extraktion von lebensmitteln und...

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen

mit Hilfe von überkritischem Kohlendioxid zur Bestimmung von Pflanzenbehandlungsmitteln

und anderen Bestandteilen

Abschlußbericht

M. Anastassiades

15. Nov. 1995 bis 15. Aug. 1998

Chemisches- und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2 2

Inhaltsverzeichnis

0. ZUSAMMENFASSUNG 6

1. EINLEITUNG 9

1.1 ZIELSETZUNG 9

1.2 APPARATIVE VORAUSSETZUNGEN 9

1.3 SFE ALS ALTERNATIVE ZU HERKÖMMLICHEN EXTRAKTIONSVERFAHREN 9

2. DAS EXTRAKTIONSVERFAHREN 11

2.1 EINFÜHRUNG IN DIE SFE 11

2.2 PHYSIKALISCHE GRUNDLAGEN DES VERFAHRENS 13

2.3 MÖGLICHKEITEN ZUR OPTIMIERUNG VON SFE-EXTRAKTIONEN 14 2.3.1 DIE ROLLE DER TEMPERATUR 15

2.3.2 DIE ROLLE DES DRUCKES 15

2.3.3 DIE ROLLE DER MATRIX 15

2.3.4 DIE ROLLE VON MODIFIERN 16

2.4 AUFBAU EINES SFE-EXTRAKTORS 16

2.5 ABLAUF EINER EXTRAKTION 17

2.6 ENTWICKLUNG EINER SFE-METHODE 18 2.6.1 PROBENVORBEREITUNG 18

2.6.2 GERÄTEEINSTELLUNGEN - OPTIMIERUNG DER EXTRAKTIONSBEDINGUNGEN 19

3. APPLIKATIONEN 20

3.1 ANALYTIK VON PFLANZENSCHUTZMITTELRÜCKSTÄNDEN IN OBST UND GEMÜSE 20 3.1.1 EINLEITUNG 20

3.1.2 OPTIMIERUNG DER MEßBEDINGUNGEN 22 3.1.2.1 Wahl des Einspritz- und Detektionsystems 22 3.1.2.2 Einflüsse des Injektionssystems und „Matrixeinflüsse“ 24 3.1.2.3 Berücksichtigung der „Matrixeinflüsse“ bei der Bestimmung 29

3.1.3 OPTIMIERUNG DER PROBENVORBEREITUNG 32

Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach


3.1.3.1 Zerkleinerung (Erzeugung repräsentativer Teilproben) 32 3.1.3.2 Entfernung bzw. Immobilisierung von Wasser 35

3.1.3.2.1 Wasserentfernung durch Gefriertrocknung 35 3.1.3.2.2 Wasserbindung durch Adsorbentien 35

3.1.4 SFE-MULTIMETHODEN FÜR PESTIZIDE IN OBST UND GEMÜSE 36 3.1.4.1 Optimierung der Extraktionsbedingungen 36 3.1.4.2 Durchführung der Multimethode 39 3.1.4.3 Wiederfindungsversuche 41

3.1.4.3.1 Vorgehensweise bei Dotierungen 41 3.1.4.3.2 Wiederfindungen mit HP 7680T 41 3.1.4.3.3 Wiederfindungen mit ISCO SFX 3560 46

3.1.4.4 Nachweis- und Bestimmungsgrenzen 47 3.1.4.5 Methodenvergleich 48 3.1.4.6 Matrixbezogene Multimethoden 51

3.1.4.6.1 Pestizide in Zitrusfrüchten 51 3.1.4.6.2 Pestizide in Kernobst 54 3.1.4.6.3 Pestizide in Beerenobst 55 3.1.4.6.4 Pestizide in Tafeltrauben 56

3.1.4.7 Einflüsse verschiedener Parameter auf die Extraktionsausbeuten 59 3.1.4.7.1 Einfluß der Zerkleinerung auf die Probenhomogenität 59 3.1.4.7.2 Einfluß der Polarität der Analyten auf die Extrahierbarkeit 59 3.1.4.7.3 Einfluß des Wassergehaltes auf die Extrahierbarkeit unpolarer Analyten 60 3.1.4.7.4 Abbau von Pestiziden während der Lagerung im Autosampler 62

3.1.5 ENTWICKLUNG VON SCHNELLEN BESTIMMUNGSMETHODEN FÜR SPEZIELLE PESTIZIDKLASSEN MIT ANALYTISCHEN DEFIZITEN 64

3.1.5.1. Einleitung 64 3.1.5.2 Naßchemische Untersuchungen im Vorfeld 65

3.1.5.2.1 Rolle des pH-Wertes bei Extraktion und Flüssig-Flüssig-Verteilung 65 3.1.5.2.2 Wechselwirkungen von Wirkstoffen mit Oberflächen 65

3.1.5.3 Pestizide mit basischen Eigenschaften 70 3.1.5.3.1 Einfluß des pH-Wertes auf die Extrahierbarkeit (vgl. Kap. 3.1.4.7.2) 70 3.1.5.3.2 Carbendazim, Benomyl und Thiophanat-Methyl 73

3.1.5.3.2.1 Umwandlung von Benomyl zu Carbendazim 74 3.1.5.3.2.2 Thiophanat-Methyl 76 3.1.5.3.2.3 Derivatisierung von Carbendazim mit PFB-Br im GC-Vial 81 3.1.5.3.2.4 Bestimmung mittels GC-MSD 81 3.1.5.3.2.5 Validierung 82 3.1.5.3.2.6 Extraktion von „gewachsenen“ Carbendazim-Rückständen aus Keltertrauben 83 3.1.5.3.2.7: SFE- und DFG-Methode zur Bestimmung der Carbendazim-Gruppe im Kostenvergleich 84

3.1.5.4 Saure Pestizide 86 3.1.5.4.1 Einführung 86 3.1.5.4.2 2,4-D-Rückstände in Zitrusfrüchten 86 3.1.5.4.3 Extraktion von freiem 2,4-D 87 3.1.5.4.4 Freisetzung von gebundenen 2,4-D-Rückständen 87 3.1.5.4.5 Derivatisierungsmöglichkeiten von Phenoxyalkancarbonsäuren 89 3.1.5.4.6 Bestimmung mittels GC-MSD 92 3.1.5.4.7 Validierung 93 3.1.5.4.8 Behandlung von Zitronen mit 2,4-D und Lagerungsversuch 94 3.1.5.4.9 Freisetzung von gebundenem 2,4-D aus Zitrusfrüchten bei simulierter Verdauung und simulierter Verarbeitung 97

3.1.5.5 N-Methyl-Carbamate 100 3.1.5.5.1 Einführung 100

3.1.5.5.1.1 Analytik 103



3.1.5.5.2 Bestimmung von N-Methyl-Carbamaten nach Extraktion mittels SFE 103 3.1.5.5.2.1 Übersicht 103 3.1.5.5.2.2 Extraktion mit SFE 105 3.1.5.5.2.3 Direkte Bestimmung mittels GC-MSD (KAS3-Gerstel) 105 3.1.5.5.2.4 Bestimmung mittels GC-MSD nach Derivatisierung 106 3.1.5.5.2.5 Bestimmung mittels LC-MSD 108 3.1.5.5.2.6 Wiederfindungen 113 3.1.5.5.2.7 Abbau in der Extraktionshülse 114

3.1.5.6 Organozinn-Pestizide 117 3.1.5.6.1 Einleitung 117 3.1.5.6.2 Extraktion mit SFE 119 3.1.5.6.3 Optimierung der Derivatisierung mit Grignard-Reagenz 119 3.1.5.6.4 Bestimmung mittels GC-MSD 124 3.1.5.6.5 Bestimmung mittels LC-MSD (API-Elektrospray) 127 3.1.5.6.6 Wiederfindungsversuche 129

3.1.6 BEISPIELE AUS DER PRAXIS DER LEBENSMITTELÜBERWACHUNG 131 3.1.6.1 Bestimmung von Pyrimethanil und Diethofencarb in Keltertrauben 131 3.1.6.2 Untersuchung von Carbendazim in Obst und Gemüse 133 3.1.6.3 Untersuchung von 2,4-D in Zitrusfrüchten 136

3.1.7 UNTERSUCHUNG VON RINGVERSUCHSPROBEN 137 3.1.7.1 European Commission´s Proficiency Tests on Pesticide Residues in Fruit and Vegetables 1996/1997 137

3.1.7.1.1 Proficiency Test I 137 3.1.7.1.2 Proficiency Test II 139

3.2 EINSATZ DER SFE IN DER ANALYTIK VON BEDARFSGEGENSTÄNDEN 141 3.2.1 EINLEITUNG 141

3.2.2 DI-ISOPROPYL-NAPHTHALIN IN PAPIER 142 3.2.2.1 Einführung 142 3.2.2.2 Bestimmungsverfahren 142

3.2.2.2.1 naßchemisches Verfahren 142 3.2.2.2.2 Extraktion mittels SFE 142 3.2.2.2.3 Bestimmung mittels GC/MSD 143

3.2.2.3 Extraktion von Proben aus dem Handel 146

3.2.3 PCP (PENTACHLORPHENOL) AUS HOLZ UND TEXTILIEN 149 3.2.3.1 Einführung 149 3.2.3.2 Bestimmung von PCP 149

3.2.3.2.1 naßchemisches Verfahren 149 3.2.3.2.2 SFE-Methode 149

3.2.3.2.2.1 Probenaufarbeitung 149 3.2.3.2.2.2 Extraktion mit ISCO SFX 3560 150 3.2.3.2.2.3 Derivatisierung mit PFB-Br 150

3.2.3.2.3 Wiederfindungen und Untersuchung PCP-haltiger Seide 151 3.2.3.2.4 Optimierung der Extraktion 151

3.2.3.3 Untersuchung von Planproben 153 3.2.3.4 Fazit 153

3.2.4 EXTRAKTION VON ANTIOXIDANTIEN AUS KUNSTSTOFF 154 3.2.4.1 Einführung 154 3.2.4.2 Bestimmung von Antioxidantien 154

3.2.4.2.1 naßchemisches Verfahren 154 3.2.4.2.2 SFE-Methode 154

3.2.4.2.2.1 Probeneinbringung in die SFE-Hülse 154 3.2.4.2.2.2 Extraktion mit ISCO SFX 3560 155



3.2.4.2.3 Untersuchung von Proben mit bekannter Rezeptur 155 3.2.4.2.3.1 untersuchte Antioxidantien 155 3.2.4.2.3.2 Probenmaterial 156 3.2.4.2.3.3 Untersuchungsergebnisse 156 3.2.4.2.3.4 Variation der SFE-Parameter 157

3.2.4.2.4 Fazit 157

4. SCHLUßFOLGERUNGEN 159

4.1 BEWERTUNG DER SFE ALS EXTRAKTIONSVERFAHREN 159

4.2 BEWERTUNG DER VERWENDETEN EXTRAKTIONSGERÄTE 160

4.3 ALLGEMEINE ANALYTISCHE ERKENNTNISSE 161

4.4 AUSBLICK 161

5. ABKÜRZUNGEN 163

6. LITERATUR 166



0. ZUSAMMENFASSUNG

Problemstellung Die amtliche Lebensmittelüberwachung steht ständig vor neuen analytischen Heraus-forderungen (neue Wirkstoffe und Kontaminanten, Monitoring-Programme). Deshalb besteht bei den Untersuchungseinrichtungen zunehmend Bedarf an schnellen, kostengünstigen und automatisierten Analysenverfahren. Aus wirtschaftlichen, gesund-heitlichen und ökologischen Gründen sind die Laboratorien zudem bemüht, den Lösungsmittelverbrauch soweit wie möglich zu senken. Ziel Die Möglichkeiten und Grenzen der SFE (Supercritical Fluid Extraction) als Extraktions-verfahren im Bereich der Lebensmittelanalytik sollten untersucht werden. Dieses Verfahren, bei dem das zu untersuchende Probenmaterial, statt wie herkömmlich mit organischen Lösungsmitteln, mit überkritischem Kohlendioxid extrahiert wird, ist erst seit wenigen Jahren durch die Entwicklung entsprechender automatisierter Geräte in Laboratorien einsetzbar. Für bestimmte analytische Fragestellungen wie z.B. Pestizid-rückstände in Obst und Gemüse und Additive und Verunreinigungen in Bedarfs-gegenständen sollten Methoden entwickelt werden, die im Vergleich zu den herkömmlichen schneller sind, einen geringeren Lösungsmittelverbrauch haben, weniger manuelle Arbeitsschritte benötigen und dadurch wirtschaftlicher sind. Vorgehensweise Zunächst wurden Versuche zur Optimierung der Probenvorbereitung durchgeführt. Da bei der SFE nur geringe Probenmengen eingesetzt werden können, ist eine gründliche aber dennoch schonende Feinzerkleinerung des Probenmaterials erforderlich. Um eine möglichst effiziente aber dennoch selektive Extraktion zu erreichen, wurden die SFE-Geräteparameter wie Extraktionszeit, -druck, -temperatur und -flußrate variiert. Um auf eine aufwendige Reinigung der Extrakte verzichten zu können, wurden selektive Meßverfahren eingesetzt und optimiert. Für bestimmte Substanzen wurden Derivatisierungsmethoden entwickelt, und so eine empfindlichere und selektivere Messung erzielt. Die entwickelten SFE-Methoden wurden validiert und die erzielten Ergebnisse mit denen herkömmlicher Methoden verglichen.



Ergebnis 1. Bei Extraktion von Obst und Gemüse mittels SFE ist auf den Wassergehalt der

eingesetzten Proben zu achten, da Wasser sowohl den Extraktionsprozeß positiv wie negativ beeinflussen als auch ggf. das Gerät beschädigen kann. Durch Vermengung der Proben mit speziellen Adsorbentien (z.B. auf Silikatbasis) konnte der Feuchtigkeitsgrad eingestellt werden.

2. Es wurden Wiederfindungsversuche für mehr als 120 verschiedene Pestizide durchgeführt. Für fast alle der untersuchten Stoffe wurden Wiederfindungen zwischen 70 und 110 %, in der Regel zwischen 80 und 95 % erreicht. Für einige ausgewählte Verbindungen wurden die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen nach dem DFG Eichgeradenverfahren ermittelt. Bei Mehrfachbestimmungen von Proben aus dem Handel wurde eine gute Wiederholbarkeit (Variationskoeffizienten meist zwischen 2 und 6 %) festgestellt. Die mit Hilfe der entwickelten SFE-Methoden erzielten Untersuchungsergebnisse von Proben aus dem Handel stimmen mit den Ergebnissen herkömmlichen Verfahren gut überein. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen, daß die SFE zur Routineanalytik von Pestizidrückständen in Obst und Gemüse hervorragend eingesetzt werden kann, dies hat sich auch bei einer Laborvergleichsuntersuchung gezeigt (EU Proficiency Test I und II 1996,1997).

3. Neben den Einstellungen des Extraktionsgerätes wurde auch der Einfluß weiterer analytischer Parameter auf die Extrahierbarkeit verschiedener Analyten am Beispiel ausgesuchter Pestizide untersucht.

3.1 Polarität der Analyten: Da überkritisches Kohlendioxid ein recht unpolares

Lösungsmittel ist, ist es gut zur Extraktion von unpolaren bis mittelpolaren Pestiziden geeignet. Polarere Pestizide werden dagegen nur unvollständig extrahiert.

3.2 pH-Wert: Bei Verbindungen mit sauren oder basischen Eigenschaften kann die

Extrahierbarkeit bedeutend verbessert werden, wenn der pH-Wert der zu extrahierenden Proben entsprechend alkalisch oder sauer eingestellt wird (Bsp. Carbendazim und 2,4-D).

3.3 Feuchtigkeitsgehalt: Bei unpolaren Pestiziden spielt der Feuchtigkeitsgehalt der

Probe eine wichtige Rolle. Mit zunehmendem Wasseranteil werden für diese Substanzen schlechtere Wiederfindungen erzielt. Durch Zugabe von größeren Mengen Adsorbens können solche Substanzen wesentlich besser extrahiert werden (Bsp. Pyrethroide, chlororganische Pestizide).

3.4 Abbau: Es wurde festgestellt, daß einige Pestizide einen signifikanten Abbau

zeigen, wenn die Extraktionshülsen bei Raumtemperatur gelagert werden. Um diesen Abbau zu minimieren, sollten Proben, die solche empfindlichen Stoffe ent-halten, bis zur Extraktion im Gefrierschrank aufbewahrt und erst kurz vor der Extraktion in den Probengeber eingestellt werden.

4. Umfassende Untersuchungen wurden auch im Bereich der Messung durchgeführt. Für viele Substanzen ist eine Kalibrierung nach dem Standardadditionsverfahren notwendig, da anderenfalls infolge der Matrixeinflüsse falsche Ergebnisse erzielt



werden. Für einige Verbindungen, deren gaschromatographische Bestimmung Schwierigkeiten bereitet, wurden einfach durchzuführende Derivatisierungsmethoden entwickelt, die direkt nach der SFE-Extraktion in den Vorlagegefäßen durchgeführt werden können (Bsp. N-Methyl-Carbamate, Carbendazim, Thiabendazol, Organo-Zinn-Verbindungen).

5. Im Bereich der Bedarfsgegenstände wurden Methoden zur Extraktion von

Pentachlorphenol aus Holz- und Stoffproben sowie von Di-Isopropyl-Naphthalin aus Recycling-Papier entwickelt. Desweiteren wurden Additive mit antioxidativer Wirkung aus Kunststoffen extrahiert, und dabei mit herkömmlichen Methoden vergleichbare Ergebnisse erzielt.

Konsequenz für die Praxis Die erarbeiteten Methoden wurden noch während der Forschungsarbeiten in der Praxis der amtlichen Lebensmittelüberwachung erprobt und eingesetzt. Verschiedene Pestizide, die bisher routinemäßig nicht erfaßt wurden, konnten somit als Rückstände in Lebensmitteln festgestellt werden. Mit SFE-Methoden wurde 1996 und 97 erstmalig in größerem Umfang auf Rückstände der Carbendazim-Gruppe in Obst und Gemüse und auf Rückstände an 2,4-D in Zitrusfrüchten untersucht. Damit wurde ein wichtiger Beitrag zur Beschreibung der Rückstandssituation dieser Stoffe geleistet. Die erarbeiteten Multimethoden erfordern einen geringen Arbeitsaufwand und ermöglichen einen hohen Probendurchsatz. Daher bietet sich die Möglichkeit die SFE für routinemäßige Pestizidrückstandsuntersuchungen z.B. für Monitoringprogramme einzusetzen. Den durchgeführten Untersuchungen zufolge kann die SFE auch im Bereich der Bedarfsgegenständeanalytik sehr erfolgreich eingesetzt werden, wie am Beispiel von PCP in Holz und Di-Isopropyl-Naphthalin in Papier gezeigt wurde. Bisherige Veröffentlichungen: • Bestimmung von Carbendazim, Benomyl, Thiophanat-Methyl und 2,4-D in pflanz-

lichen Proben nach Extraktion mit überkritischem Kohlendioxid Lebensmittelchemie 52 (1998) 13 und Lebensmittelchemie 52 (1998) 74

• Analysis of Carbendazim/Benomyl, Thiophanate Methyl and 2,4-D in Fruits and Vegetables after Supercritical Fluid Extraction Journal of Chromatography A 825 (1998) 45-54

• Analysis of Several N-Methyl-O-Aryl-Carbamates in Fruits and Vegetables after Supercritical Fluid Extraction (SFE) 9th IUPAC International Congress - Pesticide Chemistry, Books of Abstracts, Volume II

• Analysis of Pesticide Residues in Fruits and Vegetables by SFE and GC-MSD / LC-MSD Tagungsband Int. SFE/SFC/XSE-Forum, Siegen 1998

Schlagworte: SFE, Rückstandsanalytik, Lebensmittel, Bedarfsgegenstände



1. EINLEITUNG

1.1 ZIELSETZUNG

Erste Versuche mit der SFE an der CLUA Stuttgart Anfang 1995 [4], sowie einzelne Veröffentlichungen [1,2] ließen die vielfältigen Möglichkeiten, die die SFE im Bereich der Lebensmittelanalytik und insbesondere der Rückstandsanalytik bietet, vermuten. Um diese potentiellen Möglichkeiten zu konkretisieren, wurde im Frühsommer 1995 ein Antrag auf Forschungsmittel mit dem Titel:

„Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von über-kritischem Kohlendioxid zur Bestimmung von Pflanzenbehandlungsmitteln und

anderen Bestandteilen“ gestellt. Im Juli 1995 wurde der Antrag genehmigt:

Die Chemische Landesuntersuchungsanstalt Stuttgart wird gebeten, ein

Forschungsprojekt zur Überprüfung der Anwendbarkeit der „Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem Kohlendioxid zur Bestimmung von Pflanzenbehandlungsmitteln und anderen Bestandteilen“ durchzuführen. Im Rahmen dieses Projekts soll in einer wissenschaftlichen Arbeit untersucht werden, inwieweit die Extraktion mit überkritischem Kohlendioxid in der Praxis der Untersuchungen im Rahmen der Lebensmittelüberwachung eingesetzt werden kann, um • umweltbelastende Lösungmittel zu vermeiden, • durch Automatisierung Einsparungen zur erzielen, • Stoffe aus Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen zu extrahieren.

1.2 APPARATIVE VORAUSSETZUNGEN

Für die Durchführung der SFE-Extraktionen stand ein automatisiertes Gerät der Fa. HP (7680T) zur Verfügung. Im Verlauf des Projektes stellte die Fa. ISCO einen weiteren Extraktor zur Verfügung. Zur Bestimmung standen Gaschromatographen mit verschiedenen Detektortypen sowie ein HPLC-DAD zur Verfügung. Gegen Ende des Projektes war es möglich einige Messungen mit einem LC-MSD bei der Fa. HP durchzuführen. 1.3 SFE ALS ALTERNATIVE ZU HERKÖMMLICHEN EXTRAKTIONSVERFAHREN

Seit einigen Jahren werden von verschiedenen Herstellern Geräte angeboten, die eine Extraktion von Proben mit überkritischem Kohlendioxid im analytischen Maßstab ermöglichen. Die günstigen physikalischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften des überkritischen Kohlendioxids machen es möglich, Extraktionen schnell und selektiv durchzuführen. Die SFE (Supercritical Fluid Extraction) entwickelt sich damit zu einer attraktiven Alternative zu herkömmlichen Extraktionsmethoden.



Herkömmliche Lösungsmittel-Extraktionen liefern in der Regel stark mit Matrix-bestandteilen verunreinigte Extrakte. Daher ist oft, vor der Bestimmung an einem chromatographischen System, eine aufwendige Reinigung der Extrakte erforderlich. Dies ist stets mit einem hohen Arbeits-, Zeit- und Kostenaufwand verbunden. Im Gegensatz dazu liefert die SFE Extrakte, die in der Regel ohne weiteres für chromatographische Bestimmungen eingesetzt werden können. Im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden liegen die Vorteile der SFE vor allem im hohen Proben-durchsatz, sowie bei der Einsparung von Lösungsmitteln und Personalkosten. Die Probenaufarbeitung ist weitgehend automatisiert und erfordert, im Gegensatz zu den herkömmlichen Aufarbeitungsmethoden, nur wenig manuelle Arbeitsschritte. Dies erleichtert die Dokumentation des Analysengangs und dürfte zudem zu einer Ver-besserung der Vergleichbarkeit zwischen Laboratorien führen. Der extrem geringe Lösungsmittelbedarf macht die SFE auch unter dem Aspekt des Umweltschutzes interessant.



2. DAS EXTRAKTIONSVERFAHREN

2.1 EINFÜHRUNG IN DIE SFE

SFE (Supercritical Fluid Extraktion) ist eine Extraktionsverfahren, bei dem die zu untersuchenden Proben unter Einsatz eines überkritischen Fluids (meist Kohlendioxid, CO2) als Extraktionsmittel extrahiert werden. Als überkritische Fluide werden Substanzen im überkritischen Zustand bezeichnet. Dieser Zustand kann erreicht werden, wenn beide kritische Daten (kritische Temperatur und kritischer Druck) gleichzeitig überschritten werden. Beim Kohlendioxid liegt beispielsweise die kritische Temperatur bei 31,1 °C und der kritische Druck bei 73,7 bar. Überkritische Fluide sind weder Gase noch Flüssigkeiten. Ihre physikalischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften können sowohl mit denen von Gasen als auch mit denen von Flüssigkeiten verglichen werden. Aufgrund ihrer hohen Dichte besitzen überkritische Fluide ähnlich gute Solvenseigenschaften (Löseeigenschaften) wie Flüssigkeiten. Geringe Viskositäten und hohe Diffusionskraft verleihen überkritischen Fluiden für Extraktionen günstige gasähnliche Transporteigenschaften (Mobilität). Wie Gase haben überkritische Fluide ein gutes Kompressionsverhalten. Durch Änderungen des Druckes und der Temperatur kann die Dichte, und somit das damit verbundene Lösungsvermögen, über weite Bereiche variiert werden. Extraktionen mit überkritischen Fluiden werden schon seit längerer Zeit großtechnisch betrieben. Einige Beispiele hierfür sind die Entkoffeinierung von Kaffee, die schonende Extraktion von ätherischen Ölen, die Reinigung von Medikament-Präparaten, die Extraktion von Hopfen, die Entölung von Lecithin, die Extraktion von Erdölprodukten und anderes mehr [20]. Milde und selektive Extraktionsbedingungen führen zu reineren und qualitativ höherwertigen Extrakten als bei den herkömmlichen Verfahren. Dies macht die SFE auch für den Einsatz im analytischen Bereich interessant. Seit einigen Jahren bieten verschiedene Hersteller SFE-Extraktionsgeräte an, die für analytische Zwecke geeignet sind. Ähnlich wie bei Extraktionen mit Flüssigkeiten (Soxhlet) wird die Probe in eine Hülse gebracht und mit dem Extraktionsmittel (hier das Fluid) extrahiert. Da im Unterschied zu den klassischen Extraktionen mit Flüssigkeiten unter relativ hohen Drucken gearbeitet wird, muß die zu extrahierende Probe in eine druckfeste Spezialhülse (mit einer HPLC-Säule vergleichbar) gebracht werden. Das mit Extrakten aus der Probe beladene Fluid wird an einer speziellen Vorrichtung (Restriktor) schlagartig auf Atmosphärendruck gebracht. Das Kohlendioxid wird gasförmig und entweicht und die Extrakte schlagen sich auf einer gekühlten Falle nieder. Mit einem flüssigen Lösungsmittel werden die Extrakte von der Falle in ein Vorlagegefäß eluiert. Bei einigen Geräten taucht der Restriktor direkt in eine Lösungs-



mittelvorlage ein. Die auf diese Weise erhaltene extrakthaltige Lösung kann meist direkt zur chromatographischen Bestimmung eingesetzt werden. Das analytische Laboratorium von heute steht unter ständigem Druck, seinen Proben-durchsatz zu vergrößern, seine Betriebskosten zu senken und anfallende Abfälle zu reduzieren. Die Zuverlässigkeit, Exaktheit und Reproduzierbarkeit der analytischen Methoden muß dabei erhalten bleiben oder sogar verbessert werden. In der Vergangenheit wurde, sowohl seitens der Forschung als auch der Anwender in die Automatisierung und Verbesserung chromatographischer Trennmöglichkeiten, sowie in die Verbesserung der Empfindlichkeit und der Auswertungsmethoden von Detektorsignalen viel investiert. Zur Optimierung und Automatisierung der Proben-aufbereitung wurde bisher jedoch nur wenig geleistet. Ein Blick auf die heute angewendeten Methoden in der Rückstandsanalytik zeigt aber, daß der größte Arbeitsaufwand und der größte Materialverbrauch gerade in diesem Bereich (Probenaufbereitung) liegt. Klassische Extraktionsmethoden zeichnen sich durch eine Vielzahl schwieriger manueller Arbeitsschritte aus (z.B. Zweiphasen-extraktionen, Einengen von Lösungen mit Rotationsverdampfern, säulenchromato-graphische Reinigungen). Solche Arbeitsschritte bei der Probenaufarbeitung sind in der Regel sehr aufwendig und müssen, um den heutigen Anforderungen zu entsprechen, durch zuverlässigere automatisierbare Prozesse ersetzt werden. Die SFE entwickelt sich zu einer interessanten Alternative zu den klassischen Extraktionsverfahren, die mit organischen Lösungsmitteln arbeiten. Bei der SFE sind viele Arbeitsschritte automatisiert worden (Extraktion, z.T. auch Clean-up, Aufnahme der Extrakte in das für die chromatographischen Prozesse geeignete Lösungsmittel), wodurch sich erhebliche Raum-, Arbeitszeit- und Kostenersparnisse ergeben [5,6,15]. Mit Hilfe der SFE kann auch der hohe Verbrauch an Lösungsmitteln, der derzeit bei der Rückstandsanalytik anfällt, reduziert werden. Zum einem wird die Exposition des Laborpersonals mit den oft gesundheitlich bedenklichen Lösungsmitteln vermieten, zum anderen werden die Probleme, die bei der umweltgerechten Lösungsmittel-Entsorgung bzw. der Rückgewinnung auftreten, minimiert. Dies macht die SFE auch unter dem Aspekt des Umweltschutzes attraktiv [12].



2.2 PHYSIKALISCHE GRUNDLAGEN DES VERFAHRENS

Stoffe können in verschiedenen Aggregatszuständen vorliegen: gasförmig, flüssig, fest und überkritisch. Diese Zustände können durch Variation von Druck und Temperatur ineinander übergehen, siehe Abb. 2.2-1 [21]. Abb. 2.2-1: Phasendiagramm von Kohlendioxid

1

2 3

Tc=31,1°C Temperatur [T]

Druck [P]

gasförmig

fest

flüssig

überkritisches Fluid

kritischer Punkt

1= Schmelzkurve 2= Sublimationskurve 3= Verdampfungskurve

Pc=7,3 MPa

Entlang der Verdampfungskurve koexistieren der flüssige und der gasförmige Zustand. Bewegt man sich entlang dieser Kurve, beobachtet man für CO2 bei einem Druck von 73,7 bar (kritischer Druck) und einer Temperatur von 31,1°C (kritische Temperatur) das Verschwinden der Phasengrenze. Bei diesem Punkt erreichen die beiden Phasen „flüssig“ und „gasförmig“ die gleiche Dichte und vermischen sich zu einer einzigen Phase. Dieser Punkt, der im P/T-Diagramm das Ende der Verdampfungskurve darstellt, wird als kritischer Punkt bezeichnet. Der kritische Druck und die kritische Temperatur sind charakteristische Stoffkonstanten. Zur Erreichung des überkritischen Zustandes müssen beide Größen (sowohl die kritische Temperatur als auch der kritische Druck) überschritten werden. Eine Substanz im überkritischen Zustand ist weder flüssig noch gasförmig, sie wird im allgemeinen als überkritisches Fluid bezeichnet. Temperatur- und Druck-Veränderungen überhalb der kritischen Daten führen lediglich zu Änderungen der Dichte, können also nicht wie bei Flüssigkeiten und Gasen zu Phasenumwandlungen führen. Überkritische Fluide zeigen interessante physikalische und physikalisch-chemische Eigenschaften (siehe Tab. 2.2-1). Die Dichte überkritischer Fluide ist größen-ordnungsmäßig vergleichbar mit der von flüssigen Lösungsmitteln. Sie zeichnen sich deshalb durch ein hohes Lösungsvermögen aus, das teils vergleichbar, teils größer ist als das von flüssigen Lösungsmitteln. Andererseits haben überkritische Fluide im Vergleich zu Flüssigkeiten viel höhere Diffusionskoeffizienten und niedrigere Viskositäten. Das Penetrationsvermögen und die Transporteigenschaften (Mobilität) von überkritischen Fluiden sind somit in etwa vergleichbar mit denen von Gasen. Diese



Eigenschaften machen überkritischen Fluide als Extraktionsmittel außerordentlich interessant. Tab. 2.2-1: Gegenüberstellung der physikalischen Eigenschaften [21].

Aggregatszustände

Dichte (g/ml)

Diffusionskoeffizient (cm2/s)

Viskosität (Ns/m2)

Gase 10-4 - 10-3 ca. 10-1 ca. 10-4 überkritische Fluide 0,1 - 1 10-3 - 10-4 10-3 - 10-4

Flüssigkeiten 0,6 - 1,4 ca. 10-5 ca. 10-2 Bisher wurden bereits einige Fluide für die SFE erprobt: Kohlendioxid, Ammoniak, Stickstoffmonoxid, Pentan, Freone und andere mehr. Von diesen hat sich jedoch nur das überkritische Kohlendioxid für den Routineeinsatz im Laboratorium bewährt. Kohlendioxid bietet einige Vorteile: es ist leicht in den überkritischen Zustand über-führbar (vgl. Tab. 2.2-2), zeigt ein recht gutes Lösungsvermögen und wird in einem hohen Reinheitsgrad zu einem relativ günstigen Preis angeboten. Es ist einfach zu handhaben, ungiftig und umweltfreundlich. Kohlendioxid ist außerdem im Gegensatz zu Wasser oder Ammoniak chemisch inert.

Tab. 2.2-2: Kritische Daten verschiedener Stoffe [22]

Fluid

kritische Temperatur Tc (°C) kritischer Druck Pc (MPa)

CHF3 25,9 4,83 CClF3 28,8 3,92 CO2 31,1 7,37 N2O 36,4 7,24 NH3 132,2 11,27

n-Pentan 196,6 4,22 CH3OH 239,4 8,09

H2O 374,1 22,04 2.3 MÖGLICHKEITEN ZUR OPTIMIERUNG VON SFE-EXTRAKTIONEN

Das Lösungsvermögen ist von der Dichte des Fluids abhängig. Diese kann durch Variation des Druckes und der Temperatur eingestellt werden. Bei höheren Dichten werden die Extraktionseigenschaften verbessert. Je dichter ein überkritisches Fluid ist, desto effektiver kann es die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen Ionen abschirmen und abschwächen. Dies erklärt die bessere Löslichkeit von polaren Substanzen bei hohen Dichten. Da überkritisches Kohlendioxid relativ unpolare Eigenschaften besitzt (je nach Dichte in der Größenordnung von Hexan bis Dichlormethan) kann es gut unpolare bis mittelpolare Substanzen lösen. Große polare Moleküle wie Zucker oder Proteine lösen sich kaum und sind daher nicht extrahierbar. Eine zentrale Rolle bei SFE spielen die Einflüsse der Matrix. Das Extraktionsmedium muß die zu extrahierenden Substanzen nicht nur lösen können, es muß auch die Wechselwirkungen zwischen den aktiven Stellen der Matrix und den Analyten überwinden können.



Im folgenden werden die Einflüsse einiger wichtiger Parameter auf die Extraktion näher erläutert.

2.3 .1 Die Rol le der Temperatur Die Extraktionskinetik wird im wesentlichen durch Diffusions- und Desorptionsprozesse limitiert. Bei höheren Temperaturen ist die Extraktionskinetik stark verbessert. Moleküle besitzen eine höhere kinetische Energie (Mobilität) und intermolekulare Wechselwirkungen können besser überwunden werden, dadurch werden Diffusions- und Desorptionsprozesse erleichtert und die Extraktionszeiten verkürzt. Allerdings werden, um die Dichte hoch zu halten und damit die Lösefähigkeit aufrecht zu erhalten, höhere Drücke benötigt. Die einsetzbare Temperatur ist somit vom maximal einsetz-baren Druck des Fluidextraktors abhängig. Meist sind aber die thermische Stabilität der zu extrahierenden Substanzen oder die Menge der mitextrahierbaren Begleitstoffe die Faktoren, die die Extraktionstemperatur limitieren.

2.3 .2 Die Rol le des Druckes Bei gleichbleibender Temperatur führt eine Erhöhung des Druckes zu einer Dichte-erhöhung und somit auch zu einer Verbesserung der Lösungseigenschaften des Fluids. Bei höheren Dichten verliert das überkritische Kohlendioxid allerdings an Diffusionskraft und wird viskoser, wodurch die Extraktionskinetik verschlechtert wird. Es wird ersichtlich, daß hier viele gegenläufige Faktoren eine Rolle spielen. Diese müssen für das jeweilige Problem richtig abgewogen werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

2.3 .3 Die Rol le der Matr ix Eine zentrale Rolle bei Extraktionen mit überkritischem Kohlendioxid spielt die Matrix. Wechselwirkungen zwischen dem Analyten und der Matrix erschweren die Extraktion und erfordern schärfere Extraktionsbedingungen. Die Teilchengröße und Oberflächen-beschaffenheit der zu extrahierenden Partikel spielt auch eine Rolle. In den Partikeln eingeschlossene, und dadurch schwer zugängliche Analyten erfordern höhere Extraktionszeiten und eine starke Diffusionskraft des Fluids. Ein zu hoher Gehalt an mobilem Wasser in der Matrix bringt Schwierigkeiten (auch gerätetechnischer Art, siehe Kap. 3.1.3.2.) mit sich. Das Wasser kann jedoch durch den Einsatz von Adsorbentien mit großer Oberfläche wie z.B. Diatomeenerden physikalisch gebunden werden, wodurch sich gleichzeitig die zur Extraktion bestimmten Stoffe leicht zugänglich über eine große Oberfläche verteilen. Die Wechselwirkungen zwischen dem Analyten und der Matrix können durch den Einsatz geringer Mengen an Lösungsmitteln (sog. Modifiern) geschwächt werden.



