieren.UnbedingtvermiedenwerdensolltenOperatorwechselzwischendurch–dasschlägtsichmeistinderQualitätdergemessenenErgebnissenieder.
Ø BevormitdenExperimentenbegonnenwirdsolltensämtlichebenötigtenLösungen(PufferzurEnzymverdünnung,Substrat-Stocklösung,Stopplösung,evtl.weitereFarbreagenzien)hergestelltwerden.Dazumussberechnetwerden,wievielvonjederLösungproExperimentbenötigtwird.FürdieseBerechnungisteinesbesonderswichtig:
>SämtlicheVersuchewerdeninDoppelbestimmungdurchgeführt!<
Ø DieHerstellungderLösungenkannimTeamzuvierterfolgen.BeiderAufrundungdererrechnetenMengensollteimmerbeachtetwerden,wieteuerdiejeweiligeSubstanzist–daherbittenachderBerechnungmitdenTutorenabsprechen,wievielvonwelcherLösungtatsächlichhergestelltwerdensoll.
Ø Außerdemsollteberücksichtigtwerden,dassjedesExperimenteinenBlindwertverlangt.DieserwirdnichtbeijedemExperimentaufdieselbeWeiseermittelt!DerBlindwertunterscheidetsichvom„Leerwert“dadurch,dassalleLösungendarinenthaltensind,währendbeimLeerwertdieuntersuchteLösungweggelassenwird.BeimBlindwertmusssichergestelltwerden,dassdieLösungenkeineMöglichkeithaben,miteinanderzureagieren(z.B.EnzymundSubstrat–diesemüssendaherdurchStopplösungvoneinandergetrenntwerden!).AnsonstenwirdderBlindwertgenausobehandeltwiedieVersuchsansätzeunddaherimmerinDoppelbestimmunggemessen.DerBlindwertwirdbeiderAuswertungvonallenMesswertenabgezogen–auchvonsichselbst,wodurcheinNullpunktermitteltwird(„Absorption0“).
Ø WICHTIG:bittesämtlicheEnzymlösungen(auchVerdünnungen)immeraufEisaufbewahren!DieAktivitätnimmtsonstimLaufedesTagesab.Substratlösungen,PufferundStopplösungkönnenbeiRaumtemperaturaufbewahrtwerden.DieeigeneEnzymverdünnungmussamzweitenÜbungstagfrischhergestelltwerden,daüberNachtdieAktivitätstarkabnehmenkann.Wichtigdabeiist,dassdieVerdünnungaufdieselbeWeisewieamVortaghergestelltwird.
Ø ImProtokollunbedingtangeben,mitwelchemEnzymbeimKinetik-Praktikumgearbeitetwurde!DiesesistunterschiedlichjenachBeispiel(Proteinaktivität/Proteinbestimmung/Enzymkinetik).
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
11
1–ErmittlungderEnzymverdünnungé Ziel:
ErmittlungeinerEnzymverdünnung,umimlinearenMessbereichdesPhotometerszuarbeiten
JenachdenErgebnissendesBeispiels„Proteinaktivität“werdenverschiedeneEnzymverdünnungengetestet(vondenTutorenangegeben).DamitwirdjeweilsderAktivitätsassayausgeführtundanschließendüberprüft,inwelchemBereichdiegemesseneAbsorptionliegt.Zielistes,eineAbsorptionzuerreichen,diezwischenca.0.4–0.6liegt,daindiesemBereichgemesseneWertelinearunddamiteinigermaßenverlässlichreproduzierbarsind.
DiesesExperimentistsozusagenein„Vor-Experiment“,daesdieGrundlagefüralleweiterenSchritteist.HierkannausnahmsweiseinEinfach-Bestimmunggearbeitetwerden.
NachAbschlussdiesesExperimentserhältjederStudentseine„eigene“Verdünnung,mitdereralleweiterenVersuchedurchführt.DazubittediegemessenenWertemitdenTutorenbesprechen.DieTutorenlegenanschließendeineentsprechendeVerdünnungproStudentfest,d.h.vondaanmussjederseineeigeneVersuchsreihedurchführen.
