vysokoúčinná kapalinová chromatografie high-performance
TRANSCRIPT
Příprava předmětu byla podpořena
projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie High-Performance Liquid Chromatography
(HPLC)
Kapalinová chromatografie (LC)
1.1. Teorie kapalinové chromatografie
� Difúzní koeficienty jsou v LC o ~5 řádů menší než v GC(~10-5 oproti ~1 cm2/s)
� V důsledku tohoto faktu je molekulární difúzezanedbatelná a na druhé straně roste význam odporuproti přenosu hmoty v mobilní fázi
� Viskozita je pro kapaliny asi 100x vyšší než pro plyny
� Důsledkem je nezbytnost pracovat s vysokými tlaky~20 MPa pro dosažení rozumné průtokové rychlosti
� Snaha po zmenšení nežádoucího efektu pomalého přenosuhmoty v mobilní fázi vede ke zmenšování průměru částicsorbentu, to ovšem přináší nutnost užívání vysokých tlakůna koloně
� Rozšiřování zóny analytu v průběhu postupu kolonou můžebýt ovlivňováno (stejně jako v GC) dvěmi faktory,termodynamickýma kinetickým
� Faktor termodynamický se v LC podílí na rozmývání píkůčasto
Pokud KD a k jsou nezávislé na koncentraci složky, pakvšechny části zóny složky procházejí kolonou stejně rychlea je získán symetrický pík
Pokud ale pracujeme v nelineární oblasti adsorpčníizotermy, pak v případě obvyklého konvexního průběhuizotermy, obdržíme chvostující píky
Retenční(kapacitní) faktor k přitom klesá s rostoucíkoncentrací složky v nástřiku
� Vhodné je pracovat pokud možno v oblasti lineárníizotermy sorbentu
Kvantitativním parametrem je zatížení sorbentu vyjádřenév gramech dávkovaného vzorku na 1g stacionární fáze
Zatížení sorbentu, které vede ke snížení retenčníhofaktoru o 10% je označováno lineární kapacitasorbentu
Lineární oblast bývá do ~10-4 g vzorku na 1 g sorbentu
� Při přetížení kolony je vhodné snížit koncentraci (neboobjem) nastřikovaného vzorku
� V adsorpční chromatografii se stává, že snížení koncentracinevede k odpovídajícímu zlepšení tvaru píku, je tomuvětšinou tehdy, když má sorbent nehomogenní povrch,nese centra s různou aktivitouObvykle je nutno velmi aktivní centra „vysytit“ např. H2O ,izopropanolem apod.
Faktor kinetický v LC popisuje Giddingsova rovnice respektujícívzájemnou závislost vířivé difúze HF a odporu proti přenosuhmoty v mobil. fázi HM :
S
MF
H
H
1
H
1
1H +
+
= (5)
HS je odpor proti přenosu hmoty ve stacionární fázi
V rozepsaném tvaru je vztah (5) pro kapalinovou rozdělovacíchromatografii roven:
2
S
2
f
2
p
m
p
1)(kD
ku d q
u d ω
D
d λ 2
1
1H
++
+
= (6)
kde l, ωωωω, q jsou konstanty závislé na geometrii náplně kolony, Dm
a DS jsou difúzní koeficienty dané složky v mobilní a stacionárnífázi, dp je průměr částic sorbentu, df je síla filmu stacionárnífáze
Pro kapalinovou adsorpční chromatografii a iontově výměnouchromatografii je nutno poslední člen rovnice (6) substituovatvýrazem pro HS :
( )2dS1k
ku t2qH
+= (7)
kde td je čas potřebný k desorpci molekuly daného analytu
Pro gelovou chromatografii se nahradí poslední člen rovnicí:
( )2m
2
p
SM1k
k
D 30
u dH
+= (8)
kde Dm je difúzní koeficient složky v mobilní fázi
V praxi je často možno členy HS a HSM zanedbat
Pro popsání závislosti H versus u se v kapalinovéchromatografii používá i jednoduchý vztah odvozený Snyderem:
au DH = (9)
D je pro jistý chromatografický systém konstanta odpovídající Hpro u=1 cm/s. Konstanta D zahrnuje velikost částic sorbentu,hodnotu difúzního koeficientu atd.
