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Hochschule für Angewandte Wissenschaften HamburgFakultät Life Sciences

Automatisierung der Spermien-FISH Diagnostik

Bachelorarbeitim Studiengang Medizintechnik

Vorgelegt von

Jonas Schollmayer1839728

Hamburg17. Juli 2013

Gutachter: Prof. Dr. Jürgen Lorenz (HAW Hamburg)Gutachter: Dr. rer. nat. Sönke Arps (MVZ genteQ GmbH)

Die Abschlussarbeit wurde betreut und erstellt im Labor der FirmaReprogenetics Germany GmbH

Diese Bachelorarbeit widme ich meinen Eltern Ursula Schollmayer und Uwe Schwarz.Eine besondere Widmung geht an meine Oma, Hildegard Schwarz, die mich im beson-deren Maße während meines Studiums unterstützt und motiviert hat.

Ich danke Herrn Prof. Dr. Jürgen Lorenz recht herzlich für die Betreuung und Kor-rektur dieser Arbeit.Ganz besonderer Dank gilt Dr. rer. nat. Sönke Arps für die interessante Aufgabenstel-lung und die Betreuung der Arbeit. Für jede Frage hatte er ein offenes Ohr und einenpassenden Lösungsvorschlag.Bedanken will ich mich auch bei Herrn Prof. Dr. med. Karsten R. Held. Er ermöglichtemir die praktische Arbeit im Labor Reprogenetics Germany GmbH und stellte mir allenötigen Hilfsmittel zu Verfügung.Ein besonderer Dank geht an die Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter des Labores. Auchsie haben mich im besonderen Maße während der Ausführung meiner praktischen Arbeitim Labor unterstützt.Ein weiterer Dankesgruss geht an meinen guten Freund Robert Anders. Er war mireine große Hilfe in Bezug auf das Layout dieser Arbeit.

Inhaltsverzeichnis

I Einleitung 1

1 Automatisierung der Spermien-FISH Diagnostik. 21.1 Zielsetzung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21.2 Relevanz des Themas in der Medizin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21.3 Automatisierung der Spermien-FISH Diagnostik. . . . . . . . . . . . . 31.4 Methodik und Struktur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

II Grundlagen 5

2 Biologie 62.1 Chromosomen. Struktur, Funktion und Darstellung . . . . . . . . . . . 62.2 Auswertung von Chromosomen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82.3 Gametogenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

2.3.1 Spermatogenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92.3.2 Oogenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.4 Fertilisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102.5 Chromosomenaberrationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3 Technik 133.1 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH ) . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.1.1 Vorgang der Hybridisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143.1.2 Art der Sonden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

3.2 Spermien-FISH Diagnostik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163.3 Fluoreszenzfarbstoffe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173.4 Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173.5 Bildverarbeitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

III Praktische Durchführung 21

4 Problemstellung 22

5 Labor Reprogenetics Germany GmbH 23

6 Methoden 246.1 Untersuchungsmaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 246.2 Hardware . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 246.3 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 276.4 Spermienpräparation und Hybridisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . 276.5 Verwendete DNA Sonden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

6.6 Schwellenwertbestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

7 Durchführung 307.1 Vorstellung der Versuchsreihen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

7.1.1 Versuch Nr. 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307.1.2 Versuch Nr. 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307.1.3 Versuch Nr. 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307.1.4 Versuch Nr. 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 317.1.5 Versuch Nr. 5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 317.1.6 Versuch Nr. 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 317.1.7 Beitrag der Versuchsreihen auf das Untersuchungsergebnis . . . 31

7.2 Versuchsreihen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 317.2.1 Versuch Nr. 1, Lymphozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 317.2.2 Versuch Nr. 2, Lymphozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 377.2.3 Versuch Nr. 3, Spermien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 427.2.4 Versuch Nr. 4, Spermien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 497.2.5 Versuch Nr. 5, Spermien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 567.2.6 Versuch Nr. 6, Spermien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

8 Ermittelte Schwellenwerte für die Auswertung 678.1 Auffälliger Befund bei der manuellen Auswertung . . . . . . . . . . . . 678.2 Auffälliger Befund bei der automatisierten Auswertung zu dem Test 13/21 68

8.2.1 Empfehlungen für die automatische Auswertung des Test 13/21 718.3 Auffälliger Befund bei der automatisierten Auswertung zu dem Test 18XY 71

8.3.1 Empfehlungen für die automatische Auswertung des Tests 18XY 72

IV Diskussion 73

9 Eignung des Spotcounters 74

10 Eigenschaften einer geeigneten Probe 75

11 Vergleich der Schwellenwerte 76

12 Überschreitung der Schwellenwerte 7712.1 Vorgehen bei der manuellen Auswertung durch MTA . . . . . . . . . . 7712.2 Vorgehen bei der automatischen Auswertung durch den Spotcounter . . 77

13 Zusammenfassung 78

V Anhang 79

A Tabellen 80

Literaturverzeichnis 81

Teil I.

Einleitung

1

1. Automatisierung der Spermien-FISH Diagnostik.

1.1. Zielsetzung

Untersuchung zur Anwendbarkeit eines automatisierten, lichtmikroskopischen Nach-weisverfahrens für die Detektion und Quantifizierung genetischer Veränderungen anmenschlichen Spermien.

1.2. Relevanz des Themas in der Medizin

Die Reproduktionsmedizin nimmt heute einen wichtigen Stellenwert bei der Behand-lung von einem unerfülltem Kinderwunsch ein. Wichtige Inhalte wie Unfruchtbarkeit,künstliche Befruchtung und Präimplantationsdiagnostik fallen in diesen Bereich.Viele Paare wünschen sich ein Baby. Leider bleibt dieser Wunsch immer häufiger un-erfüllt. Arztpraxen die sich mit dieser Problematik beschäftigen erleben einen großenAnsturm an Patienten, was ein Zeichen für die Präsenz dieses Themas ist. WelcheUrsachen und welche Behandlungsmethoden gibt es?Für eine Unfruchtbarkeit können verschiedene Störungen bei der Frau oder beim Manvorliegen. Häufig ist es bei der Frau eine Unregelmäßigkeit des Ovulationstages (Tag desEisprunges). Dadurch wird es schwer den richtigen Zeitpunkt für den Geschlechtsver-kehr zur Befruchtung der Eizelle durch ein Spermium zu finden. In diesen Fällen liegteine Hormonstörung vor, der durch einer Hormonbehandlung entgegengewirkt werdenkann. Somit kann eine künstliche Befruchtung oft umgangen werden.Liegt der Grund für das Ausbleiben einer Schwangerschaft beim Mann, geht dies ein-her mit der Spermienqualität des Mannes. Um der Spermienqualität auf den Grund zugehen wird zunächst eine Untersuchung angeführt wobei ein Spermiogramm seine An-wendung findet. Hierbei werden Konzentration, Beweglichkeit und Form der Spermiendargestellt. Sind die Spermien zu schwach und zeigen eine Mobilitätsschwäche oderDeformierung auf, werden die Empfängnischancen durch eine künstliche Befruchtungdeutlich erhöht.Neben den oben genannten Ursachen spielen auch genetische Faktoreneine Rolle bei vorliegen eines unerfüllten Kinderwunsches.Die künstliche Befruchtung oder assistierte Reproduktion beschreibt den Eingriff zurHerbeiführung einer Schwangerschaft. Bei der künstlichen Befruchtung erfolgt die Be-fruchtung der Eizelle mit Sperma außerhalb des Körpers. Dabei wird die Methodeder „In-vitro-Fertilisation“ benutzt. Die Befruchtung der Eizelle findet im Reagenzglasstatt. Soll der so erzeugte Embryo in die Gebärmutter implantiert werden, bzw. sind

2

die Keimzellen (Spermium und Eizelle) geeignet für dieses Verfahren? 1

Diese Frage wird in der Präimplantationsdiagnostik geklärt. Es soll vermieden werdendas eine Keimzelle mit Anomalien der Chromosomen für das „In-vitro-Fertilisation“Verfahren genutzt wird. Spermien die eine Anomalie der Chromosomen haben sindnicht für die Befruchtung einer Eizelle geeignet. Es können Erbkrankheiten resultieren.Um schon vorab zu klären, ob beim Mann vermehrt Chromosomenfehlverteilungenin Spermien vorliegen, kann heutzutage eine Untersuchung namens Spermien-FISHeingesetzt werden. Diese Technik zum Nachweis genetischer Veränderungen in Spermienwurde bereits von Verschiedenen Arbeitsgruppen an Normalpersonen und Patientenmit Fertilitätsstörungen beschrieben.23

1.3. Automatisierung der Spermien-FISH Diagnostik.

Mittels moderner Bildbearbeitungsprogramme und dem Einsatz entsprechender Hard-ware können heute auch mikroskopische Anwendungen in zunehmendem Maße auto-matisiert werden.

Im Rahmen der Reproduktionsgenetischen Diagnostik (Fortpflanzungs- bzw Verer-bungsdiagnostik) wird derzeit die sogenannte Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH )an Spermien zur Detektion genetischer Veränderungen in Spermien eingesetzt. Hierbeiwerden Spots (zum Leuchten angeregte Chromosomenabschnitte) vom Laborpersonalper Handzähluhr ausgezählt. Da eine große Anzahl von Spermien pro Patient ausge-wertet werden muss, ist diese Untersuchungsart im Laboralltag besonders zeitintensiv.

In dem Labor Reprogenetics Germany GmbH wird die Untersuchungsmethode Spermien-FISH Diagnostik von medizinisch-technischen Assistentinnen (MTAs) durchgeführt.

Das Thema der Arbeit beschreibt wie die Arbeitsweise dieses diagnostischen Verfahrensmittels eines Spotcounters zu automatisieren ist. Hierbei werden verschiedene Untersu-chungsergebnisse zur Erfüllung dieser Aufgabenstellung angeführt. Ist der Spotcounterim Laboralltag konkurrenzfähig zu ausgebildeten Labormitarbeitern? Wie kann er inHinsicht auf Auswertungszeiten und Richtigkeit der Auswertungsergebnisse bestehen?

1Engel W, Schmid M, Pauer H U: Genetik und mikroassistierte Reproduktion durch intrazytoplasma-tische Spermieninjektion. Dtsch Ärztebl 95:1902-1908(1998)

2Escudero T, Abdelhadi I, Sandalinas M, Munne S: Predictive value of sperm fluorescence in si-tu hybridization analysis on the outcome of preimplantation genetic diagnosis for translocations.FERTILITY AND STERILITY 79:1528-1534(2003)

3Künstliche Befruchtung: http://de.wikipedia.org/wiki/K%C3%BCnstliche_Befruchtung (zu-letzt abgerufen am 15.7.2013)

3

http://de.wikipedia.org/wiki/K%C3%BCnstliche_Befruchtung

1.4. Methodik und Struktur

Diese Bachelorarbeit wurde in die Abschnitte Einleitung, Grundlagen, praktische Durch-führung und Diskussion unterteilt.Der Grundlagenteil führt den Leser durch die biologischen und technischen Grundlagen,welche für das Verständniss der Thematik wichtig sind.Im Teil der praktischen Durchführung sind am Anfang Erläuterungen zur Motivati-on des Themas dieser Arbeit angeführt. Es wird das Arbeitsumfeld und verwendetesMaterial sowie angewandte Methoden beschrieben. Es wird die Versuchsdurchführungerläutert und am Ende Ergebnisse genannt.Im Teil Diskussion werden Vergleiche gemacht und Eigenschaften für die Erfüllung derZielsetzung beschrieben. Ganz am Ende dieses Teiles folgt eine kurze Zusammenfassungworin das Ergebnis in einigen Sätzen umrissen wird.

4

Teil II.

Grundlagen

5

2. Biologie

2.1. Chromosomen. Struktur, Funktion und Darstellung

Menschliche Chromosomen wurden gegen Ende des neunzehnten Jahrhundert erstmalsbeobachtet. Nach der Entdeckung dauerte es noch 70 Jahre bis der menschliche Chro-mosomensatz dargestellt werden konnte. Dabei besteht das Chromatin aus DNA, RNAund Proteinen und ist unter dem Lichtmikroskop in verdichteter Form als Chromo-somen erkennbar. Die Proteingruppe der Histone sind für die strukturelle Organisati-on der Chromosomen verantwortlich. Erst durch diese Proteine, welche an die DNAbinden, kann die chromosomale DNA in eine kompakte Form gebracht werden. DasNukleosom, als Komplex aus DNA und Histonen, bildet den Kern eines jeden Chromo-soms. Um das Nukleosom herum lagert sich die DNA, bestehend aus einem Doppel-strang von Basenpaarungen an. Es werden die Nukleosomen, ummantelt von dem DNADoppelstrang miteinander nach bestimmten Sequenzen verknüpft und es entsteht soder Chromatidfaden. Ein Chromosomen setzt sich dann zusammen aus zwei Chroma-tiden, welche durch das Centromer (Einschnürungsstelle) zusammengehalten werden.Die Chromosomen lassen sich in einen kurzen und einen langen Arm unterteilen (p-und q-Arm).

Seit Mitte des zwanzigsten Jahrhunderts ist die Anzahl der Chromosomen einer mensch-lichen Zelle mit 46 Stück etabliert. Der Chromosomensatz wird häufig in einem Ka-ryogramm dargestellt. In einem Karyogramm werden die Chromosomen in geordneterReihenfolge aufgezeigt. Die Chromosomen werden hierbei unter Gesichtspunkten wieGröße, Bandmuster und Centromerlage sortiert und durchnummeriert. Dabei geben diegrößten Chromosomen den Anfang und alle kleineren werden nachfolgend eingeordnet.Die Centromerlage beschreibt den Mittelpunkt eines Chromosoms und die Bandenmus-ter entstehen durch differenzielle Färbetechniken der Chromosomen. Durch die Ban-denmuster und Centromerlage lassen sich die Chromosomen einfacher identifizieren undsomit sortieren, da die Größe teilweise nur sehr geringfügig voneinander abweicht.4

Aus mikroskopischen Aufnahmen von menschlichen Chromosomen können sogenannteKaryogramme erstellt werden:

4Tariverdian G, Paul M: Genetische Diagnostik in Geburtshilfe und Gynäkologie. Springer Verlag1:2-36 Deutschland 1999.

6

Abbildung 2.1.: Karyogramm einer Frau, Karyotyp 46,XX, Metaphasechromosomen5

Abbildung 2.2.: Karyogramm eines Mannes, Karyotyp 46,XY, Metaphasechromosomen6

Der menschliche Chromosomensatz umfasst insgesammt 23 Chromosomenpaare (diploi-der Chromosomensatz) von denen die homologen Paare 1–22 als Autosomen bezeichnetwerden. In den Karyogrammen ist gut zu erkennen, dass der weibliche Chromosomen-satz zwei X-Chromosomen (Karyotyp 46,XX) und der männliche Chromosomensatz einX- und ein Y-Chromosomen aufweist (Karyotyp 46,XY). Dies sind die Geschlechts-chromosomen, die als Gonosomen bezeichnet werden. Diese Konfiguration liegt mitAusnahme der Keimzellen (Spermien und Eizelle) in nahezu allen Zellen des Körpersvor.

5Quelle: MVZ genteQ GmbH6Quelle: MVZ genteQ GmbH

7

Tabelle 2.1.: Die Chromosomen des MenschenAnzahl Geschlechtsunterschied Einteilung2n = 4644 Autosomen und 2Genosomen

XX bei der FrauXY beim Mann

Nach Länge und Lagedes Zentromers

In Keimzellen (Spermien und Eizelle) ist eine andere Chromosomenzahl zu erwarten.Der Grund dafür liegt darin das bei den Spermien ein haploider Chromosomensatzvorliegt. Haploid bedeutet, dass alle Chromosomen 1–22 einzeln vorliegen plus einemGeschlechtschromosom X oder Y. Der haploide Chromosomensatz hat seine Notwendig-keit im Hinblick auf die Befruchtung einer Eizelle. Die Eizelle zeigt nach der Reifeteilungebenfalls den haploiden Satz auf, so dass eine Befruchtung durch das Spermium wiedereine komplette Zellkonfiguration ergibt. Den Gegenkörper zur haploiden Eizelle nenntman Polkörper, er besitzt das identische Erbgut wie die Eizelle. Was eine Untersuchung,worauf in dieser Arbeit nicht näher eingegangen wird, interessant macht.Die Chromosomen sind Träger der Erbanlagen. Ihre Hauptaufgabe besteht darin, dieInformationen zum Zellbau, gespeichert in Nukleotidsequenzen, korrekt an Tochterzel-len weiterzugeben. Die Weitergabe findet in Form der Reifeteilung (Meiose) oder inForm der Kernteilung (Mitose) statt. Bei der Meiose findet eine Trennung der homolo-gen Chromosomenpaare statt und ein haploider Chromosomensatz entsteht. Dagegenwird bei der mitotischen Teilung das gesamte genetische Informationsmaterial an dieTochterzelle weitergegeben.