2 .3 .4 Die Rol le von Modi f iern Modifier sind in der Regel organische Lösungsmittel (z.B. Methanol, Acetonitril, Aceton), die entweder direkt der Matrix oder auch in einer Mischkammer dem überkritischen Fluid zugemischt werden. Durch Modifier kann die Lösungskraft des Fluids beeinflußt werden, z.B. hat ein mit Methanol modifiziertes CO2-Fluid eine größere Polarität als reines CO2-Fluid. Polarere Substanzen werden dadurch besser solvatisiert [8]. Die Wirkung von Modifiern beschränkt sich nicht nur auf die Verbesserung der Löslichkeit von Verbindungen, sondern auch auf die Überwindung von Wechsel-wirkungen zwischen Matrix und Analyten. Dies ist insbesondere im Bereich der Spurenanalytik interessant, da hier die Löslichkeit meist nicht der begrenzende Faktor ist. Modifier wie Methanol und Wasser können aktive polare Zentren der Matrix, die mit polaren Molekülen wechselwirken können, maskieren, wodurch die Extraktion dieser Stoffe erleichtert wird. Da durch den Zusatz von Modifiern die Löslichkeit von polaren Stoffen erhöht wird, werden Extrakte erhalten, die in der Regel mit erheblich mehr störenden Matrix-komponenten belastet sind, die Extraktionsselektivität nimmt demnach ab [1]. Viele Autoren, die Untersuchungen zu diesem Thema durchgeführt haben, berichten, daß ein Zusatz von Modifiern oft keine Verbesserung der Extraktionsausbeuten bewirkt [1]. 2.4 AUFBAU EINES SFE-EXTRAKTORS

Allen SFE-Geräten gemeinsam ist eine Pumpe zum Verdichten des Kohlendioxids, eine beheizbare Extraktionskammer in der die Probe extrahiert wird, ein für die Expansion des Fluids zuständiger, sog. Restriktor und eine Vorrichtung zur Sammlung der Extrakte (Falle)(siehe Abb. 2.2-2). Die wesentlichen Unterschiede zwischen Geräten verschiedener Anbieter liegen in der Art der Falle (fest oder flüssig) und in der Art der Fluid-Expansion (Restriktor) aber auch in der Höhe des maximal einsetzbaren Druckes. Die Extraktionshülsen (thimbles) sind druckfeste Behälter, in welche die Proben eingefüllt werden. Sie bestehen aus einem Edelstahlrohr, das mit zwei speziellen Schraubkappen verschlossen wird. Diese Kappen sind mit einem Ventil versehen durch das das überkritische Fluid in die Hülsen geleitet wird. Bei Geräten, bei denen in der Hülse und dem sie umgebenden Raum (Extraktionskammer) der gleiche Druck vorherrscht (z.B. Extraktoren der Fa. ISCO) können wesentlich kostengünstigere Hülsen aus Kunststoffmaterial verwendet werden.



Abb. 2.2-2: Schematischer Aufbau eines SFE-Extraktors mit Festphasenfalle

Vial

Nozzle

Solvent

ODS

ThimbleCO2

Modifier

Der Restriktor (nozzle) ist das Kernstück des Extraktors. Hierbei handelt sich um eine Kapillare oder ein Ventil durch die/das das überkritische Fluid entweicht. Er ist beheizbar, um die bei der Expansion des Kohlendioxids entstehende Kälte (Joule-Thompson-Effekt) zu kompensieren und somit Kondensationen oder das Gefrieren von Stoffen (z.B. Fett oder Wasser) und damit Verstopfungen zu vermeiden. Es gibt statische und variable Restriktoren. Der Vorteil variabler Restriktoren ist, daß sie den Gasfluß unabhängig vom eingesetzten Extraktionsdruck regeln können. Die Fallen (traps) verschiedener Geräte zeigen ebenfalls prinzipielle Unterschiede. Bei der On-line-SFE, bei der dem Extraktionsvorgang direkt ein chromatographischer Vorgang nachgeschaltet ist, werden die Extrakte am Säulenanfang der chromato-graphischen Säule aufgefangen [23]. Bei flüssigen Fallen werden die Substanzen direkt in ein Vorlagegefäß, das ein Lösungsmittel enthält, geleitet. Dies kann bei der Extraktion von leichtflüchtigen Stoffen nützlich sein. Bei den Festphasenfallen werden die Extrakte in einer gekühlten Festphasenfalle mit großer Oberfläche aufgefangen. Die Extrakte werden dann von der Falle mit einem organischen Lösungsmittel in eine Vorlage eluiert. Der Vorteil dieser Fallen besteht darin, daß man durch gezielte Wahl des Festphasenmaterials und der Elutionsmittel eine Fraktionierung der Extrakte und somit einen zusätzlichen Reinigungseffekt erzielen kann. 2.5 ABLAUF EINER EXTRAKTION

Das Kohlendioxid wird mit Hilfe einer Pumpe und einer Heizeinrichtung auf den nötigen Druck und die nötige Temperatur gebracht. In überkritischem Zustand gelangt es dann in die beheizbare Extraktionszelle, in der sich die Probe befindet. Hier findet die Extraktion statt.



Es wird zwischen statischer und dynamischer Extraktion unterschieden. Bei der statischen Extraktion findet kein Fluß statt. Die Probenmatrix wird mit dem Extrak-tionsfluid unter bestimmten Bedingungen (Druck, Temperatur) durchdrängt („eingeweicht“). Bei der dynamischen Extraktion findet ein Fluß statt. Die Probe wird von dem Fluid unter vordefinierten Bedingungen durchflossen und somit extrahiert. Nachdem das Fluid die Extraktionskammer verlassen hat, erfolgt im Restriktor eine Expansion, das überkritische Fluid wird in den gasförmigen Aggregatzustand überführt und verliert dabei seine Lösekraft. Somit kommt es zu einer Präzipitation der Extrakte im Restriktor selbst und in der nachgeschalteten Falle. Bei Festphasenfallen werden die ausgefallenen Substanzen mit einem Lösungsmittel (etwa 1-1,5 ml) in eine Vorlage eluiert. Dabei wird auch der Restriktor mit durchflossen. Hierbei werden sowohl die Falle als auch der Restriktor beheizt. Die Temperatur darf hier nicht zu hoch sein, um zu vermeiden, daß thermolabile Komponenten zersetzt werden oder daß das Lösungsmittel bereits verdampft. Es folgt eine Nachreinigung des Restriktors und der Falle mit einer größeren Menge an Lösungsmittel (ca. 5 ml). Das Gerät ist dann für einen erneuten Extraktionsvorgang bereit. 2.6 ENTWICKLUNG EINER SFE-METHODE

Bei der Entwicklung einer SFE-Methode ist die Optimierung mehrerer Parameter, sowohl im Bereich der Geräteeinstellung, als auch im Bereich der Probenvor-behandlung notwendig. Die Extrahierbarkeit von Stoffen aus der Matrix ist von vielen, oft gegenläufigen Faktoren abhängig, die gegeneinander abgewogen werden müssen.

2.6 .1 Probenvorbere i tung Die Probenvorbereitung muß sich vor allem nach der zu extrahierenden Matrix, aber auch nach den zu extrahierenden Analyten richten. Es muß so verfahren werden, daß bei möglichst wenig Verlusten eine für die Gesamtprobe repräsentative und zudem leicht extrahierbare Teilprobe erhalten wird. Bei Proben mit hohem Gehalt an mobilem Wasser muß dieses entweder entfernt oder ausreichend immobilisiert werden. Im folgenden werden beispielhaft für verschiedenen Fragestellungen mögliche Probenvorbereitungen aufgelistet: • Pestizide und andere organische Kontaminanten aus Wasserproben können an

einer Festphasenfalle (z.B. RP-C18) adsorbiert werden. Diese Falle kann dann mittels SFE extrahiert werden.

• Andere flüssige Proben, in denen höhere Rückstandskonzentrationen (als in Wasser) zu erwarten sind, wie z.B. Säfte oder Wein können mit einem Adsorbens (z.B. Hydromatrix) vermengt werden und dann mit der SFE extrahiert werden.

• Obst und Gemüseproben werden nach einer Zerkleinerung ebenfalls mit einem wasserbindenden Adsorbens versetzt.

• Proben mit hohem Fettgehalt (z.B. Ölsamen, Schokolade, Öle) bereiten oft Schwierigkeiten bei der SFE. Große Mengen an mitextrahiertem Fett können zu Überladungen der Falle und zu Verstopfungen führen. Es besteht prinzipiell die Möglichkeit, das Fett durch gezielte Wahl der Extraktionsbedingungen von der Probe abzutrennen, um bei einer darauffolgenden Extraktion die erwünschten Stoffe



selektiver zu erhalten (fraktionierte Extraktion). Bei diesem Verfahren muß jedoch meist mit Verlusten an Analyten gerechnet werden.

• Halbflüssige und pasteuse Proben mit hohem Zuckergehalt (z.B. Honig) bereiten ebenfalls Schwierigkeiten, da die zu extrahierenden Analyten abgeschirmt werden können. Um eine möglichst optimale Extraktion zu gewährleisten, und die Extraktionsoberfläche zu vergrößern müssen derartige Proben durch Vermengung z.B. mit Seesand oder Papier aufgelockert werden.

• Trockene Proben (wie z.B. Mehle, Getreideerzeugnisse) müssen gegebenenfalls mit Modifiern (z.B. Wasser oder Methanol) angefeuchtet werden, um eine Extraktion der Wirkstoffe zu erleichtern. Sehr fein zerkleinerte, pulverisierte Proben müssen vor der Extraktion aufgelockert werden (z.B. mit Seesand) um den Fluß des Fluids zu erleichtern.

Eine wesentliche Rolle bei der Extraktion spielen auch die zu extrahierenden Analyten. Ist der Analyt wegen schlechter Löslichkeit im Fluid oder aufgrund von Wechselwirkungen mit der Matrix nicht leicht extrahierbar, kann gegebenenfalls durch Zugabe von Modifiern in die Extraktionshülse die Extraktion verbessert werden. Gegebenenfalls besteht die Möglichkeit die Analyten direkt innerhalb der Extraktionshülse zu derivatisieren und sie dadurch in eine leichter extrahierbare Form zu überführen (in-situ-Derivatisierungen [13,14]). Eigene Untersuchungen zur Optimierung der Probenvorbereitung im Bereich der Pestizidanalytik werden in Kap. 3.1.3 dargestellt.

2.6 .2 Gerätee inste l lungen - Opt imierung der Extrakt ionsbedingungen Die theoretischen Überlegungen zur Optimierung von Extraktionsbedingungen sind in Kapitel 2.3 dargestellt. Das Verständnis der physikalischen und physikalisch-chemischen Zusammenhänge, die bei den Extraktionen eine Rolle spielen, ist zwar hilfreich bei der Entwicklung von Extraktionsmethoden, da diese jedoch sehr komplex sind, spielt die Erfahrung eine genauso große Rolle. Die optimalen Extraktions-bedingungen für Stoffe aus komplexen Matrizes müssen daher oft experimentell ermittelt werden. Die wichtigsten Geräte-Parameter, die variiert werden können sind: 1. Extraktionstemperatur, Extraktionsdruck (bzw. Dichte), 2. Extraktionsflußrate, 3. Extraktionszeit, 4. Zumischung von Modifiern zum Fluid (auch direkt in die Extraktionshülse), 5. Festphasenfalle (Material und Temperatureinstellung bei der Extraktion), 6. Elutionsparameter nach der Extraktion (Wahl der Lösungsmittel,

Temperatureinstellung von Festphasenfalle und Restriktor).



3. APPLIKATIONEN

3.1 ANALYTIK VON PFLANZENSCHUTZMITTELRÜCKSTÄNDEN IN OBST UND GEMÜSE

3.1 .1 E in le i tung Der Einsatz von Pflanzenschutzmitteln ist in der modernen Landwirtschaft nicht mehr wegzudenken. Gemäß Pflanzenschutzgesetz sind „ ... Pflanzenschutzmittel ... dazu bestimmt, Pflanzen oder Pflanzenerzeugnisse vor Schadorganismen oder Krankheiten zu schützen „ [34]. Weltweit sind schätzungsweise 500-600 verschiedene Wirkstoffe im Einsatz, die entsprechend ihrer Wirkung in verschiedene Gruppen eingeteilt werden können [92,89] (siehe Tab. 3.1.1-1). Tab. 3.1.1-1: Einteilung von Pflanzenschutzmitteln nach ihrer Wirkung Gruppe Wirkung Einige Vertreter

Herbizide gegen Unkräuter Phenoxyalkancarbonsäuren, Triazine,

Uronsäurederivate Fungizide gegen Pilze Dithiocarbamate, Benzimidazole, Triazole

Insektizide gegen Insekten Carbamate, Pyrethroide,

Organophosphorsäureester Synergisten potenzieren die Wirkung von

Insektiziden Piperonylbutoxid

Akarizide gegen Milben Carbamate, Pyrethroide, Zinnorganische Verbindungen

Nematizide gegen Nematoden Organophosphorsäureester

Molluskizide gegen Schnecken Metaldehyd

Rodentizide gegen Nagetiere

Kumarinderivate

Zu den Pflanzenschutzmitteln werden im allgemeinem auch Wachstumsregulatoren und Keimhemmungsmittel gezählt. Die Anwendung von Pflanzenschutzmitteln ist gesetzlich geregelt. Ihre Zulassung in der Bundesrepublik Deutschland erfolgt durch die Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft (BBA). Eine Zulassung erfolgt nur dann, wenn „das Pflanzenschutzmittel bei bestimmungsgemäßer und sachgerechter Anwendung ... keine schädlichen Auswirkungen auf die Gesundheit von Mensch und Tier hat, die nach dem Stande der wissenschaftlichen Erkenntnisse nicht vertretbar sind“ [34]. Mit der Zulassung wird die Anwendung geregelt und gegebenenfalls werden einzu-haltende Wartezeiten festgesetzt. Trotz Einhaltung der festgelegten Wartezeiten zwischen Einsatz der Pestizide und Ernte können noch Rückstände der Pflanzen-schutzmittel im Endprodukt verbleiben. Zum Schutz der Verbraucher werden in der



Rückstandshöchstmengenverordnung (RHmV) für alle Pflanzenschutzmittel maximal zulässige Gehalte (Höchstmengen) festgesetzt [34]. Die Einhaltung der festgelegten Höchstmengen muß durch geeignete Analysenmethoden kontrolliert werden. Dies ist Aufgabe der amtlichen Lebensmittelüberwachung. Darüber hinaus werden bundesweit im Rahmen des nationalen Monitoring-Programmes Daten zu Rückständen in Lebensmitteln gesammelt und ausgewertet, um u.a. zeitliche Trends festzustellen und die Aufnahme von Pflanzenschutzmitteln durch den Verbraucher über die Nahrung abzuschätzen. Zur Analytik werden überwiegend Multimethoden eingesetzt, die eine große Anzahl an Wirkstoffen erfassen können [3]. Da sich Pflanzenschutzmittel in ihren Eigenschaften (z.B. Polarität) sehr stark unterscheiden, ist es jedoch nicht möglich alle Stoffe mit einer einzigen Methode zu erfassen. Zur Erfassung bestimmter Wirkstoffe oder Wirkstoffgruppen sind Einzelbestimmungs-Methoden erforderlich, da sie z.B. aufgrund ihrer hohen Polarität oder geringen Stabilität nicht mit den Multimethoden erfaßbar sind. Die derzeit üblichen Multimethoden beinhalten folgende Arbeitsschritte: Zerkleinerung, Extraktion, Clean-up, ggf. Derivatisierung und Messung und sind in der Regel sehr arbeitsaufwendig [3]. Pestizidrückstandslaboratorien stehen ständig vor neuen Aufgaben und Heraus-forderungen (neue Wirkstoffe, Qualitätssicherungsmaßnahmen, Absenkung der Nachweisempfindlichkeit, Monitoring-Programme). Deshalb besteht großes Interesse an schnellen, kostengünstigen und automatisierten Analysenverfahren, um die Analytik effizienter zu gestalten. Möglichkeiten hierzu bietet die SFE, die sich zur Extraktion von mittel- bis unpolaren Pestiziden anbietet. Der Einsatz der SFE in der Pestizidanalytik würde viele Vorteile mit sich bringen, da die Extraktion automatisiert abläuft und durch eine selektive Extraktion auf eine Reinigung der Extrakte verzichten werden könnte. Extraktion und Nachreinigung sind in der Regel die arbeitsintensivsten Schritte im Bereich der Rückstandsanalytik. Besonders attraktiv ist die Entwicklung von SFE-Multimethoden zur gleichzeitigen Extraktion und Bestimmung von mehreren Pestiziden. Die Entwicklung von Methoden zur Bestimmung einzelner Pestizide oder Pestizidklassen ist jedoch ebenfalls sehr wichtig, da gerade in diesen Fällen die herkömmliche Analytik sehr arbeitsaufwendig ist und in der Praxis oft selten durchgeführt wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden eine SFE-Multimethode sowie verschiedene Einzelbestimmungsmethoden entwickelt. Eine Schlüsselstellung bei jeder Methodenentwicklung nehmen die Probenvorbereitung und die Messung ein. Die Sicherstellung einer ausreichend guten Meßgenauigkeit ist bei der Entwicklung analytischer Verfahren von hoher Priorität. Nur anhand zuverlässiger Meßergebnisse kann die Optimierung vorausgehender analytischen Teilschritte effektiv gestaltet werden. Durch die Optimierung der Probenvorbereitung wird gewährleistet, daß die zu unter-suchenden Teilproben für die Gesamtprobe repräsentativ sind. Demnach sind diese beiden Arbeitsschritte bei der Entwicklung analytischer Methoden von großer Wichtigkeit und müssen vorrangig optimiert werden.



3.1 .2 Opt imierung der Meßbedingungen

3.1.2 .1 Wahl des E inspr i tz- und Detekt ionsystems

Als Bestimmungssystem wurde ein GC/MSD gewählt. GC/MSD-Systeme werden wegen ihrer vielfältigen Vorteile immer verbreiteter im Bereich der Rückstandsanalytik eingesetzt. MS-Detektoren bieten im Gegensatz zu den herkömmlich EC-, NP-, FP-Detektoren eine universelle und gleichzeitig sehr spezifische Detektionsmöglichkeit, je nach Modus. Durch die hohe Aussagekraft, der durch die Massenspektrometrie gelieferten Daten, wird die Unsicherheit bei der Identifizierung von Substanzen minimiert. Die im SIM-Modus, durch die gezielte Registrierung bestimmter Massen erreichbare, recht hohe Detektionsempfindlichkeit, genügt den Anforderungen der Lebensmittelanalytik in den allermeisten Fällen. Da die Messung mit Hilfe des GC/MSD besonders selektiv erfolgen kann, kann meist auf eine Reinigung der Extrakte (Clean-up) verzichtet werden. Für die Identifizierung unbekannter Verbindungen im Chromatogramm können, die im SCAN-Modus aufgenommenen Massenspektren mit Hilfe eines Suchprogramms (automatische Bibliotheksuche) mit den Spektren mehrerer Tausend Verbindungen verglichen werden. Die Zuordnung von Massenspektren unbekannter Peaks zu Substanzen anhand der Vorlagen der Spektrenbibliothek ist jedoch, selbst bei aus-reichender Abtrennung der Substanz von Begleitstoffen, nicht immer einfach. Bei Substanzen, die in geringer Konzentration vorliegen, werden die Massenspektren vom Untergrundrauschen oft derart verfälscht, daß eine Identifizierung des Spektrums sehr erschwert wird oder kaum möglich ist (vgl. Abb. 3.1.2-1, 1µl). In diesen Fällen ist es vorteilhaft eine größere Menge an Extrakt einzuspritzen (vgl. Abb. 3.1.2-1, 5µl). Ein zu starkes Einengen von Probenextrakten sollte vermieden werden, da es häufig zu einem Ausfallen von mitextrahierten Begleitstoffen kommt, wobei Wirkstoffe mitgerissen werden können und zudem die Gefahr besteht, daß Pestizide sich teilweise verflüchtigen. Im SIM-Modus ist eine gezielte Aufnahme ausgewählter Massen mit höherer Empfindlichkeit möglich. Durch eine geeignete Auswahl dieser Massen können durch begleitende Stoffe verursachte Störungen meist ausgeschaltet werden. Auch die Bestimmungsgrenzen im SIM-Modus können durch den Einsatz höherer Mengen des Extraktes verbessert werden, da das Verhältnis von Peakhöhe zu Untergrundrauschen günstiger wird (vgl. Abb. 3.1.2-2). Größere Volumina bis z.B. 10 µl können mit einem Kaltaufgabesystem (KAS) als Injektionssystem aufgegeben werden, das die Möglichkeit einer Lösungsmittel-ausblendung bietet. Durch Verwendung eines KAS (Fa. Gerstel) konnten die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen deutlich erniedrigt werden. Die Verwendung des KAS als Injektionssystem bietet noch weitere Vorteile: Durch die Aufgabe der Probe in ein kaltes Injektionssystem werden die Analyten im Vergleich zu anderen Injektionsmöglichkeiten thermisch weniger belastet. Der Großteil der schwerflüchtige Begleitstoffe aus dem Probenextrakt verbleiben in dem etwa 10 cm langen Injektionsliner. Dadurch wird die analytische Säule geschont. In der Praxis ist ein regelmäßiges Austauschen der Injektionsliner erforderlich, da Verschmutzungen an der Oberfläche mit Analyten unerwünschte Wechselwirkungen eingehen können (siehe Kap. 3.1.2.2).



Abb. 3.1.2-1: Massenspektren von Malathion in einem Clementinen-Extrakt

(0,5 g/ml) bei verschiedenen Injektionsvolumina, Malathion 0,25 ng/µl

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 2800

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

m/z-->

AbundanceScan 485 (15.505 min): 0802007.D

69 79

93

111

125

127

143

158

173

185 199

211229

243256

261285287

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 2800

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

m/z-->

Abundance

69

8397

111

125

127

149

158

173

187

201

207

229

243

255

271

276

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 2800

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

m/z-->

63 79

93

100

143

158

184 199

211227238

256

271

285

286

1 µl

5 µl

Vergleichsspektrum aus der Spektrenbibliothek (HPPest)



Abb. 3.1.2-2: Nachweis von Brompropylat bei unterschiedlichen Injektions volumina (GC/MSD-SIM-Modus) 0,5 g Orangenextrakt/ml, nach der GPC

21.20 21.40 21.60 21.80 22.00 22.20 22.40 22.60 22.8050

52

54

56

58

60

62

64

66

68

70

72

74

76

78

80

82

84

86

88

90

92

94

96

Time--> 21.20 21.40 21.60 21.80 22.00 22.20 22.40 22.60 22.80

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

120

125

130

Time-->

Brompropylat

4,5 pg

3µl 1µl Brompropylat

1,5 pg

Bei Betrachtung der Abb. 3.1.2-2 fällt eine überproportionale Zunahme der Peakfläche des Brompropylat bei Einspritzung eines höheren Volumens auf. Die Gründe hierfür liegen zum einen an der Verbreiterung der Peaks, wodurch Anteile des Analyten im Untergrundrauschen verschwinden und zum anderen an Abbauvorgängen, insbesondere im Injektionssystem. Diese Effekte fallen bei niedrigen Konzentrationen stärker ins Gewicht. Dieser Sachverhalt wird im folgenden Kapitel näher erläutert.

3.1.2 .2 E in f lüsse des In jekt ionssystems und „Matr ixeinf lüsse“

Bei der gaschromatographischen Bestimmung einiger Substanzen wird das Verhältnis zwischen der in das GC-System eingebrachten Substanzmenge und dem resultierenden Detektorsignal durch verschiedene Faktoren stark beeinflußt. Es ist z.B. seit langem bekannt, daß das Lösungsmittel, in dem die zu messende Probe gelöst ist, einen Einfluß auf die Bestimmung haben kann („Lösungsmitteleinflüsse“). Der Zustand der mit der Probe in Kontakt kommenden Flächen des jeweiligen Einspritz-systems hat ebenfalls einen großen Einfluß. Die Probe wird z.B. bei einer split/splitless-Injektion oder bei einem KAS primär in einen durch Silylierung oberflächlich desaktivierten Injektionsliner eingespritzt. Der „Aktivitätsgrad“ der Oberfläche des Injektionsliners nimmt mit zunehmender Benutzungsdauer zu, da durch Abspaltung von Silylresten freie Silanol-Gruppen entstehen. Die Oberflächen von Injektionsliner und Vorsäule werden von Einspritzung zu Einspritzung immer mehr mit einem Film schwerflüchtiger Verbindungen belegt. Diese „Schmutzbeläge“ weisen ebenfalls eine „aktive“ Oberfläche auf. Substanzen können mit diesen aktiven Stellen im Injektionssystem in Wechselwirkung treten, wodurch Abbaureaktionen quasi katalysiert werden.



Bei zahlreichen Stoffen wie Dicofol, Captan, Folpet und einigen N-Methyl-Carbamaten machen sich die beschriebenen Effekte nachweislich in Form eines Abbaus bemerkbar. Die Bildung ihrer Abbauprodukte (p,p’-Dichlorbenzophenon, Tetrahydrophthalimid, Phthalimid und die korrespondierenden Phenole der N-Methyl-Carbamate) nimmt mit dem Benutzungs- und Verschmutzungsgrad des Injektionssystems zu. Zum Beispiel wurde beobachtet, daß die Verbindung Azinphos-Methyl nach längerem Gebrauch des Injektionsliners kaum mehr detektierbar ist. Die Wechselwirkung zwischen diesem „Schmutzbelag“ und verschiedenen Verbin-dungen bewirkt eine unerwünschte Retention und macht sich auch in der Peakform z.B. bei Thiabendazol, Imazalil und Prochloraz als Tailing deutlich bemerkbar (vgl. Abb. 3.1.5-28 in Kap. 3.1.5.5.2.3). Dieses Tailing ist um so ausgeprägter je stärker der Verschmutzungsgrad des Injektionssystems und der Vorsäule ist. Matrixeinflüsse: Eine wesentliche Rolle spielen aber auch die Art und Konzentration der in der Probe-lösung befindlichen Matrixbestandteile [vgl. 27,28]. Es wurde beispielsweise festgestellt, daß ein mit Thiabendazol versetzter Probenextrakt wesentlich höhere Signale erbrachte, als eine Lösung dieses Stoffes in reinem Lösungsmittel, obwohl beide Lösungen die gleiche Konzentration an Thiabendazol aufwiesen und gleiche chromato-graphische Bedingungen vorlagen [29]. Matrixbestandteile in den Probeextrakten wirken offenbar „schützend“ auf die Wirk-stoffe, in dem sie aktive Stellen im Injektionssystem besetzen. In Abb. 3.1.2-3 wird die „Schutzwirkung“ der Matrix am Beispiel der Substanz Dicofol verdeutlicht. Auffällig ist, daß bei Anwesenheit von Matrix die Zersetzung von Dicofol zu p,p´-Dichlor-benzophenon in erheblich kleinerem Umfang abläuft. Es wurde untersucht, in welchem Maße die Bestimmung verschiedener Wirkstoffe durch die oben beschriebenen Effekte beeinflußt wird. Hierzu wurden Kalibrierungen in reinem Lösungsmittel und in Lösungen mit unterschiedlichem Matrixanteil erstellt und verglichen. Wie aus Tab. 3.1.2-1 zu entnehmen ist, spielen für viele der Stoffe (unter den genannten Bedingungen) „Matrixeinflüsse“ eine vernachlässigbare Rolle (vgl. Abb. 3.1.2-4, Ethion). Bei anderen Stoffen dagegen können diese Effekte bei der Quantifizierung der Rückstände auf keinen Fall außer acht gelassen werden (vgl. Abb. 3.1.2-4, Azinphos-Methyl). Derartige „Matrixeinflüsse“ auf die gaschromatographische Bestimmung von Wirkstoffen wurden sowohl bei den Extrakten der DFG-Methoden S8 oder S19 als auch bei den SFE-Extrakten festgestellt. In der Regel zeigen die ungereinigten Extrakte der klassischen (naßchemischen) Aufarbeitungsmethoden viel stärkere Matrixeffekte als SFE-Extrakte, während die über Gelpermeationschromato-graphie (GPC) gereinigten Extrakte in etwa vergleichbare Effekte zeigen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zum Einfluß der Matrix bei der gaschromato-graphischen Bestimmung wurden in [29] veröffentlicht.



Abb. 3.1.2-3: Matrixeinflüsse, thermisch bedingter Abbau des Dicofols im Injektionssystem

Dicofol

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 2 4 6 8 10

Matrix-Eichung

Lösungsmittel-Eichung

FlV

p,p´- Dichlorbenzophenon

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 2 4 6 8 10


Matrix-Eichung

FlV

Konzentration [µg/ml]

CHCl3

DicofolCl

HO CCl3

Cl

Cl

O

Clp,p´-Dichlorbenzophenon

Konzentration [µg/ml]



Abb. 3.1.2-4: Matrixeinflüsse am Beispiel Ethion und Azinphos-Methyl

Ethion

0

1

2

3

4

5

6

7

0 2 4 6 8 10

Matrix-Eichung


Konzentration

FlV

Azinphos-Methyl

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 2 4 6 8 10

Matrix-Eichung


Konzentration

FlV

N

NN

O

SP

SOCH3

OCH3

Azinphos-Methyl

S SPP

SS

OCH2CH3

OCH2CH3CH3CH2OCH3CH2O

Ethion



Tab. 3.1.2-1: Auftreten von „Matrixeinflüssen“, GC/MSD (Säule HP5, 30 m), Injektor: KAS, silylierter Glasliner, Einspritzmenge 3 µl [29]

Matrix - und Lösungsmittel-Eichungen im Vergleich

Substanz

vor der GPC: Matrixkonzentration

0,6 g Zitrone/ml

nach der GPC: Matrixkonzentration

1,25 g Zitrone/ml Wirkstoffkonzentration in

mg/kg bez. auf Frucht Wirkstoffkonzentration in

mg/kg bez. auf Frucht 0,2 0,4 1 4 0,1 0,25 0,5 1,0 3,5

Azinphos-Methyl +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ Bromacil + + Brompropylat +++ +++ ++ 0 ++ ++ ++ + 0 Carbaryl + + Chlorfenvinphos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Chlorfenson 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Chlorpyrifos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Chlorpyrifos-Methyl 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Chlorthalonil ++ + 0 0 + 0 0 0 0 Diazinon 0 0 0 0 - - 0 0 0 Dichlofluanid 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Dichloran 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Dicofol +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ ++ Dimethoat ++ ++ 0 0 ++ ++ + 0 0 Endosulfan (-beta) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Endosulfan (-alpha) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Endosulfansulfat + + 0 0 + 0 0 0 0 Ethion 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Fenarimol + 0 0 0 0 0 0 0 0 Fenitrothion ++ + + 0 + + 0 0 0 Fenpropimorph - - 0 0 0 0 0 0 0 Fenthion - - - - - - - - 0 Fonofos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Imazalil* +++ +++ +++ + Malathion + 0 0 0 0 0 0 0 0 Mecarbam + 0 0 0 + 0 0 0 0 Metalaxyl 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Methidathion ++ + + 0 + + + 0 0 Myclobutanil + 0 0 0 + + + 0 0 Orthophenylphenol ++ + 0 0 + 0 0 0 0 p,p´-Dichlorbenzophenon --- --- --- --- --- --- --- --- --- Parathion 0 0 Parathion-Methyl ++ ++ 0 0 + 0 0 0 0 Pirimiphos-Methyl 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Prochloraz +++ ++ + Procymidon 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Propiconazol + + 0 Pyridaphenthion 0 0 Quinalphos 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Tetradifon 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Thiabendazol +++ +++ +++ +++ Tolylfluanid + + 0 0 0 0 0 0 0 Vinclozolin 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Verhältnis von Eichung auf Matrix zu Eichung in reinem Lösungsmittel in %: --- = unter 20% , - = 75-89% , 0 = 90-112% , + = 113-124% , ++ = 125-150% , +++ = über 150% Die Auswertung erfolgte über zwei interne Standards.



3.1.2 .3 Berücks icht igung der „Matr ixeinf lüsse“ bei der

Best immung

Die Verwendung von „Eichungen auf Matrix“ ist zur korrekten Quantifizierung von Substanzen, bei denen deutliche „Matrixeinflüsse“ auftreten, unumgänglich. Eine Möglichkeit hierfür sind „externe Matrix-Eichungen“ d.h. zur Kalibrierung werden matrixhaltige Standards verwendet. In diesem Fall muß für jede zu untersuchende Probe eine gleichartige, pestizidfreie Blindprobe aufgearbeitet werden. Die Eich-lösungen werden durch Zusatz der entsprechenden Wirkstoffe zu den Extrakten der Blindprobe hergestellt. Um „Matrixeinflüsse“ auszugleichen, muß darauf geachtet werden, daß Eichlösungen und Probenextrakt in etwa die gleiche Konzentration an Matrix aufweisen. Eine weitere Möglichkeit sind „innere Eichungen“ nach dem Standardadditions-verfahren. Dazu wird der Probenextrakt in mehrere Aliquote geteilt, die mit den ent-sprechenden Wirkstoffen in unterschiedlichen Mengen dotiert werden (parallele Standardaddition, vgl. Abb. 3.1.2-5). Abb. 3.1.2-5: Prinzip der “inneren Eichung“ nach einer Aliquotierung („parallele“ Standardaddition)

Probenextrakt (mit internem Standard)

Aliquotierung

Aliquot 1 Aliquot 2 Aliquot 3 Aliquot 4

Standardaddition Standardaddition Standardaddition

Volumenausgleich Volumenausgleich Volumenausgleich Volumenausgleich

Meßlösung 1 Meßlösung 2

Meßlösung 3

Meßlösung 4

Messung Messung Messung Messung Kalibrierung

Vorteilhaft bei diesem Verfahren ist, daß eine zusätzliche Aufarbeitung von pestizid-freier Matrix, die von der Probenmatrix mehr oder weniger abweichen kann (Sorte, Reifegrad, Schalen- u/o Kernanteil), entfällt. Abb. 3.1.2-6 zeigt das Prinzip einer solchen Kalibrierung und Abb. 3.1.2-7 eine Kalibrierung am Beispiel Imazalil. Abb. 3.1.2-6: „Innere Eichung“ nach dem Standardadditionsverfahren




|x|

FlächenverhältnisAnalyt/ISTD

zugegebene Menge an Analyt (Aufstockung)

|x|: Absolute Menge an Analyt im Probenextrakt vor der Dotierung (y=0)

Abb. 3.1.2-7: „Innere Eichung“ („parallele“ Standardaddition) beispielhaft für Imazalil in Orangenextrakt

y = 233,82x + 57,882R2 = 0,9997

020406080

100120140160180200

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6zudotierte Menge an Imazalil in µg pro 0,3 g Probenaliquot

undotiert

ermittelte Gehalte: über innere Eichung: 0,83 ppmüber Lösungsmitteleichung: 1,9 ppm

In Anbetracht der geringen Probenmenge, die bei der SFE extrahiert wird, ist diese Art der inneren Eichung, bei der Aliquotierungen vorgenommen werden, häufig nicht praktikabel. „Innere Eichungen“ nach dem Standardadditionsverfahren können aber auch ohne eine Aliquotierung erstellt werden, in dem die gleiche Probelösung mehrfach mit Standard aufgestockt und gemessen wird. Die Tatsache, daß die Matrixeffekte nach jeder Standardzugabe verringert werden (Matrixkonzentration nimmt ab) bleibt hier allerdings unberücksichtigt, weshalb es wichtig ist kleine Volumina zu dotieren (vergleiche Abb. 3.1.2-8).


Abb. 3.1.2-8: Prinzip der „inneren Eichung“ (Standardadditionsverfahren)

Probelösung (mit ISTD)

Messung

Standardaddition

Messung Erstellung einer Kalibrierung

Standardaddition

Messung

In der Regel zeigen Eichungen auf Matrix im Vergleich zu den entsprechenden „Lösungsmittel-Eichungen“ eine deutlich bessere Linearität. Zur Minimierung gerätebedingter Effekte, ist auf jeden Fall der regelmäßige Austausch des Injektionsliners und/oder der Vorsäule zu empfehlen. Damit möglichst gleiche Gerätebedingungen bei der Bestimmung vorliegen, empfiehlt es sich, die zu verglei-chenden Lösungen (Probelösung und Eichlösung) in kleinem zeitlichen Abstand zu chromatographieren.