F Durchführung:
1. EnzymverdünnungenvondenTutorenerfragenundherstellen(inPuffer!)
2. Aktivitätsassayslt.Angabemitdiesendurchführen(Einfachbestimmung)
3. AbsorptionenbeiangegebenerWellenlängemessen
4. ErgebnissemitTutorenbesprechen–eigeneVerdünnungerfragen
à Blindwert:einenBWfürjedeEnzymverdünnungerstellen,wobeialleLösungenenthaltenseinmüssenohnemiteinanderzureagieren,d.h.manpipettiertz.B.Enzym-Stopplösung-Substrat(Reihenfolgeistegal,solangedieStopplösungzugesetztwird,bevorEnzymundSubstratmiteinanderreagierenkönnen).
! Für’sProtokoll:
WichtigistdieAngabedergewähltenVerdünnung,mitderweitergearbeitetwirdundeineErklärung,warumdieseVerdünnunggewähltwurde.AußerdemsindsämtlicheOriginal-Messdatenanzugeben.DieMethodensindindeneigenenWortenzubeschreiben(könnenauchgraphischergänztwerden):WennSiealsMethodenur„sieheUnterlagen“angeben,müssenSieeinkorrigiertesProtokollnachreichen.DasverwendeteEnzymmüssenSieauchnennen.
2–Zeitabhängigkeitsexperiment(VariierenderInkubationszeit)é Ziel:
ErmittlungeinerInkubationszeit,umimlinearenAktivitätsbereichdesEnzymszuliegen
BeidiesemExperimentstehtderParameterInkubationszeitimVordergrund.EinegeeigneteInkubationszeitfürdenAktivitätsassayzuermittelnisteinewichtigeVoraussetzungfüralleweiterenVersuche–vorallemfürdasMichaelis-Menten-Experiment(ErmittlungderEnzymkinetik).
EineVorbedingung,umKinetikmessungendurchzuführen,istdieArbeitimlinearenAktivitätsbereichdesEnzyms.GemessenwerdensollenAnfangsgeschwindigkeiten(v0),dasonstkeineKinetikkurve
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
12
aufgenommenwerdenkann.JedeEnzymaktivität(gemessenalsGeschwindigkeitderProduktbildungoder„Arbeitsgeschwindigkeit“)flachtnacheinergewissenZeitabunderreichtirgendwanneinPlateau.Dahermusssichergestelltwerden,dassdieimAktivitätsassayangegebeneInkubationszeitnochimlinearenGeschwindigkeitsbereichdesEnzymsliegt.AusdiesemGrundwirdnundieInkubationszeitvariiertundeineZeitabhängigkeitskurveaufgenommen.
NachAbschlussdiesesExperimentswirddieInkubationszeitangepasst,daheristeswiederwichtig,dieErgebnisseauszuwertenundmitdenTutorenzubesprechen,bevorweitergearbeitetwerdenkann.DieTutorenlegendanneineInkubationszeitfest,dieeinengutenKompromisszwischengutemAbsorptionswert(0.4–0.6)undlinearerEnzymgeschwindigkeitdarstellt.
F Durchführung:
1. AktivitätsassaymitdereigenenVerdünnungdurchführenundjeweilsinDoppelbestimmunginkubieren:
a. 5Minutenb. 10Minutenc. 15Minutend. 20Minuten
DabeikönnenalleAnsätzeparallelangesetztundgestartetwerden.In5-Minuten-AbständenwirddannjeweilseinDoppel-Ansatzgestoppt.DieStopplösungsolltedirektnachAblaufderZeitimWasserbadzugegebenwerden,dasonsteinezeitlicheUngenauigkeithinzukommt.
à WICHTIG:ZeitGENAUeinhalten!Stoppuhrverwenden!
2. AbsorptionenbeiangegebenerWellenlängemessen(diegestopptenAnsätzekönnenbeiRaumtemperaturaufgehobenundanschließendzusammengemessenwerden)
3. InExceleineZeitabhängigkeitskurveerstellen(sieheunten)
4. ErgebnissemitTutorenbesprechen–gemeinsamInkubationszeitanpassen
à Blindwert:istindiesemFallein„0-Minuten“-Blank,d.h.EnzymundSubstratdürfenkeineZeithaben,miteinanderzureagieren.DieDurchführungerfolgtalsogenausowiezuvor(z.B.Enzym-Stopplösung-Substrat).FürdieAuswertungwerdenalleMesswerteumdenBlindwertkorrigiert(d.h.subtrahieren).Wichtigistes,denBlindwertauch„vonsichselbst“zusubtrahieren,umeinenNullpunktfürdieGrafikzuerhalten.