2.2. Auswertung von Chromosomen

Nach der Einfärbung der Chromosomen können diese unter dem Lichtmikroskop bei1000-facher Vergrößerung analysiert und fotografiert werden. Durch die Fotoaufnahmenoder Bildverarbeitungssysteme können die Chromosomen dann sortiert werden undbeispielsweise im Karyogramm dargestellt werden.7

2.3. Gametogenese

Die Gameten, Geschlechtszellen, oder auch Keimzellen genannt, entstehen in den Gona-den (Geschlechtsdrüse). Dabei findet die Reduzierung des diploiden Chromosomensat-zes auf den haploiden Chromosomensatz statt. Es ist eine Reduktionsteilung (Meiose).Die Meiose unterteilt sich dabei in die Meiose1 und die Meiose2. Während der Meiose1bilden sich zwei haploide Tochterzellen. In der Meiose2 findet eine weitere Teilung der


8

beiden haploiden Zellen in zwei weitere haploide Zellen statt. So resultieren am Endevier haploide Zellen.Ist die Gametogenese gestört, entstehen abnorme Gameten, die wiederum zu einerabnormalen Entwicklung des Embryos führen können. Abnormale Gameten, mit Chro-mosomenfehlverteilungen, können durch die FISH -Technik aufgespürt werden.8

Abbildung 2.3.: Schema der Gametogenese9

2.3.1. Spermatogenese

Die Entwicklung der männlichen Gameten beginnt mit dem Übergang der primordialenKeimzelle (schon ewig vorhanden) in die Keimdrüse. Nun folgen mitotische Teilungen,


9Strachan T, Read A P: Molekulare Humangenetik. Spektrum Verlag3. Deutschland 2005.

9

dabei wird das gesamte genetische Informationsmaterial an die Tochterzelle weitergege-ben. Es sind wiederholte Vermehrungsphasen, wobei sich die Zellen auf fetale Sperma-togonien teilen. Mit Beginn der Pupertät setzt dann die Reifung der männlichen Keim-zellen ein in Form der Meiose1 und der Meiose2. Aus dem primären Spermatocyten mitdem diploiden Chromosomensatz (2n) entstehen zunächst, während der Meiose1, zweisekundäre Spermatocyten mit jeweils einem haploiden Chromosomensatz (n). Durchdie zweiten Reifeteilung (Meiose2), die prinzipiell einer mitotischen Teilung entspricht,entstehen vier Spermatiden mit jeweils einem haploiden Chromosomensatz (n). DieSpermatiden durchlaufen nun einen komplizierten Differenzierungsprozess, wobei sie inreife Spermien (Spermatozoen) umgewandelt werden.10

2.3.2. Oogenese

Die Entwicklung der weiblichen Gameten ist bis zu der primären Oocyte (2n) analogzur Spermatogenese, allerdings in weiblichen Keimdrüsen, zu verstehen. Während derMeiose1 entstehen eine sekundäre Oocyte (n) und ein erstes Polkörperchen (n). DasPolkörperchen enthält zwar einen haploiden Chromosomensatz, besitzt allerdings nahe-zu kein Zytoplasma und wird in der Regel abgebaut (degeneriert). Aus der sekundärenOocyte entsteht während der Meiose2 ein zweites Polkörperchen (wird degeneriert) undeine reife Eizelle mit dem haploiden Chromosomensatz.11

2.4. Fertilisation

Die Fertilisation (Befruchtung) der Eizelle findet in der Regel in der Tube statt. DasSpermium verschmilzt mit der Eizelle und es entsteht eine Zygote mit einem diploidenChromosomensatz (2n). Die Zygote entwickelt sich durch weitere mitotische Teilungenzu dem Embryo. Das Embryo beschreibt ein Lebewesen in seiner frühesten Form derEntwicklung.12




10

Abbildung 2.4.: Schema der Fertilisierung13

2.5. Chromosomenaberrationen

Es ist davon auszugehen, dass bei mindestens 5,2% aller Befruchtungen der Eizelledurch das Spermium entweder auf der einen oder auf der anderen Seite eine Chromo-somenanomalie vorliegt. Der größte Teil aus diesen Gameten hervorgegangenen Em-bryonen werden spontan abortiert (abgestoßen). Die FISH -Diagnostik kann Chromo-somenaberrationen erkennbar machen und somit Ursachen für einen unerfüllten Kin-derwunsch begründen.

Normalerweise trennen sich die homologen Chromosomen in der Meiose, und die Game-ten enthalten einen haploiden Chromosomensatz mit 23 Chromosomen. Bleiben zweihomologe Chromosomen zusammen und teilen sich eine Keimzelle entstehen aneuploi-de Keimzellen mit 24 oder analog nur 22 Chromosomen. Nach der Befruchtung miteiner normalen Keimzelle ensteht entweder eine Zygote mit einer Trisomie (drei gleicheChromosomen) oder eine Zygote mit einer Monosomie (Chromosom liegt einzeln vor).In diesem Falle liegt eine numerische Chromosomenaberration vor. Diese Chromoso-menfehlverteilung (Non-disjunktion) kann in der Meiose1 oder auch in der Meiose2stattfinden.

13Strachan T, Read A P: Molekulare Humangenetik. Spektrum Verlag3. Deutschland 2005.

11

Abbildung 2.5.: Entstehung einer Aneuploidie durch Non-disjunktion: a. normale Gameto-genese; b. Non-disjunktion in Meiose1, Bildung disomer Gameten; c. Non-disjunktion in Meiose2, Bildung von Gameten mit Disomie bzw Nullisomie14

Findet die Non-disjunktion in der Meiose1 statt, sind beide homologen Chromosomenin der Gamete enthalten. Findet Non-disjunktion jedoch in der Meiose2 statt, dannsind zwei Kopien eines der homologen Chromosomen vorhanden.15

14Tariverdian G, Paul M: Genetische Diagnostik in Geburtshilfe und Gynäkologie. Springer Verlag1:46–46 Deutschland 1999.

15Tariverdian G, Paul M: Genetische Diagnostik in Geburtshilfe und Gynäkologie. Springer Verlag1:45–47 Deutschland 1999.

12

3. Technik

3.1. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)

Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung ist als eine entscheidende Erweiterung der Dar-stellungsmethode Karyogramm im Abschnitt 2.1 zu sehen. Bei diesem Verfahren werdendefinierte Chromosomenabschnitte gezielt mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert.Der Begriff Hybridisierung beschreibt dabei die gezielte Anlagerung der mit lichti-mitierenden Substanzen markierten Sonden an eine bestimmte, zur Diagnostik aus-schlaggebende Stelle eines DNA Stranges (in situ). Dabei ist die Sonde selbst als einTeilstück/Abschnitt eines DNA-Stranges definiert.

Die DNA-Sonden stammen aus DNA-Bibliotheken. Dieser Abschnitt wird durch meistchemische Methoden markiert. Es werden dann markierter DNA-Abschnitt (Sonde)und zu untersuchendes DNA-Material aufgeschmolzen. Dadurch ist es möglich, dass sichdie passenden Basenpaare/Sequenzen aneinanderlagern. Bei diesem Untersuchungsver-fahren lagern sich die markierten DNA-Abschnitte an Metaphasechromosomen und/oderInterphasezellkerne an. Die Anlagerung der Sonden kann also auch an Zellen, die sichnicht in Teilung befinden (Interphasezellkern) erfolgen. Eine Kultivierung über Tage,wie es für die Untersuchung von Metaphasechromosomen erforderlich ist (Darstellungdurch Karyogramm), bleibt hier aus. Da die zu untersuchenden Zellen nicht über Tagekultiviert werden müssen, steht das Untersuchungsergebnis bereits zügig nach Zellent-nahme zu Verfügung. Vornehmlich werden dabei Chromosomen markiert welche beiVeränderungen häufig zu Erbkrankheiten führen. 16

16Schad CR, Kuffel DG, Wyatt WA, Zinsmeister AR, Jenkins RB, Dewald GW, Jalal SM: Applica-tion of fluorescent in situ hybridization with X and Y chromosome specific probes to buccal smearanalysis. Am J Med Genet 66(2):187-192(1996)

13

Abbildung 3.1.: Schema einer in situ Hybridisierung zum DNA Nachweis. Eine DNA Son-de (A) wird mit chemischen Verfahren behandelt und anschließend markiert(B). Sonden- DNA und Ziel- DNA werden zu einzelsträngen aufgeschmolzen(nicht gezeigt), anschließend können sich passende Sequenzen aneinanderla-gern (C). Dadurch entsteht an der entsprechenden Stelle des Präparates einemikroskopisch nachweisbare Markierung.17

3.1.1. Vorgang der Hybridisierung

Die Hybridisierung der DNA- Sonden an den zu untersuchenden DNA- Abschnitt desChromosoms beinhaltet den Vorgang der Denaturierung und Renaturierung der DNA-Doppelhelix. In der DNA- Doppelhelix stehen sich immer zwei Basen gegenüber, siesind gepaart und werden als komplementär bezeichnet. Eine hintereinander angeordne-te Basenabfolge nennt sich Sequenz. Basensequenzen bilden einen DNA- Einzelstrang,sie lagern sich komplementär zueinander an und bilden die Doppelhelix. Bei dem Vor-gang der Hybridisierung wird diese Doppelhelix unter einer Temperatureinwirkung vonmindestens 72 ◦C aufgeschmolzen. In Bezug auf ein FISH -Präparat wird der SondenDoppelstrang und der zu untersuchende Doppelstrang aufgeschmolzen. Während desVorganges der Renaturierung, welcher bei Abkühlung auf 37 ◦C geschieht, lagern sichdie Einzelstränge wieder an. Renaturierung beschreibt dabei die Anlagerung der nichtmarkierten DNA- Einzelstränge. Hybridisierung bezeichnet dagegen die Anlagerungder mit Farbstoff markierten Sonde an einen zu untersuchenden DNA- Abschnitt.

3.1.2. Art der Sonden

Die DNA-Sonden für die FISH -Analyse lassen sich in zwei Gruppen unterteilen.17In situ Hybridisierung: http://de.academic.ru/dic.nsf/dewiki/652139 (zuletzt abgerufen am

7.7.2013)

14

http://de.academic.ru/dic.nsf/dewiki/652139

Zum einen gibt es die centromerspezifischen Sonden. Diese Sonden lagern sich an repe-titiven (sich wiederholenden) DNA-Sequenzen im Centromer eines Chromosomen an.Da im Centromer eines Chromosomen mehrere hunderte Kopien von DNA-Sequenzenvorliegen resultieren bei dieser Art der Markierung meistens deutliche und im Vergleichgroße Spots. Die centromerspezifischen Sonden werden bezüglich auf die angeführtenVersuchsreihen dieser Arbeit bei den Chromosomen X, Y, und 18 eingesetzt.

Die locusspezifischen Sonden stellen die zweite Gruppe dar. Diese Sonden lagern sich andem p- bzw q- Arm eines Chromosomen an. In diesem Bereich liegen keine repititivenDNA-Sequenzen. Es wird ein Gen (Abschnitt einer DNA-Sequenz) markiert. Diese, somarkierten Chromosomen, zeigen im Vergleich kleinere Spots auf. Die locusspezifischenSonden, werden bezüglich auf die angeführten Versuchsreihen dieser Arbeit, bei denChromosomen 13 und 21 eingesetzt.

Abbildung 3.2.: Sonden an Interphasezellkern, grüne Spots sind Centromersonden (groß), roteSpots sind locusspezifische Sonden (klein)18

18Quelle: MVZ genteQ GmbH

15

Abbildung 3.3.: Sonden an Metaphasechromosomen, grüne Spots sind Centromersonden(groß), rote Spots sind locusspezifische Sonden (klein)19

3.2. Spermien-FISH Diagnostik

Seit langem ist bekannt, dass die Wahrscheinlichkeit einer Fehlverteilung der Chromo-somen mit dem Alter einer Frau zunimmt. Hierdurch resultieren eine Verminderungder Fruchtbarkeit und die Erhöhung der Gefahr einer Fehlgeburt. Der gleiche Altersef-fekt konnte bei Männern bis zu einem Alter von 50 Jahren bisher nicht nachgewiesenwerden. Aber häufig sind auch Chromosomenfehlverteilungen in Spermien Ursache füreinen unerfüllten Kinderwunsch. So eine Fehlverteilung ist in Zusammenhang mit einereingeschränkten Samenqualität, am häufigsten bei einer Azoospermie (keine Samenzel-len im Ejakulat) oder Kryptozoospermie (stark verminderte Anzahl von Samenzellenim Ejakulat), zu finden. Ist die Anzahl Spermien stark verringert (unter 3Mio/ml), oderweist ein hoher Anteil der Spermien Fehlformen auf (Anteil normal geformter Spermi-en<3%) liegen vermehrt Fehlverteilungen vor. Männer mit normaler Spermienqualitäthaben im Durchschnitt einen Anteil von Chromosomenfehlverteilungen von 5–7%. BeiMännern mit genannten Einschränkungen der Samenqualität liegen Chromosomenfehl-verteilungen im Bereich von 30% und häufig auch höher vor. Es resultiert hieraus eineEinschränkung der Befruchtungsrate einer Eizelle, eine erhöhte Abortrate und die Ratean lebend geborenen Kindern mit Chromosomenaberrationen.Die Spermien-FISH -Diagnostik dient dazu diese Chromosomenfehlverteilungen in Sper-mien nachzuweisen, die Chancen einer künstlichen Befruchtung abzuschätzen oder die19Quelle: MVZ genteQ GmbH

16

Gründe für eine vorher erfolglose Behandlung zu klären. Häufig liegt die Ursache hier-für, wie genannt, in einem verminderten Aufkommen von Samenzellen im Ejakulat. Esgibt aber auch typische Fehlverteilungen, wobei das Chromosomenmaterial zum Bei-spiel vertauscht vorliegt (Translokation) oder es gibt sogar den kompletten Abbruchvon Chromosomenanteilen. Diese Männer sind Träger einer balancierten Chromoso-menstrukturabberation (Abschnitt Chromosomenaberrationen). Hierdurch kann es zueiner eingeschränkten Befruchtungsrate oder auch zu einem unerfüllten Kinderwunschkommen, welches Gründe für eine Spermien-FISH Diagnostik sind.Voraussetzung für eine erfolgreiche Spermien-FISH Diagnostik ist das Vorhandenseineiner ausreichenden Spermienanzahl (Spermienkonzentration >0,8 Mio/ml bei norma-ler Ejakulatmenge von 2 bis 3 ml) oder die Diagnostik aus mehreren gepoolten Eja-kulaten. Diese Untersuchung kann als Kombination mit einer Polkörperdiagnostik ein-hergehen, sowie auch als alleiniges Verfahren durchgeführt werden.20

3.3. Fluoreszenzfarbstoffe

Die Fluoreszenzfarbstoffe repräsentieren die leuchtenden Spots eines mit DNA-Sondenmarkierten Chromosoms. Sie lassen sich mikroskopisch sichtbar machen, indem mansie mit Licht einer entsprechenden Wellenlänge anregt (Erregerlicht). Nun strahlt derFarbstoff Fluoreszenz Licht ab (emittiertes Licht), welches sich mit geeigneten Lichtfil-tern eines Fluoreszenzmikroskopes (siehe Abschnitt Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie)sichtbar machen läßt. 21

3.4. Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie

Die Fluoreszenzmikroskopie beruht auf dem Prinzip, dass ein Elektron im Fluores-zenzfarbstoff durch ein Photon des Erregerlichtes in ein höher gelegenes Energieniveauangehoben wird. Das neue Energieniveau des Elektrons ist instabil und kehrt deswe-gen bald in seinen Ursprungsort zurück, wobei Energie wieder abgegeben wird. DieseEnergie wird in Form von emittiertem Licht (Fluoreszenz) abgestrahlt. Das emittierteLicht hat immer eine längere Wellenlänge als das Anregungslicht.Das Fluoreszenzmikroskop hat eine Höchstdruck-Quecksilberlampe, hier wird das be-nötigte Licht abgestrahlt. Durch den Anregungsfilter im Mikroskop wird die geeigneteWellenlänge für den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff eingestellt. Das Licht der gewählten20Spermien FISH-Analyse: http://www.reprogenetics-hh.de/pages/sperm-FISH.html (Zuletzt

abgerufen am 7.7.2013)21Leitch A R,Schwarzacher T, Jackson D,Leitch I J: In situ-Hybridisierung.Scientific Publisher Limi-

ted. England 1994.

17

http://www.reprogenetics-hh.de/pages/sperm-FISH.html

Wellenlänge wird durch die Objektivlinse auf das Präparat fokussiert. Das emittierteLicht fällt dann durch einen Langwellen-Sperrfilter, der nur für Licht oberhalb einer be-stimmten Grenze durchlässig ist. Zwischen dem Anregungsfilter und dem Sperrfilter istein weiterer wichtiger Bestandteil des Mikroskops der Teilerspiegel. Er ist in einemWin-kel von 45◦ zwischen Anregungsfilter und Präparat angebracht. Er reflektiert das kurz-wellige Anregungslicht auf das Präparat und lässt das langwellige abgestrahlte Licht zudem Sperrfilter passieren. Somit erfüllt der Teilerspiegel in der Fluoreszenzmikroskopieeine wichtige Rolle, da er die Anordnung von Anregungsfilter und Sperrfilter in ver-schiedenen Strahlengängen über dem Objekt erlaubt. Nach dem Langwellen-Sperrfilterfällt das emittierte Licht auf das Okular, es ist Teil des optischen Systems wodurchdem Benutzer erlaubt wird das Objekt zu betrachten.22

Abbildung 3.4.: Schema der Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie23

22Leitch A R,Schwarzacher T, Jackson D,Leitch I J: In situ-Hybridisierung.Scientific Publisher Limi-ted. England 1994.