3.1 .3 Opt imierung der Probenvorbere i tung

3.1.3 .1 Zerk le inerung (Erzeugung repräsentat iver Te i lproben)

Ziel der Probenvorbereitung ist es, Teilproben zu erhalten, die für die Gesamtprobe repräsentativ sind. Hierbei muß jedoch darauf geachtet werden, daß die Verluste von Substanzen durch Abbauvorgänge so gering wie möglich gehalten werden. Geeignete Probenvor- und aufbereitungsstrategien sind daher erforderlich. Da bei der SFE relativ wenig Probemenge pro Versuch eingesetzt wird (z.B. bis zu ca. 3 g bei Verwendung des HP 7680 Extraktors), muß besonders darauf geachtet werden, daß die eingesetzten Obst- und Gemüseproben gut homogenisiert werden. Bei einigen Matrizes wie Salaten, Kernobst und Erdbeeren bereitet dies in der Regel keine Probleme. Bei anderen Proben ist jedoch die Erzielung einer ausreichenden Homogenität schwieriger. Zum Beispiel werden bei Trauben mit den üblichen Zer-kleinerungsmethoden die Schalen, auf denen sich oberflächlich aufgebrachte Wirkstoffe zum Großteil befinden, nicht in dem gewünschten Grad zerkleinert, wodurch bei Gehaltsbestimmungen zwangsläufig hohe statistische (zufällige) Fehler auftreten (vgl. Kap. 3.1.4.7.1). Während der Probenvorbereitung (Grob- und Feinzerkleinerung) treten in größerem oder kleineren Umfang Wirkstoffverluste auf. Durch die Feinzerkleinerung der Probe wird die Kompartimentierung der Zellen aufgehoben, wodurch Enzyme, die für Abbau-vorgänge verantwortlich sind, freigesetzt werden. Darüber hinaus wird sauerstoffhaltige Luft in die Matrix eingeschlagen. Verschiedene enzymatische und chemische Reaktionen (auch Verknüpfungsreaktionen mit Matrixbestandteilen) werden dadurch ermöglicht oder begünstigt. Zudem kann die bei dem Feinzerkleinerungsprozeß freigesetzte Wärme zu einer Beschleunigung von Abbauprozessen führen. Bei den Abbauvorgängen im zerkleinerten Probenmaterial spielen enzymatisch katalysierten Reaktionen (Oxidationen, Hydrolysen u.a.) eine wichtige Rolle. Um solche Reaktionen zu vermeiden, muß die Aktivität der Enzyme so weit wie möglich unterdrückt oder ausgeschaltet werden. Enzyme sind biochemische Katalysatoren. Ihre Aktivitäten hängen stark von den vorherrschenden Bedingungen im Reaktionsmedium ab. So zeigen z.B. viele Enzyme bei Verringerung des verfügbaren Wassers (aw-Wert), z.B. durch Zusatz von Salzen, einen Aktivitätsrückgang. Oxidasen zeigen in der Regel ein pH-Optimum im neutralen pH-Bereich. Unterhalb pH=3 werden Phenolasen irreversibel denaturiert. Ähnliches gilt auch für Temperaturen oberhalb 85°C (Blanchieren). Solch drastische Bedingungen können aber nicht zum Schutz der Proben vor enzymatischer Oxidation angewendet werden, ohne die Zersetzung empfindlicher Pestizide befürchten zu müssen. Desweiteren ist es theoretisch möglich unerwünschte enzymatische Reaktionen z.B. durch Vergiftung von Enzymen zu unterdrücken (z.B. bei Oxidasen durch Komplexierung des Kupfers im aktiven Zentrum mit EDTA, Sulfid oder Zitronensäure). Enzymatische und chemische Oxidationen können z.B. durch Zusatz antioxidativ wirksamer Stoffe, wie zum Beispiel Ascorbinsäure oder Schwefeldioxid unterdrückt werden.



Die Anwendbarkeit von Antioxidantien, Enzymvergiftern, Säuren und Salzen wurde im Rahmen dieser Arbeit allerdings nicht näher untersucht. Ein eleganter Weg Oxidationen zu vermeiden ist, die Verdrängung der sauerstoff-haltigen Luft in der Probe durch Trockeneis oder flüssigem Stickstoff, wobei gleichzeitig die Probe auch gekühlt wird [2,128]. Durch Einhaltung niedriger Temperaturen werden chemische und enzymatische Prozesse, die zu einem Wirkstoffabbau führen können, erheblich verlangsamt. Eine sehr einfache Möglichkeit die Temperaturen während der Zerkleinerung tief zu halten ist die Proben in gefrorenem Zustand feinzuzerkleinern. Diese Vorgehensweise ist sehr einfach durchzuführen und hat sich als sehr vorteilhaft auch im Hinblick auf den Zerkleinerungsgrad erwiesen. Die Zerkleinerung wird durch die Eiskristalle in den Zellen unterstützt. Das Material ist nach der Feinzerkleinerung in der Regel ausreichend homogen und befindet sich noch in gefrorenem Zustand. Eine Separierung der wäßrigen (Saft) von der festen Phase (Zellwände) findet praktisch nicht statt. Die zerkleinerten Proben lassen sich schnell wieder tiefgefrieren. Auf diese Weise wird in der Regel eine bedeutend bessere Homogenität erreicht als bei einer Zerkleinerung der Proben bei Raumtemperatur. Dies wurde am Beispiel einer Traubenprobe gezeigt (siehe Tab. 3.1.3-1 und Abb. 3.1.3-1). Die bessere Homogenität macht sich auch in der geringeren Streuung der Analysen-werte bei der gefroren zerkleinerten Traubenprobe bemerkbar (siehe auch Kap. 3.1.4.7.1). Tab. 3.1.3-1: Auswirkungen unterschiedlicher Zerkleinerungsarten (vgl. Abb. 3.1.3-1).

Zustand der Beobachtungen nach der Feinzerkleinerung Probe vor der

Feinzerkleinerung Zerkleinerungs-

dauer Durchmesser der Schalenfragmente

Zustand der Kerne

Sonstiges

„frisch“ etwa 40 s etwa 0,5-1 cm meist ganz größere Fruchtfleischstücke noch vorhanden

tiefgefroren etwa 15 s etwa 0,5-3 mm zerkleinert Fruchtfleisch fein verteilt, zahlreiche Luftbläschen



Abb. 3.1.3-1: „frisch“ und tiefgefroren zerkleinerte Trauben „Alphonse Lavallee“ (vgl. Tab. 3.1.2-1)

„frisch“ zerkleinert Abbildungs-Maßstab 1:1

tiefgefroren zerkleinert Abbildungs-Maßstab 1:1

Der höhere Zerkleinerungsgrad der durch die Zerkleinerung in tiefgefrorenem Zustand erreicht wird, wirkt sich auch positiv auf die Extrahierbarkeit aus. Bei einem entsprechenden Versuch wurden aus einer gefroren zerkleinerten Orange bedeutend bessere Ausbeuten der Fungizide Imazalil und Thiabendazol erzielt. Die unterschiedlich zerkleinerten Orangenproben wurden je zwei Mal extrahiert (erster Extraktionsschritt mit Aceton:Wasser 3:1, pH 3-4, zweiter Extraktionsschritt mit Aceton:Wasser 4:1, pH∼9,5). Während bei der zweiten Extraktion von frisch zerkleinerten Proben noch beträchtliche 10-15 % dieser Wirkstoffe erfaßt wurden, wurden bei gefroren zerkleinerten Proben nur



noch 4-7 % gefunden [vgl. 29]. Die verbesserte Extraktion der gefroren zerkleinerten Orange war darüber hinaus auch an der deutlich geringeren Farbintensität, die der extrahierte Filterkuchen nach der ersten Extraktion aufwies, erkennbar.

3.1.3 .2 Ent fernung bzw. Immobi l i s ierung von Wasser

Obst- und Gemüseproben haben einen hohen Gehalt an Wasser. Dieses Wasser muß vor der SFE-Extraktion gebunden oder entfernt werden. Zur Entfernung oder Immobilisierung von Wasser werden in der Literatur verschiedene Vorgehensweisen beschrieben wie z.B. Gefriertrocknung [40], die Verwendung von chemischen Trocken-mitteln wie Magnesiumsulfat, Natriumsulfat [8,41,42] und der Zusatz von Wasser adsorbierenden Materialien, die eine große Oberfläche besitzen und dadurch in der Lage sind, große Mengen an Wasser physikalisch zu binden. Durch die Vermengung der Probe mit dem Adsorbens kommt es zu einer starken Oberflächenvergrößung, wodurch die Extraktion erleichtert wird [1,2,12,9].

3.1.3.2.1 Wasserentfernung durch Gefriertrocknung

Die Gefriertrocknung ist eine relativ schonende Methode, einer Probe Wasser zu entziehen und die Probe aufzukonzentrieren. Dadurch ist es theoretisch möglich, mehr Probe für die Extraktion einzusetzen und somit die Nachweisgrenzen herabzusetzen. Der Trocknungsvorgang dauert jedoch einige Stunden. Bei Proben mit relativ viel Zucker wie z.B. Südfrüchten bilden sich karamelartige, pasteuse Massen, die den Trocknungsvorgang verzögern und ggf. Rückstände einschließen. Getrocknete Proben nehmen schnell Luftfeuchtigkeit auf, so daß ihre Handhabung Sorgfalt verlangt. Desweiteren bestehen Bedenken, daß es unter den Bedingungen der Gefriertrocknung zu einer Verflüchtigung von Wirkstoffen kommen kann. Die Gefriertrocknung ist nach unserer Erfahrung mit einem großen Arbeitsaufwand verbunden und bringt keine entscheidenden Vorteile.

3.1.3.2.2 Wasserbindung durch Adsorbentien

Zur Wasserbindung werden verschiedene Adsorbentien auf Basis von Diatomeenerde eingesetzt, die natürlicherweise eine sehr große Oberfläche aufweisen (z.B. Hydro-matrix (Varian), Kieselgur, Celite) [1,2,12]. Die vorzerkleinerte und homogenisierte Obst- oder Gemüseprobe wird hierbei in einem bestimmten Verhältnis (z.B. 2,5:2) mit einem Adsorbens vermengt. Aliquote des homogenen Gemisches werden in Extraktionshülsen gefüllt und bis zur Extraktion tiefgefroren aufbewahrt. Diese Art der Probenvorbereitung ist einfach durchzuführen, erfordert wenige Arbeitsschritte und ermöglicht eine effiziente Extraktion von Rückständen. Versuche haben gezeigt, daß das Mischungsverhältnis von Probe zu Adsorbens einen großen Einfluß auf die Extrahierbarkeit von unpolaren Analyten hat (vgl. hierzu Kap. 3.1.4.7.3 und 3.1.7.1).



3.1 .4 SFE-Mul t imethoden für Pest iz ide in Obst und Gemüse Eine Multimethode ist in der Regel nur ein Kompromiß. Nicht alle Substanzen sind unter den ausgearbeiteten Bedingungen optimal extrahierbar. Verluste von Substanzen werden oft bewußt in Kauf genommen, um ein möglichst gutes Gesamtergebnis bei einem angemessenen Aufwand zu erzielen. In Rahmen dieser Arbeit wurde eine SFE-Multimethode zur Aufarbeitung von Obst- und Gemüseproben ausgearbeitet. Sehr hilfreich für die Entwicklung dieser Methode waren die Arbeiten von Lehotay et al [1,2]. Im folgenden werden Versuche zur Optimierung der Extraktionsbedingungen vorgestellt.

3.1.4 .1 Opt imierung der Ext rakt ionsbedingungen

Selbst bei hoher CO2-Dichte weisen SFE-Extrakte von Obst und Gemüse noch eine relativ hohe Reinheit auf. Daher wurden bei der Methodenoptimierung nur Dichtebe-reiche von >0,85 g/ml ausgewählt. Prinzipiell ist es möglich durch die Einstellung einer geringeren Dichte, Extraktionen selektiver zu gestalten. Dies war jedoch bei den Applikationen im Bereich der Pestizidrückstandsanalytik nicht erforderlich. Selbst als die SFE-Extraktionen bei relativ drastische Extraktionsbedingungen durchgeführt wurden, waren im allgemeinen die gewonnenen Extrakte in ihrer Reinheit mit den Extrakten herkömmlicher Multimethoden vergleichbar obwohl bei diesen z.T. sehr arbeits- und zeitaufwendige Clean-up Arbeitsschritte durchgeführt werden (siehe hierzu auch Abb. 3.1.4-1).



Abb. 3.1.4-1: MSD-Chromatogramme eines SFE-Extraktes und eines DFG S8- Extraktes [3] aus Birnen im Vergleich (SCAN-Modus) (SFE-Bedingungen siehe Anlage1)

12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.000

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

1100000

1200000

1300000

1400000

Time-->

AbundanceTIC: 0301001.D

11.28

11.39

12.13

12.41

12.63

12.83

12.87

13.20

13.26

14.45

14.93

15.29

15.41

16.85

16.94

17.2117.3117.3717.6717.75

20.99

21.74

Birne, SFE-Extrakt 2g/ml Acetonitril, 1 µl in KAS, SCAN

DiphenylaminFettsäuren

Procymidon

Fettsäuren

ISTD

Iprodion

Phthalat

Phosalon

Fettsäuren

12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.000

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

1100000

1200000

Time-->

AbundanceTIC: 0401002.D

10.2410.37

10.4211.28

11.39

11.6611.8911.9612.0112.0512.1312.24

12.41

12.5312.72

12.76

12.8312.88

13.20

13.2313.26

13.46

14.45

14.5114.7014.9315.29

15.42

15.56

16.85

16.94

17.0417.2117.6717.77

20.99

21.75

23.41

23.59

Birne, S8-Extrakt 2g/ml Isooktan, 1 µl in KAS, SCAN

DiphenylaminFettsäuren

Procymidon

Fettsäuren

ISTDIprodion

Phthalat

Phosalon

Fettsäuren

(KAS= Kaltaufgabesystem)

Um festzustellen, wie sich eine Veränderung der Extraktionsparameter (Temperatur, Druck, Dichte, Modifier) auf die Extraktionsausbeuten auswirkt, wurde eine mit Hydromatrix im Verhältnis 3:2 vermengte Salatprobe bei unterschiedlichen Bedin-gungen extrahiert.



Tab. 3.1.4-1: Untersuchungsergebnisse eine Salatprobe bei Variation der Extraktionsparameter

Extraktionsbedingungen ermittelte Gehalte in mg/kg

Modifier

Temperatur (°C)

Druck (bar)

Dichte (g/ml)

Procymidon Oxadixyl direkt in die Extraktionshülse

45 376 0,93 0,021 0,027 50 350 0,9 0,025 0,032 55 347 0,88 0,022 0,029 60 329 0,85 0,026 0,031 50 350 0,9 0,022 0,020 0,5 ml Methanol 55 347 0,88 0,021 0,030 0,5 ml Methanol 60 329 0,85 0,020 0,025 0,2 ml Methanol 60 329 0,85 0,024 0,029 0,5 ml Methanol

Wie in Tab. 3.1.4-1 ersichtlich, ließen sich durch die Variation der aufgeführten Parameter keine signifikanten Unterschiede bei den Extraktionsausbeuten der Pestizide feststellen. Die Abweichungen liegen innerhalb der üblichen analytischen Streubereiche [18]. Variation des Elutionsmittels der Festphasenfalle: Bei Verwendung des HP-Gerätes werden die Extrakte auf einer Festphasenfalle (z.B. ODS) aufgefangen. Nach der Extraktion werden sie mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels aus der Festphasenfalle in ein 1,5-ml Vorlagegläschen eluiert. Dabei kann die Falle beheizt werden. Um die gewünschten Analyten in das 1,5 ml Vorlage-gläschen zu eluieren, ist es wichtig ein Lösungsmittel auszuwählen das gute Lösungs-eigenschaften aufweist. In einem Versuch wurden die Lösungsmittel Acetonitril und Methanol diesbezüglich mit-einander verglichen (siehe Tab. 3.1.4-2). Unpolare Lösungsmittel wie Isooctan wurden nicht in den Versuch miteinbezogen, da sie das nach der Extraktion oft etwas feuchte Festphasenmaterial nicht benetzen können. Auch bei diesem Versuch lagen die Unterschiede in den erzielten Ergebnissen in-nerhalb der üblichen analytischen Streubreite (siehe Tab. 3.1.4-2). Acetonitril ist prinzipiell wegen seines höheren Siedepunktes und der geringeren Polarität besser für die Gaschromatographie geeignet als Methanol.



Tab. 3.1.4-2: Vergleich von Acetonitril und Methanol als Elutionslösungsmittel, extrahierte Probe: Salat

Lösungsmittel

Pestizid (in mg/kg)

Dimethoat Vinclozolin Procymidon Oxadixyl Benalaxyl Methanol 0,53 0,82 2,7 0,70 0,008

0,54 0,89 2,76 0,76 0,006 0,61 0,98 2,95 0,88 0,010 0,66 1,16 3,21 0,85 0,010

Mittelwert

0,59 0,96 2,91 0,80 0,009

Acetonitril 0,57 1,31 3,35 0,78 0,007 0,57 1,17 3,00 0,77 0,008 0,57 1,21 3,05 0,73 0,008 0,61 1,00 2,62 0,78 0,008

Mittelwert

0,58 1,17 3,01 0,77 0,008

Gesamt-Mittelwert (n=8) 0,58 1,07 2,96 0,78 0,008 Variationskoeffizient

in % 7,3 15,9 8,6 7,5 16,7

3.1.4 .2 Durchführung der Mul t imethode

In Abb. 3.1.4-2 sind schematisch die Arbeitsschritte der ausgearbeiteten SFE-Multimethode aufgeführt. Eine detaillierte Analysenvorschrift findet sich in Anlage 1 (Code 100E3101). Die allermeisten Obst- und Gemüsesorten können nach diesem Verfahren aufgearbeitet werden. Je nach Matrix können geringfügige Abweichungen von diesem Schema erforderlich sein (vgl. Kap. 2.6.2).



Abb. 3.1.4-2: Durchführungsschema der Multimethode (siehe auch Anlage 1)

Probenvorbereitung

ggf. pH-Wert-Einstellung

Probe mit Hydromatrix vermischen

(Verhältnis: z.B. 3:2,5)

ein Aliquot in die Extraktionshülse füllen

Supercritical Fluid Extraction (SFE)

ggf.

Derivatisierung

Analyse mit LC/MS

GC/MSD Analyse

Extraktionsbedingungen: SFE-Parameter für HP 7680T:

• Extraktionsdruck: 329 bar, Temperatur: 55°C • Dichte: 0,89 g/ml • statische Extraktion: 2 min • dynamische Extraktion: 25 min • CO2-Fluß: 1,8 ml/min • Fallenmaterial: ODS, 10°C während der Extraktion • Elutions-Lösungsmittel: Acetonitril



SFE-Parameter für ISCO SFX 3560:

• Extraktionsdruck: 330 bar, Temperatur: 55°C • Dichte: 0,89 g/ml • statische Extraktion: 2 min • dynamische Extraktion: 25 min • CO2-Fluß: 1,8 ml/min • Lösungsmittel in der Vorlage: 10 ml Aceton:Acetonitril (4:1) • Temperatur der Vorlage: 0°C

3.1.4 .3 Wieder f indungsversuche

3.1.4.3.1 Vorgehensweise bei Dotierungen

Für Wiederfindungsversuche wurde unbehandeltes Probenmaterial zerkleinert und portionsweise (z.B. 3 g oder 2,5 g) in 50 ml Bechergläser (hohe Form) eingewogen. Anschließend wurde mit den Standardlösungen in Aceton dotiert. Die Konzentration der Standardlösungen wurde so gewählt, daß bis max. 200 µl der Lösung zugegeben werden mußten. Nach Zugabe von z.B. 2 g Hydromatrix wurde der Ansatz intensiv mit einem Spatel vermischt, für einige Minuten zur Verdampfung des Lösungsmittels stehen gelassen und quantitativ in die Extraktionshülse überführt. Auf ähnliche Art und Weise wurden weitere Probenaliquote mit der gleichen Menge reinen Acetons versetzt und wie oben beschrieben weiter aufgearbeitet. Die daraus erhaltenen Extrakte dienten zur Herstellung von „Matrix-Eichungen“. Wenn eine pH-Wert Einstellung nötig war, wurde zunächst das Probenmaterial auf den gewünschten pH-Wert eingestellt (z.B. durch Zugabe von 50 %iger K2CO3-Lösung) und wie oben beschrieben weiter verfahren. Bei flüssigen Proben wie Orangensaft wurden auch größere Probenmengen dotiert und mit Hydromatrix im entsprechenden Verhältnis vermischt. In die Extraktions-hülsen wurden dann Aliquote dieser Mischung eingewogen. Diese Vorgehensweise bereitete bei zerkleinertem Obst und Gemüse Probleme, da keine ausreichende Homogenität erzielt werden konnte.

3.1.4.3.2 Wiederf indungen mit HP 7680T

Für die Durchführung von Wiederfindungsversuchen wurde zunächst eine Mischung von Pestiziden aus unterschiedlichen Pestizidklassen zusammengestellt. Die Dotierung erfolgte auf pestizidfreie Apfelmus-Matrix (Dotierung 0,5 µg pro 3 g Probe, entsprechend 0,167 ppm). Die hierbei erzielten Wiederfindungen und Variations-koeffizienten sind in Tab. 3.1.4-3 angegeben.



Tab. 3.1.4-3: Wiederfindungen verschiedener Pestizde mit der SFE-Multimethode Probe: Apfelmus, Dotierung: 0,5µ/Ansatz (0,167 ppm) Extraktor: HP 7680T Pestizid Ansatz

1 Ansatz

2 Ansatz

3 Ansatz

4 Mittel-wert

Wieder-findung

Variations-koeffizient

Wiederfindungen Sollwert 0,5µg/3g Ansatz

[%] [%]

HCB 0,478 0,474 0,492 0,479 0,481 96 1,4 Carbofuran 0,504 0,495 0,478 0,486 0,491 98 2,0 Dimethoat 0,492 0,497 0,429 0,490 0,477 95 5,8 Pirimicarb 0,513 0,514 0,496 0,480 0,501 100 2,8 Thiabendazol 0,159 0,157 0,172 0,144 0,158 32 6,3 p,p-DDE 0,448 0,446 0,440 0,421 0,439 88 2,4 Cyproconazol 0,502 0,488 0,486 0,517 0,498 100 2,5 Iprodion 0,480 0,479 0,497 0,500 0,489 98 2,0 Azinphos-Methyl 0,493 0,460 0,494 0,488 0,484 97 2,9 Fenarimol 0,459 0,461 0,472 0,499 0,473 95 3,4 Permethrin 0,429 0,414 0,421 0,405 0,417 83 2,1 Analysenmethode: siehe Anhang 1 Mit Ausnahme von Thiabendazol wurden für die extrahierten Substanzen sehr gute Wiederfindungen erzielt. Es ist zu beachten, daß Thiabendazol zwei basische Stick-stoffatome in seinem Molekül aufweist und aus diesem Grund eine Extraktion unter sauren Bedingungen, wie sie in Apfelmus vorliegen, erschwert ist (siehe Kap. 3.1.4.7.2 und 3.1.5.3.1). Zudem wurde festgestellt, daß die Elution von Thiabendazol von der Festphasenfalle in die Vorlage vermutlich wegen Wechselwirkungen mit freien Silanol-Gruppen an der Oberfläche des ODS-Fallenmaterials ebenfalls erschwert ist (vgl. hierzu Kap. 3.1.5.2.2, Wechselwirkung von Wirkstoffen mit Oberflächen). Zu berücksichtigen ist hier auch die geringe Löslichkeit, die Thiabendazol in Acetonitril hat. In Tab. 3.1.4-4 werden die Wiederfindungsraten und Variationskoeffizienten (n=5) für zahlreichen Verbindungen angegeben die auf pestizidfreie Pfirsich-Martix dotiert wurden (Dotierung: 0,5 µg pro 3 g entsprechend 0,167 ppm).



Tab. 3.1.4-4: Wiederfindungen verschiedener Pestizde mit der SFE-Multimethode Probe: Pfirsich, Dotierung 0,5µ/Ansatz (0,167 ppm) Extraktor: HP 7680T Pestizid Wiederfindung

Mittelwert %

Variationskoeffizient in %

Nachweisgrenze (3-faches

Grundlinienrauschen) in ppm

Azinphos-Ethyl 86,3 3,2 0,015 Azinphos-Methyl 77,1 6,8 0,02 Benalaxyl 94,7 3,4 0,013 Binapacryl 90,9 3,8 0,013 Biphenthrin 87,0 4,4 0,005 Biphenyl 86,4 5,5 0,005 Bitertanol 86,8 3,6 0,006 Bromazil 80,3 5,7 0,02 Bromophos 94,7 2,7 0,005 Bromophos-Ethyl 108,8 4,3 0,005 Brompropylat 85,2 5,5 0,005 Bupirimat 90,8 7,7 0,025 Buprofezin 90,3 4,6 0,01 Carbaryl 79,0 7,0 0,005 Carbofuran 88,8 2,9 0,005 Chinomethionat 93,7 1,6 0,005 Chlorfenvinphos 95,5 5,9 0,005 Chlorpyrifos 85,9 4,2 0,005 Chlorpyrifos-Methyl 82,9 5,0 0,005 Chlorthalonil 90,9 2,9 0,005 Chlozolinat 94,0 2,2 0,01 Cyfluthrin 103,8 4,0 0,02 Cyhalothrin lambda 81,8 6,3 0,02 Cypermethrin 83,4 6,5 0,04 Cyproconazol 89,1 3,9 0,005 Deltamethrin 71,6 10,2 0,04 Demeton-S-Methyl 83,8 11,4 0,02 Demeton-S-Methyl-Sulfon 64,5 4,2 0,02 Diazinon 84,6 5,5 0,005 Dichlofluanid 76,5 6,8 0,005 Dichloran 83,5 3,2 0,01 p,p-Dichlorbenzophenon* 112,3 24,9 Dicofol* 66,4 5,9 0,04 Dicofol o,p 96,3 9,3 0,007 Dieldrin 108,5 6,3 0,015 Diethofencarb 105,8 1,3 0,005 Dimethoat 81,8 5,2 0,04 Diniconazol 96,3 1,6 0,01 Dioxathion 85,4 5,7 0,008 Diphenylamin 82,7 6,7 0,005



Pestizid Mittelwert in %




Disulfoton 70,3 2,1 0,01 Endosulfan alpha 87,6 5,7 0,02 Endosulfan beta 90,7 2,8 0,02 Endosulfansulfat 117,8 4,1 0,006 Endrin 88,8 4,0 0,01 Ethion 89,3 6,4 0,005 Fenarimol 94,0 3,5 0,025 Fenchlorfos 95,8 1,8 0,005 Fenitrothion 84,9 3,5 0,006 Fenoxycarb 97,2 5,5 0,013 Fenpropathrin 86,5 4,0 0,01 Fenpropimorph 87,8 3,1 0,005 Fenson 89,0 4,2 0,007 Fenthion 86,6 5,0 0,005 Fenthionsulfoxid 85,4 2,3 0,01 Fenvalerat** 118,6 13,1 0,05 Flusilazol 82,8 5,1 0,005 Folpet 67,3 8,0 0,005 Fonofos 91,3 5,4 0,005 Hexaconazol 93,8 3,5 0,01 Hexythiazox 80,8 10,0 0,1 Imazalil 73,4 9,7 0,08 Iprodion 79,3 4,2 0,015 Lindan 94,4 1,6 0,005 Malaoxon 94,4 6,3 0,005 Malathion 86,7 2,8 0,007 Mecarbam 91,4 7,1 0,015 Metalaxyl 92,9 1,7 0,01 Metazachlor 99,3 1,9 0,02 Methidathion 87,9 2,9 0,01 Methiocarb 96,2 5,5 0,015 Mevinphos 85,4 2,4 0,01 Myclobutanil 83,8 1,7 0,033 Nuarimol 88,8 4,4 0,03 Omethoat*** 9,0 14,7 - Orthophenylphenol 89,3 4,8 0,005 Oxadixyl 90,7 5,5 0,025 Parathion 82,6 4,7 0,005 Parathion-Methyl 86,1 4,9 0,01 Penconazol 86,3 3,1 0,005 Permethrin 106,7 3,7 0,01 Phosalon 78,4 4,7 0,007 Phosmet 83,2 6,9 0,005



Pestizid Mittelwert in %



Pirimicarb 81,9 0,005 Pirimiphos-Methyl 93,2 2,8 0,005 Prochloraz 71,7


3,2

16,5 0,1 Procymidon 83,9 5,2 0,005 Profenofos 92,6 3,5 0,005 Propargit 72,0 5,4 0,013 Propiconazol 84,6 3,4 0,01 Propoxur 88,6 3,2 0,007 Propyzamid 92,3 1,6 0,005 Prothiophos 89,3 3,0 0,005 Pyrazophos 85,3 3,3 0,01 Pyrifenox 1 88,2 0,015 Pyrifenox 2 84,4 5,9 0,01 Pyrimethanil 90,8 2,7 0,005 Quinalphos 83,3 4,7 0,015 Quintozen 85,8 1,8 0,01 Tebuconazol** 130,0 2,5 0,05 Tebufenpyrad 89,6 2,8 0,005 Tecnazen 88,4 1,2 0,005 Tetradifon 83,2 5,4 0,007 Tetramethrin 86,7 3,7 0,005 Thiabendazol 70,8 9,5 0,015 Tolclofos-Methyl 95,6 1,7 0,005 Tolylfluanid 78,4 5,5 0,005 Triadimefon 91,1 4,2 0,013 Triadimenol 92,9 3,4 0,01 Triazophos 90,2 2,5 0,02 Vinclozolin 83,3 4,6 0,005 Analysenmethode: siehe Anlage 1 * Dicofol wird im Injektor teilweise zu p,p’-Dichlorbenzophenon abgebaut ** gestört *** hohe Polarität

3,5

Im Bereich der Pestizidrückstandsanalytik gilt eine Methode als für einen Stoff geeignet, wenn die Wiederfindung im Bereich zwischen 70 und 110 % liegt. Bei den hier aufgeführten Stoffen wurde dies lediglich für Omethoat und Demeton-S-Methyl-Sulfon nicht erreicht. Bei den Stoffen Folpet und Dicofol u.a. kommt es, je nach Zustand des Injektions-systems zu Zersetzungen. Hier ist nicht die Extraktion, sondern die Bestimmung problematisch.



3.1.4.3.3 Wiederf indungen mit ISCO SFX 3560

Einer pestizidfreien Karottenprobe wurde eine Mischung von Pestiziden zudotiert (0,167 ppm). Pro Extraktionsansatz wurden je 3 g Probe eingesetzt, die mit 2,5 g Hydromatrix vermengt wurden. Die folgende Tab. 3.1.4-5 gibt die erzielten Wiederfindungen und Variationskoeffizienten an. Tab. 3.1.4-5: Wiederfindungen verschiedener Pestizde mit der SFE-Multimethode Probe: Karotte, Dotierung: 0,5µ/Ansatz (0,167 ppm) Extraktor: ISCO SFX-3560 Pestizid Ansatz

1 Ansatz

2 Ansatz

3 Mittelwert mittlere

Wieder- Variations-koeffizient

Wiederfindung in µg/3g Ansatz (Sollwert 0,5)

findung [%]

[%]

HCB 0,454 0,420 0,444 0,439 88 4,0 Carbofuran 0,473 0,462 0,464 0,466 93 1,3 Dimethoat 0,513 0,519 0,531 0,521 104 1,8 Pirimicarb 0,479 0,454 0,464 0,466 93 2,7 Thiabendazol 0,363 0,331 0,369 0,354 71 5,8 p,p-DDE 0,446 0,426 0,451 0,441 88 3,0 Cyproconazol 0,487 0,441 0,450 0,459 92 5,3 Iprodion 0,452 0,425 0,449 0,442 88 3,3 Azinphos-Methyl 0,495 0,447 0,505 0,482 97 6,4 Fenarimol 0,421 0,448 0,466 0,445 89 5,1 Permethrin 0,444 0,414 0,439 0,432 87 3,7 Probe/Hydromatrix 3 g : 2,5 g Extraktor: ISCO SFX 3560, Extraktionsbedingungen: siehe Kap. 3.1.4.2 Bestimmung GC/MSD: siehe Anlage 1 Die hierbei erzielten Wiederfindungen liegen, wie auch bei Verwendung des Extraktors der Fa. HP, sehr hoch (vgl. Tab. 3.1.4.-3). Bei Thiabendazol ist allerdings hier eine höhere Wiederfindungsrate erzielt worden. Dies läßt sich zum einen begründen durch den höheren pH-Wert den die Karottenmatrix im Vergleich zur Apfelmusmatrix hat und zum anderen durch die Tatsache, daß beim ISCO- Extraktor die Extrakte direkt in eine flüssige Phase eingeleitet werden. Da Carbendazim nicht direkt gaschromatographisch bestimmbar ist, wurde nach der Extraktion eine Derivatisierung mit Pentafluorbenzylbromid durchgeführt. Bei dieser Reaktion werden auch Thiabendazol und Carbofuran umgesetzt (siehe Tab. 3.1.4-6). Auffällig ist, daß bei Thiabendazol die ermittelte Wiederfindung von 71 % ohne Derivatisierung auf 59 % nach der Derivatisierung gesunken ist. Die Gründe für diese Abnahme liegen nicht bei der Derivatisierung sondern eher an der Neigung des Thiabendazols sich an Oberflächen zu adsorbieren. Eine Abnahme der Konzentration von Thiabendazol in Lösungen mit fortschreitender Zeit wurde häufiger festgestellt.



Tab. 3.1.4-6: Wiederfindungen nach Derivatisierung mit PFB-Br Pestizid Ansatz

1 Ansatz

2 Ansatz

3 Mittelwert mittlere

Wieder- Variations-koeffizient

Wiederfindung in µg/3g Ansatz (Sollwert 0,5)

findung [%]

[%]

Carbofuran 0,461 0,434 0,440 0,445 89 3,2 Thiabendazol 0,288 0,288 0,302 0,293 59 2,8 Carbendazim 0,411 0,423 0,453 0,429 86 5,0

Probe/Hydromatrix 3 g : 2,5 g Extraktor: ISCO SFX 3560, Extraktionsbedingungen: siehe Kap. 3.1.4.2 Bestimmung GC/MSD: siehe Anlage 1

3.1.4 .4 Nachweis- und Best immungsgrenzen

Wie in Tab. 3.1.4-4 bereits dargestellt, wurden die Nachweisgrenzen für eine Vielzahl von Stoffen abgeschätzt (3-faches Grundlinien-Rauschen). Für einige ausgewählte Stoffe aus verschiedenen Stoffgruppen wurden die Nachweis- und Bestimmungs-grenzen nach dem DFG-Eichgeradenverfahren ermittelt (siehe Tab. 3.1.4-7). Hierzu wurden Wiederfindungsversuche bei vier verschiedenen Konzentrationen jeweils 4 mal durchgeführt (16 Aufarbeitungen) [80]. Die Dotierungen erfolgten auf Apfelmatrix, wobei die niedrigste dotierte Konzentration im Bereich der erwarteten Nachweisgrenze lag und die höchste ein Zehnfaches hiervon [81]. Tab. 3.1.4-7: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen nach DFG [82]

Pestizid

NG (µg/kg) BG (µg/kg) kleinste ** Höchstmenge [34]

(µg/kg) Azinphos-Methyl 8 12 50

Carbofuran 5 8 200 Cyproconazol 3 8 50

Dimethoat 8 14 50 Fenarimol 9 13 20

Thiabendazol* 6 11 10 Permethrin 6 13 50

Iprodion 11 16 20 HCB 9 16 10

Pirimicarb 8 13 50 p,p´-DDE 5 8 50

Probe/Hydromatrix 3 g : 2,5 g Extraktor: ISCO SFX 3560, Extraktionsbedingungen: siehe Kap. 3.1.4.2 Bestimmung GC/MSD: siehe Anlage 1 *nach Derivatisierung mit PFB-Br, **für Säuglingsnahrung 10 µg/kg Diese Ergebnisse zeigen, daß die SFE erfolgreich in einem Rückstandslaboratorium zur routinemäßigen Pestizidanalytik eingesetzt werden kann. Eine detaillierte Analysenvorschrift zur Bestimmung von Pestiziden in Obst und Gemüse befindet sich im Anlage 1 (Code 100E3101).



3.1.4 .5 Methodenvergle ich

Um die hier vorgestellte SFE-Multimethode (siehe Anlage 1) mit den herkömmlichen in der Routineanalytik eingesetzten Multimethoden (DFG-S8 und DFG-S19) zu vergleichen, wurden zahlreiche Proben aus dem Handel parallel untersucht. Die Ergebnisse sind in Anlage 5 tabellarisch dargestellt. Aus den Ergebnissen wird ersichtlich, daß durch SFE-Extraktion für fast alle Wirkstoffe, mit den DFG-Methoden vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. Für die zum Teil unterschiedlichen Ergebnisse kommen zusätzlich zu den Unter-schieden bei den Extraktionsausbeuten auch weitere Ursachen in Frage: 1. Analytische Sreubreite:

Insbesondere bei Einfach- aber auch bei Doppelbestimmungen ist die statistische Sicherheit gering. Bei geringen Gehalten ist die analytische Streubreite sehr hoch. Im allgemeinen wird bei der gängigen Rückstandsanalytik von Pestiziden eine Streubreite von: 100 % bei Meßwerten von 0,01 mg/kg, 50 % bei Meßwerten von 0,1 mg/kg und 25 % bei Meßwerten von 1 mg/kg angegeben [18]. Diese Größenordnung hat sich oft bei Ringversuchen bestätigt.

2. Inhomogenitäten der Proben (vgl. Kap. 3.1.4.7.1 und 3.1.3.1) 3. Fehlerquellen bei der Messung z.B. durch Matrixeffekte (vgl. Kap. 3.1.2.2). Bedingt durch die analytische Streuung sind einzelne Analysenergebnisse stets mit einer Unsicherheit behaftet. Um diese Unsicherheit zu verringern werden Mehrfach-bestimmungen durchgeführt und Mittelwerte gebildet. Aus diesem Grund wurde eine Erdbeerprobe aus dem Handel mehrfach untersucht. Insgesamt wurden 5 Unter-suchungen nach DFG-S8 und 12 Untersuchungen mit SFE gemacht. Die Unter-suchungsergebnisse sind in Tab. 3.1.4-8 aufgelistet. 5-fach-Bestimmung nach der DFG-S8 Methode: Die DFG-S8-Methode wurde in einer leicht abgewandelten Form wie folgt durchgeführt: 50 g zerkleinerte Probe werden mit Aceton (Endvolumen 200ml) am Ultra-Turrax homogenisiert. Der Extrakt wird durch eine Nutsche filtriert. Ein Aliquot (40 ml) des filtrierten Acetonextraktes wird mit 5 ml gesättigter Natriumchloridlösung und 50 ml Wasser versetzt und zwei mal mit je 10 ml Dichlormethan ausgeschüttelt. Die ver-einigten Dichlormethanphasen werden mit Natriumsulfat getrocknet und am Rotationsverdampfer eingeengt. Der eingeengte Extrakt wird in 10 ml Cyclo-hexan/Essigester (1:1) aufgenommen. Ein Aliquot davon (4 ml) wird gelpermeations-chromatographisch (GPC) gereinigt. Das Eluat wird an der Rotationszentrifuge ein-geengt in Isooctan (mit ISTD) aufgenommen und zur Chromatographie verwendet. Die bei diesem Methodenvergleich erzielten Ergebnisse werden in Tab. 3.1.4-8 sowie in den Abb. 3.1.4-3 und 3.1.4-4 aufgeführt.