à WICHTIG:EnzymundSubstratwerdenbeiverschiedenenTemperaturenaufbewahrt(Enzym:Eis,Substrat:RT).DieReaktionsollbei37°C(Ausnahme:real-timeMessungen)stattfinden.WennEnzymundSubstratsofortzusammenpipettiertwerden,dauerteseinegewisseZeit,bisbeidedieReaktionstemperaturerreichthaben.Dabeikommteszueinersog.„Lag-Phase“,welchevoralleminderZeitabhängigkeitskurvesofortsichtbarwird.
DieseLag-Phasemussunbedingtverhindertwerden,indemEnzymundSubstratgetrenntvoneinandervorgewärmtwerden.DazuindenReaktionsröhrchendasbenötigteVolumenanEnzymvorlegen,ineinextraRöhrcheneinAliquotanSubstratlösung(Menge,diefüralleAnsätzederVersuchsreihebenötigtwird+einbisschenmehr)pipettierenundallesimWasserbadfür1-2minvorwärmen.DanndieReaktiondurchZugabedesentsprechendenVolumensSubstratlösungzudenvorbereitetenRöhrchenstarten.DieseVorgangsweisegiltfüralleVersuche!
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
13
! Für’sProtokoll:
AnzugebensinddieOriginalmesswerte(eventuelleAusreißerhervorhebenundalssolchebeschriften)sowiedieZeitabhängigkeitskurvefürdieeigeneVerdünnung.AußerdemistdieKurvezuinterpretierenunddieangepassteInkubationszeitanzugeben(inkl.Erklärung,warumbzw.wiedieseangepasstwurde).
Abbildung9Zeitabhängigkeitskurve–nach20MinutentrittmeistschoneineAbflachungderKurveauf,manchmalkanndieAbflachungaberauchbereitsnach15Minutensichtbarwerden
3–Michaelis-Menten-Experiment/KM-WertBestimmung(VariierenderSubstratkonzentration)
é Ziel:
ErmittlungdesKM-WertsdeseigenenEnzyms
DiesesExperimentstelltdas„Herzstück“unseresBeispielsdar.UnterdenzuvorermitteltenBedingungen(eigeneEnzymverdünnungsowieangepassteInkubationszeit)werdennunzurBestimmmungdesKM-WertsAktivitätsassaysmitunterschiedlichenSubstratkonzentrationendurchgeführt.
DabeiwirdvonderursprünglichangegebenenSubstrat-Stockkonzentration(laut„Rezept“–meist5mM)alshöchsterKonzentrationsstufeausgegangenundinäquidistantenSchrittenverdünnt.DazumussnichtunbedingteineeigeneSubstrat-LösungproVerdünnunghergestelltwerden,sondernessollteeinPipettierschemaüberlegtwerden,beidemvonderursprünglichenStocklösungausgegangenwirdunddieeingesetztenVoluminavariiertwerden.
à Beispiel:dieursprünglicheSubstrat-StocklösunghateineKonzentrationvon5mM,d.h.äquidistanteSchrittewären5mM–4mM–3mM–2mM–1mMund0mM(Blindwert).
DavonderSubstrat-Stocklösungimmer100µLeingesetztwerden,kanndiesesVolumenentsprechendderVerdünnungunterschiedlichzusammengesetztwerden–sieheTab.1.
Konzentration 5mM-Stock H2O Gesamtvolumen
5mM 100µL 0µL 100µL4mM 80µL 20µL 100µL3mM 60µL 40µL 100µL2mM 40µL 60µL 100µL1mM 20µL 80µL 100µL0mM 0µL 100µL 100µL
Tabelle1PipettierschemafürMichaelis-Menten-ExperimentamBeispielSubstratstocklsg.5mM
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
14
Wichtigist,dassdasSubstrat-GesamtvolumenimmergleichbleibtunddenursprünglichenAssay-Bedingungen(laut„Rezept“)entspricht,dasonstunterschiedlicheVerdünnungseffekteeintretenunddiegemessenenAbsorptionennichtvergleichbarsind.
NachdemdieMessungenbeidiesenSubstratkonzentrationen(wiederinDoppelbestimmung!)abgeschlossensind,mussunbedingtsofortdieAuswertungerfolgen.Dabeikannessein,dassdergewählteKonzentrationsbereichnichtdengesamtenVerlaufderMichaelis-Menten-Kurveabdeckt.DaswirdausdergraphischenAuswertungschnelldeutlichundsollteunbedingtmitdenTutorenbesprochenwerden.