23Quelle: Leitch A R,Schwarzacher T, Jackson D, Leitch I J: In situ-Hybridisierung. Scientific Pu-blisher Limited. England 1994.

18

Abbildung 3.5.: Auflichtfluoreszenzmikroskop Olympus BX6124

3.5. Bildverarbeitung

Das Fotokamerasystem, welches am oberen Ende (Tubus) des Auflicht-Mikroskops sitztund der Kamera erlaubt, wie auch dem Benutzer, das Objekt zu betrachten macht Auf-nahmen von den Fluoreszenzpräparaten. Dadurch wird eine digitale Bildaufzeichnungmöglich.

Die Bildverarbeitung erlaubt es optische Schnitte durch ein Präparat zu legen undInformationen, die nicht aus der Fokusebene stammen auszublenden. Kontrast undHelligkeit lassen sich verändern und Falschfarben helfen den Kontrast der zu betrach-tenden Objekte stark zu erhöhen. Wenn die Größe der FISH -Signale ermittelt wurdekann man diese im gewissem Umfang quantitativ auswerten. So findet die digitaleBildverarbeitung ein besonderes Einsatzgebiet in der farblichen Darstellung von Chro-mosomen und bei Nachweisen von FISH -Sonden.25

24Quelle: Broschüre: Olympus, Your Vision, Our Future25Leitch A R,Schwarzacher T, Jackson D,Leitch I J: In situ-Hybridisierung.Scientific Publisher Limi-

ted. England 1994.

19

Abbildung 3.6.: Spotaufnahme von Spermien mit den markierten Chromosomen 13 (grün)und 21(rot) (locusspezifische Sonden)26

Abbildung 3.7.: Spotaufnahme von Spermien mit den markierten Chromosomen 18(aqua)sowie X(grün) und Y(rot) (centromerspezifische Sonden)27

26Quelle: MVZ genteQ GmbH27Quelle: MVZ genteQ GmbH

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Teil III.

Praktische Durchführung

21

4. Problemstellung

In dem Labor Reprogenetics Germany GmbH (siehe nächster Abschnitt) wird die Sper-mien FISH -Diagnostik von medizinisch-technischen Assistentinnen (MTAs) durchge-führt. Diese Arbeit ist laborintensiv im Hinblick auf Personaleinteilung und Zeitauf-wand der Analyse. Während der FISH -Analyse müssen täglich eine hohe Anzahl anPräparaten ausgewertet werden. Ein Großteil dieser Arbeit ist charakterisiert durchquantitative Auswertungen der Spots eines jeden Präparates.Ist es möglich diese Arbeit mit einem automatischen Fluoreszenzmikroskop und einemBildverarbeitungssytemes zu unterstützen?

22

5. Labor Reprogenetics Germany GmbH

Seit 2002 ist das in Hamburg ansässige Medizinische Versorgungszentrum MVZ gen-teQ GmbH unter der ärztlichen Leitung von Prof. Dr. med. Karsten Held auf demGebiet der humangenetischen Labordiagnostik und Beratung tätig (www.genteq.de).Das Labor beschäftigt Ärzte, Naturwissenschaftler sowie spezialisiertes technisches Per-sonal und bietet ein breites Spektrum an molekular- und cytogenetischen Laborleis-tungen für die prä- und postnatale Medizin an. Zur Verwirklichung eines Konzeptesfür spezielle Fragestellungen in der Reproduktionsgenetik, welches den spezifischen,durch das Embryonen-Schutzgesetz vorgegebenen deutschen Bedürfnissen entsprichtwurde seitens Prof. Held das Labor Reprogenetics Germany GmbH als eine deutsch-amerikanische Kooperation gegründet.Die bei Reprogenetics Germany GmbH durchgeführte Labordiagnostik wird in en-ger Kooperation mit reproduktionsmedizinischen Arztpraxen („Kinderwunschzentren“)durchgeführt und umfasst genetische Untersuchungen von Polkörpern sowie Spermienmittels der Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung bzw. mittels Mikroarrays (Array-CGH).Reprogenetics Germany GmbH beschäftigt derzeit vier medizinisch-technische Assis-tentinnen (MTAs) sowie eine Biologin.Die Laboreinheit umfasst insgesamt vier Räume. Ein Laborraum dient der Aufarbei-tung der Proben, dem Ansatz der für die Untersuchungen erforderlichen Reagenzienund Lösungen sowie der Herstellung der Untersuchungspräparate, in einem zweiten La-borraum wird die Array-CGH durchgeführt. Ein verdunkelbarer Raum beherbergt diefür die Auswertung der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung erforderlichen Mikroskopesowie den Spotcounter. Darüber hinaus gibt es ein Büroraum mit Schreibplätzen fürPCs und Drucker. Das Labor stellte alle Präparate und Hilfsmittel, welche zur Validie-rungsstudie der automatisierten Auswertung der sog. Sperm-FISH Analyse notwendigwaren zur Verfügung. Die im Rahmen der Studie eingesetzte Hard- und Software istim Folgenden beschrieben.

23

6. Methoden

6.1. Untersuchungsmaterial

Das Untersuchungsmaterial bestand aus Lymphozyten- und Spermienproben. Die Lym-phozytenproben wurden aus dem peripheren Blut gewonnenen. Als Ausgangsmaterialwerden circa 2-5 ml Blut benötigt, dieses Blut wird dem Patienten venös abgenommem.Die Chromosomenpräparation erfolgte nach Kurzzeitkultivierung in einem Nährmedi-um (circa 72 Stunden bei 37 ◦C). Sie besteht aus Zentrifugation, gefolgt von einer hypo-tonen Behandlung und Fixierung in Methanol/Eisessig. Dannach können die fixiertenZellen in eine Pipette aufgenommen werden und auf einen Objekträger aufgebrachtwerden. Nach dem Färben des Präparates wird der Objekträger unter einem Deckglaseingedeckt und steht anschließend für die mikroskopische Analyse zur Verfügung. DieSpermienproben sind beschrieben durch das Ejakulat (Sperma) des Mannes. Es setztsich zusammen aus Spermien, Epithelzellen der Hodenkanälchen und einer Sekretflüs-sigkeit. Für die Untersuchung wird Ejakulat benötigt welches Spermien enthält, da dieSpermien die zu untersuchenden Chromosomen enthalten. Es werden ebenfalls gering-fügige Mengen von 2-5ml benötigt. Für die Präparation der Spermien ist keine vorherigekultivierung erforderlich. Die Fixierung erfolgt direkt nach der hypotonen Behandlung.Das Untersuchungsmaterial stammte jeweils aus einem Patientenkollektiv des LaborsReprogenetics Germany GmbH. Es war Material aus Routineuntersuchungen. Es wur-den für die ersten beiden Versuchsreihen Lymphozytenpräparate angefertigt, die beider manuellen Auswertung durch MTA als unauffällig analysiert wurden. Die Spermi-enpräparate stammten von einem Patientenkollektiv, das wegen Fertilisationsstörungenuntersucht wurde.

6.2. Hardware

Der Spotcounter

24

Abbildung 6.1.: Spotcounter28

Der Spotcounter ist von der Firma Applied Imaging (AI ), die 2012 von der FirmaLeica übernommen wurde. AI bietet zu verschiedenen Untersuchungen Lösungen imBereich der Bilddiagnostik an. Der Spotcounter setzt sich zusammen aus der Hardware,bestehend aus:

• Mikroskop BX61 mit Auflichtfluoreszenz- Einrichtung (Firma Olympus)

• Höchstdruck Queksilberdampflampe 100W (Firma Osram)

• vollautomatischem, motorisiertem Kreuztisch (Firma Prior)

• Videokamera

• PC mit Software Cytovision (Firma Applied Imaging)

28Quelle: MVZ genteQ GmbH

25

Abbildung 6.2.: Einheit BX61, Olympus29

Der Spotcounter besitzt einen vollautomatischen Objektträgertisch. Am oberen Endeist er mit einer Kamera ausgestattet, welche Fotos von den aufzunehmenden Objek-ten aufnimmt. Diese Fotos werden auf dem Computerbildschirm dargestellt und vonder Software (beschrieben im nächsten Abschnitt) ausgewertet. Der Grundaufbau ent-spricht einem Auflichtmikroskop, dabei wird das beobachtete Objekt nicht durchstrahltsondern nur das Objektiv beleuchtet. Die Arbeitsweise des Spotcounters stellt sich wiefolgt dar:

Das zu untersuchenden Präparat ist mit fluoreszierenden Stoffen markiert. Diese Stoffewerden mit Licht einer bestimmten Wellenlänge zum Leuchten angeregt. Hierzu besitztdas Mikroskop einen Anregungsfilter, welcher nur diese Lichtanteile hindurchlässt. Bes-tenfalls wird nur das abgestrahlte Licht durch den Sperrfilter dargestellt. Man sieht alsoein Schwarzbild, in dem nur die leuchtenden Stoffe als sogenannte Spots zu sehen sind.

29Quelle: Bedienungsanleitung Olympus BX61

26

Abbildung 6.3.: Spotaufnahme. Spermium mit centromerspezifischen Sonden für Chromoso-men X (grün) und 18 (aqua). Gelbe Umrandung bezeichnet die Objektbe-grenzung (siehe folgenden Text). Die Ziffern bezeichnen die Anzahl der de-tektierten Signale der entsprechenden Farbe.30

6.3. Software

AI Spot-Scan & Analysis ist ein automatisches Aufzählungsverfahren. Berücksichtigtwerden FISH -Sonden, die unter Zuhilfenahme differenzierter Algorithmen ausgezähltund einsortiert werden. Die Zellen, welche die mit FISH -Sonden markierten Chromo-somen beherbergen, werden auf der Grundlage ihrer Signalmuster sortiert und in einerGalerie für die Überprüfung einsortiert. ASI Spot-Scan & Analysis, ermöglicht durchverschiedene Einstellungsparameter, Ungleichmäßigkeiten der Beleuchtung und Hinter-grundrauschen herauszufiltern.31

6.4. Spermienpräparation und Hybridisierung

Für die Spermienpräparation, ebenso wie für die Lymphozytenpräparation, werdengeringe Mengen des entsprechenden Materials benötigt. Das fixierte Zellmaterial wird30Quelle: MVZ genteQ GmbH31ASI Automatic Spot Counting http://www.spectral-imaging.com/applications/

cytogenetics/automated-fish-scanning-research/automatic-spot-counting2 (Zuletztabgerufen am 9.7.2013)

27

http://www.spectral-imaging.com/applications/cytogenetics/automated-fish-scanning-research/automatic-spot-counting2


mittels einer Pipette auf einen Objektträger, in einen vorher markierten Bereich, aufge-tropft. Anschließend werden die DNA- Sonden ebenfalls in diesem Bereich aufgebracht.Diese Vorbereitung der Präparate findet jeweils am Abend statt, da die Präparate da-nach über Nacht in den so genannten Hybride kommen. In diesem Gerät findet dann dieDenaturierung, Hybridisierung und anschließende Renaturierung des Untersuchungs-materiales mit den Sonden statt (siehe Abschnitt 3.1.1. Vorgang der Hybridisierung).Die Präparate werden für fünf Minuten bis auf 72 ◦C aufgeheizt (Denaturierung derDNA), anschließend erfolgt eine Inkubation bei 37 ◦C über Nacht (Hybridisierung derSonde). Am Morgen werden die Präparate dann gewaschen. Dabei werden die Objekt-träger nacheinander in Küvetten mit einer definierten Salzlösung bei 72 ◦C beziehungs-weise bei Raumtemeratur für jeweils zwei Minuten eingestellt um nicht hybridisiertesSondenmaterial von dem Objektträger zu entfernen.

6.5. Verwendete DNA Sonden

Das Multicolor DNA-Proben-Kit CEP 18/X/Y & LSI 13/21 wird für die FISH -Untersuchungen im Labor Reprogenetics Germany GmbH verwendet.

Abbildung 6.4.: Die CEP 18/X/Y & LSI 13/21 -Sonden32

Der centromerspezifische (CEP) Sondenmix markiert die Centromere der Chromoso-men X (grün), y (rot) und 18 (aqua). Der locusspezifische (LSI ) Sondenmix markiert32Aneuvision Multicolor DNA Probenmix: http://www.abbottmolecular.com/us/products/

genetics/fish/prenatal-genetics-testing-aneuvysion.html (Zuletzt abgerufen am7.7.2013)

28

http://www.abbottmolecular.com/us/products/genetics/fish/prenatal-genetics-testing-aneuvysion.html


Zielregionen an langen Armen der Chromosomen 13 (grün) und 21 (rot).

6.6. Schwellenwertbestimmung

Der Schwellenwert ist als Richtwert anzusehen, ab dem eine Nachkontrolle einer Sper-mienprobe nötig wird. Dabei überschreitet die Anzahl gezählter Spermien mit Chromo-somenfehlverteilungen diesen Wert. Er ist beschrieben durch die Standardabweichung.Diese beschreibt die Streuung von Stichprobenwerten um ihren Mittelwert. Hierbei giltn = Anzahl der Stichproben und i = Laufvariable.

• Zunächst wird also die Berechnung des Mittelwertes einer Auswertungsreihe nö-tig:

x = x1 + x2 + . . .+ xn

n= 1n

·n∑

i=1xi (6.1)

• Alle Stichprobenwerte werden nun einzelnd zu x2i quadriert und ebenfalls auf-

summiert.

• Nun kann die Formel zur Standardabweichung mit Werten gefüllt werden:

s2 = 1n− 1

[n∑

i=1x2

i − n · x2]

(6.2)

• Um die maximal zulässige Abweichung in Prozent zu erhalten wird der letzteRechenschritt durchgeführt:

(x+ s)Anzahl ausgewerteter Spermien · 100 = Abweichung in % (6.3)

• Beispiel:

x = 24, 15

x2i = 16477

s =√

118 · (16477 − 19 · (24, 15)2) = ±17, 31

Abweichung in % = 24, 15 + 17, 312000 · 100 = 2, 05%

29

7. Durchführung

7.1. Vorstellung der Versuchsreihen

Eine Versuchsreihe (Versuch Nr. 1–6), die hier nur kurz dargestellt wird, liefert die Er-gebnisse worauf diese Abschlussarbeit aufbaut. Für jede Versuchsdurchführung warenverschiedene Präparate sowie der Spotcounter notwendig. Im Abschnitt (7.2. Versuchs-reihen) wird jeder Versuch vorgestellt, die Durchführung beschrieben und das Ergebnispräsentiert. Versuch Nr. 1 und Nr. 2 liefern erste wichtige Ergebnisse zur Auswertungund Einstellungen des Spotcounters (Software). Das Endergebnis dieser Arbeit beziehtsich ausschließlich auf die nachfolgenden Versuchsreihen der Spermien.

7.1.1. Versuch Nr. 1

Versuch Nr. 1 beinhaltet zehn Lymphozytenproben im Hinblick auf eine Chromoso-menfehlverteilung der Geschlechtschromosomen. Hier wurden manuelle Auswertungendurch medizinisch technische Assistenten (MTA) mit Spotcounterauswertungen in Hin-sicht auf Praktikabilität des Spotcounters verglichen. Durch eine manuelle Nachkon-trolle der Spotcounteraufnahmen und durch Optimierung der Softwareeinstellungenwurde versucht mit den erzielten MTA Ergebnissen plausible Übereinstimmungen zufinden.


Sechs Lymphozytenproben wurden auf eine Chromosomenfehlverteilung der Geschlechts-chromosomen untersucht. Diese Präparate wurden in verschiedenen Mischungsverhält-nissen bezüglich der Geschlechtschromosomenverteilung durch MTAs angefertigt. Eswurde erneut die manuelle Auswertung mit der Spotcounterauswertung verglichen. Eswerden Auswertungszeiten von den MTAs mit den Auswertungszeiten des Spotcounterverglichen. Es wurden zwei verschiedene Objektive (Vergrößerungsstufen der Objekte)geprüft.


Fünf Spermien-Probenvergleiche bezüglich der Chromosomenverteilung 13/21 und 18XY.Manuelle Auswertung durch MTA wird mit Spotcounter Auswertung unter Betrach-tung der Auswertungszeiten und des gewählten Objektives verglichen.

30


Zehn Spermienproben bezüglich der Chromosomenverteilung 13/21 und 18XY. Bei die-sen Proben wurde die Anzahl der Auszuwertenden Spermien stark erhöht; und derEinfluss durch diese Erhöhung auf das Untersuchungsergebnis betrachtet.


Zehn Spermien-Probenläufe bezüglich der Chromosomenverteilung 13/21. Mit einer ho-hen Anzahl auszuwertenden Spermien. Alle Probenläufe werden durch den Spotcountermit der manuellen Auswertung durch MTAs bezüglich Chromosomenfehlverteilungenverglichen.


Fünf Spermienproben bezüglich der Auswertungsmethode 13/21. Hierbei wurde dieAnzahl der auszuwertenden Spermien noch einmal stark erhöht und die Auswirkungenauf das Untersuchungsergebnis betrachtet. Die hierbei gewonnenen Daten lieferten aucheinen wichtigen Beitrag zum abschließenden Untersuchungsergebnis.