Tab. 3.1.4-8: Ergebnisse des Methodenvergleiches DFG-S8 (mod.) und SFE-Multimethode

Pestizid Mittelwerte Standard- abweichungen

Variations- koeffizienten

SFE S8 SFE S8 SFE S8* α-Endosulfan 0,009 0,009 0,0013 0,0009 17% 10% β-Endosulfan 0,023 0,020 0,0029 0,001 13% 5%

Endosulfansulfat 0,027 0,024 0,0033 0,001 12% 4,2% Metalaxyl 0,106 0,082 0,0067 0,005 6% 6,1%

*Alle 5 Bestimmungen mit der DFG-S8-Methode wurden nebeneinander aufgearbeitet (keine echten Wiederholbestimmungen)

Abb. 3.1.4-3: Mehrfachbestimmung einer Erdbeerprobe mit der SFE-Multimethode

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

a-Endosulfanß-Endosulfan

EndosulfansulfatMetalaxyl

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

Nummer des Versuchs

Mittelwerte in ppmMetalaxyl 0,106a-Endosulfan 0,009ß-Endosulfan 0,023Endosulfansulfat 0,027

MW

Abb. 3.1.4-4: Mehrfachbestimmung einer Erdbeerprobe mit der DFG-S8-Methode

1 2 3 4 5 6

a-Endosulfan

ß-EndosulfanEndosulfansulfat

Metalaxyl

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

mg/kg

Mittelwerte in ppmMetalaxyl 0,082 mg/kga-Endosulfan 0,009 ß-Endosulfan 0,020 Endosulfansulfat 0,024

Nummer des VersuchsMW



In Tab. 3.1.4-9 werden die einzelnen Arbeitsschritte die bei der SFE-Multimethode (siehe Anlage 1) und der DFG S8 Methode anfallen, gegenübergestellt. Tab. 3.1.4-9: Gegenüberstellung der DFG-S8 und der SFE-Methode:

SFE

DFG S8 (modifiziert)

Arbeitsschritte:

• Probenzerkleinerung und Homogenisierung

• einwiegen • Zugabe von Adsorbens • Einfüllen in die Extraktionshülse • Vorlage mit ISTD-Lösung versetzen • Extraktion • Chromatographie

• Probenzerkleinerung und Homogenisierung

• einwiegen • mit Aceton homogenisieren • Aliquotierung • Kochsalzlösung zugeben • mit Dichlormethan ausschütteln • mit Natriumsulfat trocknen • am Rotationsverdampfer konzentrieren • in 10 ml Ethylacetat/Cyclohexan

aufnehmen • Gelpermeationschromatographie • Lösungsmittel entfernen • mit ISTD-Lösung aufnehmen • Chromatographie

Chemikalienverbrauch:

40 g hochreines Kohlendioxid techn. Kohlendioxid zur Kühlung der Falle 3 g Hydromatrix 6,5 ml Acetonitril 5 ml Cyclohexan: Ethylacetat 1:1

200 ml Aceton 20 ml Dichlormethan 300 ml Cyclohexan/Essigester (1:1) Natriumsulfat Natriumchlorid

Arbeitszei für Aufarbeitung: 4 Stunden/12 Proben

Arbeitszeit für Aufarbeitung: 16 Stunden/12 Proben

Der Vergleich zeigt, daß die Vorteile der SFE vor allem in der Effizienz und der Einsparung von Lösungsmitteln und Personalkosten liegen. Die wenigen Arbeitsschritte und die weitgehende Automatisierung bei der SFE minimieren die Fehlerquellen und müßten zu einer besseren Vergleichbarkeit zwischen Laboratorien führen.



3.1.4 .6 Matr ixbezogene Mul t imethoden

Unsere Erfahrungen der letzten Jahre haben gezeigt, daß in die Praxis der Lebens-mittelüberwachung die Entwicklung und Verwendung von matrixbezogenen Multi-methoden viele Vorteile hat. Eine matrixbezogene Multimethode berücksichtigt ggf. die Eigenheiten der betreffenden Matrix (pH-Wert, Wasser- und Fettgehalt) und zielt nur auf Stoffe ab, die in dieser Matrix zu erwarten sind. Die selektive Erfassung der betreffenden Pestizide wird durch die Verwendung eines GC/MSD im SIM-Modus als Bestimmungssystem ermöglicht. Um festzustellen, welche Wirkstoffe für die einzelnen Probenarten relevant sind, wurden Daten aus Jahresberichten von Untersuchungseinrichtungen der Bundesrepublik Deutschland, Monitoring-Daten verschiedener Staaten sowie Literaturangaben ausgewertet. Darüber hinaus wurden z.B. aus dem INTERNET Anwendungs-empfehlungen und Angaben zu angewendeten Pestizidmengen gesammelt. Die Anwendung von matrixbezogenen analytischen Verfahren ermöglicht ein ziel-gerichteteres und dadurch effektiveres Arbeiten, da der Umfang der Untersuchungen auf Stoffe begrenzt wird, die für die jeweilige Matrix relevant sind. Auch im Hinblick auf die Qualitätssicherung hat diese Vorgehensweise Vorteile, da die Methodenvalidierung nur für die relevanten Stoff-Matrix-Kombinationen erfolgen muß. Für folgende Matrizes wurden spezifische Bestimmungsmethoden entwickelt und teilweise validiert: Trauben, Kernobst, Zitrusfrüchte und Beerenobst.

3.1.4.6.1 Pestizide in Zitrusfrüchten

Zitrusfrüchte zählen zu den Obstsorten die weltweit am meisten konsumiert werden. Beim Anbau von Zitrusfrüchten werden üblicherweise mehrfach Pflanzenschutzmittel (überwiegend Fungizide und Insektizide) eingesetzt. Meist findet nach der Ernte auch eine Behandlung der Oberfläche mit Fungiziden statt. Die Früchte beinhalten daher oft eine Vielzahl unterschiedlicher Wirkstoffe. Bei Untersuchungen von Zitrusfrüchten im 2. Halbjahr 1996 am CVUA Stuttgart wurde eine mittlere Anzahl von 6,0 verschiedenen Wirkstoffen pro Probe festgestellt [29]. Die in Zitrusfrüchten vorkommenden Wirkstoffe unterscheiden sich zum Teil erheblich in ihrem chemischen Verhalten, so daß derzeit zu ihrer Erfassung der Einsatz mehrerer analytischer Verfahren notwendig ist [vgl. 29]. Diese Verfahren sind z.T. sehr zeit- und arbeitsaufwendig und benötigen hohe Mengen an organischen Lösungsmitteln. Ein Ersatz einiger dieser Methoden durch weitgehend automatisierte SFE-Methoden würde viele Vorteile mit sich bringen. Dies wurde am Beispiel 2,4-D und Carbendazim gezeigt (siehe Kap. 3.1.5.4.2 und 3.1.5.3.2). Diese bei Zitrusfrüchten (2,4-D) und Obst allgemein (Carbendazim) häufig angewendeten Verbindungen lassen sich mit Hilfe der SFE bedeutend schneller und einfacher als mit den derzeit gebräuchlichen naß-chemischen Einzelbestimmungs-Methoden bestimmen. Um festzustellen, inwieweit sich die für Zitrusfrüchte relevanten Stoffe auch mittels SFE erfassen lassen, wurden Wiederfindungsversuche durchgeführt.



Die erzielten Wiederfindungsraten werden in Tab. 3.1.4-10 und in Abb. 3.1.4-5 auf-geführt. Zum Vergleich sind in Abb. 3.1.4-5 auch die entsprechenden Daten einer kürzlich in unserem Hause entwickelten naßchemischen Methode [29] mit aufgeführt. Tab. 3.1.4-10: Wiederfindung von Stoffen aus dotierten Orangen (n=5)

Wiederfindung in % Variationskoeffizienten % Pestizid SFE

(0,167 ppm) naßchemisch

nach [29] (0,25 ppm)

SFE naßchemisch nach [29]

Biphenyl 94 85 3,5 6,5 Brompropylat 70 91 6,9 3,1 Chlorfenvinphos 79 87 6 3,9 Chlorpyriphos-Methyl 82 96 5,8 5,1 Diazinon 84 89 4,1 5,2 Dichloran 90 70 17,4 8,1 Dicofol* 81 95 9,9 5 Dimethoat 87 84 9,1 9,9 α-Endosulfan 71 90 6,8 5,1 ß-Endosulfan 92 91 4,8 4,7 Endosulfansulfat 80 94 20,5 3,2 Fenarimol 100 76 9,5 6,1 Fenitrothion 72 90 6,4 4,8 Fenthion 81 80 12,9 5,1 Fonofos 95 100 7,7 3,9 Mecarbam 90 92 10,1 4,6 Metalaxyl 108 80 3,1 3,4 Methidathion 76 87 14,1 5,4 Myclobutanil 105 96 3,5 4,7 Parathion 83 92 4,5 4,6 Parathion-Methyl 96 89 12,2 4,2 Pirimiphos-Methyl 74 84 5,4 9,8 Prochloraz 92 106 3,6 5,3 Procymidon 103 89 3,3 3,6 Propiconazol 87 90 4,8 6,1 Pyridaphenthion 99 82 11,6 6,4 Quinalphos 79 89 4,5 5,1 Tetradifon 84 94 4,4 3,4 Vinclozolin 89 91 2,8 3,4 Analysenmethode: siehe Anlage 1, Code: 100E3101 Probe: gefroren zerkleinerte Orangen, Probenmenge 3g, Hydromatrix 1,5g Bestimmung: mittels GC/MSD



Abb. 3.1.4-5: Wiederfindungen bei Dotierungsversuchen nach der SFE-Methode und nach [29], dotierte Matrix: Orange (je n=5), Dotierungen 0,167 ppm (SFE), 0,25 ppm (naßchemische Methode)

Biphenyl

Brompropylat

Chlorfenvinphos

Chlorpyriphos-Methyl

Diazinon

Dichloran

Dicofol*

Dimethoat

a-Endosulfan

b-Endosulfan

Endosulfan-Sulfat

Fenarimol

Fenitrothion

Fenthion

Fonofos

Mecarbam

Metalaxyl

Methidathion

Myclobutanil

Parathion

Parathion-Methyl

Pirimiphos-Methyl

Prochloraz

Procymidon

Propiconazol

Pyridaphenthion

Quinalphos

Tetradifon

Vinclozolin

0 35 70 105

Biphenyl

Brompropylat

Chlorfenvinphos

Chlorpyriphos-Methyl

Diazinon

Dichloran

Dicofol*

Dimethoat

a-Endosulfan

b-Endosulfan

Endosulfan-Sulfat

Fenarimol

Fenitrothion

Fenthion

Fonofos

Mecarbam

Metalaxyl

Methidathion

Myclobutanil

Parathion

Parathion-Methyl

Pirimiphos-Methyl

Prochloraz

Procymidon

Propiconazol

Pyridaphenthion

Quinalphos

Tetradifon

Vinclozolin

SFE naßchemisch [3]



3.1.4.6.2 Pestizide in Kernobst

Äpfel und Birnen gehören zu den am meisten konsumierten Obstsorten in Deutschland. Während des Anbaus werden mehrfach Insektizide und Fungizide eingesetzt. Insbesondere Äpfel werden häufig über einen längeren Zeitraum unter klimatisierten Bedingungen gelagert. Vor der Einlagerung werden die Früchte oft durch Eintauchen in Lösungen, die Fungizide und/oder Bräunungsverhütungsmittel (z.B. Diphenylamin) enthalten, behandelt. Nach den Untersuchungen der letzten Jahre zeigt Kernobst eine vergleichsweise geringe Pestizidbelastung, wobei im allgemeinen in Birnen mehr Fungizide gefunden werden als in Äpfel. Zur Ermittlung der Wiederfindungen wurde jeweils 0,33 ppm der Wirkstoffe auf pestizidfreies Apfelmus dotiert. Die folgende Tab. 3.1.4-11 gibt die erzielten Wieder-findungen und Variationskoeffizienten für n=5 an. Tab. 3.1.4-11: ermittelte Wiederfindungen von Pestiziden aus dotiertem Apfelmus , Dotierungsmenge 0,33 ppm, Extraktionsgerät ISCO SFX 3560 Pestizid Mittlere

Wiederfindung in %

Standard-abweichung


in %

Bemerkungen

Azinphos-Methyl 104,2 9,6 9,2 Biphenthrin 76,1 3,2 4,2 Brompropylat 91,0 4,5 4,9 Captan 75,6 6,3 8,4 zersetzt sich im Injektor Carbaryl 97,0 3,3 3,4 Chlorpyrifos 89,8 4,9 5,4 Chlorpyrifos-Methyl 87,7 5,7 6,5 Cyhalothrin lambda 81,4 5,1 6,3 Cypermethrin 71,7 4,2 5,8 Deltamethrin 71,0 6,3 8,8 Diazinon 86,6 6,7 7,8 Dichlofluanid 92,4 7,7 8,4 Dicofol 70,8 17,3 24,4 zersetzt sich im Injektor Dimethoat 99,0 5,8 5,8 Diphenylamin 108,0 17,4 16,1 α-Endosulfan 88,9 4,8 5,4 ß-Endosulfan 75,1 7,8 10,4 Fenpropathrin 80,7 3,0 3,8 Fenthion 84,6 5,0 6,0 Fenvalerat 81,2 3,2 3,9 Flusilazol 84,2 2,4 2,9 Folpet 76,0 4,9 6,4 Imazalil 89,4 8,0 9,0 Iprodion 87,1 11,1 12,7 Zersetzung im Injektor Malathion 93,1 3,4 3,7 Omethoat 14,7 1,4 9,3 hohe Polarität Parathion-Methyl 87,3 4,6 5,3 Phosalon 93,3 4,7 5,0



Pestizid Mittlere Wiederfindung

in %

Standard-abweichung


in %

Bemerkungen

Phosmet 94,2 3,7 3,9 Pirimicarb 98,2 5,2 5,3 Procymidon 93,8 3,7 3,9 Propargit 78,7 9,1 11,5 Quinalphos 92,8 9,7 10,5 Tetradifon 93,4 4,4 4,8 Thiabendazol 43,8 5,5 12,6 pH-Wert nicht eingestelltTolylfluanid 92,7 4,4 4,7 Vinclozolin 90,8 6,1 6,7 Probe/Hydromatrix 3 g : 2,5 g Extraktor: ISCO SFX 3560, Extraktionsbedingungen: siehe Kap. 3.1.4.2 Bestimmung GC/MSD: siehe Anlage 1 Während Dimethoat (Löslichkeit in Wasser 39,8 mg/L, Po/w 0,74 [136]) sich noch gut mittels SFE extrahieren läßt, sind die Wiederfindungen beim polareren Abbauprodukt Omethoat (Po/w -0,74 [136]) unbefriedigend.

3.1.4.6.3 Pestizide in Beerenobst

Beerenobst ist stark anfällig gegen Pilzbefall und wird daher häufig mehrfach mit Fungiziden behandelt. Neben der einheimischen Produktion, die im Frühsommer vermarktet wird, werden in den Monaten Januar bis April große Mengen Erdbeeren aus Marokko, Spanien und Italien importiert. In den letzten Jahren wurden in spanischen Erdbeeren eine ganze Reihe auch neuer Pestizide nachgewiesen. Für einige der vorkommenden Pestizide wurden Wiederfindungsversuche durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tab. 3.1.4-12 aufgeführt.



Tab. 3.1.4-12: Wiederfindungen von Pestiziden aus dotierten Erdbeeren , Dotierungsmenge 0,33 ppm, Extraktionsgerät HP 7680T, (n=5) Pestizid Mittlere Wiederfindung

in % Variationskoeffizient

in % Chlorpyrifos-Methyl 93 10,2 Cyfluthrin 63 7,2 Cypermethrin 62 7,7 Cyproconazol 97 1,4 Dicofol 101 10,4 Dimethoat 95 6,2 α-Endosulfan 81 9,5 ß-Endosulfan 95 9,1 Endosulfansulfat 85 10,5 Fenarimol 99 2,9 Folpet 86 14,4 Lindan 87 5,9 Myclobutanil 101 2,6 Pyrifenox 1 92 2,5 Pyrifenox 2 93 2,7 Procymidon 100 6,9 Tolclofos-Methyl 93 9,2 Analysenmethode: siehe Anlage 1

3.1.4.6.4 Pestizide in Tafeltrauben

Trauben werden mittlerweile über das ganze Jahr hinweg angeboten. Während europäische Ware hauptsächlich im Sommer und Herbst angeboten wird, werden in der restlichen Zeit die Früchte vor allem aus Südamerika und Südafrika importiert. Da Trauben anfällig gegen Schimmelbefall sind, werden sie häufig mehrfach mit Fungiziden behandelt. Insbesondere Trauben aus dem Mittelmeerraum (Türkei, Griechenland, Italien) weisen häufig Mehrfachrückstände auf. Für einige der vorkommenden Pestizide wurden Wiederfindungsversuche durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tab. 3.1.4-13 und tab. 3.1.4-14 aufgeführt.



Tab. 3.1.4-13: Wiederfindungen von Pestiziden aus dotierten Trauben , Dotierungsmenge 0,167ppm, Extraktionsgerät ISCO SFX 3560 Pestizid Mittlere

Wiederfindung in %

Standard-abweichung


in % Brompropylat 91,3 3,8 4,2 Chlorpyrifos 86,6 2,7 3,1 Chlorthalonil 85,9 4,8 5,6 Chlozolinat 81,9 4,1 5,0 Deltamethrin 65,4 9,5 14,6 Dichlofluanid 82,1 3,1 3,8 Diethofencarb 98,9 3,6 3,6 Dimethoat 85,5 7,4 8,6 Endosulfan, alpha 86,5 2,9 3,3 Endosulfan, beta 86,3 4,6 5,3 Endosulfansulfat 91,3 8,7 9,5 Folpet 81,2 12,4 15,3 Folpet Abbau 87,4 9,1 10,4 Iprodion 86,3 6,8 7,9 Iprodion Abbau 78,4 6,9 8,8 L-Cyhalothrin 78,5 3,9 5,0 Myclobutanil 84,7 5,0 5,9 Oxadixyl 89,7 3,7 4,1 Parathion-Methyl 79,9 4,8 6,0 Penconazol 92,1 3,2 3,5 Procymidon 93,2 2,9 3,1 Pyrazophos 102,8 3,1 3,1 Pyrimethanil 99,1 4,3 4,4 Tebuconazol 89,6 6,1 6,8 Tetradifon 89,5 4,4 4,9 Tolylfluanid 87,3 2,7 3,1 Triadimefon 91,8 4,9 5,3 Triadimenol 102,8 4,4 4,3 Vinclozolin 92,5 3,5 3,8 Probe/Hydromatrix 3 g : 2,5 g Extraktor: ISCO SFX 3560, Extraktionsbedingungen: siehe Kap. 3.1.4.2 Bestimmung GC/MSD: siehe Anlage 1



Tab. 3.1.4-14: Wiederfindungen von Pestiziden aus dotierten Trauben Dotierungsmenge 0,6 ppm, Extraktionsgerät HP 7680T Pestizid Mittlere

Wiederfindung in %

Standard-abweichung


Brompropylat 87,5 28,6 5,5 Chlorpyrifos 88,7 19,1 3,6 Chlozolinat 95,1 32,8 5,7 Cyhalothrin 74,0 15,6 3,5 Diethofencarb 89,0 25,0 4,7 Endosulfan, alpha 94,2 18,3 3,2 Endosulfan, beta 96,9 23,4 4,0 Endosulfansulfat 97,6 24,9 4,3 Myclobutanil 95,4 5,7 1,0 Oxadixyl 97,5 22,0 3,8 Penconazol 92,3 26,0 4,7 Procymidon 97,8 18,1 3,1 Pyrimethanil 97,6 33,4 5,7 Tebuconazol 76,2 14,9 3,3 Tetradifon 74,8 31,0 6,9 Tolylfluanid 65,0 46,2 11,9 Triadimefon 95,5 30,5 5,3 Triadimenol 97,9 16,3 2,8 Vinclozolin 99,0 28,7 4,8 Analysenmethode: siehe Anlage 1



3.1.4 .7 E in f lüsse verschiedener Parameter auf d ie

Ext rakt ionsausbeuten

3.1.4.7.1 Einfluß der Zerkleinerung auf die Probenhomogenität

Wegen der geringen Probenmenge, die bei der SFE eingesetzt werden kann, ist es erforderlich eine sehr gute Probenhomogenität zu erzielen, damit ein statistisch repräsentatives Ergebnis erzielt werden kann. Eine sehr gute Feinzerkleinerung und damit auch Homogenität kann erreicht werden, wenn die grob zerkleinerte Teilprobe zunächst tiefgefroren und erst in gefrorenen Zustand feinzerkleinert wird (siehe auch Kap. 3.1.3.1). Dies wurde in folgendem Versuch demonstriert: Trauben mit Rückständen an Carbendazim wurden sowohl in frischem als auch in tiefgefrorenem Zustand zerkleinert. Die auf dieser Weise zerkleinerten Proben wurden je 7 mal extrahiert. Die dabei ermittelten Carbendazim-Gehalte waren nahezu gleich. Die gefroren zerkleinerte Probe wies jedoch eine wesentlich geringere Schwankung der Analysenergebnisse auf (vgl. Tab. 3.1.4-15) Tab. 3.1.4-15: Einfluß der Feinzerkleinerung auf die Probenhomogenität Matrix: Tafeltrauben (Alphonse Lavallee)

„frisch“ zerkleinert

gefroren zerkleinert

Mittlerer Carbendazim-Gehalt

1,76 mg/kg 1,73 mg/kg

Standardabweichung in %

10,9 (n=7) 4,4 (n=7)

Analysenmethode: siehe Anlage 2

3.1.4.7.2 Einfluß der Polari tät der Analyten auf die Extrahierbarkeit

Überkritisches Kohlendioxid ist ein recht unpolares Lösungsmittel und ist daher gut zur Extraktion von unpolaren Analyten geeignet. Bei Gegenwart von Wasser in der Probe wirkt dieses als Modifier, so daß eine gute Extrahierbarkeit von mittelpolaren Pestiziden gegeben ist. Die Extraktion von Analyten mit hoher Polarität ist jedoch schwieriger. Dies hat sich bei verschiedenen Versuchen gezeigt. So ist zum Beispiel Dimethoat besser extrahierbar als Omethoat und Methomyl besser extrahierbar als das polarere Oxamyl. In der Reihe Methiocarb, Methiocarb-Sulfon und Methiocarb-Sulfoxid verschlechtert sich die Extrahierbarkeit mit zunehmender Polarität (siehe Tab. 3.1.5-34 in Kap. 3.1.5.5.2.6). Die Extrahierbarkeit von basischen Verbindungen ist bei niedrigen pH-Werten und von sauren Verbindungen bei hohen pH-Werten schlecht, da unter diesen Bedin-gungen die Verbindungen zu einem Großteil ionisch vorliegen und daher eine hohe Polarität aufweisen. So entzieht sich z.B. die Substanz 2,4-D, die unter alkalischen Bedingungen fast ausschließlich als polares Anion vorliegt, der Extraktion. Unter sauren Bedingungen



dagegen liegt die leicht extrahierbare Säureform vor. Analoges gilt auch für weitere Substanzen wie z.B. Thiabendazol, Carbendazim und Imazalil, die unter sauren Bedingungen zu einem erheblichen Anteil als Kationen vorliegen. Diese Verbindungen lassen sich am besten im Alkalischen extrahieren (siehe auch Kap. 3.1.5.3.2). Wie in Abb. 3.1.4-6 ersichtlich, können auch bei Extraktionen mit überkritischem Kohlendioxid die Extraktionsausbeuten durch eine geeignete Einstellung des pH-Wertes verbessert werden (siehe auch Kap. 3.1.5.3.1 und 3.1.5.4.3). Abb. 3.1.4-6: Einfluß des pH auf die Extrahierbarkeit von 2,4-D und Carbendazim

0

20

40

60

80

100

Carbendazim 2,4-D

Rec

over

ies

(%) pH 2.5

pH 4pH 7pH 9.5

3.1.4.7.3 Einfluß des Wassergehaltes auf die Extrahierbarkeit unpolarer Analyten

Hohe Wassergehalte behindern die Extraktion von unpolaren Verbindungen wie Organochlorpestiziden und Pyrethroiden. Für diese Verbindungen können bessere Wiederfindungsraten erreicht werden, wenn die Proben mit mehr Adsorbens (Hydro-matrix, Hymx) vermischt werden. Aus Abb. 3.1.4-7 wird ersichtlich, daß bei einigen Verbindungen mit zunehmendem Proben / Hydromatrix Verhältnis eine starke Abnahme der Wiederfindungen einhergeht. Insbesondere bei lipophilen Verbindungen mit sehr geringer Wasserlöslichkeit wie bei den Pyrethroiden (Löslichkeit in Wasser 1 - 500 µg/L [119]) sind diese Effekte stärker ausgeprägt als bei Verbindungen mit einer verhältnismäßig größeren Löslichkeit wie z.B. Lindan (7 mg/L) (siehe hierzu auch Kap. 3.1.7.1).



Abb. 3.1.4-7: Einfluß des Wassergehaltes auf die Extrahierbarkeit unpolarer Pestizide

0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

Bip

hent

hrin

Del

tam

ethr

in

Cyh

alot

hrin

Per

met

hrin

Cyf

luth

rin

Cyp

erm

ethr

in

Fenp

ropa

thrin

Fenv

aler

at DD

E

Hep

tach

lor

Die

ldrin

Lind

an

0

20

40

60

80

100

Recoveries %

Sample/HymxRatio

Die Polarität des überkritischen Kohlendioxids nimmt mit steigendem Gehalt an gelöstem Wasser zu („modifier“-Wirkung von Wasser). Die Fähigkeit des Fluids lipophile Substanzen zu lösen nimmt somit mit steigendem Wassergehalt ab. Man könnte annehmen, daß dies die Ursache für die schlechtere Wiederfindung von Cypermethrin ist. Die Löslichkeit von Wasser in überkritischem Kohlendioxid ist jedoch sehr gering (Sättigungskonzentration etwa 3 mg/g [11]). Zudem weist das auf der Oberfläche des Adsorbens verteilte Wasser eine sehr große Oberfläche auf, so daß eine rasche Gleichgewichtseinstellung (Sättigung) zu erwarten ist. Die Absättigung des überkritischen Kohlendioxids mit Wasser dürfte demnach kurz nach dem ersten Kontakt mit der wasserhaltigen Probe erfolgen. Ein unterschiedlicher Ab-sättigungsgrad des Fluids kommt demnach als Ursache für den oben genannten Befund eher nicht in Frage. Die ziemlich unpolaren Substanzen neigen dazu sich an unpolare Oberflächen wie Wachs-, Cutin- und Ölschichten zu adsorbieren. Es ist vorstellbar, daß beim Ver-reiben der Probe mit Hydromatrix solche lipophilen Bestandteile teilweise an der unregelmäßigen Oberfläche der Hydromatrix haften bleiben und dort mehr oder weniger von einer Wasserfilm überzogen und abgeschirmt werden. Die darin/darüber liegenden Wirkstoffe wären in diesem Fall für das lipophile Extraktionsfluid nur schwer zugänglich.



3.1.4.7.4 Abbau von Pestiziden während der Lagerung im Autosampler

Im Gegensatz zu herkömmlichen naßchemischen Analysenmethoden, bei denen die Proben in der Regel direkt nach ihrer Wägung extrahiert werden, lagern bei der SFE die aufgearbeiteten Proben oft mehrere Stunden im Probengeber des Extraktionsgerätes bei Raumtemperatur. Bei zahlreichen Wiederfindungsversuchen hat sich gezeigt, daß oxidations- oder hydrolyseempfindliche Substanzen bereits abgebaut werden, wenn die Extraktion nicht unmittelbar nach der Probenvorbereitung erfolgt, sofern die Proben nicht bis dahin tiefgefroren werden. Abb. 3.1.4-8 und 3.1.4-9 zeigt das Abbauverhalten einiger dieser empfindlichen Verbindungen in zwei verschiedenen Matrizes auf. Abb. 3.1.4-8: Abbau von Pestiziden während der Lagerung in der Extraktionshülse

03

58

1630

Dia

zino

n

Dio

xaca

rb

Dis

ulfo

ton

Ethi

ofen

carb

Toly

lflua

nid

Chl

ozol

inat

e

Dic

hlof

luan

id

Folp

et

0102030405060708090

100110

Wiederfindung [%]

Zeit (h)

Salat pH∼6



Abb. 3.1.4-9: Abbau von Pestiziden während der Lagerung in der Extraktionshülse

04

820To

lylfl

uani

d

Dia

zino

n

Dic

hlof

luan

id

Fenv

aler

at

Chl

ozol

inat

e

Folp

et

Dis

ulfo

ton

Ethi

ofen

carb

Dio

xaca

rb

0102030405060708090

100110

Wiederfindung [%]

Zeit (h)Trauben pH∼ 3,5

Wie Abb. 3.1.4-8 zeigt, ist die Matrix nicht ohne Einfluß. So wird zum Beispiel Dioxacarb unter sauren Bedingungen viel schneller abgebaut als unter neutralen Bedingungen (siehe hierzu Kap. 3.1.5.5.2.6). Um Abbauvorgänge vor der Extraktion möglichst zu vermeiden, ist es daher erforderlich die Proben bis zur Extraktion tiefgefroren aufzubewahren. Um die Möglichkeiten der Autosampler der SFE-Geräte nutzen zu können, müßten diese unbedingt kühlfähig sein. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden in [104] vorgestellt.



3.1 .5 Entwicklung von schnel len Best immungsmethoden für spez ie l le Pest iz idk lassen mi t analyt ischen Def iz i ten

3.1.5 .1 . E in le i tung

Mit Hilfe der in Kap. 3.1.4 vorgestellten Multimethode kann eine Vielzahl von Pestiziden bestimmt werden. Es gibt jedoch eine ganze Reihe von weiteren Ver-bindungen für die diese Methode nicht geeignet ist: Wegen zu geringer Wiederfindung: Als Ursachen für schlechte Wiederfindungen bei SFE-Extraktionen kommen ver-schiedene Faktoren in Betracht:

• schlechte Extrahierbarkeit der Wirkstoffe (z.B. wegen zu hoher Polarität (siehe Kap. 3.1.4.7.2) und/oder starker Wechselwirkungen mit der Matrix)

• schlechte Elution der präzipitierten Stoffe von der Festphasenfalle in die Vorlage (siehe Kap. 3.1.4.3 und Kap. 3.1.5.6.2)

• Abbauvorgänge (vgl. Kap. 3.1.4.7.4 und Kap. 3.1.5.5.2.7).

Wegen Problemen bei der Gaschromatographie: z.B. bei polaren Verbindungen wie Phenoxyalkancarbonsäuren (siehe Kap. 3.1.5.4.2), Carbendazim (siehe Kap. 3.1.5.3.2) und thermolabilen Verbindungen wie z.B. N-Methyl-Carbamate (siehe Kap. 3.1.5.5) und Organo-Zinn-Verbindungen (siehe Kap. 3.1.5.6). Für eine Reihe von Verbindungen, die sich nicht mit der vorgestellten Multimethode bestimmen lassen, wurden im Rahmen dieser Arbeit spezielle SFE-Methoden entwickelt. Viele der Stoffe, die bei der SFE-Extraktion Probleme bereiten, sind auch bei den klassischen (naßchemischen) Verfahren bei der Aufarbeitung als „problematisch“ aufgefallen. Zum Beispiel werden für die Stoffe Fenpropimorph, Imazalil und Thiabendazol auch bei der DFG-S19 Multimethode [3] sehr geringe Ausbeuten er-zielt. Um die Ursachen hierfür besser zu verstehen und eventuelle molekulare Zusammen-hänge zu erkennen, wurden zunächst einige naßchemische Voruntersuchungen durchgeführt. Dabei sollte ein „Gefühl“ für die Eigenschaften der Wirkstoffe bezüglich Löslichkeit, Polarität und Affinität zu Oberflächen entwickelt werden. Die Erkenntnisse aus diesen Versuchen sollten bei der Entwicklung von SFE-Extraktionsmethoden adaptiert werden, um die Wiederfindungen dieser Verbindungen zu verbessern.



3.1.5 .2 Naßchemische Untersuchungen im Vor fe ld

3.1.5.2.1 Rolle des pH-Wertes bei Extraktion und Flüssig-Flüssig-Vertei lung

Homogenate pflanzlicher Proben weisen oft recht niedrige pH-Werte auf: z.B. Zitronen pH∼2,5, Grapefruit und Orangen pH∼3,3, Trauben, Steinobst und Kernobst pH 3 bis 4. Bei den derzeit in der Rückstandsanalytik gängigen Multimethoden wird der pH-Wert bei der Extraktion und Flüssig-Flüssig-Verteilung nicht berücksichtigt. Unvollständige Extrahierbarkeit von sauren und basischen Verbindungen sind die Folge. Unter sauren Bedingungen liegen verschiedene Wirkstoffe mit basischen Stickstoff-atomen zu einem nicht vernachlässigbaren Anteil in protonierter Form vor. Diese protonierten Wirkstoffanteile entziehen sich, aufgrund ihres polaren Charakters, der Extraktion in die organische Phase. Zur vollständigeren Erfassung derartiger Wirkstoffe wie Thiabendazol, Carbendazim und Imazalil (Formeln siehe Tab. 3.1.5-1) muß demnach die Extraktion bei höheren pH-Werten erfolgen. Bei der Aufarbeitung von dotierten Zitrusfruchtproben nach [29] wurde z.B. fest-gestellt, daß Thiabendazol und Imazalil bei der Flüssig-Flüssig-Verteilung nach den ersten zwei Verteilungsschritten (unter sauren Bedingungen) nur zu 10 bis 20 % in die organische Phase übergingen. Erheblich bessere Wiederfindungsraten wurden nach einer zusätzliche Extraktion im Alkalischen erzielt. Ein ähnliches Prinzip gilt auch bei der Extraktion von sauer reagierenden Verbin-dungen. In diesem Fall sind saure Bedingungen für die Extraktion der Wirkstoffe günstiger. Dies ist z.B. bei der Extraktion der Phenoxyalkancarbonsäuren der Fall [29,19]. Die Einflüsse des pH-Wertes auf die Extrahierbarkeit einiger Wirkstoffe werden ausführlicher in [29] dargestellt. Eine andere Problematik liegt im Fall von Orthophenylphenol vor, das üblicherweise als Natrium-Salz zur Oberflächenbehandlung von Zitrusfrüchten eingesetzt wird [30]. Bei der Extraktion der Oberflächenbehandlungsmittel nach [4,31] werden die Schalen der Früchte ohne Wasserzusatz direkt mit überkritischem Kohlendioxid bzw. mit Dichlormethan extrahiert. Da die Schalenoberfläche der Zitrusfrüchte im Gegensatz zum Fruchtfleisch nicht sauer reagiert und kaum Wasser enthält, sind die Bedingungen für eine Auflösung des Salzes und für die Protonierung des Phenolates zur Phenolform nicht günstig. Es ist demnach, bei diesen Methoden, mit einer unvollständigen Extraktion des Orthophenylphenol zu rechnen.

3.1.5.2.2 Wechselwirkungen von Wirkstoffen mit Oberf lächen

Theoretische Betrachtung: Adsorptionen von Wirkstoffen an Oberflächen (z.B. über Ionen-Ionen-Wechsel-wirkungen oder über Wasserstoffbrücken-Bindungen) sind oft die Ursache für schlechte Extrahierbarkeit, für Verluste bei der Aufarbeitung und für Schwierigkeiten bei der Chromatographie. Daher sind Kenntnisse über die möglichen Ursachen und Mechanismen dieser Erscheinungen für die Entwicklung von SFE-Methoden sehr hilfreich.



Mögliche Oberflächen mit adsorptiven Eigenschaften sind z.B.: 1. bei der Probenaufarbeitung

Bestandteile der Probe (Wachse, Cutin, Öle, Zellulose, Pektin), Glasoberflächen (Glasgeräte, Glasfaserpapier), Cellulose (Papierfilter), Adsorbentien (Hydromatrix, Kieselgel)

2. bei der Gaschromatographie Glasoberflächen (GC-Injektions-Liner) Schmutzablagerungen auf der Oberfläche von GC-Injektions-Liner und -Vorsäule.

Die Adsorptionskraft bestimmter Oberflächen kann erheblich variieren. Bei Polysi-likaten wie Kieselgel spielt z.B. der Wassergehalt (Aktivitätsstufe) eine erhebliche Rolle, da Wasser die Oberfläche benetzen und maskieren kann. Eine entscheidende Abschwächung der Aktivität kann z.B. durch Sättigung freier Silanolgruppen an der Oberfläche durch Silanisierung erreicht werden (z.B. silanisierte Glasgeräte, GC-Glasliner, Füllmaterialien von LC-Säulen).. Die Rest-menge an freien Silanolgruppen bestimmt den Restaktivitätsgrad der Oberfläche Zu Adsorptionen neigen u.a.: 1. Verbindungen, die als Lewis Säuren oder Basen fungieren und dadurch direkt

oder über Wasserstoffbrücken-Bindungen (vgl. Abb. 3.1.5-1) mit der Oberfläche des Adsorbens in Wechselwirkung treten können (z.B. Verbindungen mit Alkohol- oder Säuregruppen und Verbindungen die basische Stickstoffatome aufweisen),

2. ionische Verbindungen (adsorbieren an Oberflächen die entgegengesetzte Ladungen aufweisen),

3. lipophile Verbindungen und Verbindungen mit lipophilen Resten (neigen zur Adsorption an lipophile Oberflächen).