Dabeikönnen2Fälleeintreten:
1. DieKonzentrationenliegenbereitsimvmax-BereichderKinetik(Plateau),d.h.esmüssenstärkereVerdünnungengemessenwerden,umauchdenAnfangsbereichzuerfassen
2. DieKonzentrationenliegenimextremenAnfangsbereichderKinetik(lineareSteigungohneAbflachung),d.h.esmüssenhöherkonzentrierteSubstrat-Stocklösungenhergestelltwerden,umauchdenEndbereichzuerfassen.
DieweitereVorgangsweisewirdmitdenTutorenbesprochen.FürdieAuswertungsollteninjedemFalldieKinetik-KurveUNDderHanes-Ploterstelltwerden,danurbeideGrafikeninVerbindungeineverlässlicheAussageermöglichen.
BeidiesemExperimentwirktsichaucheineungenaueArbeitsweisestarkaufdieErgebnisseaus.InvielenFällenmussdiegesamteMessungwiederholtwerden,dadieerstenErgebnissezukeinerAussageführen.In99%derFällefälltder2.VersuchdeutlichgenauerausJBittemitdenTutorenabsprechenundnichtwundern,wenndasExperimentwiederholtwerdenmuss.
F Durchführung:
1. SubstratverdünnungenundPipettierschemaüberlegenundmitTutorenabklären(!)
2. AktivitätsassaysunterermitteltenBedingungen(eigeneEnzymverdünnungundangepassteInkubationszeit)mitdiesenVerdünnungendurchführen(inDoppelbestimmung)
3. AbsorptionenbeiangegebenerWellenlängemessen
4. InExceldieDatenauswerten:eineGeschwindigkeitskurveUNDdenHanes-Ploterstellen(sieheunten)
5. ErgebnissemitTutorenbesprechen–eventuellweitereSubstratverdünnungenmessenbzw.gesamtesExperimentwiederholen
à Blindwert:derBlindwertistbeidiesemExperimentdie„0-Substrat-Konzentration“–dieseauchinDoppelbestimmungmessen(genausowiedieanderenAnsätzebehandelnd.h.mit-inkubieren)undfürdieAuswertungvonallenMesswertensubtrahieren.Wichtigistwieder,denBlindwertauch„vonsichselbst“zusubtrahieren,umeinenNullpunktzuerhalten.
! Für’sProtokoll:
AnzugebensinddieOriginalmesswerte(eventuelleAusreißerhervorhebenundalssolchebeschriften)sowiedieMichaelis-Menten-Kurve(=Geschwindigkeitskurve,Substratabhängigkeitskurve)undderHanes-PlotfürdieeigeneVerdünnung.Außerdemistder
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
15
KM-WertinbeidenGrafikeneinzuzeichnenundmittelsHanes-Plotauszurechnen.DabeisollenauchdieKM-WertederGruppenkollegen(selberEnzymextrakt)angegebenwerdenundeventuelleAbweichungenkommentiertwerden.Einheiten(mMbzw.mmol/L)nichtvergessen!
à ACHTUNG:beiderErstellungderGrafiken(undsomitauchfürdieBerechnungdesKM)istdiefinaleSubstratkonzentrationimAnsatzzuverwenden!DieseistnichtidentmitdereingesetztenSubstrat-Stocklösung(z.B.5mM–4mM–usw.)!Esmussberechnetwerden,wiedieSubstratlösungimAnsatzweiterverdünntwurde,z.B.durchZugabevonPufferbzw.Enzymlösung.FürdieMichaelis-Menten-KinetikistdieKonzentrationanSubstratimAnsatz,d.h.währendderReaktion,relevant.SobalddieReaktiondurchZugabevonStopplösungbeendetwird,kanndasEnzymnichtweiterarbeiten–daheristdasStopplösungsvolumenfürdieBerechnungnichteinzubeziehen.Wichtigistlediglich,welcheSubstratkonzentrationdemEnzymwährendderReaktionzurVerfügungsteht.
4–Temperaturabhängigkeitsexperiment/Temperatur-Optimum(VariierenderInkubationstemperatur)é Ziel:
ErmittlungderTemperatur,beiwelcherdiehöchsteEnzymaktivitätvorliegt
NunwirdderParameter„Temperatur“variiert.Dabeisollherausgefundenwerden,wiesichunterschiedlicheInkubationstemperaturenaufdieEnzymaktivitätbzw.dieReaktionsgeschwindigkeitauswirken.