7.1.7. Beitrag der Versuchsreihen auf das Untersuchungsergebnis

Durch die Ergebnisse aus 20 Proben für Gruppe 500 auszuwertender Spermien und 20Proben für Gruppe 2000 Spermien und 10 Proben für Gruppe 4000 Spermien liefertdiese Abschlussarbeit prozentuale Ergebnisse mit welchen der Spotcounter in der Praxiszur Spermien FISH Analyse eingesetzt werden kann. Es sind Richtwerte, welche beiÜberschreitung eine manuelle Nachkontrolle eines Präparates erfordern.

7.2. Versuchsreihen

7.2.1. Versuch Nr. 1, Lymphozyten

Um die Grundeinstellungen des Gerätes zu gewinnen wurden bei diesem Versuch zehnLymphozytenproben ausgewertet. Lymphozyten sind Bestandteil des Blutes. In diesemVersuch werden die Geschlechtschromosomen (XX für Frau; XY für Man) durch dieSonden markiert. Das Y- Chromosom erscheint im Schwarzbild als roter Spot und dasX- Chromosom als grüner Spot. Die Lymphozytenzelle wird in Dapi eingefärbt underscheint im Schwarzbild als bläulich abgegrenzte Struktur. Ein unauffälliges Ergebniswäre somit eine „blaue“ Zelle, worin sich entweder ein rotes und ein grünes Signal oderzwei grüne Signale befinden.

31

Dieser Test (XX;XY) zielt darauf ab Chromosomenanomalien der Geschlechtschromo-somen aufzuspüren. Solche Anomalien (Abweichungen) sind bezeichnet durch Chromo-somenaberrationen. Hierzu zählt zum einen eine numerische Veränderung der Chromo-somen und zum anderen eine strukturelle Veränderung der Chromosomen. Bei einernummerischen Veränderung liegt zum Beispiel eine Verdoppelung der Geschlechtschro-mosomen vor, dieser pathologische Befund entspricht im Auswertungsbild einer Ver-dopplung der Spots. Strukturelle Veränderung der Geschlechtschromosomen nennensich Inversion, Deletion und Translokation. Bei der Inversion ist ein Abschnitt einesChromosomen um 180◦ gedreht. Das Chromosom ist somit zerbrochen und umgekehrtan der Bruchstelle aneinandergefügt. Wäre diese Bruchstelle mit einer Sonde mar-kiert, entstehen aus einem Spot zwei Spots. Eine Deletation beschreibt die Löschungeines Teilstückes oder sogar eines gesamten Chromosoms. Der Verlust von genetischemMaterial könnte sich in der Spot Analyse Beispielsweise durch Fehlen einzelner Spotsbemerkbar machen. Die Translokation beschreibt eine Ortsveränderung eines ganzenChromosoms oder eines Teilabschnittes innerhalb des Chromosomenbestandes. DieserGendefekt bleibt bei der FISH -Analyse möglicherweise unentdeckt, da alle Bestand-teile eines Chromosomensatzes vorhanden sind und auch markiert werden. An welcherStelle der Spot erscheint, evtl angelagert an ein anderes Chromosomen, ist bei dieserUntersuchung nicht unbedingt ersichtlich.Sofern eine der beschriebenen Chromosomenanomalien in den Keimzellen (Spermiumoder Eizelle) vorliegt kann es zu einem Ausbleiben der Befruchtung oder ggf einemAbort oder der Geburt eines Kindes mit Fehlbildungen führen.Der FISH -Test (XX;XY) dient als Nachweis für Fehlverteilungen der Gonosomen diezu Chromosomenerberkrankungen führen. Zu diesen Erkrankungen zählen das TurnerSyndrom und das Klinefelter Syndrom. Bei dem Turner Syndrom, auch Monosomie X-Syndrom genannt, gibt es in jedem Chromosomensatz nur ein X- Chromosom. Es han-delt sich deswegen um eine nummerische Chromosomenaberration. Dann ist die Konfi-guration einer Frau 45,X. Phänotypisch sind betroffene Personen eher kleinwüchsig mitgedrungenem Hals und häufig tritt eine Unfruchtbarkeit auf. Das Klinefelter Syndrom,auch eine nummerische Chromosomenaberration, betrifft den Mann. Bei diesem Syn-drom liegt ein weiteres X- Chromosomen in der Gesammtkonfiguration vor. Somit istdie Verteilung 47XXY. Diese Männer sind phänotypisch schlank und groß und häufigunfruchtbar. 33

Auch wird der Test (XX;XY) als Nachkontrolle bei einer Knochenmarkstransplantationbenutzt, sofern ein gegengeschlechtlicher Spender vorliegt. Bei dieser Behandlung wirdbeispielsweise einem Mann das Knochenmark einer Frau transplantiert. Im Knochen-33Passarge E, Wirth J: Taschenatlas der Genetik. Thieme2. Deutschland 2003.

32

mark werden neue Blutzellen gebildet. Somit müsste ein Mann, bei dem die Therapieanspricht, nach gewisser Zeit einen weiblichen Chromosomensatz im Blut aufzeigen.Diese drei angeführten Beispiele sind eine Indikation warum der Test (XX;XY) in derLaborroutine gemacht wird.Zur Veranschaulichung der Auswertungsergebnisse dieses Versuches wird diese Tabelleangeführt.

Tabelle 7.1.: Vergleich manuelle- zu Spotcounterauswertung von zehn Lymphozytenproben,Auswertung von XY-Chromosomen

Probe Fall Qualität∑

Zellen Uninfor-mativeGruppe

andereGruppe

Autoin XY-Gruppe

nachman.Korrek-tur inXY

Nr. 134 Spotcountermanuell

L09-347 - 302206

32 52 218 (71%)206 (100%)

263 (86%)


L09-280 + 232200

19 28 185 (80%)200 (100%)

206 (89%)


L09-666 ++ 148200

19 7 122 (82%)200 (100%)

122 (82%)


L09-667 - 162210

17 36 109 (66%)210 (100%)

156 (95%)


T09-102 + 386529

17 169

353 (92%)520 (97%)

353 (92%)


L09-1003 + 251250

16 8 227 (89%)250 (100%)

228 (91%)


L09-1141 + 134208

14 173

103 (77%)205 (98%)

107 (80%)


L09-1005 ++ 174204

1 52

168 97%)202 (98%)

169 (97%)


L09-1121 + 135215

14 126

109 (81%)209 (96%)

116 (86%)


++ 638 18 14 606 (95%) 626 (97%)

Die zehn Lymphozytenproben wurden bei diesem Versuch durch MTA Mitarbeiter so-wie durch den Spotcounter ausgewertet (in der Tabelle jeweils Zeile Spotcounter bzwManuell). Der Spotcounter arbeitete in dieser Versuchsreihe mit dem Objektiv dersechshundertfachen Vergrößerung. Jedes Präparat hat eine IdentNr (Spalte eins). Die-se Probennummer wird im Labor nach Eingang der Proben vergeben. In der zweitenSpalte der Tabelle wird die Qualität des Präparates beurteilt. Die Qualität eines Prä-

34Wenig Zellen, Hintergrundsignale in grün. Viele X, da rote Signale sehr schwach. Kreuzhybrid mitX.

35Wenig Zellen. Grüne Signale stark, rote schwach.36Wenig Zellen, sonst schönes Präparat37Viele Zellklumpen.38Guter Lauf.39Guter Lauf.40Wenig Zellen, sonst guter Lauf.41Guter Lauf.42Guter Lauf.

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parates wurde hier an folgenden Kriterien beurteilt:

• ist die Hybridisierung gut gelungen? Dies lässt sich an der Helligkeit der Spots,deren Farbe und ob sich diese gut von der DAPI -Färbung der Zelle abhebenbeurteilen.

• sind die Zellen gut voneinander abgegrenzt? In der mikroskopischen Ansicht sinddann einzelne Zellen gut erkennbar, mit einem Abstand zur Nachbarzelle. Zel-lenklumpen sind als negativ zu bewerten.

• weisen die Zellen eine runde Form auf und grenzen sie sich zur Umgebung klarab? Ist die Dapifärbung der Zelle gut zu der dunklen Umgebung abgegrenzt underscheint die Zelle in der Ansicht rund ist dies positiv zu bewerten.

Alle drei Kriterien zur Qualität eines Präparates fließen durch die Erfahrung der quali-fizierten MTA Mitarbeiter in diesen Versuch mit ein. Jedes Kriterium wurde hier (sieheTabelle) mit einem + bzw – beurteilt.In der dritten Spalte der Tabelle wird die Anzahl der ausgewerteten Zellen angegeben.In der vierten Spalte wird angegeben wie viele ausgewertete Zellen als uninformativeingeteilt wurden(„uninformative Gruppe“). Als uninformativ werden Zellen eingeteilt,die keine bekannte pathologische Spotverteilung erkennen lassen aber dennoch nichtdie normale XY- Konfiguration aufweisen. In diese Gruppe fallen bei diesem Versuchalle Zellen, die nicht als „andere Gruppen“ oder „XY- Gruppe“ eingeteilt wurden. An-dere Gruppen (siehe Spalte fünf) beschreiben Zellen, die eine bekannte pathologischeSpotverteilung aufweisen, hierzu zählen:

• Einzelnes grünes Signal, beschreibt Monosomie X, siehe Turner Syndrom

• Zwei grüne Signale und ein rotes, beschreiben zwei X- Chromosomen und einY-Chromosom, siehe Klinefelter Syndrom

• Ein grünes Signal und zwei rote, bezeichnet einen XYY Status.

In die XY-Gruppe in Spalte sechs fallen alle als normal einzustufenden Zellen, also mitder Konfiguration XX oder XY. Diese Spalte hat den Vorsatz Auto, dies bedeutet, dassdie aufgenommenen Zellen automatisch von der Software in diese Gruppe eingeteiltworden sind. Bei diesem Versuch wurde das Auswertungsergebnis des Spotcountersmanuell nachkontrolliert. Das heißt, alle Zellen, die in den Gruppen „uninformativund andere“ gewertet wurden, sind nochmals manuell begutachtet worden. Einige die-ser Zellen konnten dann nachträglich in die Gruppe XY eingeordnet werden (Spalte

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sieben), was bedeutet das die Auswertungssoftware nachjustiert werden sollte. Es wur-de der Einstellungswert des „Rundheitsgrades“ (AxisRational) einer Zelle erhöht, dieSoftware hatte Zellhaufen, die eine wenig runde Struktur aufwiesen als eine Zelle er-kannt und somit zu viele Spots für eine Zelle erhalten. Auch galt es denselben Fehleranhand des Einstellungswertes „Abstand“ (Spacing) zu erhöhen. Durch diese beidenEinstellungsparameter sollte die Software also Zellen besser voneinander abgrenzen,und einzelne Zellen besser erkennen. Ein weiterer Auswertungsfehler ließ sich anhandder falsch eingeordneten Zellen erkennen. Es lagen Spots teilweise außerhalb des Fokus.Diese erschienen dann abgeschwächt und diffus auf den Bildern. Deswegen wurde dieAnzahl der Ebenen, mit denen eine Zelle durchlaufen wird, (Number of Planes) erhöht.Ein weiteres, einzustellendes Kriterium, der Auswertung ist die Größe einer Zelle sowiedie eines Spots. Spots wurden teilweise nicht gewertet, da sie bedingt durch ihre Größenicht gewertet wurden. Hier mußte der Einstellungswert für die maximale Größe einesSpots herabgesetzt und für die minimale Größe eines Spots heraufgesetzt werden. Beidiesem Test für die Geschlechtschromosomen XY werden centromerspezifische Sondenbenutzt, dadurch sind größere Spots zu erwarten. Diese Einstellungsparameter lassensich in einem sogenannten Classifier speichern.In der Fußzeile zu der Tabelle sind Kommentare zum jeweiligen Präparat festgehaltenworden. Diese Kommentare untermauern das Auswertungsergebnis und die manuel-le Nachkontrolle eines Präparates indem kurze Stichworte angeführt werden warumbei diesem Präparat ein vergleichbar schlechtes bzw gutes Auswertungsergebnis erzieltwurde. Im Nachfolgenden werden diese Kommentare mit den jeweiligen Ergebnissenerläutert:Bei der Probe Nr. 1 lässt sich in der Auswertung durch die MTAs eine hundertprozenti-ge Einordnung der Ergebnisse in die zu erwartende XY Gruppe erkennen. Das geschulteAuge der Mitarbeiter ist der Auswertungssoftware um einiges vor raus. Das Präparatwird mit geübten Fingerbewegungen an den Einstellungsrädern am Objektträgertischscharfgestellt und abgefahren. Areale in denen sich Zellklumpen befinden, zerstörte Zel-len zu sehen sind, oder die Spots nicht gut zu erkennen sind werden gemieden. Schnellwird ein Areal markiert indem sich eine Auswertung zügig durchführen lässt. Bei demErgebnis des Spotcounters hingegen sind nur 71 Prozent der Zellen automatisch in diezu erwartende XY Gruppe einsortiert worden. Im Kommentar ist zu lesen „wenig Zel-len; Hintergrundsignale in grün; viele X da rote Signale sehr schwach; Kreuzhybrid mitX“. Das Präparat wies also wenige Zellen auf, große Freiräume waren zu erkennen. Wieman an der Zahl der im gesamten ausgewerteten Objekte sehen kann hat die Auswer-tungssoftware dennoch, im Vergleich zur manuellen Auswertung, ausreichend Objektedetektieren können. Dieser Faktor hat das Ergebnis, bis auf die Auswertungsdauer

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(wird im nächsten Versuch Nr. 2) darauf eingegangen nicht weiter beeinflusst. Dagegenhat der Aspekt Hintergrundsignale in grün das Auswertungsergebnis geprägt. Dadurchfanden einige, wie sich bei der manuellen Nachkontrolle herausstellte, Falschsortierun-gen in Uninformative bzw andere Gruppen statt. Die grünen Hintergrundsignale warennicht am X- Chromosomen hybridisiert sondern flockten teilweise über das gesamtePräparat aus. Sie wurden fälschlicherweise detektiert und gewertet. Diese, vom Präpa-rat mitgegebene Auswertungsschwierigkeit, bedingt auch den nächsten Kommentar. Eswurden also mehr X- als Y- Chromosomen ausgewertet, da die roten Signale noch dazuschwach hybridisiert waren. Es wird bei diesem Präparat eine Kreuzhybridisierung derX- Centromersonde mit dem Centromer eines anderen Chromosoms vermutet. Durchdie manuelle Nachkontrolle konnten dann 86 Prozent der aufgenommenen Zellen in dieunauffällige Gruppe einsortiert werden. Die übrigen Objekte fielen dann alle in die un-informative Gruppe. Das heißt es gab bei dieser Probe keinen pathologischen Befund.Es bedeutet, dass gewertete Objekte, die von MTAs von vorneherein nicht gewertetwürden in die Wertung mit eingeflossen sind. Allerdings in eine Klasse die zum Befunddes Präparates nicht beiträgt.Bei der Probe Nr. 2, die ein besseres Qualitätsmerkmal als die vorangegangene Probeaufzeigt ist die automatische Einteilung durch den Spotcounter in die zu erwarten-de XY-Gruppe auf 80% angestiegen. Eine gute Ausgangssituation, die sich durch diemanuelle Nachkontrolle nochmals verbessern ließ. Die Kommentarspalte beschreibt diesignifikanten Probleme dieser Probe wodurch sich das Auswertungsergebnis beeinflus-sen ließ. Die Probe wies ebenfalls wenig Zellen auf, dennoch wurden genügend Objekte(mehr als in der manuellen Auswertung) gewertet. Bei dieser Probe ist die Hybridi-sierung der X- Chromosomen gut gelungen da die grünen Signale kräftig ausgeprägtzu sehen waren. Die Hybridisierung am Y-Chromosom war dagegen gegenteilig aus-geprägt. Diese ungleichmäßig gute Hybridisierung, Leuchtkraft der Spots, führte zueiner Falscheinteilung einiger Objekte die nachträglich in die unauffällige XY-Gruppeeingeteilt werden konnten. Beispielsweise wurde in anderen Gruppen eine MonosomieX gewertet, nur wurde das Y- Chromosom aufgrund der schwachen Leuchtkraft nichtdetektiert. Außer Konkurrenz steht die manuelle Auswertung.Die der Probe Nr. 3 mit dem Qualitätsmerkmal doppel plus wurde ein gutes Auswer-tungsergebnis erzielt. Dies ist sehr schön daran zu erkennen das nach der manuellenNachkorrektur nicht mehr Objekte in die XY-Gruppe eingeteilt werden konnten. In„andere Gruppen“ wurden also sieben Zellen gewertet. Die manuelle Auswertung zeigtallerdings kein auffälliges Ergebnis. Die Kommentarspalte unterstreicht durch den Ver-merk „schönes Präparat“ das Auswertungsergebnis.Bei der Probe Nr. 4 zeigt sich schon durch die Vergleichsweise schlechtere Qualitäts-

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bewertung das dieses Präparat zu Auswertungserschwernissen gesorgt hat. Dieses wirdbestätigt dadurch, dass viele Objekte nach der manuellen Nachkontrolle in die zu er-wartende XY-Gruppe gewertet werden konnten. In der Kommentarspalte ist zu lesen„viele Zellklumpen“. Untermauert wird dieser Kommentar dadurch, dass vergleichswei-se viele Objekte in „andere Gruppen“ gewertet wurden. Die Zellklumpen haben alsopathologische Spotverteilungen erkennen lassen. Allerdings werden Zellklumpen bei dermanuellen Auswertung gar nicht erst gewertet, da diese immer unerwartete Spotver-teilungen aufzeigen und sowieso nur einzelne Zellen gewertet werden. Um der Wertungdurch den Spotcounter solcher Objekte vorzubeugen musste der Classifier weiter opti-miert werden. Die manuelle Auswertung ist eindeutig ohne Befund.Die Proben Nr. 5, 6, 8 und 10 lassen sich gut zusammenfassen. Diese Proben zeigenalle vergleichsweise gute Qualitätsmerkmale auf. Die Kommentarspalte beschreibt beijeder einzelnen Probe dieselbe Bemerkung . Schon die automatische Einteilung in dieXY-Gruppe liefert zufriedenstellende Ergebnisse. Diese Ergebnisse konnten durch diemanuelle Nachkontrolle nur noch geringfügig verbessert werden. Die Änderungen dereinzustellenden Parameter im Classifier führen insgesamt zu konstanteren Ergebnissen.Die Proben Nr. 7 und 9 hat der automatischen Auswertung Probleme bereitet. Durchdie dünne Besiedlung der Präparate sind nur wenige Objekte gefunden worden. Selbstdurch die manuelle Nachkontrolle ließ sich das Auswertungsergebnis nicht wesentlichin die zu erwartende Richtung lenken. Bei diesen beiden Proben wurden selbst bei derrein manuellen Wertung auffällige Objekte ausgezählt.Damit ist die erste Versuchsreihe abgeschlossen. Es wurden wichtige Einstellungen amClassifier vorgenommen, durch deren Änderungen auch schon erste Besserungen inden Auswertungen erzielt wurden. Auch wurde ein deutlicher Unterschied zwischen dermanuellen Auswertung durch MTA und der automatischen Auswertung festgestellt. DerEinfluss durch die Qualität eines Präparates auf das Auswertungsergebnis ist enorm.