Eine wichtige Rolle bei Adsorptionsprozessen spielen auch die beteiligten flüssigen Phasen (Lösungsmittel). Lösungsmittel treten sowohl mit den Analyten als auch mit aktiven Stellen der Oberfläche der festen Phase in Wechselwirkung und können damit die Affinität von Analyt zu Oberfläche schwächen. Zum Beispiel wird die Adsorption von Verbindungen an einem hydrophilen Adsorbens (wie Kieselgel) erheblich abgeschwächt, wenn die aktiven Stellen an seiner Oberfläche durch Lösungsmittelmoleküle wie Wasser oder Methanol „besetzt“ (desaktiviert) werden. Unpolare Lösungsmittel (z.B. Hexan) konkurrieren dagegen kaum um solche aktive Stellen und können in diesem Fall die Adsorptionsprozesse nur wenig beeinflussen. Die Adsorption unpolarer Analyten an lipophilen Oberflächen (z.B. Wachsober-flächen) ist dagegen günstiger, wenn die beteiligte flüssige Phase polar (z.B. wasserhaltig) ist. I.a. sind Wechselwirkungen elektrostatischer Art zwischen dem Analyt und der Oberfläche des Adsorbens um so schwächer ausgeprägt, je höher die Dielektrizitäts-konstante des Lösungsmittels ist. Abb. 3.1.5-1: Wechselwirkung von Verbindungen mit aktiven Oberflächen über Wasserstoffbrückenbindungen, am Beispiel eines Benzimidazolderivates (Vorschlag)



HOH

H

OO

H

HH O

N

NH

H

R

OH

H H

H

HO

N

N

HR

OH

HH O

RH

HN

N

Praktische Erfahrungen - Adsorptionserscheinungen bei der GPC: Im folgenden Kapitel werden derartige Adsorptionsvorgänge beschrieben, die zu Verlusten von Analyten führen. Ein praktisches Beispiel bei dem Wechselwirkungen von Verbindungen mit Oberflächen festgestellt wurden, ist die bei zahlreichen Methoden der Rückstandsanalytik zur Abtrennung höhermolekularer Begleitstoffe eingesetzte GPC. Bei diesem Verfahren werden Substanzen nach ihrer Größe (räumliche Ausdehnung) getrennt. Als Säulenmaterial wird meist ein in seiner Porosität definiertes Copolymerisat auf Basis von Styren und Divinylbenzol (zu 3 % quervernetzt) verwendet (Bio-Beads S-X3). Die Trennung bei der GPC basiert auf folgendem Prinzip: Die Porengrößen des Säulenmaterials sind so verteilt, daß höhermolekulare Stoffe z.B. Triglyceride und Wachse, aufgrund ihrer Ausdehnung in die Mehrzahl der Poren nicht eindringen können. Dadurch erfahren solche Moleküle nur eine kleine Retention durch die stationäre Phase. Dagegen können kleinere Moleküle, wie z.B. Pestizide, in die Poren eindringen und legen somit längere Wegsstrecken zurück. Bei GPC-Elutionsversuchen wurden für verschiedene Substanzen besonders niedrige Wiederfindungen festgestellt. Auffällig ist, daß diese Substanzen in ihrem Molekül sterisch nicht gehinderte basische Stickstoffatome aufweisen, die (bis auf Fenpropimorph) an aromatischen Heterosystemen beteiligt sind (siehe Tab. 3.1.5-1). Bei Fenpropimorph ist wegen der relativ starren Struktur des Morpholin-Sechsringes (Sesselkonformation) das basische N-Atom ebenfalls leicht zugänglich. Die molekularen Verhältnisse spielen hier eine große Rolle, da sie für die Ausprä-gung der Basizität entscheidend sind. Bei Pestiziden, wie etwa Diazinon, Pirimiphos-Methyl und Chlorpyrifos, deren Stickstoffatome durch benachbarte Gruppen sterisch abgeschirmt oder sonst in ihrer Nucleophilie geschwächt sind (siehe Abb. 3.1.5-2) wurden, erwartungsgemäß, geringere Verluste bei der GPC festgestellt.



Abb. 3.1.5-2: Beispiele für N-haltige Pestizide mit abgeschwächter Nucleophilie

N

N

O

P O

OCH3

H3CO

Diazinon Pirimiphos-methyl

N

N

NO

P O

OCH3

H3CO

NO

P O

OC2H5

H5C2O

Cl

ClCl

Chlorpyrifos Tab. 3.1.5-1: Einige Fungizide mit schlechter Wiederfindung bei der GPC Verluste festgestellt bei GPC-

Elutionsversuchen* Wirkstoff Gruppen-

zugehörigkeitWirkstoffe in

reinem Elutionsgemisch

bei Gegenwart von Probenextrakt (1 g Zitrone/ml)

Thiabendazol: N

N

H

N

S

Benzimidazol-derivat

bis zu 80 % bis zu 95 %

Carbendazim: N

N

H

NHC

O

OCH3

Benzimidazol-derivat

nicht durchgeführt bis zu 90 %

Imazalil:

NN CH2 CH

OCH2 CH CH2

ClCl

Imidazolderivat bis zu 50 % bis zu 90 %

Prochloraz: N

N CO

N CH2CH2O

Cl

Cl

ClCH3CH2CH2

Imidazolderivat nicht durchgeführt bis zu 60 %

Myclobutanil: N

NN CH2

CH2CH2CH3

CH2

CN

C Cl

Triazolderivat bis zu 50 % bis zu 60 %

Fenpropimorph:

N

O

CH3

CH3

Morpholin-derivat

bis zu 70% bis zu 80 %

* eingesetztes Probevolumen je 4 ml, Wirkstoffkonzentration: 1 µg/ml



Bei Thiabendazol, Imazalil und Fenpropimorph wurde ein über längere Zeit an-dauerndes „Schleichen“ festgestellt. Bei einem Elutionsversuch waren Spuren dieser Substanzen in der GPC-Fraktion 70-90 min noch nachweisbar (Durchflußrate von 5 ml/min, Collect-Fraktion für Pestizide 18-30 min), obwohl diese nach ihrer Größe in der Fraktion zwischen 18 und 30 min zu erwarten wären. Auffällig ist, daß es bei Gegenwart von Matrixbestandteilen in der zu eluierenden Probelösung zu einer Verschlechterung der Wiederfindungen bei der GPC kommt (siehe Tab. 3.1.5-1). Beobachtet wurde zudem, daß bei Gegenwart von Matrix, Anteile von Imazalil und Thiabendazol früher als erwartet im GPC-Eluat auftreten (vor 17 min). Hier könnten Wechselwirkungen zwischen den Wirkstoffen und Matrixbestandteilen eine Rolle spielen. Wechselwirkungen zwischen dem Säulenmaterial und Wirkstoffen (etwa über π-Elektronen-Systeme) spielen bei diesen Effekten sicherlich kaum eine Rolle. Einige denkbare, mit der GPC in Zusammenhang stehende, zu Verlusten führende Effekte werden im folgenden aufgeführt: • Wirkstoffanlagerung an Schwebstoffe, die sich entweder schon vor der GPC

absetzen oder sich am Anfangsbereich der GPC-Säule ablagern. • Anlagerung weiterer Wirkstoffe an diese Ablagerungen am vorderen Teil der GPC-

Säule. (Die kontinuierliche Abgabe aus diesem „Depot“ könnte für das Schleichen/Bluten dieser Wirkstoffe verantwortlich sein).

• Wirkstoffanlagerungen an gelöste höhermolekulare Matrixbestandteile, wodurch diese Moleküle eine kürzere Retention erfahren, als aufgrund ihrer räumlichen Ausdehnung zu erwarten wäre. Sie eluieren dadurch vor der „collect“ Fraktion in der die Pestizide eluieren.

Die hier beschriebenen Beobachtungen werden auch in [29] erläutert. Die oben aufgeführten theoretischen Überlegungen und die durchgeführten naß-chemischen Untersuchungen haben wertvolle Erkenntnisse zum Verhalten ver-schiedener Pestizide bezüglich Extrahierbarkeit und Adsorptionsverhalten gebracht. Diese waren für die Entwicklung von speziellen SFE-Methoden für saure und basische Pestizide von großem Nutzen.



3.1.5 .3 Pest iz ide mi t bas ischen E igenschaf ten

3.1.5.3.1 Einfluß des pH-Wertes auf die Extrahierbarkeit (vgl . Kap. 3.1.4.7.2)

Basische Pestizide können mit ihren freien Elektronenpaaren in Wechselwirkungen z.B. mit anderen Verbindungen oder verschiedenen Oberflächen treten. Aufgrund dieser Eigenschaft treten bei Extraktion und Chromatographie Probleme auf (siehe auch Kap. 3.1.5.2.2), so daß die Analytik dieser Verbindungen ein besonderes Vorgehen erfordert und z.T. sehr aufwendig ist. Häufig handelt es sich bei diesen Stoffen um Fungizide, die in ihrem Molekül basische Stickstoffatome z.B. als Teil eines aromatischen Systems aufweisen. Zu den verbreitetsten Vertretern basischer Fungizide zählen die Benzimidazolderivate Thiabendazol (pKb 9,3 und 11,5) [130] und Carbendazim (pKb 9,52), die Imidazolderivate Imazalil und Prochloraz (pKb 10,2) sowie das Morpholinderivat Fenpropimorph (pKb 9,4) (siehe Abb. 3.1.5-3). Wie in Kap. 3.1.4.7.2 gezeigt, kann die Extrahierbarkeit von basischen Verbindungen bei der SFE durch Erhöhung des pH-Wertes deutlich verbessert werden. Es wurde ein Versuch durchgeführt um festzustellen, wie sich der pH-Wert auf die Extrahierbarkeit der oben genannten Fungizide sowie von Diphenylamin auswirkt. Hierzu wurde eine unveränderte (pH-Wert 2,5) und eine auf pH 9 eingestellte (Zugabe von 50%iger K2CO3-Lösung) Zitronenmatrix mit einer Mischung dieser Verbindungen dotiert und nach Vermengung mit Hydromatrix extrahiert. Zur Extraktion wurde das Extraktionsgerät der Fa. ISCO gewählt, da hier die Extrakte direkt in eine Lösungsmittelvorlage geleitet werden. Bei Verwendung des Gerätes der Fa. HP, bei dem die Extrakte zunächst an einer mit ODS befüllten Falle aufgefangen werden, wurde beobachtet, daß einige basische Pestizide, insbesondere Thiabendazol aber auch Imazalil und Fenpropimorph nur sehr schleppend von der Falle in das Vorlagegläschen eluiert werden. Grund hierfür sind Wechselwirkungen dieser Pestizide mit aktiven Stellen an der Oberfläche des ODS-Adsorptionsmaterials (vgl. Kap. 3.1.5.2.2). Die dabei erzielten Wiederfindungen sind in Tab. 3.1.5-2 dargestellt.



Abb. 3.1.5-3: Strukturformeln einiger Pestizide mit basischen Eigenschaften

NN C

O

N CH2CH2O

Cl

Cl

ClCH3CH2CH2

Imazalil

NN CH2 CH

OCH2 CH CH2

ClCl

Thiabendazol Prochloraz

H

N

Diphenylamin

N

N

H

N

S

N

N

H

NHC

O

OCH3

Carbendazim

Wie aus der Tab. 3.1.5-2 ersichtlich spielt der pH-Wert bei der Extraktion von Thiabendazol, Imazalil und Carbendazim aus Zitrone eine wichtige Rolle. Bei Diphenylamin und Prochloraz dagegen wurden sowohl im Sauren als auch im Alkalischen gute Wiederfindungen erzielt. Auffällig ist, daß bei Imazalil der pH-Wert einen viel größeren Einfluß auf die Wiederfindungen hat als bei Prochloraz, obwohl es sich bei beiden Molekülen um Imidazolderivate handelt. Im Unterschied zu Imazalil steht jedoch das aromatische System bei Prochloraz in Konjugation mit der angrenzenden Carbonylgruppe, so daß die Elektronenverteilung im Molekül verschoben wird und die Basizität des Stickstoffs am Imidazolring geschwächt wird (siehe Abb. 3.1.5-4).



Tab. 3.1.5-2: Wiederfindungen verschiedener basischer Pestizide bei unterschiedlichen pH-Werten mittlere Wiederfindungen in % Bedingungen Thiabendazol Carbendazim* Imazalil Diphenylamin Prochloraz pH∼2,5

15 12 44 96 92

pH 9

62 94 91 98 95

pH 9, 2. Extr.

16 - - - -

* nach Derivatisierung mit Pentafluorbenzylbromid (siehe Kap. 3.1.5.3.2.3) Abb. 3.1.5-4: Konjugation des Imidazolsystems mit der Carbonylgruppe bei Prochloraz

Prochloraz

NN C

O

N R1

R2

H

NN C

O

N R1

R2

H

R2

HN

N CO

N R1

R2

HNN C

O

N R1

NN C

O

N R1

R2

Fazit: Durch diese einfache Maßnahme, der pH-Wert-Einstellung vor der SFE-Extraktion, wird die Bestimmung verschiedener basischer Pestizide ermöglicht. Mit Ausnahme von Carbendazim, das vor einer gaschromatographischen Bestimmung derivatisiert werden muß, lassen sich die untersuchten Verbindungen bei Berücksichtigung der Matrixeffekte (vgl. Kap. 3.1.2.3) gut mittels GC/MSD bestimmen. Obwohl Carbendazim eines der am häufigsten in der Landwirtschaft verwendeten Fungizide ist, wird es wegen der Aufwendigkeit bestehender analytischer Methoden bisher nicht routinemäßig untersucht. Stellvertretend für basische Pestizide wurde im Rahmen dieser Arbeit eine schnelle Methode zur Bestimmung von Carbendazim entwickelt.



3.1.5.3.2 Carbendazim, Benomyl und Thiophanat-Methyl

Bei der Entwicklung von analytischen Methoden zur Bestimmung von Carbendazim muß berücksichtigt werden, daß diese Verbindung der Hauptmetabolit und die fungizid wirksame Form von zwei weiteren landwirtschaftlich oft eingesetzten Verbindungen, Benomyl und Thiophanat-Methyl, ist (siehe Abb. 3.1.5-5). Üblicherweise erfolgt die Bestimmung der drei Fungizide, nach Umwandlung zu Carbendazim, gemeinsam. In der RHmV ist daher eine Summen-Höchstmenge berechnet als Carbendazim festgesetzt [34,46]. Abb. 3.1.5-5: Strukturformeln von Carbendazim, Thiophanat-Methyl und Benomyl (Carbendazim-Gruppe)

NH

NH

C

S

C

S

NH COOCH3

NH COOCH3

Thiophanat-Methyl

Carbendazim

N

N NH COOCH3

H

Benomyl

N

N NH

C

COOCH3

ONH C4H9

Während der Wachstumsperiode werden diese Fungizide häufig im Kernobstanbau, beim Anbau von Tafeltrauben, Steinobst, Salat und Getreide verwendet. Als Nacherntebehandlungsmittel finden sie bei Bananen, Zitrusfrüchten, Kernobst, Mangos und Kartoffel zum Schutz vor zahlreichen Pilzkrankheiten Verwendung [30,47]. Carbendazim, Benomyl und Thiophanat-Methyl werden nicht mit den gängigen Multimethoden erfaßt, da sie bei der Extraktion Schwierigkeiten bereiten und da eine Umwandlung zu Carbendazim sowie eine Derivatisierung vor der GC-Bestimmung durchgeführt werden muß. Vorhandene Einzelbestimmungsverfahren sind daher sehr arbeitsintensiv, verbrauchen große Mengen an Lösungsmittel und sind für die Routineanalytik wenig attraktiv [48,51-58]. Wegen des verbreiteten Einsatzes und der unzureichenden Rückstandsdaten ist es jedoch notwendig diese Stoffe im Rahmen der Lebensmittelüberwachung und des Lebensmittel-Monitoring routinemäßig zu untersuchen [48,49].



Jimènez et al [40] entwickelten eine SFE-Methode zur Bestimmung von Carbendazim in gefriergetrocknetem Salat, bei der Methanol als Modifier des Kohlendioxids verwendet wurde. Die Gefriertrocknung von Probenmaterial ist jedoch sehr zeitaufwendig und nicht für alle Obst- und Gemüsesorten geeignet (siehe Kap. 3.1.3.2.1). Aharonson et al. [9] beschreiben eine Methode zur Bestimmung der Benzimidazol-Fungizide einschließlich Carbendazim und Thiophanat-Methyl unter Verwendung von SFE und HPLC-UV. Sie erzielten gute Wiederfindungen für Bananen, Kartoffel und Äpfel. Allerdings sind die Nachweis- und Bestimmungs-grenzen dieses Verfahrens nicht ausreichend zur Überprüfung kleiner Höchst-mengen. Desweiteren wird nach unserer Erfahrung Carbendazim aus sauren Lebensmitteln nicht vollständig extrahiert (siehe Kap. 3.1.4.7.2).

3.1.5.3.2.1 Umwandlung von Benomyl zu Carbendazim Benomyl ist eine labile Verbindung. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die Kinetik der Zersetzung von Benomyl in organischen Lösungsmitteln [64-66] und in wäßrigen Lösungen [66-69]. Ältere Arbeiten berichten, daß Benomyl in wäßrigen Lösungen [28,45] und auf Pflanzen [71] schnell und vollständig zu Carbendazim umgewandelt wird. Baude et al [74] zeigten jedoch bei Feldversuchen, daß Benomyl sowohl in wäßriger Suspension als auch als Rückstand auf der Pflanze eine gute Stabilität besitzt. Wegen seiner geringen Wasserlöslichkeit (3,8 ppm bei 20°C [69]) liegt Benomyl in wäßrigen Präparaten als Suspension vor (übliche Konzentration 250 ppm) und wird dort nur langsam abgebaut [65]. Da Benomyl-Standardsubstanzen stets einen kleinen Anteil an Carbendazim ent-halten und Benomyl sich in organischen Lösungsmitteln rasch zu Carbendazim umwandelt, ist es nicht möglich carbendazimfreie Benomyl-Lösungen herzustellen [68]. Für Dotierungsversuche wurde eine Benomyl-Lösung in kaltem Acetonitril hergestellt (500µg/ml). Diese Lösung wurde unmittelbar nach ihrer Herstellung mit HPLC/DAD untersucht und dabei ein Carbendazimgehalt von etwa 40 µg/ml ermittelt, was etwa 60 µg/ml Benomyl entspricht. Bei einer Lagerung dieser Lösung bei -18°C stieg der Anteil an Carbendazim über längere Zeit nicht merklich an. Bei Raumtemperatur setzte sich jedoch das Benomyl rasch zu Carbendazim um. Nach einer anfänglich hohen Umsetzungsrate (t0,5 = etwa 40 min), erreichte die Reaktion schnell einen Gleichgewichtszustand, bei dem etwa 20 % des ursprünglichen Benomyl noch intakt vorlag. Diese Beobachtungen stimmen sehr gut mit kinetischen Studien über das Verhalten von Benomyl in Acetonitril überein, die von Singh et al. [66] durchgeführt wurden. Auch sie beobachteten das Auftreten eines Gleichgewichtszustandes. In neutralen wäßrigen Lösungen ist die Umwandlungsrate von Benomyl zu Carbendazim geringer als in organischen Lösungsmitteln, sie steigt jedoch im Sauren und im Alkalischen an [67,68,75]. Im Alkalischen tritt neben der Bildung von Carbendazim eine weitere dazu konkurrierende Reaktion auf, die mit steigendem pH-Wert zunehmend an Bedeutung gewinnt (siehe Abb. 3.1.5-6). Zunächst bildet sich aus Benomyl unter Ringschluß STB (3-Butyl-2,4-Dioxo[1,2-a]-s-Triazino-benzimidazol), das bei höheren pH-Werten weiter zu BBU (1-(2-Benzimidazoyl)-3-n-Butylharnstoff) abgebaut wird [76]. Abb. 3.1.5-6: Abbaupfade von Benomyl [69,74,77]



BBU

N

N NH

H CONH

C4H9

STB

H+

OH-

2-Aminobenzimidazole

OH-OH-

N

N

CO N

C4H9

NH

O

N

N NH2

H

Benomyl

N

N

CO NH

C4H9

NH OCH3

O

C

Carbendazim

N

N NH OCH3

O

C

H

Diese Konkurrenzreaktion zur Bildung von Carbendazim unter alkalischen Be-dingungen bringt analytische Schwierigkeiten mit sich. Vor einer Extraktion unter alkalischen Bedingungen muß Benomyl zu Carbendazim umgewandelt werden, da sonst unerwünschtes STB und BBU entsteht. Eine quantitative Umwandlung von Benomyl zu Carbendazim kann nach Literatur-angaben durch Erhitzen angesäuerter Proben erreicht werden [51,54]. Allerdings berichten Calmon et al. [67], daß die Umwandlung bei pH-Werten unterhalb 2,5 wegen der Protonierung des Benomyl gehemmt ist. Die Umwandlung von Benomyl zu Carbendazim wurde deshalb bei pH∼3 durch Erhitzen der Probe durchgeführt. Bei Wiederfindungsversuchen wurde gezeigt, daß unter diesen Bedingungen eine sehr hohe Umwandlungsrate von Benomyl zu Carbendazim (über 90 %) erreicht wird (Bem.: der pH-Wert wurde vor der Extraktion auf 8 eingestellt). Zudem wurde gezeigt, daß weder Thiophanat-Methyl noch Carbendazim unter diesen Bedingungen beeinträchtigt werden. Die Wiederfindung an Benomyl war wesentlich schlechter (73 % als Carbendazim), wenn die dotierten Proben ohne saure Vorbehandlung direkt alkalisiert (pH=8) und extrahiert wurden (siehe Tab. 3.1.5-3). Dies ist vermutlich auf die kompetitive Bildung von STB zurückzuführen. Die Wiederfindungsraten waren noch niedriger, wenn die bereits in die Extraktionshülsen gefüllten Proben vor der Extraktion bei Raumtemperatur gelagert wurden (siehe Tab. 3.1.5-3, Bem.: etwa 12 % des Benomyls lag bereits vor der Dotierung als Carbendazim in der Standardlösung vor).



Tab. 3.1.5-3: Wiederfindung von Benomyl als Carbendazim

(dotierte Menge 3,3 mg/kg), Extraktion bei pH 8 Lagerzeit in der

Extraktionshülse vor der Extraktion bei RT

Wiederfindungsrate als Carbendazim

%

Bemerkungen

0 h 73 keine Vorbehandlung 2 h 41 im Sauren 8 h 28 0 h 94 mit Vorbehandlung 2 h 90 im Sauren 8 h 92 (20 min, 65° C, pH 3)

Der Umwandlungsfaktor 1,52 wurde für die Berechnung verwendet Anmerkung zur Analytik von Benomyl: Die Umwandlung von Benomyl zu STB und BBU im Alkalischen eröffnet die Mög-lichkeit zur indirekten Bestimmung von Benomyl-Rückständen in Proben. Dies wurde jedoch nicht weiter verfolgt, da in der RHmV eine Summenhöchstmenge für Benomyl Carbendazim und Thiophanat-Methyl angegeben ist. Die gesonderte Bestimmung von Benomyl-Rückständen in Proben ist daher für die Überwachung nicht interessant.

3.1.5.3.2.2 Thiophanat-Methyl Thiophanat-Methyl ist beständiger als Benomyl und kann oft über längere Zeit in behandelten Erntegütern nachgewiesen werden [51,78]. Wie Abb. 3.1.5-7 zeigt ist die Umwandlung von Thiophanat-Methyl zu Carbendazim während der SFE-Extraktion, selbst bei alkalischen Bedingungen, vernachlässigbar. Folglich kann Thiophanat-Methyl nach einer SFE-Extraktion als solches bestimmt werden (HPLC/DAD). Allerdings wurde eine nicht unwesentliche Umwandlung von Thiophanat-Methyl zu Carbendazim beobachtet, wenn die Extraktion nicht direkt durchgeführt wurde, sondern die Extraktionshülsen einige Stunden bei Raumtemperatur (z.B. im Autosampler des Extraktions-Gerätes) lagerten. Diese Umwandlung wird mit steigendem pH-Wert begünstigt. Allerdings treten auch hier Konkurrenzreaktionen auf, so daß die Wiederfindungsrate als Carbendazim relativ niedrig lag (bei max. 60% nach 24 h, pH 8,5) (Abb. 3.1.5-8). Bei -18°C wurde dagegen selbst nach längerer Lagerung kein wesentlicher Abbau von Thiophanat-Methyl beobachtet. (siehe Abb. 3.1.5-7).



Abb. 3.1.5-7: Unerwünschter Abbau von Thiophanat-Methyl in der Extraktionshülse während der Lagerung bei Raumtemperatur

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5 6 7 10 72*Lagerzeit der Extraktionshülsen in Stunden bei pH 8,5

µg/E

xtra

ktio

nshü

lse

Carbendazim Thiophanat-Methyl Summe ber. als Carbendazim

* diese Probe wurde bei -18° C gelagert

100 % Wiederfindung ber. als Carbendazim

Abb. 3.1.5-8: Unerwünschter Abbau von Thiophanat-Methyl in der Extraktionshülse während der Lagerung bei Raumtemperatur

.

0 1 2 3 4 5 6 7 10 24

pH 9,5pH 8,5

pH 70

20

40

60

80

100

Stunden

Wiederfindung als Carbendazim in %



Umwandlung von Thiophanat-Methyl zu Carbendazim nach der Extraktion: Eine nahezu vollständige Umwandlung von Thiophanat-Methyl zu Carbendazim wurde durch Zugabe von Kaliumcarbonat-Lösung als Katalysator in den GC-Vials, die den SFE-Extrakt in Acetonitril enthalten, durchgeführt. Um diese Umwandlung zu optimieren wurde eine einfache kinetische Studie gemacht. Der Fortgang der Umwandlung wurde mit Hilfe eines RP-HPLC/DAD verfolgt und ist in Abb. 3.1.5-9 dargestellt. Abb. 3.1.5-9: Kinetik der Umwandlung von Thiophanat-Methyl zu Carbendazim in Acetonitril/K2CO3

Der erste Schritt dieser basisch katalysierten Reaktion läßt sich anhand der raschen Abnahme der Peakfläche des Thiophanat-Methyl verfolgen. Diese Abnahme scheint den Gesetzen einer Reaktion 1. Ordnung zu folgen (Linearität der Beziehung zwischen dem Logarithmus der Peakfläche von Thiophanat-Methyl gegen die Reaktionszeit, siehe Abb. 3.1.5-10). Wie in Abb. 3.1.5-9 und Abb. 3.1.5-11 zu sehen ist, entstehen einhergehend mit der Abnahme des Thiophanat-Methyl Zwischen-produkte, die hier nicht näher untersucht wurden. Die Halbwertszeiten (HWZ) der Abnahme von Thiophanat-Methyl bei verschiedenen Temperaturen wurden aus den Steigungen der Geraden in Abb. 3.1.5-10 berechnet (HWZ=ln 2/Steigung). Die Bildung von Carbendazim kann durch die Erhöhung der Temperatur beschleunigt werden. Allerdings sollte die Temperatur unterhalb 70°C liegen um zu vermeiden, daß Carbendazim zu 2-Aminobenzimidazol abgebaut wird (siehe Abb. 3.1.5-7 und Abb. 3.1.5-2).



Abb. 3.1.5-10: Kurven des Logarithmus der relativen Peakflächen von Thiophanat- Methyl gegen die Zeit

0

1

2

3

4

5

6

0 10 20 30 4Zeit [min]

ln (s

igna

lx10

0/In

t.Std

0

) t0.5=21 min

t0.5=3.4 min

t0.5=1.8 min

t0.5=1.1 min

20°C

60°C

50°C

40°C

Abb. 3.1.5-11: Fortgang der Umwandlung von Thiophanat-Methyl zu Carbendazim in Acetonitril/K2CO3 bei Raumtemperatur (HPLC/DAD, 285 nm)

2 4 6 8

mAu

0

20

40

60

80

100

Thio

phan

at-M

ethy

l

2 4 6 8

mAu

0

20

40

60

80

100

Zwis

chen

prod

ukte

Car

bend

azim

Thio

phan

at-M

ethy

l

2 4 6 8

mAu

0

20

40

60

80

Zwis

chen

prod

ukte

Car

bend

azim

2 4 6 8

mAu

0

20

40

60

80

100C

arbe

ndaz

im

Zwis

chen

prod

ukte

0 min 60 min 160 min 300 min



Abb. 3.1.5-12: Bildung von Carbendazim bei der Umwandlung von Thiophanat-

Methyl in Acetonitril/K2CO3 bei verschiedenen Temperaturen

Die Bildung der Zwischenprodukte erfolgt rasch. Wesentlich langsamer und daher geschwindigkeitsbestimmend erfolgt die nachfolgende Bildung des Carbendazim. (Abb. 3.1.5-9 und Abb. 3.1.5-11). Dies hat Auswirkungen auf die Analytik. Die HPLC-Bestimmung kann erst dann durchgeführt werden, wenn sich die Zwischenprodukte quantitativ in Carbendazim umgewandelt haben und nicht sobald kein Thiophanat-Methyl mehr vorhanden ist, da sonst zu niedrige Werte ermittelt werden. Analog dazu sollte eine nachfolgende Derivatisierung des Carbendazim erst nach vollständig erfolgter Umwandlung durchgeführt werden, da andernfalls das Derivatisierungsmittel mit Thiophanat-Methyl selbst oder den Zwischenprodukten reagiert, wodurch andere Produkte als das gewünschte Carbenazim-Derivat entstehen können. Bestimmung von Thiophanat-Methyl als solches: Es wurde gezeigt, daß sich Thiophanat-Methyl bei pH-Werten zwischen 4 und 9,5 gut extrahieren läßt. Wegen der Instabilität des Thiophanat-Methyl im Alkalischen sind jedoch niedrigere pH-Werte günstiger. Wird die Extraktion jedoch bei höheren pH-Werten durchgeführt, ist darauf zu achten, daß unter alkalischen Bedingungen in den Extraktionshülsen ein Abbau erfolgen kann. Sowohl die Extraktion als auch die Bestimmung müssen ohne Verzögerung möglichst rasch durchgeführt werden, da Thiophanat-Methyl selbst in den in Acetonitril gelösten Extrakten innerhalb einiger Stunden teilweise zu Carbendazim umgewandelt wird.



3.1.5.3.2.3 Derivatisierung von Carbendazim mit PFB-Br im GC-Vial Die direkte Bestimmung von Carbendazim mittels HPLC-DAD ist relativ un-empfindlich. Eine gaschromatographische Bestimmung ist nur nach Derivatisierung möglich. Da für Carbendazim und Thiophanat-Methyl eine gemeinsame Höchstmenge, berechnet als Carbendazim, gilt und Carbendazim sehr empfindlich als PFB-Derivat mit GC-MSD bestimmt werden kann, ist es sinnvoll beide Stoffe zusammen als Carbendazim zu bestimmen (Benomyl wird schon vor der Extraktion zu Carbendazim umgewandelt). Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher eine Methode entwickelt bei der die Umwandlung von Thiophanat-Methyl und die anschließende Derivatisierung des Carbendazim direkt in dem GC-Gläschen durchgeführt wird, in dem der SFE-Extrakt anfällt. Beide Reaktionen werden durch K2CO3-Lösung katalysiert. Sie ist einfach durchzuführen und erfordert nur wenige Arbeitsschritte (siehe Anlage 2, Code 101E3102).

3.1.5.3.2.4 Bestimmung mittels GC-MSD Die derivatisierten Extrakte können ohne weitere Reinigung direkt zur Messung eingesetzt werden. Tab. 3.1.5-4 zeigt die Strukturformel des Derivates, seine Retentionszeit sowie die zur Quantifizierung und Identifizierung verwendeten SIM-Massen auf. Tab. 3.1.5-4: GC-MS-Daten des Carbendazim-bis-PFB-Derivates Strukturformel Retentionszeit

(min) Quantifizierungs-

Masse (m/z)

Bestätigungs-Massen

(m/z) N

NN

C

O

OCH3

CH2C6F5

CH2C6F5

24,10

551

492, 292

GC-Bedingungen: siehe Anlage 2 (Code 101E3102)

Zur Kompensation von Matrix-Effekten bei kleinen Carbendazim-Konzentrationen ist es günstig Kalibrierungen nach dem Standard-Additionsverfahren durchzuführen. Abb. 3.1.5-13 zeigt die Matrix-Effekte des Carbendazim-bis-PFB-Derivates am Beispiel eines Orangensaft-Extraktes.



Abb. 3.1.5-13: Matrixeffekte, die bei niedrigen Konzentrationen an Carbendazim- Derivat auftraten, Eichlösungen auf Orangensaft-Extrakt

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100 120 140 160

ng C arbendaz im/ ml

Fläc

he vs

. Inte

rnen

Sta

ndar

d

"Lösungsmittel-Eichung"

"Matrix Eichung"

3.1.5.3.2.5 Validierung Wiederfindungen: Zur Ermittlung der Wiederfindungsraten wurden zerkleinerte Grapefruit-, Trauben- und Eisbergsalat-Proben mit Thiophanat-Methyl oder Carbendazim dotiert. Die verwendete Analysenvorschrift befindet im Anlage 2. Tab. 3.1.5-5 zeigt die ermittelten Wiederfindungen. Tab. 3.1.5-5: Wiederfindung von dotiertem Carbendazim (0,33 mg/kg) und Thiophanat-Methyl (0,66 mg/kg) aus verschiedenen Lebensmitteln Lebensmittel Carbendazim

Thiophanat-Methyl

Mittlere Wiederfindung in % Grapefruit

91 85

Trauben

92 79

Eisbergsalat

93 -

Analysenmethode: siehe Anlage 2



Nachweis- und Bestimmungsgrenzen: Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen für Carbendazim wurden nach dem DFG-Eichgeradenverfahren ermittelt (siehe Tab. 3.1.5-6) [80]. Hierzu wurden Wieder-findungsversuche bei vier verschiedenen Konzentrationen jeweils 4 mal durchgeführt (16 Aufarbeitungen). Die Dotierungen erfolgten auf Apfelmatrix, wobei die niedrigste dotierte Konzentration im Bereich der erwarteten Nachweisgrenze lag [81]. Tab. 3.1.5-6: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen nach dem DFG-Eichgeraden-

verfahren [80-82] Parameter Carbendazim

(als Bis-PFB-Derivat) dotierte Menge (µg/kg) 4,8/9,5/19/28,6 berechnete Nachweisgrenze 3 µg/kg berechnete Bestimmungsgrenze* 5 µg/kg Korrelation der Geraden (r) 0,998 Korrelationskoeffizient (%RSD) 3,6 Analysenmethode: siehe Anlage 2 * kleinste Höchstmenge für Obst und Gemüse 100 µg/kg, für Säuglingsnahrung 10 µg/kg [34] Laborvergleichsuntersuchung Eine zerkleinerte, mit einer unbekannten Menge an Carbendazim dotierte Apfelprobe wurde mit der in Anlage 2 vorgestellten SFE-Methode untersucht. Diese Probe wurde von der Europäischen Kommission im März 1997 im Rahmen einer Laborvergleichsuntersuchung (Proficiency Test) zur Verfügung gestellt [83]. Tab. 3.1.5-7 zeigt die Ergebnisse, die mit der SFE-Methode erzielt wurden, im Vergleich zu denen der 58 teilnehmenden Laboratorien. Tab. 3.1.5-7: European Commission’s Proficiency Test II (März 1997) Teilnehmerzahl 58 Mittelwert 0,507 mg/kg Median 0,513 mg/kg dotierte Menge 0,653 mg/kg Ergebnis der SFE-Methode 0,66 mg/kg Wiederfindung1) 100% (0,5 mg/kg) 1)pestizidfreie Apfelmatrix, die von den Organisatoren zur Verfügung gestellt wurde, wurde mit 0,5 mg/kg Carbendazim dotiert Analysenmethode: siehe Anlage 2 Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden in [101, 102] veröffentlicht. Untersuchungsergebnisse von zahlreichen Proben aus dem Handel werden in Kap. 3.1.6.2 vorgestellt.

3.1.5.3.2.6 Extraktion von „gewachsenen“ Carbendazim-Rückständen aus Keltertrauben



Im Rahmen eines Feldversuches im Überwachungsgebiet der CVUA Stuttgart wurde die Wirksamkeit der botriticiden Präparate „Skala“ und „Botrylon“ im Weinbau untersucht. Zur Überprüfung der Rückstandssituation der enthaltenen Wirkstoffe Carbendazim, Pyrimethanil und Diethofencarb zum Zeitpunkt der Lese wurden von Weinkontrolleuren entsprechende Proben entnommen. Die Trauben wurden nach der Zerkleinerung zu je 3 g in 50 ml Bechergläser eingewogen und zum Teil mit NaHCO3-Lösung zur Einstellung des pH-Wertes auf etwa 6,5 („neutral“) bzw. 8,5 („alkalisch“) versetzt. Die restlichen Proben wiesen einen pH-Wert von etwa 3 auf („sauer“). Alle Proben wurden anschließend mit 2 g Hydromatrix verrührt und zur SFE-Extraktion eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tab. 3.1.5-8 dargestellt. Tab. 3.1.5-8: Einfluß des pH-Wertes auf die Extrahierbarkeit von Carbendazim aus Trauben mittels SFE Carbendazimgehalt (in ppm) bestimmt nach Derivatisierung

mit PFBB/K2CO3 SFE-Methode DFG-Methode „alkalisch“

pH∼8,5 „neutral“ pH∼6,5

„sauer“ pH∼3

Probe 1 0,18 (n=5) 0,035 (n=4) Probe 2 0,10 (n=6) 0,053 0,018 (n=3) Probe 3 0,16 (n=6) 0,039 (n=4) Probe 4 0,17 (n=6) 0,042 (n=3) Probe 5 0,37 (n=4) 0,38 (n=2) Probe 6 0,16 (n=5) 0,045 0,019 (n=2) Analysenmethode: siehe Anlage 2

Wie zu erwarten war, spielt der pH-Wert auch bei der SFE-Extraktion von ge-wachsenen Carbendazim-Rückständen eine große Rolle. Unter alkalischen Be-dingungen wurden für Carbendazim Werte ermittelt, die mit denen der DFG-Methode vergleichbar sind. Unter sauren Bedingungen konnte dagegen nur ein Bruchteil des Carbendazim erfaßt werden. Die Ergebnisse der Untersuchung auf Pyrimethanil und Diethofencarb sind in Kap. 3.1.6.1 dargestellt.