Abbildung10Michaelis-Menten-Kurve
Abbildung11Hanes-Plot
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
16
DabeiistesbesonderswichtigimHinterkopfzubehalten,dassessichbeideruntersuchtenReaktionumeineenzymatischkatalysiertehandelt.Dasbedeutet,dassnebendesthermodynamischenEffekts(höhereTemperaturàhöhereEnergieàchemischeReaktionläuftschnellerab)einegegenläufigesPhänomenauftritt,welchessichumgekehrtauswirkt.BeihohenTemperaturenkommteszurDenaturierungdesEnzyms–dadurchnimmtdieAktivitätimProteinextraktab.
ErmitteltwerdensolldahereinTemperatur-Optimum,beidemdieAktivitätnochpositivbeeinflusstwird,bevorsieaufgrundderkonkurrierendenDenaturierungs-Reaktionbeginntabzunehmen.
WenneszurDenaturierungdesEnzymskommt,wirddiesinFormeinesPräzipitatsimReaktionsröhrchensichtbar.EinsolchesPräzipitatkanndeutlichausfallen,kannabermanchmalauchnurinFormeinerleichtenTrübungderLösungerkennbarsein.DaeineLösung,diePräzipitatenthält,wederverlässlichpipettiertwerdenkann,nochderenAbsorptionreproduzierbargemessenwerdenkann(aufgrundvonStreuung,dieinderKüvettedurchdiePartikelauftritt),mussjedetrübeLösungvorderMessungabzentrifugiertwerden.DazuüberführtmandieMesslösungineinEppendorf-HütchenundzentrifugiertinderEppendorf-Zentrifugefür1Minutebei13200rpm(Tutorfragen!).
DieMessungenerfolgenanhanddesAktivitätsassay-Rezepts,wobeiwiederumdieeigeneVerdünnungunddieselbstermittelteInkubationszeiteingehaltenwerden.DieAuswertungsollgleichanschließendinExceldurchgeführt(sieheunten)undmitdenTutorenbesprochenwerden.
F Durchführung:
1. AktivitätsassaymitdereigenenVerdünnungdurchführenundjeweilsinDoppelbestimmunginkubierenbei:
a. 0°Cbzw.4°C(aufEis,amPlatz)b. Raumtemperatur(amPlatz)c. 37°C(imWasserbad)d. 55°C(imWasserbad)e. 75°C(imWasserbad)
à WICHTIG:Timingüberlegen,daessonsthektischwerdenkann,dieverschiedenenWasserbäderimAugezubehalten!
2. AbsorptionenbeiangegebenerWellenlängemessen(diegestopptenAnsätzekönnenbeiRaumtemperaturaufgehobenundanschließendzusammengemessenwerden)
3. InExceleineTemperaturabhängigkeitskurveerstellen(sieheunten)
4. ErgebnissemitTutorenbesprechen
à Blindwerte:gibtesbeidiesemExperimentverschiedene.Daesbei55°Cund75°CzueinemrelativgroßenEnergieeintragdurchWärmezufuhrkommt,musssichergestelltwerden,dassdiebeobachtbareProduktbildungtatsächlichaufArbeitdesEnzymszurückzuführenist.DieAbspaltungeinerGruppevomSubstratmolekül,dieanschließendzurFärbungführt,kannbereitsdurchdiehoheTemperaturselbstpassieren(thermischerZerfall).
DahermussbeidenbeidenhöchstenTemperaturenein„Substrat-Blank“gemessenwerden,beidemnurdasSubstratfürdieermittelteInkubationszeitinkubiertwird(MengenachAngabeimAktivitätsassay,z.B.100µL).NachAblaufderZeitwirddemBlankgenauwiedenanderenAnsätzenStopplösungzugesetzt.AbschließendmussaberauchnochdieEnzymlösungzugefügtwerden,damitwiederalleLösungenimAnsatzvorhandensind(Gesamtvolumenmussstimmen!).
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
17
FürdieTemperaturenzwischen0°Cund37°Ckannwiederder„0-Minuten“-Blank(z.B.Enzym-Stopplösung-Substrat)verwendetwerden.DaderursprünglicheAktivitätsassayjabei37°C(bzw.RTbeidenreal-timeBeispielen)durchgeführtwurde,kanndavonausgegangenwerden,dassesbeidieserTemperaturnochzukeinerthermischenZerfallsreaktionkommt.
FürdieAuswertungwerdenalleMesswerteumdenjeweiligenBlindwertkorrigiert(d.h.subtrahieren).