7.2.2. Versuch Nr. 2, Lymphozyten

Alle vorangegangenen Erkenntnisse über die automatische Auswertung durch den Spot-counter finden in dieser Versuchsreihe ihre Anwendung. Einstellungswerte im Classifierwerden beibehalten, da dieselben Chromosomen ausgewertet werden. Die Versuchs-reihe Nr.2 dient als Kontrolle der Einstellungen da die Auswertungsergebnisse durchMischungsverhältnisse der Proben vorgegeben werden. In dem Versuch Nr.2 wurdensechs Lymphozytenproben manuell, durch MTAs und durch den Spotcounter ausge-wertet. Zur Auswertung dieser Versuchsreihe werden folgende die Tabellen/Grafikenangeführt.

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Legendem: Minuten(60): Auswertung Spotcounter, 600-fache Vergrößerung(40): Auswertung Spotcounter, 400-fache Vergrößerung

Tabelle 7.2.: Vergleich manuelle- zu Spotcounterauswertung, Mischungsverhälntniss der Ge-schlechtschromosomen 100%XY, Versuch Nr. 1

Spotcounter Manuelle AuswertungAnzahl % Anzahl %

XY 353 -95,6 520 -98,3XX 1 0,2 9 1,7X 4 1,1 0 0XXY 1 0,2 0 0XYY 10 2,7 0 0∑

369 529 0

−100 −50 0 50 100

Spotcounter

Manuell

0.2

1.7

−95.6

−98.3

% XY XX

Tabelle 7.3.: Vergleich manuelle- zu Spotcounterauswertung, Mischungsverhälntniss der Ge-schlechtschromosomen 90%XX, 10%XY, Versuch Nr. 2Spotcounter:(60) 1h10m Spotcounter:(40) 45m Manuelle AuswertungAnzahl % Anzahl % Anzahl %

XY 47 -12,2 27 -7,2 16 -7,5XX 174 45,5 98 25,8 200 92,5X 63 16,4 251 66,3 0 0XXY 86 22,3 1 0 0 0XYY 14 3,6 1 0 0 0∑

384 378 216

−100 −50 0 50 100

Spotcounter (60)Spotcounter (40)

Manuell

45.525.8

92.5

−12.2−7.2−7.5

% XY XX

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Tabelle 7.4.: Vergleich manuelle- zu Spotcounterauswertung, Mischungsverhälntniss der Ge-schlechtschromosomen 90%XY, 10%XX, Versuch Nr. 3Spotcounter:(60) 1h10m Spotcounter:(40) 40m Manuelle AuswertungAnzahl % Anzahl % Anzahl %

XY 312 -83,9 344 -84,8 175 -87,5XX 35 9,3 41 10,1 25 12,5X 21 5,5 13 3,1 0 0XXY 4 0,5 4 0,5 0 0XYY 0 0 3 0,5 0 0∑

372 405 200

−100 −50 0 50 100


Manuell

12.510.19.3

−87.5−84.8−83.9

% XY XX

Tabelle 7.5.: Vergleich manuelle- zu Spotcounterauswertung, Mischungsverhälntniss der Ge-schlechtschromosomen 70%XX, 30%XY, Versuch Nr. 4Spotcounter:(60) 55m Spotcounter:(40) 38m Manuelle AuswertungAnzahl % Anzahl % Anzahl %

XY 93 -23,7 72 -18,1 58 -28,2XX 200 50,1 255 63,9 142 69,5X 93 23,7 71 18,1 4 2,3XXY 3 1,2 3 0,8 0 0XYY 4 1,3 1 0 0 0∑

393 398 204

−100 −50 0 50 100


Manuell

50.163.969.5

−23.7−18.1

−28.2

% XY XX

Tabelle 7.6.: Vergleich manuelle- zu Spotcounterauswertung, Mischungsverhälntniss der Ge-schlechtschromosomen 30%XX, 70%XY, Versuch Nr. 5Spotcounter:(60) 1h20m Spotcounter:(40) Manuelle AuswertungAnzahl % Anzahl % Anzahl %

XY 222 -61,7 Präparat zerstört! 127 -65,1XX 84 23,2 68 34,9X 31 8,5 0 0XXY 20 5,6 0 0XYY 3 1 0 0∑

360 195

−100 −50 0 50 100

Spotcounter 60

Manuell

34.9

23.2

−65.1

−61.7

% XY XX

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Tabelle 7.7.: Vergleich manuelle- zu Spotcounterauswertung, Mischungsverhälntniss der Ge-schlechtschromosomen 50%XX, 50%XY, Versuch Nr. 6Spotcounter:(60) 50m Spotcounter:(40) 32m Manuelle AuswertungAnzahl % Anzahl % Anzahl %

XY 147 -37,3 115 -28,5 101 -50,5XX 183 46,6 152 37,5 99 49,5X 56 14,1 137 34 1 0XXY 2 0 0 0 0 0XYY 5 2 0 0 0 0∑

393 404 200

−100 −50 0 50 100


Manuell

46.637.5

49.5

−37.3−28.5

−50.5

% XY XX

Bei diesem Versuch wurden die Präparate in bestimmten Mischungsverhältnissen vonweiblichen und männlichen Zellen angefertigt. So ergibt sich in den zu untersuchendenProben eine bekannte, prozentuale Verteilung der Geschlechtschromosomenkonfigurati-on XX und XY. Jedes der Präparate wurde mit einer vierhundert- und einer sechshun-dertfachen Vergrößerung untersucht. Es wurden Auswertungszeiten beider Objektiveund manuelle Auswertungszeiten dokumentiert. In der Tabelle wird unterschieden zwi-schen der Konfiguration XX und XY um die Mischungsverhältnisse wiederzugeben. Auchgibt es drei pathologische Gruppen. Wieder wird die Monosomie X, XXY, und eine wei-tere Gruppe XYY ausgezählt. Uninformative Gruppen werden bei diesem Versuch nichtausgewertet. In der Tabellenansicht wird der Spotcounter der manuellen Auswertunggegenüber gestellt. Jede Tabelle unterteilt sich in eine Spalte „Anzahl“ und eine Spalte„Prozent“. In der Balkengrafik haben beide Auswertungsmethoden einen Balken. DieVerteilung der Mischungsverhältnisse sollen hier dargestellt werden.

Bei der Probe Nr. 1 handelt es sich um eine rein „männliche“ Probe. Dieses Präpa-rat wurde als einziges nicht versetzt mit weiblichen Zellen. Es dient als Referenzprobein dem eine hundertprozentige Einteilung der Geschlechtschromosomen in die GruppeXY zu erwarten ist. Dieses Ergebnis ist auch weitestgehend eingetreten. Die manu-elle Auswertung hat weibliche Zellen gewertet. In den anderen Gruppen hat nur derSpotcounter Objekte gewertet.

Die Probe Nr. 2 wurde in einem Mischungsverhältnis aus neunzig Prozent weiblicherZellen und zehn Prozent männlicher Zellen (90%XX und 10%XY) hergestellt. Das Bal-kendiagramm zeigt schnell auf das die manuelle Auswertung dieses Mischungsverhältnisgut auswerten konnte. Die beiden Balken der Spotcounterauswertung lassen hingegen

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erkennen, dass die zehn Prozent der männlichen Zellen gut detektiert wurden. Aller-dings hat es bei der Spotcounterauswertung in Bezug auf die weiblichen Zellen Auswer-tungsschwierigkeiten gegeben. Viele der weiblichen Zellen wurden in die pathologischenGruppen Turner- bzw Klinefelter Syndrom detektiert. Häufig waren die ausgewertetenZellen nicht gut voneinander abgegrenzt und es wurden kleine Zellklumpen gewertet.Die Qualität der Probe war für die Auswertung durch den Spotcounter nicht gut ge-eignet.Die Probe Nr. 3 ist in einem umgekehrten Mischungsverhältnis wie die vorherige Pro-be angefertigt worden. Alle drei Auswertungsmethoden haben das Mischungsverhältnisgut erkannt und lassen sich deshalb bei dieser Probe gut vergleichen. Kleine Ungenauig-keiten lassen sich bei dem Spotcounter durch die Einteilung einiger Objekte in die ande-ren Gruppen erklären. Auch die manuelle Auswertung lässt eine geringe Abweichung zudem Mischungsergebnis erkennen. Diese Probe weist eine gute Qualität für die automa-tische Auswertung auf. Die Auswertungszeit des Objektives mit der vierhundertfachenVergrößerung unterschreitet die Auswertungszeit mit der sechshundertfachen Vergrö-ßerung um 30 Minuten. Es liefert auch das geringfügig bessere Endergebnis und wertetgleichzeitig mehr Objekte aus. Die Auswertungszeit der manuellen Auswertung beträgtfür 200 auszuwertende Objekte lediglich circa sieben Minuten.Die Probe Nr. 4 ist charakterisiert durch ein Mischungsverhältnis von 70XX/30XY. Diemanuelle Auswertung trifft diese Verteilung sehr gut und ist mit einer Auswertungszeitum die sieben Minuten sehr schnell. Bei der Spotcounter Auswertung lässt sich abermalsein Vorteil des Objektivs mit der vierhundertfachen Vergrößerung erkennen. Es istbei gleicher Anzahl ausgewerteter Objekte schneller und trifft das Mischungsverhältnisbesser.Bei der Probe Nr. 5 ist ein Unfall passiert. Nach der manuellen Auswertung und deranschließenden Spotcounterauswertung mit der sechshundertfachen Vergrößerung istdas Präparat zu Boden gefallen und war nicht mehr zu einer weiteren Auswertungzu gebrauchen. Beide ausgeführten Auswertungen lassen die Mischverteilung erkennen.Die manuelle Auswertung ist zeitlich und vom Ergebnis her der Spotcounterauswertungüberlegen.Probe Nr. 6 hat eine Verteilung von 50XX/50XY. Die manuelle Auswertung behält ihrenZeitvorteil und hat das Mischungsverhältnis exakt getroffen. Die Mengenverteilung derZellen sind in dem Balkendiagramm der Spotcounterdarstellung zu erkennen. Leiderwurden Objekte in den anderen Gruppen gewertet, sodass sich die genaue Verteilungnur erahnen lässt. Das Objektiv mit der vierhundertfachen Vergrößerung behält denZeitvorteil.Bei allen Proben dieser Versuchsreihe ist das Objektiv mit der vierhundertfachen Ver-

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größerung schneller als das mit der sechshundertfachen. Es kann mehr Zellen pro Auf-nahme detektieren. Die manuelle Auswertung ist allerdings mit einer Zeit von durch-schnittlich zwölf Minuten unschlagbar schnell. Bei dieser Versuchsreihe wurde wiederdeutlich wie wichtig die Qualität eines Präparates für die automatische Auswertungist. Tendenziell wurden die Mischungsverhältnisse bei der Spotcounterauswertung guterkannt, jedoch lassen sich Abweichungen erkennen, durch Zellen die in andere Grup-pen eingeteilt wurden. Der Spotcounter versucht Areale in denen Problemzellen liegenauszuwerten. Die manuelle Auswertung geht über solche Areale auf dem Objektträ-ger hinweg und wertet das Präparat an einer anderen Ecke aus wo die Qualität desPräparates gut ist.

7.2.3. Versuch Nr. 3, Spermien

Da der Spotcounter nun bei den Lymphozytenproben brauchbare Ergebnisse erzielenkann, beschäftigt sich dieser Versuch erstmalig mit einer Spermienprobenreihe. Zu-nächst wurden in den vorangegangenen Probenreihen Lymphozyten ausgewertet, dadiese eine runde Form und einen größeren Durchmesser als Spermien haben.

Abbildung 7.1.: Spermium

Dies sind beides Eigenschaften, die eine Auswertung durch den Spotcounter vereinfa-chen. Der Durchmesser eines Lymphozyten beträgt 7,5 µm, dagegen ist der Kopf einesSpermiums oval mit einer Länge von 5µm und einer Breite von 3µm. Das Spermiumbesitzt ein Mittelstück, welches an den Kopf anschließt und somit Kopf und Schwanzverbindet. Inwiefern diese neuen Begebenheiten Einfluss auf die Auswertungsergebnissehaben wird, wird diese Versuchsreihe aufzeigen. Einstellungsparameter des Classifierbleiben zunächst bestehen, da in diesem Test, ebenso wie in den vorangegangenen,die Geschlechtschromosomen untersucht werden. Ebenfalls wird das Chromosom 18markiert, auch mit centromerspezifischen Sonden.Bei dem Versuch Nr. 3 werden fünf Spermien Proben ausgewertet. Jeder Objektträ-ger besitzt zwei Areale und wird somit auf zwei verschiedene Tests hin untersucht.

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Bei dem einen Test werden wiederum die Geschlechtschromosomen X und Y des Sper-miums mit Sonden markiert. Allerdings wird hier auch das Chromosom 18 markiert.Dieses Chromosom dient als Referenz, so dass man in einem unauffälligen Spermiumzwei Spots erhält. Die Normalkonfiguration ist 18X oder 18Y. Dabei ist eine 50 prozen-tige Verteilung zu erwarten. Das Chromosom X wird dabei in grün, das ChromosomY in rot und das Chromosom 18 in aqua markiert. Es werden auch auffällige Konfi-gurationen gewertet. Die Gruppe XY18 wertet beispielsweise ein Spermium das zweiGeschlechtschromosomen hat.

Abbildung 7.2.: Spermium mit zwei Geschlechtschromosomen und einem Chromsomen 18

Eine andere Gruppe nennt sich Disomy18, hier werden Spermien gewertet, die zweiChromosomen 18 besitzen, ein Chromosom X oder ein Chromosom Y. Die DiploideGruppe zeigt vier Signale auf XX1818 oder XY1818. Eine weitere auffällige Gruppeheißt Wild18. Diese Gruppe zeigt ein Chromosomen 18 auf und keine Geschlechts-chromosomen. In die Gruppe Uninform fallen alle Spermien, die keine hier aufgeführteVerteilung der Chromosomen aufzeigen. In dieser Gruppe befindliche Objekte werdenals „Müll“ betrachtet und fließen, bis auf die Zeitdauer, nicht ins Auswertungsergebnismit ein. Die Konfigurationen der pathologischen Gruppen führen in Kombination miteiner Eizelle beispielsweise zu dem Klinefelter Syndrom oder sie sind aus dem Laborall-tag bekannt und somit untersuchungswürdig.In dem zweiten Areal des Objektträgers wird der Test 13/21 untersucht. Eine Normal-konfiguration bei diesem Test zeigt zwei Signale pro Spermium auf. Ein Signal in grünfür Chromosom 13 und ein Signal in rot für Chromosom 21. Es werden desweiteren

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pathologische Gruppen ausgewertet. Dazu gehören die beiden Gruppen Disomy13 undDisomy21. Hier werden Spermien eingeordnet,die eine Signalverteilung von grüngrün-rot oder grünrotrot aufzeigen. Zwei weitere pathologische Gruppen heißen 0/13 und0/21. Hier erscheint also nur ein Signal pro Spermium, es ist die Gruppe der Nulli-somien. Dann wird noch das diploide Spermium als pathologisch gewertet. Jedes hiereingeteilte Spermium zeigt vier Spots auf.

Zu der Auswertung dieses Versuches wird diese Tabelle/Grafik angeführt.