3.1.5.3.2.7: SFE- und DFG-Methode zur Bestimmung der Carbendazim-Gruppe im Kostenvergleich

In Tab. 3.1.5-9 werden die einzelnen Arbeitsschritte, die bei der SFE-Methode (siehe Anlage 2) und der DFG-Methode 261, 378 zur Bestimmung von Carbendazim, Benomyl und Thiophanat-Methyl anfallen, gegenübergestellt. Darüber hinaus werden die Kosten für die beiden Verfahren geschätzt. Es wird ersichtlich, daß die SFE-Methode im Vergleich zu der herkömmlichen Methode deutlich effizienter ist. Die Vorteile liegen vor allem in der Einsparung von Lösungsmittel- und Personalkosten. Tab. 3.1.5-9: Gegenüberstellung der DFG-261, 378 und der SFE-Methode zur Bestimmung der Stoffe der Carbendazim-Gruppe



SFE-Methode DFG 261, 378 Arbeitsschritte

• einwiegen • alkalisieren • Zugabe von Adsorbens • einfüllen in die Extraktionshülse • Extraktion • Derivatisierung • Chromatographie

• einwiegen • mit Methanol homogenisieren • ausschütteln • abnutschen, nachwaschen,

auffüllen • Aliquotierung • mit DMF am Rotationsverdampfer

konzentrieren • mit DMF und Ammoniak versetzen • auf dem Wasserbad erwärmen • am Rotationsverdampfer

konzentrieren • mit Phosphatpuffer und Salzlösung

versetzen • 3 x mit Dichlormethan ausschütteln • mit Natriumsulfat trocknen • am Rotationsverdampfer

konzentrieren • aufnehmen • Al2O3-Säulen herstellen • säulenchromatographische

Reinigung • Lösungsmittel entfernen • Derivatisierung • Chromatographie

Arbeitszeit pro Serie in Stunden 6 Arbeitsstunden für 12 Proben 20 Arbeitsstunden für 6 Proben

Chemikalienverbrauch • 40 g hochreines Kohlendioxid • techn. Kohlendioxid zur Kühlung der

Falle • 10 g Hydromatrix • 8 ml Acetonitril • 5 ml Hexan

• 250 ml Methanol • 240 ml Dichlormethan • 150 ml Hexan/Essigester • 10 ml DMF • Natriumsulfat • Natriumchlorid

Kosten für die Aufarbeitung pro Probe in DM

Personalkosten: ca. 15 DM Personalkosten: ca. 100 DM Chemikalien / Verbrauchsmaterial

ca. 10 DM Chemikalien / Verbrauchsmaterial:

ca. 55 DM

Summe

ca. 65 DM ca. 155 DM



3.1.5 .4 Saure Pest iz ide

3.1.5.4.1 Einführung

Ähnlich wie im Fall basischer Verbindungen ist bei sauren Pestiziden zur Verbes-serung der Extrahierbarkeit eine pH-Wert-Einstellung notwendig. Eine Ansäuerung der Matrix ist hier erforderlich um das Säure-Base-Gleichgewicht in Richtung der leicht extrahierbaren protonierten Form zu verschieben. Die meisten Pestizide mit Carbonsäure-Funktion sind herbizid und/oder wachstumsregulatorisch wirksam. Zu den wichtigsten Vertretern gehören die Phenoxyalkancarbonsäuren, die als Selektivherbizide im Getreideanbau verwendet werden. Beispiele hierfür sind 2,4-D und Mecoprop, die weltweit zu den mengenmäßig am häufigsten verwendeten Pestiziden gehören. Pestizide mit Säuregruppen sind in der Regel gut wasserlöslich und daher systemisch wirksam, d.h. sie dringen z.B. über die Wurzeln in die Pflanzen ein und verteilen sich über die Assimilatenbahnen über die ganze Pflanze. Hier können sie über die Säuregruppe Bindungen mit verschiedenen Pflanzeninhalts-stoffen, wie Kohlenhydraten und Proteinen eingehen (Ausbildung gebundener Rückstände). Analytisch bereiten Pestizide mit Säuregruppen einige Schwierigkeiten, da sie besondere Extraktionsbedingungen erfordern und nicht ohne Derivatisierung gaschromatographisch bestimmt werden können. Sie werden daher nicht mit den gängigen Multimethoden erfaßt und somit routinemäßig kaum untersucht. Die Entwicklung einer einfachen Methode zur Bestimmung solcher Pestizide ist daher erforderlich. Stellvertretend für Phenoxyalkancarbonsäuren wurde 2,4-D für die Entwicklung einer Bestimmungsmethode ausgewählt. 2,4-D wird nicht nur als Herbizid im Getreideanbau eingesetzt, sondern auch in geringen Konzentrationen als Wachstumsregulator beim Anbau von Obst und Gemüse. In Getreide werden üblicherweise nur geringe Gehalte an Phenoxyalkancarbonsäuren gefunden, da die Behandlung bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt des Anbaus erfolgt. Bei Zitrusfrüchten wird 2,4-D zudem häufig auch zur Nacherntebehandlung eingesetzt, weshalb hier am ehesten mit Rückständen zu rechnen ist.

3.1.5.4.2 2,4-D-Rückstände in Zitrusfrüchten

Seit den späten 40 iger Jahren wird 2,4-D im Zitrusanbau als Wachstumsregulator eingesetzt [9]. In den USA werden beispielsweise Zitrusbäume vor der Ernte mit schwach konzentrierten 2,4-D-Isopropylester-Lösungen behandelt [4,9]. 2,4-D bewirkt eine Verlangsamung der Reifungsprozesse in den Früchten, wodurch der Fruchtabfall verzögert wird. Dadurch kann die Erntezeit erheblich verlängert werden. Die Belastung der Früchte mit 2,4-D durch diese Behandlung ist relativ gering [9]. In Ländern wie Argentinien, Uruguay und Südafrika werden Zitrusfrüchte vor der Einschiffung zum Export nach Europa mit wäßrigen Wachsemulsionen behandelt, die etwa 500 ppm 2,4-D enthalten. Der Wirkstoff wird hier meist als Salz (z.B. Natrium- oder Dimethylammonium-Salz) oder als Ester (z.B. Isopropylester) eingesetzt [5,9,125,132]. In USA und Spanien wird 2,4-D nur bei Früchten verwendet, die zur Lagerung bestimmt sind [125,131]. Hier wird das 2,4-D-haltige Wachs vor dem Verkauf abgewaschen und durch ein 2,4-D-freies Glanzwachs ersetzt.



Mit 2,4-D behandelte Zitrusfrüchte sind beständiger gegen Pilzbefall. Dies ist darauf zurückzuführen, daß biologische Prozesse, die für die natürliche Alterung der Früchte verantwortlich sind, mit Hilfe von 2,4-D verzögert werden. Dadurch bleiben die Resistenzmechanismen der Früchte gegenüber Pilzen länger intakt [9,47,50]. Die zur Oberflächenbehandlung von Zitrusfrüchten eingesetzten 2,4-D-Ester hydrolysieren in der Regel kurze Zeit nach ihrer Anwendung zu der Säureform [5,9]. Der als Säure vorliegende Wirkstoff kann sich nun an verschiedene Moleküle mit reaktionsfähigen Gruppen (z.B. Hydroxyl- oder Epoxid-Gruppen [vgl. 33]) anbinden. In Betracht kommen hier in erster Linie Wachse, die zur Oberflächenbehandlung der Früchte eingesetzt werden, fruchteigene Wachse und Cutin-Makromoleküle, Wachsalkohole und Polysaccharide. Reaktionen mit stickstoffhaltigen Substanzen (z.B. Aminosäuren) unter Ausbildung von Amidbindungen spielen auf der Schalen-oberfläche eine untergeordnete Rolle. Über Esterbindungen gebundene Rückstände können mittels einer alkalischen Hydrolyse, wie sie auch bei anderen Methoden zur Bestimmung von Phenoxyalkan-carbonsäuren in Getreide eingesetzt wird [2,6], freigesetzt werden.

3.1.5.4.3 Extraktion von freiem 2,4-D

Einfluß des pH-Wertes: Zur Extraktion von 2,4-D mit überkritischem Kohlendioxid wird das Probenmaterial angesäuert, wodurch das Säure-Base-Gleichgewicht (pKs=2,73) in Richtung der gut extrahierbaren protonierten Form verschoben wird (siehe auch Kap. 3.1.4.7.2). Der Einfluß des pH-Wertes auf die Extrahierbarkeit von 2,4-D wird in Tab. 3.1.5-10 dargestellt. Es wird ersichtlich, daß unter alkalischen Bedingungen, nur geringe Anteile des 2,4-D extrahiert werden. Tab. 3.1.5-10: Wiederfindungen von 2,4-D in Abhängigkeit

vom pH-Wert, Grapefruit-Matrix 0,5 ppm „sauer“ pH 1-2 „alkalisch“ pH∼9,5

Wiederfindung in %

100 (n=2) 6 (n=4)

Analysenmethode: siehe Anlage 3 Einfluß des Wassergehaltes: Zur Überprüfung des Einflusses von vorhandenem Wasser wurden Wiederfindungs-versuche mit unterschiedlichem Probe/Hydromatrix-Verhältnis durchgeführt. Dabei wurden bei Orangensaft für Probe/Hydromatrix-Verhältnisse von 0,75:1 bis 1,65:1 nahezu identisch Wiederfindungsraten für 2,4-D festgestellt. Noch größere Anteile an Probe (höherer Wasseranteil) führten jedoch zu einer Verschlechterung der Wiederfindung.

3.1.5.4.4 Freisetzung von gebundenen 2,4-D-Rückständen



Nach der Ernte wird 2,4-D häufig als Isopropyl-Ester oder Dimethylamin-Salz ein-gesetzt. 2,4-D-Ester hydrolysieren nach der Anwendung rasch zur freien Säure [30,59,60]. Die Säure kann dann teilweise an Wachsüberzüge und natürliche Schalenbestandteile unter Esterbildung binden. Derartig „gebundene“ 2,4-D-Rückstände werden bei einer Extraktion mit Lösungsmitteln nicht mit erfaßt. Es wurde festgestellt daß sich der Anteil an extrahierbarem 2,4-D deutlich erhöht, wenn Proben mit gewachsenen 2,4-D-Rückständen unter alkalischen Bedingungen erhitzt werden (Tab. 3.1.5-11, Abb. 3.1.5-14). Eventuell gebundene 2,4-Dichlor-phenol-Anteile (Abbauprodukt von 2,4-D) dürften bei dem alkalischen Aufschluß [29] ebenfalls freigesetzt werden. Eine Erhöhung des extrahierbaren 2,4-D wurde ebenfalls festgestellt, wenn die Proben im Sauren erhitzt wurden, allerdings wurde in diesem Fall deutlich weniger 2,4-D freigesetzt als bei alkalischer Hydrolyse. Zur Optimierung dieses alkalischen Aufschlusses wurde der pH-Wert und die Erhitzungszeit variiert, um die Bildung unerwünschter Artefakte, die bei der GC-Bestimmung stören können, möglichst klein zu halten. Es zeigte sich, daß bereits relativ milde Bedingungen ausreichen, um den Großteil des „gebundenen“ 2,4-D freizusetzen. Keine weitere Erhöhung des extrahierbaren 2,4-D aber deutlich dunklere Extrakte wurden bei längerer Erhitzungszeit und höheren pH-Werten erzielt (Tab. 3.1.5-11). Tab. 3.1.5-11: Einfluß der Erhitzungszeit und des pH-Wertes während der Hydrolyse auf die Freisetzung von 2,4-D

Erhitzungszeit (min)

pH-Wert während der Hydrolyse

2,4-D Menge1) Fruchtart (Herkunftsland)

-2) - 0,22 mg/kg 15 ∼9,5 0,47 mg/kg 20 ∼9,5 0,48 mg/kg Orange 30 ∼9,5 0,44 mg/kg (Südafrika) 45 ∼9,5 0,47 mg/kg 15 >13 0,46 mg/kg -2) - 0,11 mg/kg Zitrone 30 ∼2,53) 0,17 mg/kg (Argentinien) 20 ∼9,5 0,31 mg/kg -2) - 0,60 mg/kg 60 ∼3,33) 0,62 mg/kg Orange 30 2 0,88 mg/kg (Simbabwe) 60 2 0,94 mg/kg 20 ∼9,5 1,60 mg/kg

1) alle Proben wurden bei pH∼2,5 extrahiert, SFE-Bedingungen: siehe Anlage 3 2) es wurde keine Hydrolyse durchgeführt 3) natürlicher pH Wert Die Auswirkung eines alkalischen Aufschlusses vor der SFE-Extraktion von 2,4-D-haltigen Zitrusproben aus dem Handel wird aus Abb. 3.1.5-14 ersichtlich.



Abb. 3.1.5-14: Freisetzung gebundener 2,4-D Rückstände aus Zitrusfrüchten durch alkalische Hydrolyse

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

2,4-

D (m

g/kg

)

ohne alkalische Hydrolyse nach alkalischer Hydrolyse

Nr. Fruchtart Herkunftsland Verhältnis

1 Orange Simbabwe 1,6 2 Orange Uruguay 1,7 3 Orange Südafrika 2,1 4 Grapefruit Südafrika 6,3 5 Grapefruit Argentinien 2,4 6 Grapefruit Honduras 3,0 7 Zitrone Argentinien 4,0 8 Zitrone Argentinien 5,7 9 Zitrone Argentinien 2,8

3.1.5.4.5 Derivatisierungsmöglichkeiten von Phenoxyalkancarbonsäuren

Die Derivatisierung des 2,4-D, sowie auch weiterer Phenoxyalkancarbonsäuren zu den 2,2,2-Trichlorethyl- (TCE) Derivaten ist einfach in der Durchführung und hat sich als sehr zuverlässig und robust erwiesen. Durch die Zugabe von 20 %iger statt konzentrierter Schwefelsäure als Katalysator konnte die Reinheit der Extrakte nach der Derivatisierung weiter erhöht werden. Diese Derivatisierungsmethode wird in [19] eingehend erläutert. Als Alternative zu der Trichlorethylierung wurde eine Derivatisierung mit 1,3-Dichlor-Isopropanol (DCIP) vorgenommen [29]. Reagentienverteilung und Ablauf der Reaktion entsprechen der Trichlorethylierung. Zu den DCIP- und TCE-Derivaten wurden neben 2,4-D auch weitere Phenoxyalkancarbonsäuren und andere Säuren derivatisiert. Wie in Abb. 3.1.5-15 und 3.1.5-16 zu sehen ist, lassen sich die Derivate gaschromatographisch gut trennen.



Abb. 3.1.5-15: TIC der 1,3-Dichlorisopropylester saurer Pestizide

15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

220000

240000

260000

280000

300000

320000

340000

Time-->

15.51

15.78

16.15

16.50

16.70

17.06

17.40

18.01

18.6419.32

20.05

20.22

21.26

1,3-Dichlorpropan-2-ol Derivate15.51 Dichlorbenzoesäure 15.78 Clopyralid16.15 4-Chlorphenoxyessigsäure16.50 MCPP (Mecoprop)16.70 Dicamba17.06 MCPA17.40 2,4-DP (Dichlorprop)18.01 2,4-D18.64 Triclopyr19.32 2,4,5-TP (Fenoprop)20.05 2,4,5-T20.22 MCPB21.26 2,4-DB

Abb. 3.1.5-16: TIC der 2,2,2-Trichlorethylester saurer Pestizide

15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00 23.00 24.00 25.000

10000

20000

30000

40000

50000

60000

Time-->

14.42

14.79

15.0715.36

15.85

16.2716.65

17.1317.39

17.75

18.47

19.0819.30 20.2921.67

24.50

2,2,2-Trichlorethyl Derivate 14.42 Reagenz-Blindpeak14.79 Dichlorbenzoesäure 15.07 Clopyralid15.36 4-Chlorphenoxyessigsäure15.84 MCPP (Mecoprop)15.86 Dicamba16.27 MCPA16.65 2,4-DP (Dichlorprop)17.14 2,4-D17.39 Interner Standard PCB 10117.75 Triclopyr18.47 2,4,5-TP (Fenoprop)19.09 2,4,5-T19.30 MCPB20.29 2,4-DB21.67 Picloram24.50 p,p´-DDA



Charakteristisch für die Massenspektren der DCIP-Derivate ist, daß die, wegen ihrer höheren Massen in der Regel weniger störungsanfälligen höhermolekularen Ionen, i.a. stark vertreten sind. Die Bestimmungen mittels GC/MSD gewinnen dadurch an Empfindlichkeit und Spezifität. Problematisch für den Einsatz von DCIP ist allerdings dessen cancerogenes Potential [32]. 2,4-Dichlorphenol als Abbauprodukt von 2,4-D wird bei den oben beschriebenen Derivatisierungsreaktionen nicht umgesetzt. Als Alternative bietet sich hier eine Umsetzung mit Pentafluorbenzylbromid an, siehe [29], bei der auch phenolische Gruppen derivatisiert werden. Die Massenspektren der verschiedenen 2,4-D-Derivate sind in den Abbildungen 3.1.5-17 bis 19 dargestellt. Abb. 3.1.5-17: Massenspektrum von 2,4-D-TCE-Ester

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 4000

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

7500

8000

8500

9000

9500

m/z-->

61

77

111

133

145161

175

205

220238 271277 316318

352

374384 408

175

2,4-D-TCE-Ester

Abb. 3.1.5-18: Massenspektrum von 2,4-D-DCP-Ester

100 150 200 250 300 350 4000

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

7500

8000

8500

9000

9500

m/z-->

63

75

111

133

145

175

177

210

220

255269284 317

332

344 380387 417

175

2,4-D-DCIP-Ester



Abb. 3.1.5-19: Massenspektrum von 2,4-D-PFB-Ester ( )

100 150 200 250 300 350 4000500

100015002000250030003500400045005000550060006500700075008000850090009500

m/z-->

6375111

133

145

175

219224 243 279288 307 342 365380

400

415

181

2,4-D-PFB-Ester

3.1.5.4.6 Bestimmung mittels GC-MSD

Die derivatisierten Extrakte können ohne weitere Reinigung direkt zur Messung eingesetzt werden. Tab. 3.1.5-12 zeigt die Sturkturformeln der Derivate, deren Retentionszeiten sowie die zur Quantifizierung und Identifizierung verwendeten SIM-Massen auf. Die beschriebenen „Matrix-Effekte“, die die gaschromatographische Bestimmung beeinflussen können, erwiesen sich im Fall der 2,4-D-TCE-Derivate als sehr gering. Lediglich bei sehr geringen Gehalten (<0,05 ppm) machten sie sich bemerkbar. Zur Vermeidung von „Matrix-Effekten“ und zur Erzielung exakterer Analysen-ergebnisse bei niedrigen Konzentrationen, empfiehlt sich die Kalibrierungen nach dem Standard-Additionsverfahren. Tab. 3.1.5-12: GC-MS-Daten der 2,4-D-Derivate

Strukturformel Retentionszeit (min)

Für die Quantifizierung herangezogene Masse

(m/z)

Qualifier Massen

(m/z) Cl

Cl

OCH2COOC6F5

2,4-D-PFB-Derivat

17,48

400

175, 402, 177

Cl

Cl

OCH2

C

O

O CH2CCl3

2,4-D TCE-Derivat

17,52

352

175, 350,

177

GC-Bedingungen: siehe Anlage 3



3.1.5.4.7 Val idierung

Wiederfindung: Zur Ermittlung der Wiederfindungsrate wurden zerkleinerte Grapefruit mit 2,4-D dotiert (0,25 ppm) und nach der Analysenvorschrift 102E3102 (siehe Anlage 3) fünf mal aufgearbeitet. Die ermittelte Wiederfindungsrate betrug 93 %. Nachweis- und Bestimmungsgrenzen: Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen für 2,4-D wurden nach dem DFG-Eich-geradenverfahren ermittelt (siehe Tab. 3.1.5-13) [80]. Hierzu wurden Wieder-findungsversuche bei vier verschiedenen Konzentrationen jeweils 4 mal durchgeführt (16 Aufarbeitungen). Die Dotierungen erfolgten auf Apfelmatrix, wobei die niedrigste dotierte Konzentration im Bereich der erwarteten Nachweisgrenze lag [81]. Tab. 3.1.5-13: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen nach dem DFG- Eichgeradenverfahren [80,81]

Parameter 2,4-D (als TCE-Derivat)

dotierte Menge (µg/kg) 7,1/14,2/22,8/71 berechnete Nachweisgrenze 6 µg/kg berechnete Bestimmungsgrenze * 14 µg/kg Korrelation der Geraden (r) 0,999 Korrelationskoeffizient (%RSD) 3,8 Analysenvorschrift: siehe Anlage 3 * die kleinste Höchstmenge für Obst und Gemüse beträgt 100µg/kg, für Säuglingsnahrung 10 µg/kg Methodenvergleich: Zur weiteren Überprüfung der Methode wurden Proben, die gewachsene 2,4-D-Rückstände enthielten, mit der SFE-Methode zur Bestimmung von 2,4-D und parallel dazu mit einer naßchemischen Methode untersucht [29]. Die Ergebnisse sind in Tab. 3.1.5-14 zusammengefaßt. Bei beiden Methoden wird ein alkalischer Aufschluß vor der Extraktion durchgeführt. Es wurden nahezu identische Ergebnisse erzielt.



Tab. 3.1.5-14: Vergleich der SFE-Methode zur Bestimmung von 2,4-D in Zitrusfrüchten mit einer Extraktionsmethode die organische Lösungsmittel verwendet

Fruchtart Herkunftsland 2,4-D in mg/kg

SFE-Methode „Lösungsmittel“ Methode [29]

Zitrone Argentinien 0,16 0,17 Zitrone Argentinien 0,15 0,16 Zitrone Argentinien 0,12 0,13

Grapefruit Argentinien 0,19 0,21 Grapefruit Argentinien 0,13 0,14 Grapefruit Südafrika 0,63 0,60 Grapefruit Südafrika 0,59 0,64 Clementine Argentinien 0,29 0,29

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden in [101,102] veröffentlicht. Untersuchungsergebnisse von zahlreichen Zitrusfruchtproben aus dem Handel werden i Kap. 3.1.6.3 vorgestellt.

3.1.5.4.8 Behandlung von Zitronen mit 2,4-D und Lagerungsversuch

Um festzustellen, mit welcher Kinetik 2,4-D auf der Oberfläche von Zitrusfrüchten nach einer Behandlung gebunden wird, wurden unbehandelte Zitronen wie folgt behandelt: Ein Teil der Proben wurde in eine wäßrige 2,4-D-Lösung (1000 ppm) eingetaucht, der andere Teil der Proben wurde mit einer 2,4-D-haltigen Wachsemulsion auf Polyethylen-Basis überzogen (500 ppm). Gelagert wurden die Proben bei Temperaturen zwischen 3 und 7°C in einem Kellerraum. Gegen Ende des Versuches (ab etwa dem 100. Tag) stieg die Temperatur witterungsbedingt allmählich auf etwa 12°C-14°C an. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Früchte entnommen, zerkleinert und tief-gefroren. Der Gehalt an 2,4-D in den jeweiligen Einzelfrüchten wurde mit und ohne die Durchführung einer alkalischen Hydrolyse bestimmt (freies 2,4-D und „Gesamt-2,4-D“). Zur Extraktion wurde die SFE eingesetzt (Analysenvorschrift siehe Anlage 3. Die Ergebnisse sind in Tab. 3.1.5-15 / Abb. 3.1.5-20 und Tab. 3.1.5-16 / Abb. 3.1.5-21 zusammengefaßt.



Tab. 3.1.5-15: Zitronen behandelt mit wäßriger 2,4-D-haltiger Lösung

Lagerzeit (Tage)

Proben- nummer

mit Hydrolyse ("Gesamt-2,4-D")

ohne Hydrolyse (freies 2,4-D)

Faktor freies 2,4-D /

"Gesamt-2,4-D"

Mittlerer Faktor

2,4-D (mg/kg)* 0 1 7,39 6,97 0,94 2 5,44 5,20 0,96 0,95

10 3 3,28 3,10 0,95 4 7,22 6,80 0,94 0,94

28 5 3,67 2,75 0,75 6 5,39 3,63 0,67 0,71 7 5,61 4,00 0,71

50 9 6,39 3,80 0,59 10 7,39 3,90 0,53 0,57 11 5,49 3,40 0,62 12 8,77 4,75 0,54

71 13 4,56 2,38 0,52 14 5,56 2,90 0,52 0,52

* Mittelwerte aus mindestens 2 Bestimmungen pro Probe

Abb. 3.1.5-20: Bindung des 2,4-D an die Matrix während der Lagerung behandelter Zitronen

2,4-D in wässriger Lösung aufgebracht

0,0

0,5

1,0

0 10 28 50 71Lagerzeit (Tage)

Faktor: freies 2,4-D /

"Gesamt-2,4-D"



Tab. 3.1.5-16: Zitronen behandelt mit wäßriger 2,4-D-haltiger Wachsemulsion Lagerzeit

(Tage) Proben- nummer

mit Hydrolyse ("Gesamt-2,4-D")

ohne Hydrolyse (freies 2,4-D)

Faktor freies 2,4-D /

"Gesamt-2,4-D"

Mittlerer Faktor

2,4-D (mg/kg)*

0 1 1,53 1,59 1,04 2 1,04

5 3 1,83 1,82 1,00 1,86 1,83 0,98 0,99

14 5 1,36 1,28 0,94 6 1,14 1,08 0,94 0,94

28 7 1,50 1,29 0,86 8 1,36 1,23 0,90 0,88

35 9 1,39 1,13 0,82 10 0,82

50 11 1,58 1,18 0,75 12 1,38 1,13 0,82 0,78

71 13 1,40 0,94 0,67 14 1,59 1,05 0,66 0,67

99 15 1,32 0,81 0,62 16 1,32 0,84 0,63 0,62

130 17 1,20 0,50 0,42 18 1,22 0,49 0,40 0,41

* Mittelwerte aus mindestens 2 Bestimmungen pro Probe

4

Abb. 3.1.5-21: Bindung des 2,4-D an die Matrix während der Lagerung behandelter Zitronen

2,4-D mit Wachs aufgebracht

0,0

0,5

1,0

0 5 14 28 35 50 71 99 130Lagerungszeit (Tage)

Faktor: freies 2,4-D /

"Gesamt-2,4-D"



Der Anteil an gebundenem 2,4-D stieg sowohl bei den mit Wachs behandelten als auch bei den mit wäßriger 2,4-D-Lösung behandelten Zitronen im Verlauf der Lagerung deutlich an (siehe Tab. 3.3.5-15 und 3.1.5-16) Bemerkenswert ist, daß sich trotz der sehr langen Lagerzeit von über 4 Monaten kein signifikanter 2,4-D Abbau feststellen ließ (vgl. Abb. 3.1.5-22). Abb. 3.1.5-22: Mittlere Gehalte an "Gesamt-2,4-D" einzelner Früchte während der Lagerung

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 14 28 35 50 71 99 130

Lagerungszeit (Tage)

Geh

alt a

n 2,

4-D

(mg/

kg) Mittelwert

3.1.5.4.9 Freisetzung von gebundenem 2,4-D aus Zitrusfrüchten bei simulierter Verdauung und simulierter Verarbeitung

Die in der RHmV festgesetzten Höchstmengen für 2,4-D [34] beziehen sich auf das freie 2,4-D, seine Salze und Ester, wobei unter 2,4-D-Ester die Esterverbindungen zu verstehen sind, die als Pflanzenschutzmittel eingesetzt werden und in den Proben noch unhydrolysiert als Rückstände vorliegen. Das über Konjugate an Matrixbestand-teile gebundene 2,4-D ist hierbei nicht berücksichtigt [127]. Derartiges gebundenes 2,4-D kann aber ebenfalls von Relevanz sein, da es bei der Verarbeitung von Zitrusfrüchten und im Verdauungsapparat des Menschen freigesetzt und dadurch bioverfügbar werden kann. Um dies zu überprüfen, wurde eine 2,4-D-haltige argentinische Zitronenprobe, die einen großen Anteil an gebundenem 2,4-D enthielt, einer simulierten Magen- und Dünndarmverdauung unterzogen (Durchführung siehe Anlage 8) [135]. Für die Verdauungsversuche wurde Pepsin sowie Galle und Dünndarmenzyme aus Schwein verwendet. Magen- und Dünndarmverdauung wurden isoliert betrachtet. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Abb. 3.1.5-23 und 3.1.5-24 dargestellt. Es wird ersichtlich, daß unter den Bedingungen einer simulierten Dünndarmver-dauung große Anteile des gebundenen vorliegenden 2,4-D freigesetzt werden



können (57 % nach 1 h und 86 % nach 3 h); bei einer simulierten Magenverdauung dagegen, innerhalb von 3 h, nur 14 %. Auch ohne Zusatz von Enzymen bei einem pH-Wert von 7,4 und 37°C wurde eine erhebliche 2,4-D-Freigesetzung festgestellt (70%). Abb. 3.1.5-23: Gegenüberstellung der ermittelten 2,4-D-Gehalte in Zitronen bei unterschiedlicher Probenvorbehandlung

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5

Freies 2,4-D

Magenverdauung 3h

Dünndarmverdauung (1h)

Ohne Enzyme (3h) pH7,4/ 37°C


Alkalische Hydrolyse

2,4-D in ppm

100%

29%

39%

69%

78%

90%

Abb. 3.1.5-24: Freisetzung von gebundenem 2,4-D durch verschiedene Verfahren

14

57

70

86

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 11

Magenverdauung 3h


Ohne Enzyme (3h)


Alkalische Hydrolyse

Freigesetzter Anteil von gebundenem 2,4-D in %0



Simulierung einer Zitrusfruchtverarbeitung

Zur Simulierung der Herstellung einer Zitronenmarmelade wurde eine Probe zer-kleinerter argentinischer Zitronen (die oben aufgeführte Probe), die einen hohen Anteil an gebundenem 2,4-D enthielt, 1 h lang in einem siedenden Wasserbad erhitzt. Unter diesen Bedingungen wurde etwa 25 % des gebundenen 2,4-D freigesetzt, so daß der Gehalt an freiem 2,4-D von 0,121 auf 0,174 mg/kg anstieg.



3.1.5 .5 N-Methyl-Carbamate

3.1.5.5.1 Einführung

N-Methyl-Carbamate werden häufig in der Landwirtschaft eingesetzt. Es handelt sich meist um Insektizide, einige zeigen jedoch auch akarizide, nematizide oder molluskizide Wirkung [92,89]. Als gemeinsames Strukturmerkmal weisen die Vertreter dieser Pestizidklasse eine N-Methyl-Carbamat-Gruppe auf:

OC

O

NHCH3R

In Abbildung 3.1.5-25 werden die Strukturformeln, die Wasserlöslichkeit und die Wirkung einiger N-Methyl-Carbamate aufgeführt [92,119]. Nach der Art des Restes R- werden die N-Methyl-Carbamate im allgemeinen in zwei Grundtypen unterteilt: • Aryl-Carbamate • Oxim-Carbamate. Im Vergleich zu den Aryl-Carbamaten weisen Oxim-Carbamate eine deutlich höhere Polarität auf und wirken daher meist systemisch, d.h. sie werden über die Leitungsbahnen über das ganze Pflanzensystem verteilt. Wegen ihrer vergleichsweise geringen Persistenz und dem schwachen Bio-akkumulationspotential konnten die N-Methyl-Carbamate, zusammen mit den Organophosphorsäureestern, die Organochlorinsektizide, die in den 40iger und 50iger Jahren weit verbreitet waren, verdrängen. Ähnlich wie bei Organophosphorsäureestern basiert die insektizide Wirkung der Carbamate auf der Hemmung des Enzyms Chlolinesterase. Carbamate werden jedoch in der Regel schneller metabolisiert und sind daher für Warmblüter im all-gemeinen weniger toxisch. In den letzten Jahren sind allerdings Bedenken hin-sichtlich ihre toxikologischen Wirkung beim Menschen aufgekommen. So wird von einer subchronischen Neurotoxizität, infolge einer längeren Anwendung der Substanz Carbaryl in Wohnräumen berichtet. Weiterhin führt bei einigen Vertretern, wie beispielsweise Aldicarb, die Metabolisierung der Thioethergruppe zum Sulfoxid und Sulfon, zu einer deutlichen Erhöhung des toxikologischen Potentials.



Abb. 3.1.5-25: Strukturformeln einiger N-Methyl-Carbamate [92]:

CARBOFURAN (0,32g/l)Insektizid und Nemadizid

OC

O

NHCH3

O

ETHIOFENCARB (1,8g/l)Insektizid

OC

O

NHCH3

CH2 SCH2CH3

NHCH3

O

CO

PROMECARB (0,091g/l)Insektizid

NHCH3

O

CO

N

AMINOCARB (0,92mg/l)Insektizid und Akarizid

NHCH3

O

CO

O

PROPOXUR (1,9g/l)Insektizid

CH3S NHCH3

O

CO

METHIOCARB (0,027g/l)Insektizid und Molluskizid

OC

O

NHCH3

O O

BENDIOCARB (0,26g/l)Insektizid

DIOXACARB (6g/l)Insektizid

OC

O

NHCH3

OO

OXIM-CARBAMATE

ARYL-CARBAMATE

Anmerkung: In Klammern ist die Löslichkeit der Substanzen in Wasser bei 20°C aufgeführt.

CARBARYL (0,12g/l)Insektizid und Nemadizid

NHCH3

O

CO

OXAMYL (280g/l)Insektizid und Nematizid

CS

CN

O

N

CH3

OC

O

NHCH3

METHOMYL (58g/l)Insektizid und Akarizid

CS

H3CN

CH3

OC

O

NHCH3

ALDICARB (9g/l)Insektizid, Nematizid und Akarizid

C NH

H3CS

OC

O

NHCH3

Zu den wichtigsten Metabolisierungsreaktionen der N-Methyl-Carbamate zählen, neben der erwähnten Oxidation von Thioethergruppen zu Sulfonen und Sulfoxiden, die Hydroxylierung des aromatischen Restes sowie die Hydrolyse der Carbamat-Gruppe unter Bildung von Methylamin, Kohlendioxid und des korrespondierenden Phenols bzw. Oxims [133]. Im Gegensatz zu den Organophosphorsäureestern



zeigen sich die N-Methyl-Carbamate in der Regel in der Pflanze widerstandsfähiger gegen Hydrolyse und werden eher durch Ringhydroxylierung abgebaut [123]. Dioxacarb (siehe Abb. 3.1.5-25) wird hauptsächlich über die hydrolytische Spaltung des cyclischen Acetals abgebaut, wobei neben Benzaldehyd, Ethylenglykol freige-setzt wird. Darüber hinaus zeigen einige Vertreter einen starken photochemischen Abbau (z.B. Ethiofencarb und Propoxur) [105,106,134]. Zu den N-Methyl-Carbamaten werden im weitesten Sinne auch die Verbindungen Furathiocarb, Benfuracarb und Carbosulfan gezählt. Diese drei Verbindung werden sowohl auf der Pflanze selbst, als auch während der Probenvor- und aufarbeitung zu Carbofuran umgewandelt (siehe Abb. 3.1.5-26). Abb. 3.1.5-26: Umwandlung von Furathiocarb, Benfuracarb und Carbosulfan zu Carbofuran

FURATHIOCARB

CARBOFURAN

OC

O

NH

CH3O

CH3

N

O

CO

CH3

C4H9O

O

CNS

O

CARBOSULFAN

CH3

N

O

CO NS

C4H9

C4H9

O

BENFURACARB

NSCH

C2H4 COC2H5

O

CH3

CH3

CH3

N

O

CO

O



3.1.5.5.1.1 Analytik Analytisch bereiten N-Methyl-Carbamate gewisse Schwierigkeiten. Aufgrund der Thermolabilität der Carbamatgruppe und der hohen Polarität einiger Vertreter werden sie in den gängigen Multimethoden, bei denen die Bestimmung mittels Gaschromatographie erfolgt, in der Regel nicht erfaßt. Eine gaschromatographische Bestimmung von N-Methyl-Carbamaten ist nach ihrer Umsetzung zu thermostabilen Derivaten möglich. In der Literatur werden ver-schiedene Möglichkeiten hierzu beschrieben, wie beispielsweise die Umsetzung mit Dinitrofluorbenzol [107,108], mit Essigsäureanhydrid [122] oder mit verschiedenen Perfluoracylanhydriden wie z.B. Heptafluorpropionsäueanhydrid [109]. Die meisten in der Literatur beschriebenen Methoden zur Bestimmung der N-Methyl-Carbamate basieren auf eine flüssigkeitschromatographischen Auftrennung und anschließender Fluoreszenzdetektion [121]. Dabei werden die N-Methyl-Carbamate nach ihrer Auftrennung mittels RP-LC mit Lauge hydrolysiert und das dabei ent-stehende Methylamin mit o-Phthalsäureanhydrid in Gegenwart von 2-Mercapto-ethanol (OPA/2-Me) zu einem fluoreszierenden Isoindol-Derivat umgesetzt. Dieses wird fluorimetrisch mit hoher Empfindlichkeit detektiert [110-114].