à WICHTIG:Esgiltwiederzubeachten,dassEnzymundSubstratbeiverschiedenenTemperaturenaufbewahrtwerden.DieReaktionsollbeiverschiedenenTemperaturenstattfinden.Umeine„Lag-Phase“zuverhindern,müssenbeideLösungenwiedergetrenntvoneinandervorgewärmtwerden.DieVorgangsweisekanngenauwievorhererfolgen,egalbeiwelcherTemperaturgemessenwird.
Vorsichtistallerdingsbei75°Cgeboten,daeshierschonbeieinerInkubationdesEnzymsvonwenigenMinutenzurDenaturierungkommenkann.DahersolltedieVor-Inkubationhiermax.30secbetragen!
! Für’sProtokoll:
AnzugebensinddieOriginalmesswerte(eventuelleAusreißerhervorhebenundalssolchebeschriften)sowiedieTemperaturabhängigkeitskurvefürdieeigeneVerdünnung.AußerdemistdieKurvezuinterpretierenunddasermittelteTemperaturoptimumanzugeben.
Abbildung12Temperaturabhängigkeitskurve–beiEnzymenauspflanzlichenQuellenistmeisteinTemperaturoptimumbei55°Czubeobachten,wobeidieGründedafürunklarsind
SONDERFALLReal-TimeMessungen:
WieinderEinleitungbeschrieben,müssenmancheAktivitätsassays(z.B.Peroxidase)direktimPhotometerdurchgeführtwerden,wobeidieProduktmessungübereinenZeitraumvonzweiMinutenlaufenderfolgt(AbsorptionwirddirektvomGerätalle20secgemessen).Daesnichtmöglichist,dasPhotometeraufverschiedeneTemperaturenzubringenundderAktivitätsassaydahernichtbeiverschiedenenTemperaturendurchgeführtwerdenkann,wirdjenachEnzymeinAlternativexperimentdurchgeführt.GenaueresdazuwirdvondenTutorenerläutert.
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
18
5–Lagerstabilitätsexperiment/Temperatur-Stabilität(VariierenderLagerbedingungen)é Ziel:
ErmittlungdesEinflussesvonLager-Temperaturund-VerdünnungaufdieEnzymstabilität
ZumSchlusswerdenineinemweiterenExperimentverschiedeneEinflussfaktorenderEnzymlagerunguntersucht.DazugehöreneinerseitsdieTemperatursowieandererseitsdieVerdünnung,inwelcherdasEnzymaufbewahrtwird.
Wichtigistzuverstehen,dassbeidiesemExperimenteineunterschiedlicheVorbehandlungdesEnzymsnotwendigist–undzwarsolldasEnzymalleinevorbehandeltwerden,d.h.eserfolgteineArt„VorinkubationohneSubstrat“.ÄhnlicheStudienmüsseninUnternehmendurchgeführtwerden,wennesdarumgehtzuermitteln,unterwelchenBedingungenz.B.reineEnzymextrakteeingelagertbzw.versendetwerdenmüssen.DieseBedingungenvariierenvonExtraktzuExtrakt.NatürlichkönnendieProben,dieindiesemPraktikumverwendetwerden,keinesfallsalsreineEnzymextrakteangesehenwerden,daessichumkomplexeProteinlösungenhandelt.IndiesemZusammenhangistesaberwiederuminteressantzubeobachten,wiesichdieLagerstabilitätverändert,daz.B.Proteasen,die„unser“Enzymabbauen,unterbestimmtenBedingungenaktiversindalsunteranderen.
UmdenEinflussderLagertemperaturzuermittlen,wirdjeweilseinAliquotdesEnzymextraktsbeiverschiedenenTemperaturen(sieheunten)fürmindestens1Stundeeingelagert.DieZeitkannselbstgewähltwerden–esistempfehlenswert,den2.ÜbungstagmitderEinlagerungzubeginnenundinderLagerzeitdasTemperatur-Optimum-Experimentdurchzuführen,damitkeineunnötigeWartezeitentsteht.GenaueresdazuwirdamÜbungstagvondenTutorenerklärt.DiegenaueLagerzeitkanndaherjenachArbeitsgeschwindigkeitderGruppenmitgliedervariieren–wichtigist,dasssie:
• mindestens1Stundebeträgt• undbeiallenGruppenmitgliederngleichist.