Legendem: Minuten(60): Auswertung Spotcounter, 600-fache Vergrößerung(40): Auswertung Spotcounter, 400-fache Vergrößerung

Tabelle 7.8.: Spermien Tests 13/21 und 18XY, Vergleich manuelle- zu Spotcounterauswer-tung, Probe Nr. 1; Diagramm Darstellung Anzahl gewerteter Objekte in abnor-malen Klassen13/21 18XY(60) 43m (40) 27m Manuell (60) 57m (40) 21m Manuell

13/21 364 372 500 X18 162 188 258Disomy21 0 0 1 Y18 165 172 263Disomy13 2 8 1 XY18 5 2 00/21 2 1 0 Disomy18 1 0 113/0 3 2 1 Diploid 1 0 1Diploid 18 10 1 Wild18 2 0 0Uninform 2 1 0 Uninform 235 220 0∑

391 394 502∑

571 582 523

(60) 43m (40) 27m Manuell0

5

10

0 0 12

8

1Anz

ahl

Disomy21 Disomy13(60) 57m (40) 21m Manuell

0246 5

20

10

1Anz

ahl

XY18 Disomy18

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Tabelle 7.9.: Spermien Tests 13/21 und 18XY, Vergleich manuelle- zu Spotcounterauswer-tung, Probe Nr. 2; Diagramm Darstellung Anzahl gewerteter Objekte in abnor-malen Klassen13/21 18XY(60) 27m (40) 12m Manuell (60) 51m (40) 18m Manuell


415 387 509∑

612 618 501

(60) 27m (40) 12m Manuell0

5

10

47

0

11

20

Anz

ahl


0246

2 20

1

5

0Anz

ahl

XY18 Disomy18

Tabelle 7.10.: Spermien Tests 13/21 und 18XY, Vergleich manuelle- zu Spotcounterauswer-tung, Probe Nr. 3; Diagramm Darstellung Anzahl gewerteter Objekte in ab-normalen Klassen

13/21 18XY(60) 56m (40) 37m Manuell (60) 46m (40) 23m Manuell


253 413 555∑

438 439 547

(60) 56m (40) 37m Manuell05

1015

4 50

15

1 0

Anz

ahl


02468 7

3

01 0 1Anz

ahl

XY18 Disomy18

45




394 415 521∑

580 608 505

(60) 39m (40) 17m Manuell0

20

40 35

178

1911

0

Anz

ahl


0

5

105 6

2

10 9

0Anz

ahl

XY18 Disomy18




372 398 503∑

399 410 636

(60) 57m (40) 32m Manuell0

20406080

3

61

224

38

0

Anz

ahl


0

1

2

32

1 1

0 0 0

Anz

ahl

XY18 Disomy18

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Jedes Präparat wurde also auf die beiden Tests hin, sowie mit verschiedenen Vergrö-ßerungen und manuell ausgewertet. Dabei wurden die Auswertungszeiten notiert. DieErgebnisse werden in den Tabellen als Anzahl ausgewerteter Objekte angegeben. In denBalkendiagrammen zu der Untersuchung 13/21 werden die Gruppen Disomy13 und Di-somy21 grafisch dargestellt. Die Balkendiagramme zu dem Test 18X bzw 18Y zeigendie Gruppen XY18 und Disomy18 auf.Bei der Probe Nr. 1 zeigt sich zunächst einmal das die Auswertung durch den Spot-counter mit der Objektivvergrößerung von vierhundert einiges an Zeit gegenüber dersechshundert fachen Vergrößerung gut machen kann. Dies ist ein wichtiges Auswahlkri-terium bezüglich der Vergrößerung welches sich auch schon durch vorherige Versuchsrei-hen zog. Diese Zeiten können nicht mit denen der manuellen Auswertung konkurrierendie bei um die 500 auszuwertenden Objekten bei circa sechzehn Minuten liegt. Bei die-ser Probe erkennt man in dem Balkendiagramm zu dem Test 13/21 das Spermien beiallen drei Untersuchungen in pathologische Gruppen eingeteilt wurden. Doch wird dasmanuelle Ergebnis als Normalbefund gewertet. Denn es gibt Schwellenwerte ab wanneine Probe als auffällig einzuteilen ist. Für den Spotcounter gibt es solche Schwellen-werte/Richtwerte welche beispielsweise eine manuelle Nachkontrolle eines Präparateserfordern noch nicht. Die Untersuchung 18X bzw 18Y zeigt wiederum den Zeitvorteildes Objektivs mit vierhundertfachen Vergrößerung auf. Auch hier wurden Spermien inden pathologischen Gruppen gewertet.Probe Nr. 2 zeigt zu dem Test 13/21 mit dem Objektiv der vierhundertfachen Ver-größerung ein gutes Ergebnis auf. Zwar wurden weniger Objekte als bei der manuellenAuswertung ausgewertet jedoch in einer beachtlich kurzen Zeit. Auch sind hier nurgeringe Abweichungen in die abnormalen Klassen zu sehen. Die sechshundertfache Ver-größerung benötigt deutlich mehr Zeit und hat dazu noch viele Objekte in anderenKlassen gewertet. Dazu kam es da einzelne Spermien detektiert wurden die sich aller-dings als Spermienklumpen bezeichnen lassen. So wurden Objekte falsch abgegrenztin denen dann eine abweichende Spotkonfiguration erkannt wurde. Dieses Areal hättein die Kategorie Uninform gehört, der Spotcounter versucht es allerdings hartnäckigauszuwerten. Die manuelle Auswertung lässt solche Areale von vorneherein nicht in dieAuswertung einfließen. Zu dem Test 18XY wird ein gutes Ergebnis sichtbar. Es sindwenige Objekte in den abnormalen Klassen gewertet worden und die fünfzig prozentigeVerteilung zwischen den Gruppen 18X und 18Y ist getroffen worden. Vor allem dieAuswertungszeit mit dem Objektiv der vierhundertfachen Vergrößerung ist beachtlichnah an der Zeit einer manuellen Auswertung.Bei der Probe Nr. 3 wurde bei dem Test 13/21 mit der vierhundertfachen Vergrößerungviele Spermien in der Klasse 13/0 gewertet. Es liegt abermals das Problem bezüglich

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der Abgrenzung einzelner Spermien vor. Ein verklebter Spermien Haufen wurde hierausgewertet in dem hauptsächlich das Chromosom 13 ausreichend gut hybridisiert war.Das Objektiv mit der sechshundertfachen Vergrößerung hat bei diesem Test nur wenigeSpermien gezählt weist aber ein besseres Ergebnis auf. Die manuelle Auswertung ist hierzeitlich überlegen und es wurden keine Objekte in abweichenden Klassen gewertet. DerTest 18XY ist bei der Probe Nr. 3 gut gelungen. Beide Objektive haben wenige Spermienin abnormalen Klassen gewertet und lassen die Halbierung zwischen Spermien mit demMerkmal männlich und den Spermien mit dem Merkmal weiblich gut erkennen. DasObjektiv mit der vierhundertfachen Vergrößerung ist bei gleicher Anzahl ausgewerteterObjekte im klaren Zeitvorteil.Die Probe Nr. 4 lässt erkennen, dass bei dem Test 13/21 über alle abnormalen Klassenverteilt Spermien gewertet wurden. Diese Verteilung betrifft beide Auswertungsme-thoden mit den unterschiedlichen Objektiven. Bei einer höheren Anzahl ausgewerteterSpermien liegt das Objektiv mit der vierhundertfachen Vergrößerung im Zeitvorteil.Auch die manuelle Auswertung zu diesem Test zeigt Sortierungen in die abweichendenKlassen auf. Der Test 18XY hat eine hohe Anzahl ausgewerteter Objekte. Die fünfzigfünfzig Verteilung der Gruppen 18X und 18Y ist bei der automatischen Auswertungnicht signifikant. Die manuelle Auswertung trifft die Verteilung recht gut. Auch beidiesem Test ist das Objektiv mit der geringeren Vergrößerung im Zeitvorteil.Probe Nr. 5 hat bei dem Test 13/21 zu beiden Objektiven Einteilungen in abweichendeGruppen erhalten. Das Ergebnis ist bis auf die längeren Auswertungszeiten vergleichbarmit der vorangegangenen Probe. Beide Objektive brauchten länger zur Auswertung dadas Präparat deutlich dünner mit Spermien besiedelt war. Der Test 18XY ist gut ver-laufen. Die Verteilung der Geschlechtschromosomen in den Spermien ist gut getroffenund es wurden nur wenige Objekte in abweichende Klassen sortiert. Das Objektiv mitder vierhundertfachen Vergrößerung liefert wiederum eine kurze Auswertungszeit.Während dieser Versuchsreihe wurden zunächst die Einstellungen des Classifier zu derLymphozyten Auswertung übernommen. Im Laufe der Versuchsreihe wurden dann Pa-rameter nachjustiert. Die Größe auszuwertender Objekte wurde der Größe eines Sper-miums angepasst. Die Größe der Spots konnte für den Test 18,XY beibehalten werden,da hier ebenfalls centromerspezifische Sonden verwandt wurden. Da das Mittelstückund der Schwanz eines Spermiums die Grundeinfärbung in Dapi nicht angenommenhaben konnte der Wert Axis Rational nur geringfügig herabgesetzt werden. Die Anzahlder Ebenen, mit denen ein Objekt durchfahren wird, wurde leicht erhöht um jedenSpot zu detektieren. Der Abstand zwischen Objekten wurde heraufgesetzt da die Sper-mien Präparate des öfteren eine dünne Besiedlung haben. Eventuell kann durch dieweitere Verfeinerung der Einstellungen dem Problem, dass Spermien Klumpen ausge-

48

wertet werden zuvorgekommen werden. Bei dem Test 13/21 werden locusspezifischeSonden eingesetzt. Deswegen wurde ein zweiter Classifier erstellt. Sie stimmen in allenEinstellungsparametern, bis auf die Größe der zu wertenden Spots, überein.Die Spermien FISH Diagnostik mittels Spotcounter lief durch diese Versuchsreihe rechtgut an. Es wurden schon viele brauchbare Ergebnisse erzielt und ein weiterer Classifierfür den Test 13/21 wurden erstellt. Die Fächerung der ausgewerteten Objekte in abwei-chende Klassen bei dem Test 13/21 ist bei fast jeder Probe ersichtlich und wird weiterbeobachtet. Der Test 18XY lieferte über die gesamte Versuchsreihe gute Ergebnisse,auch in Hinsicht auf die natürlichen Verteilungsmerkmale bezüglich der Geschlechts-chromosomen in Spermien. Ein positiver Aspekt sind auch die Auswertungszeiten desObjektivs mit der vierhundertfachen Vergrößerung. Hier konnten kurze Auswertungs-zeiten realisiert werden, gepaart mit akzeptablen Ergebnissen wird dieses Objektiv fürdie zukunftigen Versuchreihen verwandt.


Versuch Nr. 4 wertet beide Tests XY18 und 13/21 in zehn Proben aus. Es wurde zurAuswertung, aufgrund der vorherigen Ergebnisse das Objektiv mit der vierhundertfa-chen Vergrößerung gewählt. Dieser Versuch ist tabellarisch und grafisch nachfolgenddargestellt:

Tabelle 7.13.: Spermien Tests 13/21 und 18/X/Y, Probe Nr.1; Diagramm Darstellung Anzahlgewerteter Objekte in abnormalen Klassen43

13/21 18XY13/21 1427 X18 575Disomy21 94 Y18 605Disomy13 494 XY18 1080/21 186 Diploid 513/0 8 Disomy18 9Diploid 91 Wild18 24∑

2300∑

1326

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200

13/21

Anzahl13/21 Disomy21 Disomy13 0/21 13/0 Diploid

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300X18

AnzahlX18 Y18 XY18 Diploid Disomy18 Wild18

43Manuelle Kontrolle

49



1751∑

285

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

13/21


0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280X18


Tabelle 7.15.: Spermien Tests 13/21 und 18/X/Y, Probe Nr.3; Diagramm Darstellung Anzahlgewerteter Objekte in abnormalen Klassen


1735∑

863

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

13/21


0 100 200 300 400 500 600 700 800X18


44Lauf wiederholt, Parameter Dapi, Red Green verändert, kaum besseres Ergebnis

50

Tabelle 7.16.: Spermien Tests 13/21 und 18/X/Y, Probe Nr.3; Diagramm Darstellung Anzahlgewerteter Objekte in abnormalen Klassen, Vergleich mit (60)45


1798∑

1077

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

13/21


0 100 200 300 400 500 600 700 800X18




743∑

543

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

13/21


0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500X18


45Auswertung mit 600-facher Vergrößerung4613/21 = 85%, X18 = 45%, Y18 = 50%

51



806∑

388

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800

13/21


0 50 100 150 200 250 300 350X18




1646∑

1309

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000110012001300140015001600

13/21


0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300X18


4713/21 = 96%, X18 = 49%, Y18 = 49%4813/21 = 89%, X18 = 48%, Y18 = 45%

52



1695∑

574

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

13/21


0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550X18




1922∑

131

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

13/21


0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130X18


4913/21 = 91%, X18 = 52%, Y18 = 45%5013/21 = 96%, X18 = 44%, Y18 = 56%

53



1803∑

531

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

13/21


0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500X18


Tabelle 7.23.: Spermien Tests 13/21 und 18/X/Y, Probe Nr.10; Diagramm Darstellung An-zahl gewerteter Objekte in abnormalen Klassen52


1626∑

1463

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

13/21


0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400X18


5113/21 = 93%, D.13 = 3%, X18 = 44%, Y18 = 54%5213/21 = 84%, D.13 = 1%, X18 = 52%, Y18 = 45%

54

Bei dieser Versuchsreihe wurde die Anzahl der auszuwertenden Objekte stark erhöht. Eswurde versucht bis zu 2000 Spermien pro Lauf auszuwerten. Es soll untersucht werdenwie sich die Erhöhung der auszuwertenden Objekte auf das Ergebnis auswirkt. Auchsollen die Unterschiedlichen Auswertungsstufen bezüglich der Anzahl ausgewerteterObjekte verwirklicht werden.Die ersten drei Proben fallen bezüglich des Testes 13/21 mit einer großen Anzahl gewer-teter Objekte in abweichenden Klassen auf. Die Qualitätsmerkmale dieser Proben sindfür die automatische Auswertung als negativ zu bewerten. Nur wenige klar angegrenzteObjekte. Die Hybridisierung des Chromosomen 13 ist nicht stark ausgeprägt, dadurchist der grüne Spot oft nur schwach zu sehen. An anderen Arealen des Objektträgers istdie Hybridisierung gut gelungen. Durch die Nachjustierung der Intensität, ab der einSpot als solcher erkannt wird, stellte sich als Gradwanderung heraus. Auch der Test18XY, lässt durch die Diagramme, Abweichungen erkennen. Liefert jedoch plausiblereErgebnisse.Bei der Probe vier erzielt der Spotcounter deutlich bessere und plausiblere Ergebnis-se. Die Prozentzahlen und das Diagramm zeigen, dass deutlich weniger Spermien inabweichende Klassen gewertet wurden.Die Probe fünf zeigte hervorragende Qualitäten für die automatische Auswertung. DieSpermien waren gleichmäßig über das gesamte Auswertungsareal verteilt. DeutlicheAbgrenzungen zwischen den Objekten. Eine Gleichmäßig ausgeprägte Hybridisierungder Chromosomen liefert klare und stark leuchtende Spots die sich deutlich von derDapifärbung des Spermien Körpers abheben. Ein entsprechend schönes Auswertungs-ergebnis ist in der Darstellung zu sehen.Ab der Probe sechs dieser Versuchsreihe stabilisieren sich die Auswertungsergebnissein Bezug auf ihre Plausibilität. Es werden nur noch wenige Spermien in abweichendenKlasse gewertet. Ist die Qualität der Präparate auf einem gleichbleibend hohem Niveauliefert die automatische Auswertung konstant stabile Ergebnisse ab.Diese Versuchsreihe machte deutlich, welche Wichtigkeit die Qualität eines Präparatesfür die automatische Auswertung hat. In der manuellen Auswertung durch Laborperso-nal werden von vorneherein nur Objekte gewertet, die eindeutig als einzelnes Spermiumzu erkennen sind und eine gute Hybridisierung aufzeigen. Die automatische Auswertungist an diese Auswahl an Objekten mit guten Qualitätsmerkmalen schwer heranzufüh-ren. Es wird versucht alle Areale eines Objektträgers auszuwerten. Es werden zwarSpermien Klumpen nicht gewertet, das heißt diese Objekte werden als zu groß erkannt.Allerdings ist in solchen Arealen auch häufig die Hybridisierung des Präparates nichtgut gelungen. Dadurch werden in der Umgebung doch häufig einzelne Objekte erkannt,

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bei diesen Objekten wird dann allerdings eine Fehlverteilung der Spots erkannt.

Wie sich die Ergebnisse in der Gruppe mit 2000 auszuwertenden Spermien von derGruppe mit 500 auszuwertenden Spermien unterscheidet wird im Ergebnis dieser Arbeitgeklärt.


Dieser Versuch wertet den Test 13/21 in zehn Proben aus. Um dem Ziel der Schwel-lenwerte der Spotcounteranalyse näher zu kommen wurde dieser Test favorisiert. DieVersuchsreihe wird in folgenden Tabellen und Grafiken dargestellt.