3.1.5.5.2 Bestimmung von N-Methyl-Carbamaten nach Extraktion mittels SFE

3.1.5.5.2.1 Übersicht In diesem Abschnitt wird zunächst eine SFE-Extraktionsmethode für die N-Methyl-Carbamate vorgestellt und anschließend folgende drei Bestimmungsmöglichkeiten gegenübergestellt und ihre Vor- und Nachteile erläutert: 1. direkte Bestimmung mittels GC/MSD bei Verwendung eines Kaltaufgabesystems, 2. Bestimmung mittels GC/MSD nach Derivatisierung mit PFB-Br, 3. Bestimmung mittels LC/MSD im API-Elektrospray-Modus. Abb. 3.1.5-27: zeigt den Analysengang zur Bestimmung der N-Methyl-Carbamate auf. Eine detaillierte Analysenvorschrift befindet sich in Anlage 4.



Abb. 3.1.5-27: SFE-Methode zur Bestimmung der N-Methyl-Carbamate

Feinzerkleinerung der Probe

3 Teile der Probe werden intensiv mit 2 Teilen Hydromatrix vermengt

5g Aliquot (3g Probe) wird

in eine Extraktionshülse eingewogen

Supercritical Fluid Extraction (SFE) 2. 3. 1.

Derivatisierung mit PFB-Br/K2CO3

Bestimmung mit LC/MS

GC/MSD Bestimmung

Anmerkungen: Zu 1: Im Rahmen der Vorversuche zur Optimierung der gaschromatographischen Bedingungen (siehe Kap. 3.1.2.1 und 3.1.2.2) wurde festgestellt, daß verschiedene polare und thermolabile Verbindungen (u.a. auch Carbamate) bei Verwendung eines Kaltaufgabesystems (Kaltinjektion und Lösungsmittelausblendung, vgl. Kap 3.1.2.1) gaschromatographisch auch ohne Derivatisierung bestimmt werden können. Daraus ergibt sich die Möglichkeit eine ganze Reihe von N-Methyl-Carbamaten in die üblichen Multimethoden zu integrieren, wodurch für diese Verbindungen auf eine gesonderte Bestimmung mittels HPLC verzichtet werden kann (effizientere Analytik). Zu 3: Für die Bestimmung aller N-Methyl-Carbamate und deren Umwandlungs-produkte bietet sich die LC-MSD als Methode der Wahl an. Es bot sich die Mög-lichkeit dieses Verfahren, das durch die Entwicklung verbesserter Geräte für die Routineanalytik interessant geworden ist, für einige Messungen zu verwenden. Die Messungen wurden in den Laboratorien der Fa. HP in Waldbronn durchgeführt.



3.1.5.5.2.2 Extraktion mit SFE Die Mehrzahl der N-Methyl-Carbamate sind unpolare bis mittelpolare Verbindungen und lassen sich gut unter den Extraktionsbedingungen der in Kapitel 3.1.4.2 aufgeführten Multimethode extrahieren. Dies haben auch erste Versuche mit einigen N-Methyl-Carbamaten gezeigt.

SFE-Parameter: Extraktionsgerät: HP 7680T • Extraktionsdruck: 329 bar, Temperatur: 55°C • Dichte: 0,89 g/ml • statische Extraktion: 2 min • dynamische Extraktion: 25 min • CO2-Fluß: 1,8 ml/min • Fallenmaterial: ODS, 10°C während der Extraktion • Lösungsmittel: Acetonitril

3.1.5.5.2.3 Direkte Bestimmung mittels GC-MSD (KAS3-Gerstel) N-Methyl-O-Aryl-Carbamate können direkt gaschromatographisch bestimmt werden. Infolge von Wechselwirkungen mit aktiven Stellen im GC-Injektionssystem werden sie jedoch bei erhöhten Temperaturen teilweise zu ihren korrespondierenden Phenolen abgebaut. So kommt es, daß in den erhaltenen Chromatogrammen sowohl die Muttersubstanz (das Carbamat) als auch das Abbauprodukt (Phenol) auftritt. Das Ausmaß der Zersetzungen hängt in erster Linie von der Aktivität der Oberflächen ab, mit denen die Pestizide in Kontakt kommen. So ist z.B. bei Verwendung eines stark verschmutzten Injektionsliners der Abbau viel größer und auf Grund unerwünschter Wechselwirkungen (Retention) die Peakform viel schlechter als bei Verwendung eines sauberen Liners (stärkeres Tailing). Interessant ist, daß bei Gegenwart von Matrixbestandteilen in den zu messenden Lösungen, dieser Abbau viel geringer ausfällt und die Peaks eine schärfere Form aufweisen (siehe Abb. 3.1.5-28). Grund hierfür ist die Maskierung von aktiven Stellen durch Matrixbestandteile (Konkurrenzreaktion). Aus diesem Grund erhält man bei Verwendung von Kalibrierstandards in reinen Lösungsmitteln Ergebnisse die deutlich überhöht sind. Die Verwendung von Kalibrierlösungen, die Matrix enthalten ist daher unerläßlich (vgl. Kap. Matrixeffekte 3.1.2.3). Bei diesem Verfahren muß auf jeden Fall darauf geachtet werden, daß das Injektionssystem in einer guten Kondition ist. Darüber hinaus sollten zu Kontroll-zwecken die korrespondierenden Phenole mit erfaßt werden.



Abb. 3.1.5-28: Unerwünschter Abbau und Retention im GC-Injektor-System:

0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

µg/ml

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1µg/ml

Methiocarb

Methiocarb

"Matrix-Kalibrierung"

"Lösungsmittel-Kalibrierung"

15.70 15.75 15.80 15.85 15.90 15.95 16.00 16.05 16.10 16.15 16.200

500

1000

1500

Time-->

AbundanceIon 168.00 (167.70 to 168.70): 1301019.D

15.83

15.70 15.75 15.80 15.85 15.90 15.95 16.00 16.05 16.10 16.15 16.200

500

1000

1500

Time-->

Abundance

15.70 15.75 15.80 15.85 15.90 15.95 16.00 16.05 16.10 16.15 16.200

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

Time-->


15.74

Abundance

Methiocarb

Methiocarb

Korresp. Phenol

Korresp. Phenol

Ion 326.00 (325.70 to 326.70): 1301019.D

Ion 326.00 (325.70 to 326.70): 0201002.D

3.1.5.5.2.4 Bestimmung mittels GC-MSD nach Derivatisierung Zur Erzeugung thermostabiler Derivate werden die N-Methyl-Carbamate (NMC) mit Pentafluorbenzylbromid (PFB-Br) umgesetzt. Die eingesetzte Derivatisierungs-methode ist identisch mit derjenigen, die zur Umsetzung von Carbendazim, Thiabendazol und 2,4-D eingesetzt wird (siehe auch Kap. 3.1.5.3.2.3 und 3.1.5.4.5, Anlage 2 sowie [29]). Sie kann gut zu Screeningzwecken eingesetzt werden, da Verbindungen mit unterschiedlichen reaktiven Gruppen wie Säure-, Alkohol- und z.T. Amino-Gruppen gut mit PFB-Br umgesetzt werden. Sie ist einfach in der Durch-führung und wird in dem GC-Vial durchgeführt in dem die SFE-Extrakte anfallen. Bei dieser Reaktion werden sowohl die N-Methyl-O-Aryl-Carbamate als auch ihre korrespondierende Phenole zum gleichen Derivat umgesetzt und gemeinsam erfaßt (siehe Abb. 3.1.5-29).



Abb. 3.1.5-29: Reaktionsgleichung zur Bildung der PFB-Derivate Derivatisierung der NMC mit Pentafluorbenzylbromid

Hydrolyse

Korr. Phenol

NHCH3

CO

O

R

+ C6F5CH2 Br

PFB-Derivat

K2CO3/ H2OR O CH2C6F5

Katalyse

R O H

Die Oxim-Carbamate lassen sich jedoch nicht zu analytisch interessanten Derivaten umsetzen. Ethiofencarb läßt sich im Vergleich zu den anderen Aryl-Carbamaten erheblich schlechter umsetzen. Dies könnte auf sterische Gründe zurückzuführen sein, denn Ethiofencarb besitzt als einziger Vertreter in ortho-Position zur Phenolgruppe einen vergleichsweise sperrigen Rest (-CH2SCH2CH3). Eine Oxidation von Ethiofencarb am Schwefelatom während der Derivatisierung ist ebenfalls nicht auszuschließen. Eine weitere Besonderheit tritt bei der Derivatisierung von Dioxacarb auf. Hier kommt es nicht zu einer Abspaltung der Carbamatgruppe, sondern primär zu einer Hydrolyse der Acetalfunktion. Die Anlagerung des Pentafluorbenzylrestes erfolgt erst nach einer Cyclisierung. In Abb. 3.1.5-30 wird ein möglicher Reaktionsmechanismus für die Entstehung des Derivatisierungsproduktes von Dioxacarb vorgestellt. Abb. 3.1.5-30: Reaktionsmechanismus zur Entstehung des Dioxacarb-PFB-Derivates

Dioxacarb

Derivatisierungsprodukt

OC

O

NHCH3

O O

OC

O

NHCH3

O H

CH3

O

CON

O

H

H

C6F5CH2 Br K2CO3

CH3

O

CON

O

H

C6F5CH2

HOCH2CH2OHO

CON

H CH3

O

H

H

H2O

H-

NH

OC

OO

HH CH3

Derivatisierung von Dioxacarb mit PFB-Br

Derivatisierung

Gaschromatographische Bestimmung:



In Tabelle 3.1.5-17 sind die zur GC-MSD Bestimmung der Aryl-Carbamat-Derivate verwendeten Quantifizierungs- und Identifizierungsmassen angegeben. Die apparativen Einstellungen sind in Anlage 4 aufgeführt. Tabelle 3.1.5-17: Verwendete Identifizierungs- und Quantifizierungsmassen

Verbindung Target-/Qualifier-Ionen (m/z) Aminocarb 331, 150, 181 Bendiocarb 346, 331, 125 Carbanolat 336, 155, 181 Carbaryl 324, 143, 115 Carbofuran 344, 163, 135 Dioxacarb 345, 188, 181 Ethiofencarb 348, 287, 181 Fenobucarb 330, 301, 181 Isoprocarb 316, 135, 181 Landrin 316, 135, 181 Methiocarb 348, 167, 139 Promecarb 330, 287, 181 Propoxur 332, 290, 109

GC/MSD Bedingungen: siehe Anlage 4 Rechtliche Problematik: Da sich die Höchstmengen in der Rückstandshöchstmengenverordnung nur auf die N-Methyl-Carbamate beziehen und die Abbauprodukte nicht berücksichtigt werden, ergibt sich bei deren gemeinsamer Bestimmung ein rechtliches Problem, da eventuell bereits in der Probe vorliegendes Phenol (Abbauprodukt) mit erfaßt wird. Für die korrespondierenden Phenole der Verbindungen Carbaryl (α-Naphthol), Propoxur (o-Isopropoxyphenol), Promecarb (3-Isopropyl,2-methyl-phenol) und Carbofuran (2,3 Dihydro-2,2-dimethyl-7-benzofuranol) wurden Wiederfindungsversuche durchgeführt und dabei Wiederfindungen von über 90% festgestellt.

3.1.5.5.2.5 Bestimmung mittels LC-MSD Unter den schonenden Bedingungen der Flüssigkeitschromatographie findet kein Abbau der N-Methyl-Carbamate statt. Durch den Einsatz der LC/MSD konnte eine sehr empfindliche und selektive Bestimmung dieser Verbindungen erzielt werden. Die Empfindlichkeit und Robustheit der HPLC-MSD-Geräte konnte in den letzten Jahren durch Optimierung der Interface-Techniken bedeutend verbessert werden. Die Messungen wurden an einem HP 1100 series LC/MSD im API-Elektrospray-Modus durchgeführt. Bei diesem Verfahren kommt es durch Protonierung in der flüssigen Phase zu einer Ionisierung von Analyten. Die LC-Eluate werden nach der Säule in eine Kammer gesprüht und das Elutionsmittel im Stickstoffstrom verdampft. Durch die zunehmende Ladungsdichte in den erzeugten Tröpfchen werden diese aufgrund von aufeinanderfolgenden Coulomb-Explosionen, zu immer kleineren Einheiten reduziert. Durch Einwirkung eines elektrischen Feldes kommt es letztendlich zu einer Freisetzung von Ionen in die Gasphase. Die erzeugten Ionen werden in Richtung des



Analysators beschleunigt. Vor dem Eintritt in den Quadrupol erfolgt eine Fragmentierung der Ionen aufgrund von Kollisionen, die auf ein angelegtes Spannungsfeld (Fragmentorspannung) zurückzuführen sind (collision induced dissociation) [126]. Die zur Quantifizierung und Identifizierung verwendeten Massen werden in Tab. 3.1.5-18 aufgeführt. Tab. 3.1.5-18: Zur Quantifizierung und Identifizierung herangezogene m/z N-Methyl-Carbamat M+1 M-56 weitere

Fragmentionen Bemerkungen

Aldicarb Sulfon 223 240 (M+18) Aminocarb 209 152 M+1: Bendiocarb 224 167 protoniertes Molekülion Carbanolat 214 157 Carbaryl 202 145 219 (M+18) Carbofuran 222 165 Dioxacarb 224 165 M-56: Ethiofencarb 226 169 164 (M-61) protoniertes Fenobucarb 208 151 korrespondierendes Isoprocarb 194 137 Phenol Landrin 226 169 Methiocarb 226 169 Methiocarb Sulfon 258 185 Methiocarb Sulfoxid 242 185 M+18: Methomyl 163 106 180 (M+18) Ammonium-Addukt Metolcarb 166 Oxamyl 220 Promecarb 208 151 Propoxur 210 153 168 (M-41) Benfuracarb 411 - 190, 252 Furathiocarb 383 - 252, 195 Carbosulfan 381 - 222 Das Fragmentierungsmuster der N-Methyl-Carbamate ist im Vergleich zur GC meist sehr einfach, durch Abspaltung der Carbamatgruppe tritt das protonierte korrespondierende Phenol als Hauptfragmention auf. Vereinzelt treten bei einigen Vertretern wie z.B. bei Ethiofencarb durch Spaltung der Thioethergruppe auch weitere nennenswerte Fragmente auf (vgl. Abb. 3.1.5-31). Im allgemeinen kann das Fragmentierungsmuster durch Variation der Fragmentorspannung verändert werden. Bei höherer Fragmentorspannung kommt es zu einer stärkeren Bildung von Fragmentionen. Die Intensität der Hauptfragmentionen nimmt jedoch dabei meist ab.



Abb. 3.1.5-31: Fragmentierung von Ethiofencarb

CH3CH2SH

CH2 SCH2CH3

OC

O

NHCH3

CH2 SCH2CH3

OC

O

N

H

CH3

H

CH2 SCH2CH3

HO

H

H

H

H3C N C O

+M+1

M-61

CH2 SCH2CH3

H

HO

Ethiofencarb

NHC

OO

CH3CH2

OC

O

NHCH3

M-56



LC-MSD-Einstellungen: LC-Parameter: • Säule: 2,1x 30 mm, 3,5µ, ZORBAX XDB C-18, • mobile Phasen: A: 1 mM wäss. CH3COONH4, B: Methanol/Acetonitril 1:1, 10%B → 90%B in 5 min, • Fluß 0,3 ml/min, • Ofentemperatur: 50°C, • Injektionsvolumen: 0,5-2µl. MSD-Parameter: • API-Elektrospray, • Fragmentor 40 V, • drying gas: Stickstoff 10 l/min, 300°C Abb. 3.1.5-32 zeigt für einige N-Methyl-Carbamate mehrere SIM-Chromatogramme übereinander gelegt. Dabei wird deutlich, daß für Carbaryl, Fenobucarb und Promecarb, bei der hier gewählten Fragmentorspannung von 40 V, die Fragment-ionen in ausreichender Ausbeute entstehen, so daß eine Identifizierung relativ gut möglich ist. Für Aminocarb und Isoprocarb sind die erzeugten Fragmentionen jedoch sehr schwach ausgeprägt. Hier ist eine Identifizierung, vor allem bei kleinen Gehalten problematisch. Durch eine Erhöhung der Fragmentorspannung ist es jedoch möglich, die Fragmentierung so zu gestalten, daß durch verstärkte Bildung von Fragmentionen, die Identifizierung dieser Verbindungen verbessert wird. Das Meßsystem bietet die Möglichkeit die Fragmentorspannung je nach Frage-stellung für jede Substanz individuell zu wählen. Dies wurde aus zeitlichen Gründen nicht durchgeführt, da alle Messungen bei HP in Waldbronn durchgeführt wurden (zu diesem Zeitpunkt war das entsprechende Analysengerät beim CVUA Stuttgart noch nicht vorhanden).



Abb. 3.1.5-32: SIM-Chromatogramme übereinander gelegt, Dotierung auf Apfel 0,166 ppm, Endvol. 1,5 ml, Injektionsvol. 0,5 µl,

9 10 11 12

166 pg

Aminocarb

Carbaryl

Isoprocarb Fenobucarb

Promecarb

m/z 208, 151, 145, 202, 137, 194, 152, 209

Empfindlichkeit des Verfahrens: Durch die API (Atmospheric Pressure Ionisation) Elektrospray-Technik können ohne vorherige Derivatisierung für die N-Methyl-Carbamate Nachweisgrenzen erreicht werden, die im Bereich dessen liegen, was mittels GC-MSD möglich ist. Wie Abb. 3.1.5-33 zeigt sind die Hauptmassen von Promecarb und Fenobucarb bei einer Konzentration von 0,003 ppm bezogen auf die Probe (3,3 pg absolut) noch deutlich in einem Apfelextrakt nachweisbar. Allerdings waren unter den gewählten Bedingungen die Hauptfragmentionen mit der Masse 151 nicht mehr nachweisbar. (Anmerkung: beide Verbindungen geben ein Fragmention mit der Masse 151). Durch eine Erhöhung des Injektionsvolumens oder einer Verschiebung der Fragmentorspannung könnte die Nachweisempfindlichkeit der Fragmentionen jedoch noch weiter gesteigert werden und dadurch die Selektivität erhöht werden.



Abb. 3.1.5-33: Abschätzung der Nachweisempfindlichkeit Dotierung auf Apfel 0,003 ppm, Endvol. 1,5 ml, Injektionsvol. 0,5 µl

FenobucarbPromecarb

3,3 pg

m/z 151

m/z 208

Vorteile der LC/MSD: Die Vorteile der LC/MSD Methode lassen sich wie folgt zusammenfassen: • hohe Selektivität und Empfindlichkeit, • keine Derivatisierung erforderlich, • Erfassung aller N-Methyl-Carbamate (Oxim- und Aryl-), • gleichzeitige Bestimmung der Abbauprodukte möglich, • Schnelligkeit.

3.1.5.5.2.6 Wiederfindungen Es wurden mehrere Wiederfindungsversuche mit verschiedenen Matrizes (Apfel, Orangensaft, Traube, Karotte, Blumenkohl) durchgeführt und mit den drei be-schriebenen Bestimmungsmethoden untersucht. Die dabei erzielten Wiederfindungen lagen unabhängig von der gewählten Bestimmungsmethode in der gleichen Größenordnung. In Abb. 3.1.5-34 sind die mittels SFE und LC-MSD erzielten Wiederfindungen für eine mit 0,167 ppm dotierte Traubenmatrix aufgeführt. Mit diesem Verfahren können, im Gegensatz zu den beiden gaschromatographischen Verfahren, nicht nur die Aryl- sondern auch die Oxim-Carbamate und Benfuracarb, Furathiocarb und Carbosulfan erfaßt werden. Die erzielten Wiederfindungen bei Verwendung der anderen Bestimmungs- verfahren werden nicht gesondert aufgeführt. Im Vergleich wiesen die mittels LC-MSD erzielten Ergebnisse von Wiederholbestimmungen die kleinsten Schwankungen auf (Variationskoeffizienten zwischen 1,3% und 4,8%, meist im Bereich von 2%). Erwartungsgemäß waren die Wiederfindungen der polaren Oxim-Carbamate Aldicarbsulfon, Oxamyl und Methomyl schlecht (vgl. Kap. 3.1.4.7.2).



Abb. 3.1.5-34: Wiederfindungen verschiedener Carbamate (SFE-LC-MSD) dotierte Matrix: Traube, Dotierungs-Level: 0,167 ppm

0 20 40 60 80 100

PropoxurPromecarb

OxamylMetolcarb

MethomylMethiocarb

Methioc. SulfoxidMethioc. Sulfon

Landrin

IsoprocarbFenobucarbEthiofencarb

Dioxacarb

CarbofuranCarbaryl

BendiocarbAminocarb

Aldicarb Sulfon

Wiederfindung in %

10g/l

Abbau

280 g/l

58 g/l

Var. Koeff.: 1,3-4,8 %

Anmerkung: Die neben den Balken aufgeführten Werte zeigen die Löslichkeit der Carbamate in Wasser bei 20°C.

3.1.5.5.2.7 Abbau in der Extraktionshülse Im Gegensatz zu den herkömmlichen Analysenverfahren, bei denen die Proben unmittelbar nach der Einwaage extrahiert werden, werden die Proben bei der SFE bis zur Extraktion manchmal über mehrere Stunden im Autosampler des SFE-Gerätes bei Raumtemperatur gelagert. Dabei kann es zu einem signifikanten Abbau bestimmter empfindlicher Verbindungen kommen: Abbau von Dioxacarb:



Dioxacarb weist eine Acetalgruppe auf, die insbesondere säurekatalysiert leicht hydrolysierbar ist. So wurde z.B. beobachtet, daß bei Dotierungen auf Traube (pH∼3,5) die Wiederfindungen mit der Lagerzeit der zu extrahierenden SFE-Hülsen rasch abnahmen. Bei Salat dagegen (pH∼6) war unter vergleichbaren Bedingungen praktisch kein Rückgang der Wiederfindungen festzustellen (siehe Kap. 3.1.4.7.4). In der folgenden Abbildung (3.1.5-35) wird der Abbau von Dioxacarb in Apfelmus-Matrix (pH∼5) gezeigt. Abb. 3.1.5-35: Abbau von Dioxacarb in Apfelmus/Hydromatrix-Gemisch 3:2 bei Lagerung in der Extraktionshülse bei Raumtemperatur

0

20

40

60

80

0 h 2 h 12 h

Wiederfindung in %

OC

O

NHCH3

OO

Lagerzeit bei RT Umwandlung zu Carbofuran: Wie bereits erwähnt, werden Carbosulfan, Benfuracarb und Furathiocarb leicht zu Carbofuran abgebaut. Dieser Abbau erfolgt sowohl auf der behandelten Pflanze als auch während der Analyse. Abb. 3.1.5-36 zeigt den Fortgang der Umwandlung von Benfuracarb und Furathiocarb zu Carbofuran während der Lagerung der Extraktions-hülsen bei Raumtemperatur . Dabei werden die Wiederfindungen als Carbofuran angegeben. Zur Berechnung wurden hierbei die Umwandlungsfaktoren 1,73 für Furathiocarb und 1,86 für Benfuracarb herangezogen. Wie aus der Graphik ersichtlich, erfolgt bei Benfuracarb eine raschere Umwandlung zu Carbofuran als bei Furathiocarb.



Abb. 3.1.5-36: Umwandlung zu Carbofuran in Apfelmus/Hydromatrix-Gemisch 3:2 bei Lagerung in der Extraktionshülse bei Raumtemperatur

0

20

40

60

80

0 h 2 h 20 h

Wiederfindung in %

Lagerzeit bei RT

BENFURACARB

NSCH

C2H4 COC2H5

O

CH3

CH3

CH3

N

O

CO

O

FURATHIOCARB

CH3

N

O

CO

CH3

C4H9O

O

CNS

O

Fazit: Mit Hilfe der SFE können N-Methyl-O-Aryl-Carbamate mit sehr guten Ausbeuten extrahiert werden. Oxim-Carbamate zeigen dagegen wegen ihrer hohen Polarität geringere Wiederfindungen. Es wurden drei verschiedene Verfahren zur Bestimmung dieser Verbindungen miteinander verglichen: die direkte Bestimmung mittels GC/MSD bei Verwendung eines Kaltaufgabesystems, die Bestimmung mittels GC/MSD nach Derivatisierung mit PFB-Br und die Bestimmung mittels LC/MSD. Mit der LC/MSD ist eine direkte schnelle und einfache Bestimmung aller N-Methyl-Carbamate und Ihrer Abbauprodukte mit guter Empfindlichkeit möglich. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden als Poster beim 2nd European Pesticide Residue Workshop in Almería, beim 9th IUPAC International Congress- Pesticide Chemistry und beim 3. SFE-SFC-XSE Forum in Siegen, sowie als Vortrag beim MS-Anwendertreffen der Fa. HP in Fulda (1998) vorgestellt [103,104].



3.1.5 .6 Organozinn-Pest iz ide

3.1.5.6.1 Einleitung

Organozinn-Verbindungen werden in der Industrie z.B. als Hilfsmittel bei der Ver-arbeitung von PVC, als Holzschutzmittel und als Bestandteil von Anstrichmitteln für Schiffsteile, die vor Anlagerung von Pflanzen und Tieren geschützt werden sollen, verwendet [84,85]. In der Landwirtschaft werden sie seit den 50 iger Jahren [86] als Akarizide und Fungizide eingesetzt. Die Strukturformeln der Organozinn-Pestizide werden in Abb. 3.1.5-37 aufgeführt. Triphenylzinn-Verbindungen (Fentinhydroxid und Fentinacetat) werden hauptsächlich wegen ihrer fungiziden Wirkung und als Antifraßmittel gegen blattfressende Larven im Kartoffel-, Rüben- und Sellerieanbau verwendet [85]. Fentinacetat hat darüber hinaus algizide und mulluscizide Eigenschaften. Es wird nach dem Aufbringen inner-halb kurzer Zeit zu Fentinhydroxid umgewandelt [93]. Die Trialkyl-Zinn-Verbindungen Azocyclotin, Cyhexatin und Fenbutatinoxid sind gegen alle beweglichen Entwicklungsstadien der Spinnmilbe wirksam [92]. Cyhexatin wurde lange Zeit bei der Produktion von Obst eingesetzt. 1987 wurde allerdings das Produkt (Handelsname Plictran) vom Hersteller aufgrund von Studien, die eine teratogene Wirkung bei Versuchstieren nachwiesen, vom Markt genommen. Dennoch ist Cyhexatin ist in mehreren EU-Staaten noch zugelassen [120].

Analytik: Organo-Zinn-Pestizide werden in Deutschland im Rahmen der Lebensmittelüber-wachung nicht routinemäßig untersucht [124], da zu ihrer Bestimmung eine ge-sonderte Aufarbeitung und Derivatisierung erforderlich ist. Zur Beseitigung analytischen Defizite im Bereich der Pestizid-Rückstandsanalytik wurde vom BMG eine Liste von Substanzen zusammengestellt, für die schwerpunkt-mäßig analytische Methoden entwickelt werden sollen. In dieser Prioritätenliste stehen die Organo-Zinn-Pestizide Fentinacetat, Fentinhydroxid und Azocyclotin unter den ersten sechs und Fenbutatinoxid, Cyhexatin und Fentinchlorid unter den ersten 25 Stoffen mit größter Priorität [124]. Für die Spurenanalytik zinnhaltiger Pestizide sind in der Literatur verschiedene Analysenmethoden beschrieben worden. Diese Methoden lassen sich in zwei Gruppen einteilen. Bei den indirekten Bestimmungsverfahren werden die Organozinn-Verbindungen durch einen Aufschluß zerstört. Das freigesetzte Zinn wird z. B. polarographisch [94,95], über AAS [93] oder ICP/MS bestimmt. Für die Bestimmung der unzersetzten Pestizide werden in der Literatur u.a. flüssigkeitschromatographische, gaschromato-graphische und dünnschichtchromatographische Verfahren beschrieben. Für gaschromatographische Untersuchungen muß durch Alkylierung oder Hydrierung die Thermostabilität erhöht und die Siedetemperatur der Moleküle erniedrigt werden, da bei allen hier vorgestellten Verbindungen eine direkte gaschromatographische Analyse nicht möglich ist. Für eine Bestimmung mittels HPLC ist, bei Verwendung eines DAD-Detektors, ebenfalls eine Derivatisierung notwendig, weil nicht alle zinnhaltigen Pestizide ein Chromophor enthalten.

Abb.3.1.5-37: Strukturformeln der Organozinn-Pestizide



Organozinn-Pestizide

Sn

OH

Sn

O

CO CH3

Sn

NN

N

Cyhexatin(Tricyclohexylzinnhydroxid)

Sn

OH

Fentinhydroxid(Triphenylzinnhydroxid)

Fentinacetat(Triphenylzinnacetat)

Azocyclotin(Tri(cyclohexyl)-1-1H-1,2,4-triazol-1-yl-zinn)

Fenbutatinoxid(Bis[tris(2-methyl-2-phenylpropyl)zinn]oxid)

CH2

Sn

CH2

O

CH2

Sn

CH2

CH2 CH2



3.1.5.6.2 Extraktion mit SFE

Organozinn-Pestizide weisen eine geringe Polarität auf und werden bei den in der Literatur beschriebenen Analysenmethoden mit unpolaren Lösungsmitteln wie Hexan oder Dichlormethan extrahiert. Überkritisches Kohlendioxid bietet sich daher ebenfalls als Extraktionsmittel an. Es wurden Extraktionsversuche mit beiden zu Verfügung stehenden Extraktions-geräten durchgeführt. Die dabei verwendeten Bedingungen werden im folgenden aufgeführt: SFE-Parameter HP 7680T: • Extraktionsdruck: 329 bar, Temperatur: 55°C • Dichte: 0,89 g/ml • statische Extraktion: 2 min • dynamische Extraktion: 25 min • CO2-Fluß: 1,8 ml/min • Fallenmaterial: ODS, 10°C während der Extraktion • Elutionslösungsmittel: Hexan SFE-Parameter ISCO SFX 3560: • Extraktionsdruck: 330 bar, Temperatur: 55°C • Dichte: 0,89 g/ml • statische Extraktion: 2 min • dynamische Extraktion: 25 min • CO2-Fluß: 1,8 ml/min • Lösungsmittel in der Vorlage: 10 ml Hexan • Temperatur der Vorlage: 0°C

Während bei Verwendung des Gerätes der Fa. ISCO gute Wiederfindungen erzielt werden konnten (siehe unter Wiederfindungen) wurden bei Verwendung des HP-Extraktors, bei dem die Extrakte zunächst an einer Festphasenfalle gesammelt werden, niedrige und schwankende Ergebnisse erzielt. Wie aus den oben aufge-führten Bedingungen ersichtlich, wurde bei diesem Gerät zur Elution der Extrakte aus der Festphasenfalle in die Vorlagen, Hexan verwendet. Dies könnte auch die Ursache für die schlechten Wiederfindungen sein. Bei der SFE-Extraktion von Obst - und Gemüseproben gelangt, trotz der Verwendung von Adsorbentien stets eine gewisse Menge an Wasser bis zur Falle. Die Elution mit Hexan ist gestört, da dieses Lösungsmittel sich mit dem Wasser nicht mischt, so daß die präzipitierten Analyten vom Wasser abgeschirmt werden. Aus Zeitgründen konnte diese Problematik jedoch nicht weiter verfolgt werden.

3.1.5.6.3 Optimierung der Derivat isierung mit Grignard-Reagenz



Um die gaschromatographische Bestimmung der Organo-Zinn-Pestizide zu er-möglichen, müssen diese derivatisiert werden, wobei ein vierter organischer Rest am Zinnatom eingeführt wird (siehe Abb. 3.1.5-38). Abb. 3.1.5-38: Derivatisierung schematisch

R Sn

R

R

X R Sn

R

R

R'

R: Alkyl, Aryl; R’: Alkyl; X: Hydroxid, Acetat, Triazol

In der Literatur werden zur Derivatisierung der Organo-Zinn-Verbindungen ver-schiedene Möglichkeiten beschrieben. Eine Alkylierung am Zinnatom ist durch eine Umsetzung mit Tetraalkylborat möglich. Die Ethylierung mit Tetraethylborat wird in der Literatur zum Beispiel für die Umsetzung der Organozinn-Verbindungen aus Trinkwasser und Abwasser sowie aus Bodenproben beschrieben [97]. Die am häufigsten beschriebene Derivatisierungsmethode von Organozinn-Ver-bindungen ist die Umsetzung mit Grignard-Reagenzien [3,88,90,93,98], vgl. Abb. 3.1.5-39. Abb. 3.1.5-39: Umsetzung mit Grignard-Reagenz

R Sn

R

R

X R Sn

R

R

CH3CH3MgCl ++ MgClX

Dort beschriebenen Verfahren zur Derivatisierung mit Grignard-Reagenz sind allerdings etwas langwierig und daher für die Routineanalytik wenig attraktiv. Die Derivatisierung wird oft in aufwendigen Apparaturen unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Es folgt dann meist eine mehrmalige Ausschüttelung der Derivate aus dem Derivatisierungsansatz sowie in einigen Fällen eine Nachreinigung durch Säulenchromatographie. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine erheblich einfachere Variante dieser Deriva-tisierung ausgearbeitet.

Derivatisierungsreaktion: Bei Verwendung des ISCO-Gerätes werden die Extrakte in 20 ml Vorlagegläschen, in denen 10 ml Hexan vorgelegt wurde aufgefangen. Nach Beendigung der Extraktion



sind etwa 4-5 ml des Hexans noch im Vorlagegefäß vorhanden. Diese Lösung wird direkt zur Derivatisierung eingesetzt. Nach Zugabe von Internem Standard (PCB IUPAC Nr. 101) in Isooctan und der Grignard-Reagenz-Lösung wird der Ansatz 15 min unter Rühren (Magnetrührer) bei Raumtemperatur derivatisiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 15 %iger Ammoniumchlorid-Lösung gestoppt. Nach kräftigem Schütteln wird die obere organische Phase mit Stickstoff bis auf etwa 1,5 ml eingeengt, in ein GC-Vial überführt und zur GC-MSD-Bestimmung eingesetzt. Bei der Derivatisierung entstand neben dem Hauptderivat Triphenyl-methyl-zinn in geringen Mengen ein weiteres Produkt, das Diphenyl-dimethyl-zinn. Möglicherweise findet hier als Nebenreaktion eine Substitution des Phenyl-Restes durch einen Methyl-Rest statt. Auffällig war, daß mit der Zunahme der Bildung des Dimethyl-Derivates eine geringere Ausbeute an Methyl-Derivat einherging. Das Dimethyl-Derivat wird in Abb. 3.1.5-40 abgebildet: Abb. 3.1.5-40: Strukturformel von Diphenyl-dimethyl-zinn (unerwünschtes Nebenprodukt bei der Derivatisierung von Fentinacetat und -hydroxid)

Diphenyl-dimethyl-zinn

Sn CH3

CH3

Abb. 3.1.5-41 zeigt die Entstehung der Derivatisierungsprodukte aus den Organo-Zinn-Verbindungen.



Abb. 3.1.5-41: Entstehung der Derivatisierungsprodukte aus den Organo-Zinn- Verbindungen nach Umsetzung mit Grignard-Reagenz

Sn

OH

Fentinhydroxid

Sn

OH

Cyhexatin

Sn

O

COCH3

Fentinacetat

Azocyclotin

Sn

NN

NCH3

Sn

Fenbutatinoxid

CH2

Sn

CH2

O

CH2

Sn

CH2

CH2 CH2

CH3

CH2

CH2 CH2Sn

Tricyclohexyl-methyl-zinn

Tris(2-methyl-2-phenyl-propyl)-methyl-zinn

Bildung der Derivatisierungsprodukte


Sn

CH3



Wie erwähnt, enthalten SFE-Extrakte von Obst und Gemüseproben geringe Mengen an Wasser. Da Wasser mit Grignard-Reagenz reagieren kann, wurde überprüft, ob diese kleinen Wassermengen die Derivatisierung beeinflussen können. Darüber hinaus wurde die Reaktion in drei verschiedenen Reaktionsmedien durchgeführt und die Derivatisierungsausbeuten wurden verglichen: • Isooctan:Hexan 1:4 (IO:HEX), • Cyclohexan: Ethylacetat 1:1 (CH:EA), • tert.-Butyl-Methyl-Ether (TBME). In diesen Fällen wurden Extrakte aus 3 g Mango verwendet, die zuvor mit Natriumsulfat getrocknet wurden. Dotiert wurde kurz vor der Derivatisierung mit je 1 µg an Cyhexatin, Fentinhydroxid und Fenbutatinoxid. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden in Tab. 3.1.5-19 dargestellt. Tab. 3.1.5-19: Derivatisierungsausbeute der Organo-Zinn-Pestizide bei Variation

der Derivatisierungsparameter Verwendetes

Lösungsmittel Cyhexatin Fentin-

hydroxid Fentin Abbau**

TPME

1 1 1 auf 1 normiert

TPME* 0,99 0,96 1,36 *Wasser nicht entfernt

CH:EA 1:1

0,98 1,04 0,10

IO:HEX 1:4

0,91 0,88 1,87

** Zur Entstehung des Diphenyl-dimethyl-zinn-Derivates aus Fentinhydroxid siehe oben

Anmerkungen

Die Unterschiede in den Derivatisierungsausbeuten bei Verwendung verschiedener Lösungsmittel waren nur gering. Bei Derivatisierung in Cyclohexan-Ethylacetat wurde deutlich weniger unerwünschtes Diphenyl-dimethyl-zinn gebildet, als in den anderen Reaktionsmedien. Dieser Sachverhalt sollte noch weiter untersucht werden. Das in den Probenextrakten vorhandene Wasser störte die Derivatisierungsreaktion nicht.