D.h.dassderersteStudenteinerGruppe,dermitdenMessungendesLager-Experimentsbeginnt,dieeingelagertenAliquoteallerGruppenmitgliederzusammensammelt.DiegenaueLagerzeitwirdnotiert.InderZwischenzeitzwischen„einsammeln“undbisdieanderenGruppenmitgliederzumessenbeginnen,könnensämtlicheAliquoteaufEisaufbewahrtwerden(wiebeidenanderenExperimenten).DieZeitbiszurMessungistdannirrelevant.
ZurUntersuchungdesVerdünnungs-EffektswirdjedemStudenteneinerGruppe(meistzuviert)eineEnzym-Verdünnungzugeteilt,diedieserherstelltundinAliquotenbeidenjeweiligenTemperatureneinlagert.DieseVerdünnungistnichtidentmitderjenigenVerdünnung,diebeiallenvorigenExperimentenverwendetwurde!Eshandeltsichdabeilediglichumeine„Vor-Verdünnung“.
NachAblaufderLagerzeitmussdieeingelagerteVerdünnungsinnvollweiterverdünntwerden.DabeiwirdvondenTutoreneine„Ziel-Verdünnung“proGruppefestgelegt,beiwelcherletztendlichdieMessungerfolgensoll.Diese„Ziel-Verdünnung“wirdanhanddervorherigenExperimentegewähltundsollteeineAbsorptionvonca.0.5liefern(mitdenTutorenabsprechen!).UmdieVorgangsweisezuverdeutlichen,seieinBeispielangegeben.
à Beispiel:dieZiel-Verdünnungeiner4er-Gruppesoll1:150betragen.DieTutorenlegenfolgendeVor-VerdünnungenfürdieLagerungfest:unverdünnt,1:10,1:50,1:100.JederStudentwählteineVor-Verdünnungundmusssichnunüberlegen,wieeramEndederLagerzeitdieseweiterverdünnenmuss,umaufdieZiel-Verdünnung1:150zukommen(Tab.2).
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
19
Vor-Verdünnung
Ziel-Verdünnung
notwendigerweiterer
Verdünnungs-schritt
Volumenteile
unverdünnt 1:150 1:150 1(unv)+149Puffer1:10 1:150 1:15 1(1:10)+14Puffer
1:50 1:150 1:3 1(1:50)+2Puffer
1:100 1:150 1:1.5 1(1:100)+0.5PufferTabelle2VerdünnungstabellefürdasLager-Experiment(Beispiel)
Umzuberechnen,welchesVolumenderVor-Verdünnungeingelagertwerdenmuss,solltesichjederStudentbereitseineigenesPipettierschemaüberlegen.ProTemperaturmusseinAliquoteingelagertwerden.ProTemperaturerfolgt1MessunginDoppelbestimmung–d.h.eswerden2x100µLEnzymverdünnungbenötigt(Ausnahme:real-timeMessungen!).UmalsoamEndeproTemperatur(d.h.proAliquot)mindestens200µLderZiel-Verdünnungzuerhalten,mussüberlegtwerden,wiedieVor-Verdünnungweiterverdünntwerdenkann.
Z.B.wenndieVor-Verdünnung1:50beträgt,mussdiese1:3weiterverdünntwerden–d.h.ummind.200µLzuerhalten,können100µLderVorverdünnung+200µLPufferpipettiertwerden.DasGesamtvolumenbeträgtdann300µL–alsogenug,umdieDoppelbestimmungdurchzuführen.
DiessollnuralsBeispieldienen–jederStudentsolltesicheineigenesSchemaüberlegen,wiederweitereVerdünnungsschrittdurchgeführtwerdenkann.
à WICHTIG:essolltenniemals<40µLpipettiertwerden(UngenauigkeitderPipetten)!
Weitersgiltzubeachten,dasseswährendderLagerungdesEnzymszurDenaturierungkommenkann(wiezuvorbeschrieben).DabeikanndurchauseinegroßeProteinmengeausfallen–dasPräzipitatmusswiederunbedingtabzentrifugiertwerden(Eppi-Zentrifuge),bevorweitergearbeitetwird.AusdiesemGrundsollteunbedingtmehrVolumenanVor-VerdünnungproTemperatureingelagertwerden,alsfürdenweiterenVerdünnungsschrittbenötigtwird.InunseremBeispielbenötigtderStudent100µLseinerVor-VerdünnungzumWeiterarbeiten–ersolltedaherzurSicherheit300µLeinlagern,umausreichendLösungzurVerfügungzuhaben,wenngroßeProteinmengenpräzipitieren.BitteunbedingtvordemEinlagernmitdenTutorenabklären!