Tabelle 7.24.: Spermien Test 13/21, Vergleich manuelle- zu Spotcounterauswer-tung, Probe Nr.1; Diagramm Darstellung Anzahl gewerteter Objektein abnormalen Klassen

Spotcounter Manuell13/21 1394 78% 13/21 520Disomy21 55 Disomy21 1Disomy13 65 Disomy13 013/0 32 13/0 021/0 222 12% 21/0 0Diploid 82 Diploid 9∑

1805∑

530

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Spotcounter


0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500Manuell


56


Spotcounter Manuell13/21 2004 92% 13/21 501Disomy21 61 3% Disomy21 1Disomy13 37 2% Disomy13 013/0 3 13/0 021/0 37 21/0 0Diploid 25 Diploid 0∑

2167∑

502

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

Spotcounter


0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500Manuell



Spotcounter Manuell13/21 2297 97% 13/21 504Disomy21 13 Disomy21 0Disomy13 6 Disomy13 013/0 5 13/0 021/0 19 0,7% 21/0 0Diploid 13 Diploid 2∑

2353∑

506

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200

Spotcounter


0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500Manuell


57


Spotcounter Manuell13/21 1430 87% 13/21 579Disomy21 9 Disomy21 1Disomy13 90 6% Disomy13 013/0 28 13/0 021/0 66 4% 21/0 0Diploid 16 Diploid 0∑

1639∑

580

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

Spotcounter


0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550Manuell



Spotcounter Manuell13/21 2190 91% 13/21 502Disomy21 7 Disomy21 0Disomy13 37 Disomy13 013/0 100 4% 13/0 021/0 37 1,5% 21/0 0Diploid 13 Diploid 0∑

2384∑

502

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200

Spotcounter


0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500Manuell


58



2215∑

503

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200

Spotcounter


0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500Manuell




1632∑

521

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

Spotcounter


0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500Manuell


59


Spotcounter Manuell13/21 8477 90% 13/21 548Disomy21 134 Disomy21 1Disomy13 418 4% Disomy13 013/0 115 13/0 021/0 220 21/0 0Diploid 54 Diploid 0∑

9458∑

549

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000

Spotcounter


0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500Manuell




1695∑

588

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

Spotcounter


0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550Manuell


60

Tabelle 7.33.: Spermien Test 13/21, Vergleich manuelle- zu Spotcounterauswer-tung, Probe Nr.10; Diagramm Darstellung Anzahl gewerteter Ob-jekte in abnormalen Klassen


480∑

305

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Spotcounter


0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300Manuell


Der Spotcounter steht der manuellen Auswertung gegenüber. Die Anzahl der auszu-wertenden Objekte wurde versucht auf 2000 Stück zu halten,um weitere Ergebnisse fürdiese Gruppe zu erhalten. In der linken Spalte ist stets das Auswertungsergebnis desSpotcounters zu sehen. Tabellarisch dargestellt mit prozentualen Angaben der Spermi-en. In der rechten Spalte steht das manuelle Ergebnis gegenüber. Hier wurden, wie imLabor üblich zu diesem Test, jedes mal 500 Spermien ausgewertet.Bei der Probe Nr. 1 hat die automatische Auswertung ein Viertel der Spermien in ab-weichende Klassen eingeteilt. Besonders heraus sticht dabei die Klasse 0/21. Mit zwölfProzent der gesamt ausgewerteten Objekten fällt diese Klasse noch einmal deutlichaus den anderen Abweichungen heraus. Durch die schlechte Hybridisierung des Chro-mosomen 13 war das grüne Signal in diesen Spermien äußerst diffus. Die manuelleAuswertung hat dagegen einige diploide Spermien gewertet.Die Proben Nr. 2, 7 und 9 sind in der manuellen Auswertung ohne Auffälligkeiten.Auch der Spotcounter erzielt bei diesen beiden Proben gute Ergebnisse. Die Anzahlder detektierten Spermien, welche in abweichenden Klassen gewertet wurden, verteilensich besser über alle abweichende Klassen. Größere Ausreißer einer einzelnen Klassesind hier nicht zu erkennen. Circa Neunzig Prozent der Gesamtanzahl ausgewerteterSpermien wurden als unauffällige Objekte erkannt.Bei den Probe Nr. 3 und 6 stimmen manuelle und automatische Auswertung am besten

61

überein. Beide Ergebnisse durch den Spotcounter werten 97 Prozent in der Klasse 13/21und zeigen nur geringe Einteilungen in abweichende Klassen auf.

Die Probe Nr. 4 zeigt durch die automatische Auswertung ebenfalls eine gleichmäßigeVerteilung einiger Spermien in abweichende Klassen. Jedoch ist die Anzahl dieser Ob-jekte zur Gesamtanzahl ausgewerteter Objekte höher. Dadurch sinkt die Prozentzahlder unauffälligen Spermien auf unter neunzig Prozent.

Probe Nr. 5 erzielt durch die automatische Auswertung ein recht gutes Ergebnis. DieAnzahl der Spermien in Klasse 13/21 liegt bei über neunzig Prozent. Jedoch ist ähnlichwie bei der Probe Nr. 1 ein Ausreißer in eine abweichende Klasse zu erkennen.

Die Probe Nr. 10 war nur sehr dünn mit Spermien besiedelt. Die manuelle Auswertungkonnte nur 305 Spermien auf dem Objektträger, die zu einer Auswertung geeignetwaren, ausfindig machen. Der Spotcounter wertete 480 Spermien. Davon fallen dannallerdings 81 in auffällige Klassen. Die Prozentzahl der unauffälligen 13/21 Klasse sinktdadurch. Viele Spermien die der Spotcounter gewertet hat wurden vermutlich bei dermanuellen Auswertung direkt übersprungen.

Diese Testreihe liefert weitere Auswertungsergebnisse des Spotcounters, welche zur Be-rechnung der Schwellenwerte, der automatischen Spermien FISH -Diagnostik benötigtwerden.


Es wird der Test 13/21 in fünf Spermien Proben untersucht. Jede Probe wird dreimaldurch den Spotcounter ausgewertet. Einmal mit 500 auszuwertenden Objekten, dannmit 2000 auszuwertenden Objekten und mit 4000 auszuwertenden Objekten. Diese Ver-suchsreihe soll die letzten Ergebnisse zur Berechnung der Schwellenwerte für die Spot-counterauswertung bezüglich des Tests 13/21 liefern. Dargestellt wird die Versuchsreihein nachfolgenden Tabellen und Diagrammen.

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Tabelle 7.34.: Spermien Test 13/21, Variation Anzahl auszuwertender Objekte, Probe Nr. 1;Diagramm Darstellung Anzahl gewerteter Objekte in abnormalen Klassen

4000 Stück 2000 Stück 500 Stück13/21 8477 89% 1732 89% 471 91%Disomy21 134 1,4% 21 1,1% 3 0,5%Disomy13 418 4,4% 37 1,9% 11 2,1%13/0 115 1,2% 12 0,6% 9 1,7%0/21 220 2,3% 120 6,2% 18 3,5%Diploid 54 0,5% 7 0,5% 0 0,0%∑

9418 1929 512

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 90004000 Stück


0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 18002000 Stück


0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500500 Stück



4000 Stück 2000 Stück 500 Stück13/21 3361 89% 1597 86% 388 84%Disomy21 64 1,7% 32 1,7% 17 3,6%Disomy13 62 1,6% 31 1,6% 4 0,8%13/0 35 0,9% 33 1,8% 9 1,9%0/21 176 4,6% 146 7,8% 33 7,1%Diploid 62 1,6% 27 1,4% 11 2,3%∑

3761 1866 462

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 35004000 Stück


0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 18002000 Stück


0 50 100 150 200 250 300 350 400 450500 Stück


63


4000 Stück 2000 Stück 500 Stück13/21 3768 97,8% 2297 97,6% 492 98,6%Disomy21 18 0,5% 13 0,5% 1Disomy13 16 0,3% 6 913/0 7 1 10/21 25 0,6% 19 0,8% 4 0,8%Diploid 19 13 0,5% 1∑

3852 2353 499

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 35004000 Stück


0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 22002000 Stück


0 50 100 150 200 250 300 350 400 450500 Stück



4000 Stück 2000 Stück 500 Stück13/21 2936 88% 1468 87% 434 89%Disomy21 77 2,3% 52 3,2% 9Disomy13 130 3,9% 25 1,5% 10 2%13/0 20 0,6% 10 0,6% 70/21 98 2,9% 28 0,7% 8Diploid 66 1,9% 63 3,8% 18 3,7%∑

3327 1646 486

400 800 1200 1600 2000 2400 2800 32004000 Stück


0 200 400 600 800 1000 1200 1400 16002000 Stück


0 50 100 150 200 250 300 350 400 450500 Stück


64


4000 Stück 2000 Stück 500 Stück13/21 3666 95% 2190 91% 448 92%Disomy21 79 2% 7 3Disomy13 70 1,8% 37 813/0 22 0,5% 100 4,1% 90/21 52 1,3% 37 14 2,9%Diploid 19 13 0∑

3858 2384 482

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 35004000 Stück


0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 22002000 Stück


0 50 100 150 200 250 300 350 400 450500 Stück


Zu jedem Untersuchungslauf gibt es eine Tabelle und ein Diagramm. In der Tabelleist jeweils der prozentuale Wert der abweichenden Klasse markiert in der die meistenObjekte gewertet wurden.Bei der Probe Nr. 1 stimmen die Prozentzahlen in der unauffälligen Klasse 13/21 fastüberein. Dadurch wird ein Vergleich der drei Auswertungsstufen gut erkennbar. Leiderwurden in der Auswertungsstufe zu 4000 Spermien wesentlich mehr ausgezählt wodurchdieser Lauf nicht gewertet wird. Bei den Läufen zu 2000 und 500 auszuwertendenSpermien ist die gleiche Klasse Null21 als höchste abweichende Klasse markiert. Jedochist der Prozentsatz bei 2000 Spermien in der abweichenden Klasse fast doppelt so hoch.Die Probe Nr. 2 und 3 zeigt das in allen drei Auswertungsstufen die Klasse 13/21 imProzentsatz fast übereinstimmen. Auch ist bei allen drei Läufen dieselbe abweichendeKlasse Null21 mit dem höchsten Prozentsatz versehen. Hier hat der Lauf mit 4000auszuwertenden Spermien die geringste Abweichung in dieser Klasse.Probe Nr. 4 und 5 stimmen wiederum mit der Prozentzahl in der Klasse 13/21 weitesgehend überein. Bei beiden Proben sind unterschiedliche abweichende Klassen markiert,die den höchsten Prozentsatz aufzeigen.Aus den vier Versuchsreihen zu der automatisierten Spermien FISH – Auswertung

65

gehen elf Ergebnisse zu der Klasse 500 Spermien, 20 Ergebnisse zu der Klasse 2000Spermien und vier Ergebnisse zu der Klasse 4000 Spermien in die Schwellenberech-nung zur Auswertung durch den Spotcounter ein. Weitere Proben wurden durch denSpotcounter analysiert um die erforderliche Anzahl von 20. Läufen zu der Klasse 500Spermien und 10. Läufe zu der Klasse 4000 Spermien zu erreichen.

66

8. Ermittelte Schwellenwerte für die Auswertung

8.1. Auffälliger Befund bei der manuellen Auswertung

Untersuchungen von Chromosomenfehlverteilungen an Spermien für die hier untersuch-ten Chromosomen wurden bereits in mehrerern Studien an Normalpersonen durchge-führt. Hierbei wurden jeweils an Spendermaterial mindestens 10000 Spermien ausge-wertet und eine Frequenz an Fehlverteilungen zwischen 0,03% bis 0,5% beobachtet.(Templado)Für das bei Reprogenetics Germany GmbH untersuchte Patientenkollektiv ist aufgrundder häufig verminderten Anzahl von Spermien im Ejakulat die Auswertung einer sol-chen Anzahl von Spermien in der Regel nicht möglich. Deswegen können oft für jedenSondenmix etwa 500 Spermien ausgewertet werden. Jedes aufgefundene Spermium miteiner Chromosomenfehlverteilung treibt somit die Frequenz stark in die Höhe. NachVorversuchen an Patienten wurden folgende Schwellenwerte festgelegt. Ab diesen Wer-ten werden Proben als tendenziell auffällig bewertet. Werden diese Werte bei einermanuellen Auswertung durch Mitarbeiter des Labors (MTA) überschritten wird dasErgebnis durch einen Biologen nachgeprüft. Diese Schwellenwerte werden bei einer Aus-wertungsreihe von 500 Spermien herangezogen. Berechnet wurden die Schwellenwertewie unter Punkt 6.6. Schwellenwertbestimmung, allerdings wird für die Abweichung inProzent die dreifache Standardabweichung genommen.Schwellenwerte für den Test 13/21:

• Disomy21 >1,5%• Disomy13 >1,5%• 0/21 >1,5%• 0/13 >1,5%• Diploid >1,5%

Schwellenwerte für den Test 18XY:

• XY18 >2,5%• Disomy18 >1,5%• Diploid >2,5%• Wild18 1,5%

67

8.2. Auffälliger Befund bei der automatisierten Auswertung zudem Test 13/21

Alle Auswertungsergebnisse, welche zur Berechnung der Schwellenwerte herangezogenwurden sind im Anhang als Tabelle „Ergebnisse Test 13/21“ einzusehen. Hier wird nunder Mittelwert, die Standardabweichung und die maximal Zulässige Abweichung jederKlasse berechnet. Die durchgeführten Rechenschritte sind unter 6.6. Schwellenwertbe-stimmung erläutert.

Klasse mit 500 ausgewerteten Spermien:

Tabelle 8.1.: Mittelwert 500Disomy21 Disomy13 0/21 13/0 Diploid

i xi x2i xi x2

i xi x2i xi x2

i xi x2i

1 0 0 8 64 1 1 2 4 10 1002 7 49 2 4 1 1 6 36 7 493 5 25 1 1 30 900 0 0 0 04 17 289 11 121 17 289 24 576 12 1445 0 0 0 0 10 100 26 676 0 06 2 4 6 6 0 0 29 841 1 17 0 0 0 0 0 0 0 0 1 18 1 1 0 0 0 0 0 0 0 09 1 1 0 0 0 0 0 0 0 010 0 0 0 0 0 0 0 0 7 4911 0 0 0 0 0 0 0 0 1 112 0 0 0 0 0 0 0 0 0 013 1 1 0 0 0 0 0 0 0 014 0 0 0 0 0 0 0 0 2 415 1 1 0 0 0 0 0 0 0 016 1 1 0 0 0 0 0 0 9 8117 3 9 11 121 18 324 9 81 0 018 17 289 4 16 33 1089 9 81 11 12119 1 1 0 0 4 16 1 1 1 120 9 81 10 100 8 64 7 49 18 32421 3 9 8 64 9 81 14 196 0 0∑

69 761 61 497 131 2865 127 2541 80 885

• Berechnete Schwellenwerte für den Test 13/21:

– Disomy21 >1,74%– Disomy13 >1,42%– 0/21 >3,35%– 0/13 >3,18%– Diploid >1,89%

• Durchschnittliche Zeitdauer = 30 Minuten


68


i xi x2i xi x2

i xi x2i xi x2

i xi x2i

1 26 676 24 576 27 729 5 25 34 11562 2 4 8 64 11 121 1 1 6 363 52 2704 25 625 28 784 10 100 63 39694 29 841 32 1024 44 1936 13 169 42 17645 9 81 9 81 9 81 44 1936 6 366 17 289 48 2304 21 441 30 900 27 7297 23 529 22 484 29 841 0 0 11 1218 0 0 65 4225 0 0 32 1024 82 67249 61 3721 37 1369 37 1369 3 9 25 62510 13 169 6 36 19 361 5 25 13 16911 9 81 0 0 66 4356 28 784 16 25612 7 49 37 1369 37 1369 100 10000 13 16813 13 169 9 81 35 1225 2 4 14 19614 44 1936 46 2116 68 4624 12 144 52 270415 7 49 32 1024 44 1936 13 169 42 176416 29 841 37 1369 120 14400 12 144 7 4917 21 441 31 961 146 21316 33 1089 27 72918 32 1024 6 36 19 391 5 25 13 16919 13 169 25 625 28 784 10 100 0 020 52 2704 37 1369 37 1369 100 10000 13 169∑

459 16477 536 19738 825 58415 458 26648 506 21534






i xi x2i xi x2

i xi x2i xi x2

i xi x2i

1 65 4225 62 3844 176 30976 35 1225 62 38442 18 324 16 256 25 625 7 49 19 3613 77 5929 130 16900 98 9604 20 400 66 43564 79 6241 70 4900 52 2704 22 484 19 3615 26 676 55 3025 126 15876 167 27889 41 16816 41 1681 73 5329 237 56169 274 75076 43 18497 56 3136 57 3249 14 196 345 119025 12 1448 69 4761 102 10404 15 225 66 4325 102 104049 60 3600 295 87025 170 28900 543 294849 44 193610 48 2304 40 1600 16 256 407 165649 85 7225∑

539 32877 900 136532 929 145531 1886 689002 493 32161


– Disomy21 >1,86%

69

– Disomy13 >3,6%– 0/21 >4,3%– 0/13 >9,5%– Diploid >1,97%


Es ist nun deutlich zu erkennen, dass die Auswertungsstufe mit 500 Spermien in vierabweichenden Klassen Disomy21, Disomy13, 0/21 und Diploid die geringsten Prozent-zahlen aufweist. Diese Auswertungsstufe ist für den Test 13/21 im Sinne der automati-schen Auswertung zu empfehlen. Dahinter schließt sich die Auswertungsstufe mit 2000Spermien an, welche in der abweichenden Klasse 0/13 den geringsten Prozentsatz hat.Die Auswertungsstufe mit 4000 Spermien hat in allen abweichenden Klassen höhereProzentzahlen der maximalen Abweichung.Wie bei der manuellen Auswertung wird die maximal zulässige Abweichung in Pro-zent mit der dreifachen Standardabweichung für die Auswertungsstufen 500 und 2000Spermien hier berechnet:

(x+ (3 · s))Anzahl ausgewerteter Spermien · 100 = Abweichung in %

Somit lassen sich die endgültigen Schwellenwerte für die Auswertungsstufen 500 und2000 Spermien berechnen.Klasse mit 500 ausgewerteten Spermien:






70

8.2.1. Empfehlungen für die automatische Auswertung des Test 13/21

Aufgrund der vorangegangenen Ergebnisse ist für die automatisierte Spermien FISH -Diagnostik die Auswertungsstufe für 500 Spermien zu empfehlen. Diese Auswertungs-stufe konkurrierte zuletzt mit der Stufe von 2000 Spermien. Durch die kürzere Aus-wertungszeit, welche die Auswertungszeit von 2000 Spermien um durchschnittlich 45Minuten, unterschreitet ist diese Stufe klar zu favorisieren.