Konstanta a obvykle nabývá hodnot 0.3 - 0.7. Pro pelikulárnínáplně je hodnota a ~ 0.4 a pro porézní a ~ 0.6
Rovnici se dvěma parametry navrhli také Kennedy a Knox provyjádření závislosti redukované výšky patra h na redukovanélineární rychlosti νννν:
ν Cν Ah31+= (10)
h=H/dp a νννν=udp/Dm
A, C jsou konstanty
První člen vztahu (10) reprezentuje vliv turbulentní difúze
Konstanta A má vztah ke kvalitě naplněné kolony, u dobrýchkolon je A < 1Člen C νννν představuje odpor proti přenosu hmoty v mobilníi stacionární fázi, pro konstantu C platí zpravidla C < 0.1
2.1. Technika sloupcové chromatografie
1. Systém otevřený – nízkotlaký
Low(Medium) Pressure Liquid Chromatography
2. Systém uzavřený – vysokotlaký
High Performance Liquid Chromatography
2.1.1. Čerpadla
Zásobník mobilní fáze
Filtrace kapalin – membránové filtry 0.45 µm
Frita 2 µm
Odplynění - helium, vakuum, ultrazvuk
Požadavky kladené na čerpadlo pro analytickou HPLC:
� Konstantní průtok s přesností lepší než 0.5 %
� Bezpulzní provoz
� Průtok regulovatelný v rozsahu od desítek mikrolitrůdo 10 ml/min, správnost a přesnost
� Malý objem hlav => umožní rychlé změny složení kapalin
� Inertnost čerpadla k mobilní fázi – rubín, safír, titan,polymery-teflon, PEEK
� Provozní tlaky do 40 MPa
2.1.1.1. Čerpadla s konstantním průtokem
a) Čerpadla reciprokační
Průtok se nastavuje volbou délky zdvihu nebo frekvence
Objem hlavy čerpadla ~10-100 µl
Výhody: Nepřetržitá dodávka mobilní fáze, snadná změnamobilní fáze
Nevýhoda: Pulzní chod => detektor-šum => dvoupístovéuspořádání, tlumič pulzů
b) Lineární dávkovače
Objem ~ 200 – 500 ml
Výhoda: Konstantní průtok mobilní fáze-bezpulzní čerpadlo =>velmi vhodné pro mikrokolonové aplikace
Nevýhoda: Nutnost plnit zásobník čerpadla, diskontinuálníprovoz, nesnadná změna fází
2.1.1.2. Čerpadla s konstantním tlakem
Pneumatické membránové čerpadlo
Výhody: Vysoké tlaky (kolem 70 MPa), stabilita tlaku, vhodnépro plnění kolon a pro vysoké průtoky-pro preparativníHPLC, nízká cena
Nevýhody: Konstantní tlak-ne průtok! Průtok závisí na viskozitěmobilní fáze
2.1.2. Zařízení pro tvorbu gradientu
• V řadě případů je nutno nahradit izokratickou eluci elucígradientovou
• Gradientová eluce:
� Definovaná změna složení mobilní fáze v průběhu analýzy
� Měnit se může polarita solventu, iontová síla, pH, atd.
� Změny složení mohou být skokové, lineárnínebo nelineární
� Míchání složek mobilní fáze v mixérech-pasivní, aktivní
� Gradienty-binární, ternární, kvartérní
• V současné době se pro HPLC užívají především dva typygradientových systémů:
� 1) Nízkotlaký
� 2) Vysokotlaký
ad 1) Nízkotlaký gradient
ad 2) Vysokotlaký gradient
2.1.3 Nástřik vzorku
• Pro aplikace v HPLC se již nepoužívá technika nástřikustříkačkou přes septum, ani technika nástřiku na kolonuse zastaveným tokem mobilní fázeNástřik stříkačkou má v současnosti význam jenu otevřených systémů
• Téměř výlučně se vzorek nastřikuje pomocí ventilů:(Rheodyne, Valco)
� Nástřik bez zastavení toku mobilní fáze
� Ventily mají vysokou tlakovou odolnost přes 40 MPa
� Chemická odolnost je dobrá, odolnost vzhledemk vysokému pH se může zvýšit volbou materiálů –Vespel; PEEK
� Vysoká reprodukovatelnost nástřiku ~ 0.2%
� Plnění smyčky-úplné, částečné
� Smyčka-interní, externí
2.1.4. Kolony pro HPLC
• Typy HPLC kolon: ID vnitřní průměr
� Kapilární kolony ~ stovky, desítky mikrometrů
� Mikrokolony 1 mm
� “Narrow-bore” kolony 2 mm
� Analytické kolony ~2 mm do ~10 mm
� Semipreparativní kolony~10 mm do ~25 mm
� Preparativní kolony nad 25 mm
• Materiály:
� Nerezová ocel-pasivace povrchu
� Sklo-tvrzené (odolnost do ~20MPa)
� Ti-Zr
� PEEK-nižší odolnost vzhledem ke koncentrovanýmanorganickým kyselinám a THF
∗ Rozměry analytických kolon - trendy
∗ Nekompatibilita kolon a částí
∗ “Cartridge“ systém
∗ Radiální a axiální komprese
∗ Minimalizace mimokolonových objemů, rozmytí (směrodatná odchylka)
∗ Plnění kolon - za sucha vs. “slurry“ metoda