DieMessungenerfolgenanschließendwiederanhanddesursprünglichenAktivitätsassay-Rezepts.DieAuswertungwirdinExceldurchgeführt(sieheunten)undmitdenTutorenbesprochen.
F Durchführung:
1. Ziel-VerdünnungundVor-VerdünnungenmitTutorenbesprechen
2. Vor-Verdünnungwählen,Pipettierschemaüberlegen,notwendigesVolumenproAliquotberechnenundvonTutorenüberprüfenlassen
3. Vor-VerdünnungfüralleAliquotsherstellen,in6EppisaliquotierenundbeifolgendenTemperaturenjeeinEppifürmind.1Stundeeinlagern:
a. -20°C(imGefrierschrank#2)b. 0°Cbzw.4°C(aufEis,amPlatz)c. Raumtemperatur(amPlatz)d. 37°C(imWasserbad)e. 55°C(imWasserbad)f. 75°C(imWasserbad)
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
20
Für’sEinlagernimWasserbadstehenStyropor-SchwimmerzurVerfügung(Tutoren/Thomasfragen).
4. derersteStudent,dermitdemTemperatur-OptimumfertigistunddieLager-Messungbeginnt,holtalleAliquotsderGruppevondenverschiedenenTemperaturenundlagertsiebisallefertigsindaufEis
5. Ziel-VerdünnungproTemperaturanhanddeseigenenPipettierschemasherstellen
6. AktivitätsassayjeweilsinDoppelbestimmungdurchführenundbei37°Cinkubieren(Ausnahme:real-time)
7. AbsorptionenbeiangegebenerWellenlängemessen(diegestopptenAnsätzekönnenbeiRaumtemperaturaufgehobenundanschließendzusammengemessenwerden)
8. InExceleineLagerstabilitätskurveerstellen(sieheunten)
9. ErgebnissemitTutorenbesprechen
à Blindwert:DaderAktivitätsassaywieschonbeimZeitabhängigkeits-undbeimMichaelis-Menten-ExperimentwieimursprünglichenRezeptangegebenbei37°Cdurchgeführtwird(Ausnahme:real-time),musslediglichder„0-Minuten“-Blank(z.B.Enzym-Stopplösung-Substrat)gemessenwerden.Dabeiistesegal,welchedereingelagertenEnzymlösungendafürverwendetwird,daeshierkeinegroßenUnterschiedegibt.Wichtigistaberzubeachten,dassdieverwendeteEnzymverdünnungmitderZiel-Verdünnungübereinstimmt.
! Für’sProtokoll:
AnzugebensinddieOriginalmesswerteallerGruppenmitglieder(eventuelleAusreißerhervorhebenundalssolchebeschriften)sowiedieLagerstabilitätskurvefüralleVor-Verdünnungen(alleGruppenmitglieder–in1Diagramm).AußerdemistdieKurvehinsichtlichderEinflussfaktorenzuinterpretieren.
Abbildung13Lagerstabilitätskurve–beidiesemBeispiellässtsichanhandderKurvekeinsignifikanterEinflussderVerdünnungableiten
SkriptumEnzymkinetik BiochemischeÜbungenI_____________________________________________________________________________________________________
21
ZEITPLAN(ungefähr)fürEnzymkinetik-Beispiel
Zeit(ca.) 1.ÜBUNGSTAG 2.ÜBUNGSTAG
9:30–10:00
9:30–VorbesprechungimSeminarraum(mitProf.Wilson)
9:30–KurzeVorbesprechungimLabor(mitTutoren)
10:00–
11:00
EinlagerungderEnzymverdünnungenfürLagerstabilitätsexperiment
11:00–
12:00HerstellungsämtlicherbenötigterPufferundLösungenundErmittlungderArbeitsverdünnung
Temperaturoptimum-ExperimentErmittlungdesTemperaturoptimums
12:00–
13:00
Lagerstabilitätsexperiment(Messungen)ErmittlungdesEinflussesvonLagertemperaturundVerdünnung
13:00–
14:00
ZeitabhängigkeitsexperimentErmittlungdeslinearenArbeitsbereichs -PAUSE-
14:00–
15:00
Michaelis-Menten-ExperimentErmittlungdesKm-Wertes
Zwischen14:00und16:30–NachbesprechungfürEnzymkinetikundProteinbestimmungimSeminarraum(mitProf.Wilson)
15:00–
16:00
16:00–
17:00