8.3. Auffälliger Befund bei der automatisierten Auswertung zudem Test 18XY

Die Schwellenwertberechnung für den Test 18XY erweitert diese Abschlussarbeit. Vor-nehmlich wurde der Test 13/21 für die automatisierte Auswertung herangezogen. Daim Laufe der Entstehung dieser Arbeit aber nicht darauf verzichtet werden sollte, fürden Test 18XY auch Schwellenwerte zu berechnen, werden die Ergebnisse in diesemAbschnitt vorgestellt. Es liegen für die Berechnung nicht so viele Versuchsergebnissevor wie für den anderen Test. So beschränkt sich die Anzahl der untersuchten Probenauf sechzehn Stück die sich alle in einer Klasse um die 1500 ausgewerteter Spermienansiedeln lassen.Klasse mit 1500 ausgewerteten Spermien:

Tabelle 8.4.: Mittelwert 1500X18 Diploid Disomy18 Wild18

i xi x2i xi x2

i xi x2i xi x2

i1 46 2116 16 256 9 81 18 3242 8 64 6 36 5 25 2 43 9 81 4 16 3 9 6 364 81 6561 15 225 18 324 6 365 38 1444 8 64 10 100 12 1446 4 16 4 16 10 100 4 167 24 576 4 16 2 4 0 08 36 1296 0 0 26 676 14 1969 10 100 10 100 14 196 19 36110 19 361 14 196 8 64 3 911 44 1936 4 16 6 36 8 6412 12 144 16 256 38 1444 22 48413 13 169 3 9 3 9 6 3614 8 64 9 81 3 9 6 3615 19 361 26 676 10 100 22 48416 77 5929 5 25 9 81 24 576∑

448 21218 144 1988 174 3258 172 2806

• Berechnete Schwellenwerte für den Test 18XY:

– XY18 >6,46%– Diploid >1,93%– Disomy18 >2,0%

71

– Wild18 >2,26%

8.3.1. Empfehlungen für die automatische Auswertung des Tests 18XY

Bei einer Auswertung durch den Spotcounter von 1500 Spermien bezüglich des Test18XY sind die in der Berechnung im vorangegangenen Punkt angegebenen Schwellen-werte zu beachten. 53. Am J Med Genet 76(4):318-326(1998)

53Dewald G, Stallard R, Al Saadi A, Arnold S, Bader PI, Blough R, Chen K, Elejalde BR, Harris CJ,Higgins RR, Hoeltge GA, Hsu WT, Kubic V, McCorquodale DJ, Micale MA, Moore JW, PhillipsRM, Scheib-Wixted S, Schwartz S, Siembieda S, Strole K, VanTuinen P, Vance GH, Wiktor A,Zinsmeister A: A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization usingX- and Y-chromosome probes

72

Teil IV.

Diskussion

73

9. Eignung des Spotcounters

Zu der Präimplantationsdiagnostik gehört die Untersuchung von Spermien in Bezugauf die Auffindung von Chromosomenfehlverteilungen. Als diagnostisches Verfahrenfür die Erfüllung dieser Aufgabenstellung wird häufig die Spermien-FISH Analyse ge-macht. Chromosomen werden mit DNA-Sonden markiert und anschließend numerischausgewertet. Ob diese Auswertung maschinell unterstützt werden kann wird durch dieErgebnisse aus den Versuchsreihen geklärt.Anhand der gewonnenen Ergebnisse aus den Versuchsreihen ist es gelungen den Spot-counter als automatisches Auswertungsverfahren für die Spermien FISH -Analyse ein-zusetzen. Über zahlreiche Auswertungen von Präparaten, besonders schon im Vorlaufbei den Lymphozyten Proben, konnten die verschiedenen Parameter der Auswertungs-software auf die Spermien FISH -Diagnostik angepasst werden. Die berechneten Schwel-lenwerte sind als Hinweis zu verstehen, bei ihrer Überschreitung in der Spermien- FISHAuswertung liegt möglicherweise ein auffälliger Befund vor. Solche Proben sollten ma-nuell durch ausgebildetes Laborpersonal nachgeprüft werden. Maßgeblich entscheidendüber die Richtigkeit einer Auswertung ist bei der automatisierten Analyse die Beschaf-fenheit einer Probe. Da durch den Spotcounter auch Areale auf dem Objektträgerausgewertet werden die bei einer manuellen Auswertung übersprungen werden, da sieals nicht repräsentativ für die Probe anzusehen sind, können erhebliche Abweichun-gen zwischen manuellem und automatisiertem Ergebnis resultieren. Deswegen wird imnächsten Abschnitt auf die Eigenschaften einer geeigneten Probe für die automatisierteSpermien FISH -Diagnostik eingegangen. 54

Der Zeitfaktor bei der Auswertung einer Probe spielt ebenfalls eine wichtige Rolle. Dieautomatisierte Auswertung einer Spermien FISH -Probe für den Test 13/21 liegt dabeidurchschnittlich bei 30 Minuten. Diese Auswertungszeit ist fast doppelt so hoch wie beider manuellen Auswertungszeit, die bei 16 Minuten liegt, dieser Wert kann aber auchdrastisch unterschritten werden, wenn die Besiedlung des Präparates dicht ist. Aller-dings benötigt der Spotcounter, sobald ein Präparat eingelegt ist und die Auswertunggestartet wurde keine weitere Beaufsichtigung. So könnten Labormitarbeiter währendder Spotcounter zählt anderen Tätigkeiten nachgehen.

54Carrell DT, Emery BR.: Use of automated imaging and analysis technology for the detection ofaneuploidy in human sperm.Fertil Steril 90(2):434-437(2007)

74

10. Eigenschaften einer geeigneten Probe

Die auf dem Objektträger befindlichen Objekte sollten klar voneinander abgegrenztsein. Regionen, in denen sich Verklumpungen aufzeigen, sind nicht für die automatischeAuswertung geeignet. Hier verliert der Spotcounter viel Zeit, detektiert dabei oftmalsmehrere Objekte als eines und erhält somit falsche Spotkonfigurationen. Auch bei dergegenteiligen Beschaffenheit einer Probe, sie ist dünn besiedelt und zeigt in vielenArealen keine Objekte auf, ist die Auswertung durch den Spotcounter weniger geeignet.Die automatische Auswertung eines solchen Präparates beansprucht im Vergleich vielZeit. Das Ergebnis ist dann häufig nicht aussagekräftig da zu wenige Objekte detektiertwurden.Die Form und Größe der zu detektierenden Objekte sollten dem erwartetem Erschei-nungsbild entsprechen. Weichen sie von der Größe ab oder zeigen andere Formen aufwerden sie nicht als auswertbares Objekt erkannt. Dabei zeigen unauffällige Objektemeist das erwartete Erscheinungsbild und auffällige können in der Form variieren. Sokönnen dem Spotcounter Objekte mit auffälliger Spotkonfiguration entgehen.Die Hybridisierung der Sonden am Chromosom sollte gut gelungen sein. Dann hebtsich jeder einzelne Spot klar von der eingefärbten Zelle ab. Die Sonde hat sich nuran dem für die Auswertung vorgesehenen Chromosomenabschnitt angelagert. Somitbesteht kein Farbschleier über das Präparat und der Spot zeigt sich in zu erwartenderGröße und Farbprägnanz.Die genannten Eigenschaften beeinflußen die automatisierte Auswertung maßgeblich.Treffen sie nicht zu ist die automatische Auswertung unzuverlässig und noch nichtanwendbar. 55

55Molina O, Sarrate Z, Vidal F, Bianco J: FISH on sperm: spot-counting to stop counting? Not yet..FertSteril 92:1474-1480

75

11. Vergleich der Schwellenwerte

Die berechneten Schwellenwerte für die automatisierte Auswertung, beruhend auf denErgebnissen der Versuchsreihen, überschreiten die gültigen Schwellenwerte der manu-ellen Auswertung des Labors Reprogenetics Germany GmbH. Dies spiegelt die Diskre-panz zwischen manueller und automatischer Auswertung und deren unterschiedlichenHerangehensweisen zur Auswertung einer Probe wieder.

76

12. Überschreitung der Schwellenwerte

12.1. Vorgehen bei der manuellen Auswertung durch MTA

Wird bei einer Spermienprobe eine Auffälligkeit, auch im Sinne einer Überschreitungdurch das Labor vorgegebenen Schwellenwerte, wird diese Probe gesondert behandelt.Der Normalfall sieht vor,dass die Positionen, der entdeckten, auffälligen Spermien no-tiert werden. Nun wird ein Biologe zu rate gezogen der sich die auffälligen Spermien,bei denen die Spots von der Normlkonfiguration abweichen nocheinmal begutachtet.Gemäß der gewonnenen Erkenntnisse über die Anomaliestruktur der Spermien wirdein Befund durch den Biologen gestellt. Im ersten Schritt wird oftmals eine Vergleichs-probe angefordert. Zeigt die zweite Probe dieselben Auffälligkeiten, wird die Diagnosedurch den Biologen gestellt.

12.2. Vorgehen bei der automatischen Auswertung durch denSpotcounter

Werden Schwellenwerte der automatisierten Spermien- FISH Auswertung durch denSpotcounter in auffälligen Klassen überschritten, ist eine manuelle Nachkontrolle durchMTAs des Labores erforderlich. Bei dieser Nachkontrolle sollte eingegangen werdenauf die Beschaffenheiten der Probe und ob diese im Zusammenhang mit geeignetenProbenbeschaffenheiten für die Spotcounteranalyse stehen. Ist dies der Fall, sollten dieFotos der Objekte, welche in auffälligen Klassen gewertet wurden, manuell nachsortiertwerden. Die auffällige Probe kann auch komplett das manuelle Auswertungsverfahrendurchlaufen. Treten dabei ebenfalls Auffälligkeiten der Probe auf, oder decken sich diesesogar mit denen der automatischen Auswertung sollte weiter vorangegangen werden wiedas Verfahren im vorangegangenen Abschnitt beschrieben ist. Sind die Eigenschaftender Probe nicht für die automatische Auswertung geeignet, sollte von einer Auswertungdurch den Spotcounter abgesehen werden und die Probe durchläuft den manuellenAuswertungsweg.

77

13. Zusammenfassung

Die Zielsetzung der Arbeit war es herauszustellen ob sich die Spermien-FISH Diagnos-tik unter Anwendung eines Spotcounters automatisieren lässt. Dafür wurden Hardware-und Softwarekomponenten sowie Probenmaterial und DNA-Sonden benötigt. In sechsVersuchsreihen wurden Einstellungsparameter der Software vorgenommen. In den Ver-suchsreihen gewonnene Ergebnisse erlaubten die Festlegung von Schwellenwerten fürdie Erkennung auffälliger- bzw. pathologischer Proben. Es wurde deutlich, dass die au-tomatisierte Spermien-FISH Diagnostik bei bestimmten Probenmaterial einsetzbar ist.Genauso deutlich wurde allerdings auch, dass durch Probeneigenschaften die automa-tisierte Auswertung unzuverlässig ist.

78

Teil V.

Anhang

79

A. Tabellen

Tabelle A.1.: Tabelle Ergebnisse Test 13/21Anz. Pro-ben

13/21 Disomy21 Disomy13 0/21 13/0 Diploid

1 372 0 8 1 2 102 360 7 2 1 6 73 157 5 1 30 0 04 323 17 11 17 24 125 199 1 8 10 26 06 627 26 24 27 5 347 777 2 8 11 1 68 1468 52 25 28 10 639 1535 29 32 44 13 4210 1845 9 9 9 44 611 1660 17 48 21 30 3012 1619 23 22 29 0 213 1394 0 65 0 32 8214 2004 61 37 37 3 2515 2297 13 6 19 5 1316 1430 9 0 66 28 1617 2190 7 37 37 100 1318 2142 13 9 35 2 1419 1410 44 46 68 12 5220 1535 29 32 44 13 4221 399 2 6 0 29 122 304 0 0 0 0 123 587 1 0 0 0 024 548 1 0 0 0 025 514 0 0 0 0 726 502 0 0 0 0 127 502 0 0 0 0 028 579 1 0 0 0 029 504 0 0 0 0 230 501 1 0 0 0 031 520 1 0 0 0 932 1732 21 37 120 12 733 3361 65 62 176 35 6234 3768 18 16 25 7 1935 2936 77 130 98 20 6636 3666 79 70 52 22 1937 471 3 11 18 9 038 1597 32 31 146 33 2739 2297 13 6 19 5 1340 1468 52 25 28 10 041 2190 7 37 37 100 1342 388 17 4 33 9 1143 492 1 0 4 1 144 434 9 10 8 7 1845 448 3 8 9 14 046 4383 26 55 126 167 4147 2975 41 73 237 274 4348 3405 56 57 14 345 1249 2887 69 102 15 66 10250 2547 60 295 170 543 4451 2527 48 40 16 407 85

80

Literaturverzeichnis

[1] Tariverdian G, Paul M: Genetische Diagnostik in Geburtshilfe und Gynäkologie.Springer Verlag1. Deutschland 1999.

[2] Strachan T, Read A P: Molekulare Humangenetik. Spektrum Verlag3. Deutschland 2005.

[3] Leitch A R,Schwarzacher T, Jackson D,Leitch I J: In situ-Hybridisierung.ScientificPublisher Limited. England 1994.

[4] Passarge E, Wirth J: Taschenatlas der Genetik. Thieme2. Deutschland 2003.

[5] Papula, Lothar: Mathematische Formelsammlung. Vieweg Verlag. Deutschland 2006.

[6] Bedienungsanleitung Olympus BX61.

[7] Broschüre: Olympus, Your Vision, Our Future.

wissenschaftliche Arbeiten:

[8] Engel W, Schmid M, Pauer H U: Genetik und mikroassistierte Reproduktion durchintrazytoplasmatische Spermieninjektion. Dtsch Ärztebl 95:1902–1908(1998).

[9] Escudero T, Abdelhadi I, Sandalinas M, Munne S: Predictive value of spermfluorescence in situ hybridization analysis on the outcome of preimplantation geneticdiagnosis for translocations. FERTILITY AND STERILITY 79:1528–1534(2003).

[10] Schad CR, Kuffel DG, Wyatt WA, Zinsmeister AR, Jenkins RB, Dewald GW, JalalSM: Application of fluorescent in situ hybridization with X and Y chromosome specificprobes to buccal smear analysis. Am J Med Genet 66(2):187–192(1996).

[11] Dewald G, Stallard R, Al Saadi A, Arnold S, Bader PI, Blough R, Chen K, ElejaldeBR, Harris CJ, Higgins RR, Hoeltge GA, Hsu WT, Kubic V, McCorquodale DJ, MicaleMA, Moore JW, Phillips RM, Scheib-Wixted S, Schwartz S, Siembieda S, Strole K,VanTuinen P, Vance GH, Wiktor A, Zinsmeister A: A multicenter investigation withinterphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am JMed Genet 76(4):318–326(1998).

[12] Carrell DT, Emery BR.: Use of automated imaging and analysis technology for thedetection of aneuploidy in human sperm. Fertil Steril 90(2):434–437 (2007).

[13] Molina O, Sarrate Z, Vidal F, Bianco J: FISH on sperm: spot-counting to stopcounting? Not yet.. Fert Steril 92:1474–1480.

Internetquellen:

[14] Künstliche Befruchtung:http://de.wikipedia.org/wiki/K%C3%BCnstliche_Befruchtung (zuletzt abgerufenam 15.7.2013)

81

http://de.wikipedia.org/wiki/K%C3%BCnstliche_Befruchtung

[15] In situ-Hybridisierung: http://de.academic.ru/dic.nsf/dewiki/652139 (zuletztabgerufen am 7.7.2013)

[16] Spermien FISH-Analyse:http://www.reprogenetics-hh.de/pages/sperm-FISH.html (Zuletzt abgerufen am7.7.2013)

[17] ASI Automatic Spot Counting: http://www.spectral-imaging.com/applications/cytogenetics/automated-fish-scanning-research/automatic-spot-counting2(Zuletzt abgerufen am 9.7.2013)

[18] Aneuvision Multicolor DNA Probenmix: http://www.abbottmolecular.com/us/products/genetics/fish/prenatal-genetics-testing-aneuvysion.html (Zuletztabgerufen am 7.7.2013)

82

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http://www.reprogenetics-hh.de/pages/sperm-FISH.html





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