3.1.5.6.4 Bestimmung mittels GC-MSD

Die Bestimmung der Derivate wurde mittels GC-MSD im EI-Modus durchgeführt. Es wurden die Meßbedingungen der im Anhang 1 aufgeführten SFE-Multimethode eingesetzt. Die Bestimmung der Organozinn-Verbindungen mittels GC/MSD bietet sich an, da diese charakteristische Isotopenmuster im Massenspektrum aufweisen. Das Element Zinn besitzt zehn Isotope, von denen 120Sn (natürliche Häufigkeit: 32,4 %), 118Sn (24,3 %) und 116Sn (14,7 %) am häufigsten vorkommen. Massenspektren zinnhaltiger Verbindungen zeigen daher ein charakteristisches Isotopenmuster. Abb. 3.1.5-42 verdeutlicht dies am Massenspektrum von Triphenyl-methyl-zinn, dem Derivat von Fentinhydroxid und Fentinacetat. Abb. 3.1.5-42: Massenspektrum von Triphenyl-methyl-zinn

100 150 200 250 300 350 4000

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

110000

120000

m/z-->


77

91

120

124154

169

197

210 251271

289

294 335

351

365

393 414434

118Sn+

3

120Sn+

3

116Sn+

3

Cyhexatin und Azocyclotin werden bei der Derivatisierung zu Tricyclohexyl-methyl-zinn umgesetzt (vgl. Abb. 3.1.5-41). In der Rückstands-HöchstmengenVO wird für beide Pestizide eine Summenhöchstmenge, berechnet als Cyhexatin, angegeben [34]. Ähnliches gilt auch für Fentinacetat und Fentinhydroxid, die beide zu Triphenyl-methyl-zinn umgesetzt werden. Hier besteht ebenfalls eine Summenhöchstmenge, berechnet als Fentinhydroxid [34].



Zur Bestimmung der Substanzen im SIM-Modus, wurden die in Tab 3.1.5-20 auf-geführten Quantifizierungs- und Identifizierungs-Ionen (Target- und Qualifier-Ionen) ausgewählt. Tab 3.1.5-20: Übersicht der Derivatisierungsprodukte, Retentionszeiten und

detektierten Massen im SIM-Modus

Organo-Zinn-Pestizid

Derivatisierungsprodukt Target-/

Qualifier-Ionen [m/z]

Retentions-zeit

[min]

Azocyclotin


301/

19,05

Cyhexatin 219

Fentinacetat

Triphenyl-methyl-zinn

351/

19,28

Fentinhydroxid

349; 347

Fenbutatinoxid

Tris(2-methyl-2-

phenylpropyl)-methyl-zinn

401/

399; 397

34,30

Unerwünschtes Nebenprodukt aus Fentinhydroxid und Fentinacetat

Diphenyl-

zinn-dihydroxid

Diphenyl-dimethyl-zinn

289/

287; 285

13,22

299;



Abb.3.1.5-43: Massenspektren der Derivatisierungsprodukte zinnhaltiger Pestizide

Tricyclohexyl-methyl-zinn aus Cyhexatin und Azocyclotin

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 3800100002000030000400005000060000700008000090000

100000110000120000130000140000

m/z-->

Abundance (19.016 min)

67

83

116

135137

159 175

203

219

249251 287

301

307 327 355365 384

Triphenyl-methyl-zinn aus Fentinhydroxid und Fentinacetat

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 3800100002000030000400005000060000700008000090000

100000110000120000130000140000150000

m/z-->


7791

120

124 154169

197

201

221 247 273

289

293 318

349

351

373 405

Tris(2-methyl-2-phenyl-propyl)-methyl-zinn aus Fenbutatinoxid

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 40005000

10000150002000025000300003500040000450005000055000600006500070000750008000085000

m/z-->


77

91

117 135

145 161

197

201 227 253281

289

303 341345369

401

405



Kalibrierung

Zur Erstellung von Kalibrierungen wurden folgende Standardlösungen angefertigt: • Azocyclotin/Fentinacetat-Standardgemisch • Cyhexatin/Fentinhydroxid/Fenbutatinoxid-Standardgemisch. Bei der Zusammenstellung der Standardlösungen wurde beachtet, daß Verbin-dungen, die das gleiche Derivat ergeben, nicht zusammen vorkommen. Während die Kalibrierkurven der Derivate von Cyhexatin und Azocyclotin eine sehr gute Linearität aufwiesen, war bei Fentinhydroxyd/-acetat und bei Fenbutatinoxid bei Abwesenheit von Matrixbestandteilen die Linearität schlecht. Dies deutet auf eine Zersetzung dieser Substanzen im Injektionssystem hin. Dagegen zeigte sich bei Anwesenheit von Matrixbestandteilen in den Meßlösungen ein linearer Verlauf der Kalibrierkurven, was auf Matrixeffekte hindeutet (vgl. Kap. 3.1.2.3). Um den Einfluß verschiedener Matrizes auf die Derivatisierungsausbeute und die Steigung der Kalibriergeraden zu untersuchen, wurden Extrakte verschiedener Matrizes (Petersilie, Mango, Zitrone), mit unterschiedlichen Mengen an Organo-Zinn-Pestiziden dotiert und derivatisiert. Dabei wurde festgestellt, daß die Art der Matrix keinen nennenswerten Einfluß auf die Steigung der Kalibriergeraden hatte.

3.1.5.6.5 Bestimmung mittels LC-MSD (API-Elektrospray)

Für die Bestimmung der Organo-Zinn-Pestizide mittels LC-MSD ist keine Derivati-sierung erforderlich. Erste Messungen wurden mit einem HP 1100 series MSD-Gerät im Elektospray-Modus (Fragmentorspannung 80V) durchgeführt. Hierbei wurden die Verbindungen mittels LC aufgetrennt und Massenspektren für die einzelnen Verbindungen aufgenommen. Es wurde festgestellt, daß nicht das protonierte Molekülion als Hauptmasse im Massenspektrum auftritt, sondern die Triphenyl-/Trialkyl-Zinn-Kationen. Mögliche Mechanismen, die zur Entstehung dieser Hauptfragmentionen bei Cyhexatin, Azocyclotin, Fentinhydroxid und Fentinacetat führen, werden in Abb. 3.1.5-44 dargestellt.



Abb. 3.1.5-44: Entstehung der Hauptfragmentionen aus Fentin, Fentinacetat, Azocyclotin und Cyhexatin.

Fentinacetat

Azozyclotin

Sn

OH

Fentinhydroxid

Sn

OH H

+H

+H

O

Sn

COCH3

O

Sn

COCH3

H

H2O

H2O

Cyhexatin

NN

N

Sn +H

NN

N

Sn

H

N

NNH

Sn

Tricyclohexylzinnkation (Hauptfragmention)

Sn

OH

Sn

OH H

+H

Triphenylzinnkation(Hauptfragmention)

Sn

CH3COOH

m/z 369

m/z 351

Anmerkung: Die angegebenen Massen beziehen sich auf das 120Sn-Isotop



Bei der Fragmentierung von Cyhexatin und Azocyclotin im MSD entsteht nach Ab-spaltung von Cyclohexen und Wasser ein weiteres Fragmention mit hoher Intensität (siehe Abb. 3.1.5-45) . Abb. 3.1.5-45: Abspaltung von Cyclohexen aus Cyhexatin und Azocyclotin (Vorschlag)

Cyhexatin

H

H

Sn

HHO

Azocyclotin

H

Sn

HN

NNN NH

NOH H

Fragmentionm/z 287

Sn H

Die Entwicklung einer vollständigen Bestimmungsmethode war leider nicht möglich, da alle Messungen bei der Fa. HP in Waldbronn erfolgten. Die bisherigen Erfahrungen zeigen jedoch, daß diese Bestimmungsmethode für Organo-Zinn-Verbindungen gut geeignet ist. Sie ist nicht nur schnell in der Durchführung, sondern erlaubt auch prinzipiell die Erfassung von Azocyclotin und Cyhexatin sowie von Fentinhydroxid und Fentinacetet nebeneinander. Die Untersuchungen sollten daher fortgeführt werden.

3.1.5.6.6 Wiederf indungsversuche

Zur Ermittlung der Wiederfindungsraten wurde Apfelmus mit je 0,166 ppm sowie 1,11 ppm der Organo-Zinn-Pestizide dotiert, mit SFE extrahiert und nach Derivatisierung mittels GC-MSD bestimmt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden in Tab. 3.1.5-21 aufgeführt. Leider konnten Wiederfindungen mit dem LC-MSD-System als Bestimmungs- verfahren nicht mehr durchgeführt werden. Tab. 3.1.5-21: Wiederfindungen der Organozinn-Pestizide,

dotierte Probe: Apfelmus, dotierte Menge: je 0,166 ppm und 1,11 ppm, (n=4)

Organozinn- Pestizide

Dotierung 0,166 ppm

Dotierung 1,11 ppm

Mittlere Wiederfindungen in % Azocyclotin 83 Fentinacetat 76 (9) 69 Cyhexatin 73 (6) 71

77 (8) 73 Fenbutatinoxid 75 (6) 71 Anmerkung: In Klammern sind die Wiederfindungen, die bei einer Nachextraktion der Probe unter den gleichen Bedingungen erzielt wurden, aufgeführt

73 (10)

Fentinhydroxid

Angesichts der relativ hohen Wiederfindungen bei der zweiten Extraktion (Nachextraktion), erscheint es notwendig und möglich die Extraktionsbedingungen zu optimieren, so daß noch bessere Wiederfindungen erzielt werden können.



Da Organo-Zinn-Verbindungen bekanntermaßen oxidationsempfindlich sind, könnten bei weiterführenden Untersuchungen, zu ihrem Schutz, Antioxidantien wie Ascorbinsäure eingesetzt werden.



3.1 .6 Beispie le aus der Praxis der Lebensmit te lüberwachung

3.1.6 .1 Best immung von Pyr imethani l und Diethofencarb in

Kel ter t rauben

Bei einem Feldversuch im Weinbau wurden Pyrimethanil und Diethofencarb sowie Carbendazim zur Überprüfung ihrer Wirksamkeit bei der Bekämpfung von Botrytis cinerea eingesetzt. Verschiedene Traubenproben wurden der CVUA Stuttgart zur Bestimmung der Wirkstoffgehalte zum Zeitpunkt der Lese vorgelegt (vgl. Kap. 3.1.5.3.2.6). Pyrimethanil und Diethofencarb sind erst in den letzten Jahren auf den Markt ge-kommen. In den Wirkstofflisten der gängigen DFG-Multi-Methoden für Pestizide waren sie noch nicht aufgeführt. Für Pyrimethanil war in der RHmV zu diesem Zeitpunkt noch keine Höchstmenge festgesetzt worden. Abb. 3.1.6-1: Strukturformeln von Pyrimethanil und Diethofencarb

C2H5O

C2H5O NH O

O

CCH

CH3

CH3

Diethofencarb

N

N

CH3

CH3N

H

Pyrimethanil Wiederfindungsversuche mit dotierten Traubenproben zeigten, daß diese Stoffe sich sehr gut mittels SFE extrahieren lassen. Eine Änderung des pH-Wertes von ∼3 auf ∼6,5 und ∼8,5 zeigte im Gegensatz zu Carbendazim (siehe Kap. 3.1.5.3.2.6) keinen Einfluß auf die Extraktionsausbeuten (siehe Tab. 3.1.6-1). Die Carbamatgruppe des Diethofencarb zeigt sich im Alkalischen stabil. Die Basizität der drei Stickstoffatome des Pyrimethanil ist relativ schwach, so daß bei einem pH von ∼3 nur ein kleiner Anteil protoniert vorliegt. Tab. 3.1.6-1: Wiederfindungsversuche für die Stoffe Pyrimethanil und

Diethofencarb, je 0,33 ppm Stoffe Wiederfindungen in % Mittelwert pH∼3

(natürlicher pH)pH∼6,5 pH∼8,5

Pyrimethanil 100 106 103 103 Diethofencarb 99 99 98 99 SFE-Bestimmungsmethode: siehe Anlage1 Probe: tiefgefroren zerkleinerte Weintrauben, Probenmenge 3 g / Hydromatrix 2 g Bestimmung: mittels GC/MSD Die ermittelten Wirkstoffgehalte, die die untersuchten Weintrauben und die daraus hergestellten Weine aufwiesen, werden in Tab. 3.1.6-2 dargestellt.



Tab. 3.1.6-2: Untersuchungsergebnisse von Keltertrauben aus einem Feldversuch Probennummer Pyrimethanil

Diethofencarb

Trauben Wein

(ppm) Trauben (ppm)

Wein (ppm)

unbehandelt Probe 1 0,05 < 0,005 0,024 <0,01 < 0,005 <0,005 Probe 3 0,004 <0,05 behandelt Probe 4 0,056 0,007 mit Probe 5 0,04 0,01 0,015 <0,01 Botrylon 0,016 0,039

0,005 mit Botrylon Probe 8 0,55 0,1 0,011 <0,01 und Scala Probe 9 1,13 <0,005 SFE-Bestimmungsmethode: siehe Anlage 1 Probe: tiefgefroren zerkleinerte Weintrauben, Probenmenge 3 g, Hydromatrix 2 g Bestimmung: mittels GC/MSD

(ppm)

Probe 2

Probe 6 behandelt Probe 7 0,85

Die Gehalte in unbehandelten Proben sind auf Verwehungen und Verschleppungen zurückzuführen.



3.1.6 .2 Untersuchung von Carbendazim in Obst und Gemüse

Da die in der Literatur beschriebenen Analysenverfahren für Benomyl, Thiophanat-Methyl und Carbendazim zeitaufwendig und arbeitsintensiv sind, werden diese Verbindungen kaum routinemäßig bestimmt. Mit Hilfe der in Anlage 2 aufgeführten Methode lassen sie sich jedoch problemlos und schnell bestimmen. Die Untersuchung von über 250 Obst- und Gemüseproben aus dem Handel zeigt, daß diese Verbindungen in der Landwirtschaft sehr häufig eingesetzt werden und daß durchaus Überschreitungen der Höchstmengen auftreten (siehe Tab. 3.1.6-3 sowie Abb. 3.1.6-2). Tab. 3.1.6-3: Carbendazim* Rückstände in Proben aus dem Handel (1997) Proben-

zahl Proben mit

Rückständen Höchst-menge

[34]

>Höchst-menge

Gehalt in mg/kg

Salate 131 21 (16%) 1,0 2 <0,01-11 Steinfrüchte 20 10 (50%) 0,1 2 <0,01-0,3 Mangos 15 6 (40%) 2 <0,01-0,8 Papayas 10 3 (30%) 0,1 1 0,04-0,48 Champignons 15 6 (40%) 1,0 - <0,01-0,13 Zitrusfrüchte 24 10 (42%) 5,0 - <0,01-0,12 Erdbeeren 46 22 (48%) 1,5 - <0,01-0,8 * Summe Benomyl, Thiophanat-Methyl und Carbendazim

0,1



Abb. 3.1.6-2: Carbendazim Rückstände in Proben aus dem Handel (1997)

< HM: 15% > HM: 2%

Salat (131)

max. 11 ppm

Steinobst (20) < HM: 40% > HM: 10%

Erdbeeren (46)

< HM: 48% > HM: 0%

< HM: 42% > HM: 0%

Zitrusfrüchte (24)

< HM: 24% > HM: 12%

Papayas und Mangos (25)



Abb. 3.1.6-3 zeigt einen Vergleich der beim CVUA Stuttgart gefundenen Pestizid-Rückstände in Obst in den letzten vier Jahren. Aufgeführt sind jeweils die 15 am häufigsten quantifizierten Pestizide. Die starke Zunahme der Carbendazim-Befunde im Jahr 1997 ist auf die Einführung der hier vorgestellten Analytik für Routine-zwecke zurückzuführen. Ähnliches gilt auch für die Verbindung 2,4-D im Jahr 1996.

Abb. 3.1.6.-3: Pestizid-Rückstände in Obst in den letzten vier Jahren (CVUA-Stuttgart)

0 5 10 15 20 25

ProcymidonThiabendazol

Chlorpyrifos

Imazalil

BrompropylatVinclozolin

Dichlofluanid

Dicofo l

Endosulfan

o-Phenyl-PhenolCaptan

Tetradifon

M ethidathion

Iprodion2,4-D

0 5 10 15 20 25 30

CarbendazimProcymidon

Chlorpyriphos

Dichlofluanid

ImazalilThiabendazol

Brompropylat

Pyrimethanil

o-Phenyl-Phenol

EndosulfanVinclozolin

Iprodion

Captan

ProchlorazDicofo l

0 5 10 15 20 25 30

VinclozolinProcymidon

Chlorpyrifos

Endosulfan

TetradifonDichlofluanid

Brompropylat

Dicofo l

Thiabendazol

ProchlorazM ethidathion

Iprodion

Parathion

M ecarbamCaptan

0 5 10 15 20 25

Vinclozolin

Dicofo l

EndosulfanBrompropylat

Tetradifon

Chlorpyrifos

Procymidon

M ethidathionThiabendazol

Dichlo fluanid

Iprodion

Azinphos-M ethylCarbendazim

Parathion

o-Phenyl-Phenol

376 Proben 77 % mit Rückständen 73 versch. Pestizide 2,8 Wirkstoffe/Probe 8,2 % der Proben >HM

% der Proben


% der Proben

% der Proben % der Proben



1996 1997

1995 1994



3.1.6 .3 Untersuchung von 2,4-D in Z i t rus f rüchten

Da die herkömmlichen Verfahren zur Bestimmung von 2,4-D relativ arbeitsaufwendig sind, wird diese Verbindung nur äußerst selten untersucht. Deshalb liegen nur wenige Daten über die Häufigkeit und Höhe von 2,4-D-Rückständen in Zitrusfrüchten vor. Mit der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten SFE-Methode (Anlage 3, Code 102E3102) wurden deshalb 140 Zitrusproben aus verschiedenen Herkunftsländern untersucht. Die Ergebnisse sind in Tab. 3.1.6-4 dargestellt. In Proben aus Mittelmeerländern wurden bei dieser Untersuchung selten Rückstände an 2,4-D nachgewiesen. Dagegen wiesen nahezu alle Proben aus Süd- und Mittelamerika und aus Südafrika 2,4-D-Rückstände auf. Der höchste Befund wurde in einer Probe aus Simbabwe mit 1,6 ppm festgestellt. Die Höchstmenge von 2 ppm wurde jedoch in keinem Fall überschritten. Tab. 3.1.6-4: Rückstände an 2,4-D in Proben des Handels (1996 und 1997) Herkunft

Anzahl Proben

Proben mit Rückständen

Gehalt in mg/kg

Südafrika und Simbabwe 23 16 (70 %) Süd- und Mittelamerika 12 11 (92 %) Mittelmeerländer 83 7 (8 %)

0,01-1,6 0,01-0,38 0,01-0,29



3.1 .7 Untersuchung von Ringversuchsproben

3.1.7 .1 European Commiss ion´s Prof ic iency Tests on Pest ic ide

Res idues in F ru i t and Vegetables 1996/1997

Das CVUA Stuttgart hat Anfang 1997 an einem Ringversuch der Europäischen Kommission (European Commission´s Proficiency Tests on Pesticide Residues in Fruit and Vegetables 1996/1997, Proficiency Test I und II) teilgenommen.

Acephat, Benalaxyl, Binapacryl, Bromophos-Ethyl, Captafol, Chlorthalonil, Chlorpyrifos, Chlorpyrifos-Methyl, Cyfluthrin, Cypermethrin, DDT, Deltamethrin, Diazinon, Dioxathion, Endosulfan, Endrin, Fenarimol, Fenchlorphos, Fenvalerat, Heptachlor, Iprodion, Lambda-Cyhalothrin, Mecarbam, Metalaxyl, Methamidophos, Methidathion, Permethrin, Pirimiphos-Methyl, Procymidon, Propoxur, Propyzamid, TEPP und Triazophos.

3.1.7.1.1 Proficiency Test I

Eine dotierte Probe Gemüsepaprika sollte auf folgende Stoffe untersucht werden:

Daneben sollten für die positiven Stoffe Wiederfindungen aus einer dotierten Blindprobe ermittelt werden. Die Kalibrierung sollte entweder mit Standards in Lösungsmittel oder mit Standards in Matrixextrakt erfolgen. Für die Bestimmung wurden folgende Methoden eingesetzt: 1) DFG S19 (modifiziert, ohne Mini-Kieselgelsäulen) 2) SFE Methode (siehe Anlage 1, Code: 100E3101) Folgende Substanzen wurden identifiziert: Diazinon, Chlorpyrifos, Procymidon, Endosulfan, Cypermethrin. Tab. 3.1.6-5 zeigt die nach beiden Methoden ermittelten Wiederfindungen. Zur Herstellung der Kalibrierlösungen wurden Extrakte der Blindprobe mit Standards versetzt (Eichung auf Matrix).



Tab. 3.1.7-1: Wiederfindungen von Wirkstoffen aus Paprika.

Diazinon Chlorpyrifos Procymidon Cypermethrin α- β- -sulfat Wiederfindung in %

SFE-Methode: 3g Probe + 2g Hydromatrix, Zusatz: 0,8µg/3g (0,267 ppm) Ansatz 1 106 96 73 109 102 105 101 Ansatz 2 101 99 105 107 104 104 83 Ansatz 3 88 91 105 103 98 83 83

95 90 100 104 87 84 Ansatz 5 84 87 92 92 92 80 82 Mittelwert

92 102 102 99 81

Variations-koeff. in %

9,7 5,2 6,4 5,5 5,3 12,1 5,6

SFE-Methode: 2g Probe + 2g Hydromatrix, Zusatz: 0,8 µg/2g (0,4 ppm) Ansatz 1 100 102 105 100 103 97 87

93 105 107 107 103 75 Ansatz 3 100 106 104102 106 88 91 Ansatz 4 86 81 98 99 97 98 105

97 101 105 105 76 93 Mittelwert

95 104 102 102 81 97

Variations-koeff. in %

6,4 2,6 2,9 4,2 2,4 7,4 5,6

Methode DFG S19: Zusatz 0,32 ppm Mittelwert

85 88 97

SFE-Bestimmungsmethode: siehe Anlage 1 Probe: tiefgefroren zerkleinerte Paprika Dotierung: auf 3g bzw. 2g Probe je 100µl Standardlösung (Aceton: Isooctan 1:1)

Endosulfan

Ansatz 4 97

95 91

Ansatz 2 98

Ansatz 5 100101

95 91

Bestimmung: mittels GC/MSD Wie aus Tab. 3.1.7-1 ersichtlich wurden sowohl mit der DFG S19 als auch den SFE-Methoden für alle Stoffe hohe Wiederfindungen erzielt. Auffällig ist, daß die Wiederfindung von Cypermethrin bei einem Probe/ Hydromatrix Verhältnis von 3:2 mit 81 % deutlich niedriger lag als bei einem Verhältnis von 2:2 (97 %) (siehe Tab. 3.1.7-1). Es besteht hier ein Zusammenhang zwischen dem Wasser/Hydromatrix-Verhältnis in der Probe (Feuchtigkeitsgrad) und der Extrahierbarkeit von Cypermethrin (vgl. Kap. 3.1.4.7.3). In Tab. 3.1.7-2 werden die nach der SFE-Methode (Anlage 1) und der DFG-S-19-Methode ermittelten Gehalte mit den Angaben der Organisatoren des Ringversuches verglichen. Tab. 3.1.7-2: Gegenüberstellung der ermittelten Gehalte der SFE-Methode und der DFG S19 mit den Ergebnisangaben der Organisatoren



SFE-Methode

DFG S19 (modifiziert)

Angaben der Organisatoren

Mittelwert Mittelwert („korrigiert*“)

kleinster angegebener

Wert Gehalte in ppm

Diazinon 0,39 (0,41) 0,37 (0,44) 0,312 0,170 0,74 (0,80) 0,72 (0,82) 0,681 0,370 0,942

Procymidon 0,75 (0,74) 0,76 (0,78) 0,644 0,993 0,315 Σ-Endosulfan 0,47 (0,47) 0,48 (0,51) 0,391 0,195 0,650 Cypermethrin 0,34 (0,37) 0,330 0,042 SFE-Bestimmungsmethode: Anlage 1 Probe: tiefgefroren zerkleinerte Paprika, 3g Probe + 2g Hydromatrix Bestimmung: mittels GC/MSD * bei Berücksichtigung der Wiederfindungen

(„korrigiert*“) Median aller 85

Teilnehmer

höchster angegebener

Wert

0,460 Chlorpyrifos

0,29 (0,36) 0,695

3.1.7.1.2 Proficiency Test I I

Eine dotierte Probe Apfel sollte auf folgende Stoffe untersucht werden:

Acephat, Benalaxyl, Binapacryl, Bromophos-Ethyl, Captafol, Carbendazim, Carbofuran, Chlorthalonil, Chlorpyrifos, Chlorpyrifos-Methyl, Cyfluthrin, Cypermethrin, DDT, Deltamethrin, Diazinon, Dicofol, Dioxathion, Disulfoton, Endosulfan, Endrin, Fenarimol, Fenchlorphos, Fenvalerat, Heptachlor, Imazalil, Iprodion, Lambda-Cyhalothrin, Mecarbam, Metalaxyl, Methamidophos, Methidathion, Permethrin, Pirimiphos-Methyl, Procymidon, Propiconazol, Propoxur, Propyzamid, TEPP, Thiabendazol, Triazophos und Vinclozolin.

Für die Bestimmung wurden die in Anlage 1 und Anlage 2 aufgeführten Methoden verwendet. Auch hier wurden für die positiven Stoffe Wiederfindungsversuche durchgeführt (siehe Tab. 3.1.7-3) und zur Herstellung der Kalibrierlösungen Extrakte der Blindprobe mit Standards versetzt (Eichung auf Matrix). Folgende Substanzen wurden identifiziert: Diazinon, p,p-Dichlorbenzophenon, Thiabendazol, Methidathion, Iprodion und Carbendazim. Tab. 3.1.7-3 zeigt die ermittelten Wiederfindungen (Carbendazim siehe Kap. 3.1.5.3.2.5).



Tab. 3.1.7-3: Wiederfindungen von Wirkstoffen aus Paprika.

Diazinon p,p´-Dichlor-benzophenon*

Methidathion Iprodion

Wiederfindung in % Ansatz 1 94 92 90 87 Ansatz 2 93 89 88 86 Ansatz 3 100 93 89 87 Ansatz 4 104 94 88 87 Ansatz 5 98 94 87 87 Mittelwert 98 88 87

SFE-Bestimmungsmethoden: Anlage 1 Probe: tiefgefroren zerkleinerte Paprika 3g Probe + 2g Hydromatrix, Zusatz: 2µg/3g (0,267 ppm) Bestimmung: mittels GC/MSD *Abbauprodukt von Dicofol

92

In Tab. 3.1.7-4 werden die nach den SFE-Methoden (Anlage 1 und 2) ermittelten Gehalte mit den Angaben der Organisatoren des Ringversuches verglichen.

Tab. 3.1.7-4: Vergleich der mittels SFE-Methode ermittelten Gehalte mit den Angaben der Organisatoren

Wirkstoff Ansatz 1 Ansatz 2 Mittel-wert

Spiking level

Mittelwert aller

Teilnehmer mg/kg mg/kg mg/kg

Carbendazim 0,58 0,74 0,66 0,653 0,507 0,211 0,214 0,21 0,243 0,197

p,p´-Dichlorbenzophenon* 0,331 0,345 0,34 0,373 keine AngabeMethidathion 0,232 0,237 0,23 0,253 0,246 Iprodion 1,20 1,25 1,22 1,38 1,222 Thiabendazol 1,00 0,943 0,97 1,11 0,825 SFE-Bestimmungsmethoden: Anlage 1 und Anlage 2 Probe: tiefgefroren zerkleinerte Paprika 3g Probe + 2g Hydromatrix Bestimmung: mittels GC/MSD *Abbauprodukt von Dicofol

Diazinon



3.2 EINSATZ DER SFE IN DER ANALYTIK VON BEDARFSGEGENSTÄNDEN

3.2 .1 E in le i tung Zu den Bedarfsgegenstände im Sinne des LMBG werden unter anderem gezählt: • „Gegenstände, die dazu bestimmt sind, bei dem Herstellen, Behandeln, Inver-

kehrbringen oder dem Verzehr von Lebensmitteln verwendet zu werden und dabei mit den Lebensmitteln in Berührung zu kommen oder auf diese einzuwirken“ (Lebensmittelbedarfsgegenstände) wie z.B. Lebensmittelverpackungen, Geschirr,

• „Spielwaren und Scherzartikel“, • „Gegenstände, die dazu bestimmt sind, nicht nur vorübergehend mit dem

menschlichen Körper in Berührung zu kommen...“, wie Kleidung, Bettwäsche. In Bedarfsgegenständen können Stoffe enthalten sein, die, bei einem Kontakt, ggf. auf Lebensmittel oder Menschen übergehen (migrieren) können. Nach §31 LMBG ist es verboten: „...Gegenstände als Bedarfsgegenstände... so zu verwenden oder für solche Verwendungszwecke in den Verkehr zu bringen, daß von ihnen Stoffe auf Lebensmittel oder deren Oberfläche übergehen, ausgenommen gesundheitlich, geruchlich und geschmacklich unbedenkliche Anteile, die technisch unvermeidbar sind“. In der Bedarfsgegenständeverordnung werden deshalb u.a. umfangreiche Positiv-listen von Stoffen aufgeführt, die die Zusammensetzung und Migration von Lebensmittelbedarfsgegenständen regeln. Aufgabe der Lebensmittelüberwachung ist es, die Einhaltung der Vorschriften hinsichtlich der Zusammensetzung der Bedarfsgegenstände und des Migrationsverhaltens der Inhaltsstoffe zu überwachen. Auf den ersten Blick erscheinen viele Bedarfsgegenstände gut für Extraktionen mit überkritischem Kohlendioxid geeignet zu sein. Sie enthalten meist wenig oder kein Wasser oder Fett, Inhaltsstoffe, die bei der SFE im allgemeinen Probleme bereiten können (vgl. Kap. 2.3.3). Allerdings bereitet bei vielen Bedarfsgegenständen, z.B. bei Kunststoffen, die Zerkleinerung Schwierigkeiten. Da bei der SFE nur wenig Proben-material zur Extraktion eingesetzt werden kann, ist hier auf eine besonders gute Homogenität zu achten. Dies ist aber nicht immer einfach, da z.B. bei der Zerkleinerung von Kunststoffen viel Wärme entsteht und Verluste an Inhaltsstoffen auftreten können. Darüber hinaus ist es bekanntermaßen meist nicht möglich, die z.B. bei Kunststoffen eingebetteten Inhaltsstoffe durch Dotierungen im Labor zu simulieren. Daher ist bei reellen Proben eine Abschätzung der Extraktionsausbeuten von Inhaltsstoffen sehr schwer. Im folgenden werden einige Anwendungen vorgestellt, bei denen die SFE zur Extraktion von Inhaltsstoffen in Bedarfsgegenständen erfolgreich eingesetzt werden kann.



3.2 .2 Di - Isopropyl -Naphthal in in Papier

3.2.2 .1 E in führung

Di-Isopropyl-Naphthalin (DIPN) wird als Isomerengemisch u.a. bei der Herstellung von Durchschreibepapieren und Thermopapieren als Farblösungsmittel und Farb-träger verwendet. Die allgemeine Strukturformel der DIPN-Isomere ist in Abb. 3.2.2-1 dargestellt [117]. Abb. 3.2.2-1: Strukturformel von Di-Isopropyl-Naphthalin

Di-Isopropyl-Naphthalin (Isomerengemisch)

Da beim Recycling von Altpapier alle Prozesse in wäßrigen Medien ablaufen, wird DIPN wegen seiner stark lipophilen Eigenschaften nur schwer abgetrennt und ge-langt somit in Recyclingpapiere und Recyclingkartonagen. Aus Sicht der Lebens-mittelüberwachung ist es interessant DIPN zu analysieren, da Verpackungs-materialien oft zu einem großen Anteil aus Altpapier hergestellt werden. Kommen diese Papiere in Kontakt mit Lebensmitteln, so kann es durch Migrationen, zu einer Kontamination kommen [118].

3.2.2 .2 Best immungsver fahren

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode zur Bestimmung von DIPN-Rück-ständen in Papier entwickelt. Nach einer Extraktion mit überkritischem Kohlendioxid wurde das DIPN Isomerengemisch mittels GC/MSD gemessen. Erzielte Ergebnisse wurden mit denen eines naßchemischen Verfahrens verglichen.

3.2.2.2.1 naßchemisches Verfahren

Im Rahmen einer Praktikantenarbeit am CVUA Stuttgart wurde ein Verfahren zur Bestimmung von DIPN in Papieren und Lebensmitteln ausgearbeitet, bei dem das Isomerengemisch mit Hilfe einer Wasserdampfdestillation nach Clevenger aus dem Papier in eine Isooctan-Vorlage getrieben wird [115]. Die Messung erfolgt fluori-metrisch nach flüssigkeitschromatographischer Auftrennung. Die einzelnen DIPN-Isomere konnten flüssigkeitschromatographisch nicht aufgetrennt werden und wurden daher als Summe erfaßt.

3.2.2.2.2 Extraktion mittels SFE



Es wurden Extraktionen mit beiden zur Verfügung stehenden Extraktoren durch-geführt. Die zu extrahierenden Papierproben wurden in kleine Streifen geschnitten und in die Extraktionshülsen gefüllt (meist 0,8 bis 1,2 g) und extrahiert. Extraktion mit HP-7680T: Zur Ermittlung der Wiederfindungsrate wurde ein zuvor mit Ether extrahiertes Filterpapier verwendet. Je 1 g Filterpapier wurde in drei Extraktionshülsen gefüllt und mit jeweils 5 µg DIPN in acetonischer Lösung versetzt. Vor der Extraktion wurde die Hülse für ca. 1 min offen stehen gelassen, damit das Lösungsmittel verdampfen konnte. Die Extraktion erfolgte nach den unten aufgeführten Bedingungen und die Bestimmung wurde mittels GC-MSD durchgeführt. Dabei wurde eine mittlere Wiederfindung von 98% (n=3) ermittelt. SFE-Parameter für HP 7680T: • Extraktionsdruck: 329 bar, Temperatur: 55°C • Dichte: 0,89 g/ml • statische Extraktion: 2 min • dynamische Extraktion: 25 min • CO2-Fluß: 1,8 ml/min • Fallenmaterial: ODS, 5°C während der Extraktion • Elutions-Lösungsmittel: Acetonitril Extraktion mit ISCO SFX 3560: Bei Extraktionsversuchen mit dem ISCO Gerät wurde zunächst zum Auffangen der Extrakte Acetonitril/Aceton 1:4 bei einer Temperatur von 10°C vorgelegt. Es wurde jedoch beobachtet, daß es mit steigender Extraktionszeit zu Verlusten an DIPN durch Verflüchtigung kam. Daraufhin wurde das unpolare Isooctan als Vorlagelösungsmittel verwendet und die Temperatur wurde während der Extraktion bei 0°C gehalten. Zur Überprüfung ob unter diesen Bedingungen Verluste auftreten, wurden vier Vorlagegläschen in denen Isooctan vorgelegt wurde mit je 10 µg DIPN versetzt und für 5, 10, 20, 30 min eine Extraktion simuliert. Selbst nach 30minütiger „Extraktionszeit“ waren praktisch keine Verluste festzustellen. SFE-Parameter für ISCO SFX 3560: • Extraktionsdruck: 330 bar, Temperatur: 55°C • Dichte: 0,89 g/ml • statische Extraktion: 2 min • dynamische Extraktion: 25 min • CO2-Fluß: 1,8 ml/min • Lösungsmittel in der Vorlage: 10 ml Isooctan • Temperatur der Vorlage: 0°C

3.2.2.2.3 Bestimmung mittels GC/MSD

Die nach der SFE erhaltenen Extrakte wurden direkt ohne jegliche Nachreinigung mittels GC/MSD gemessen. In Abb. 3.2.2-2 sind die SIM-Chromatogramme (m/z 155



und 197) einer DIPN-Standardlösung dargestellt. Es wird ersichtlich, daß das Isomerengemisch durch die Gaschromatographie zu einer Vielzahl von Peaks aufgetrennt wird, die man im wesentlichen in zwei Hauptgruppen unterteilen kann. Gruppe 1: Retentionszeit-Fenster 17 -17,60 min (leichterflüchtigere Isomere) Gruppe 2: Retentionszeit-Fenster 17,60-18,30 min (schwererflüchtigere Isomere). Abb. 3.2.2-2: SIM-Chromatogramme von DIPN-Standardlösung (m/z 155, 197)

17.00 17.10 17.20 17.30 17.40 17.50 17.60 17.70 17.80 17.90 18.00 18.100

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

55000

60000

65000

70000

75000

80000

Time-->


17.82

17.00 17.10 17.20 17.30 17.40 17.50 17.60 17.70 17.80 17.90 18.000

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

220000

Time-->


17.83

Anmerkung: Die Unterschiede im Peakmuster der beiden SIM-Chromatogramme sind auf die Unterschiede in den Massenspektren der einzelnen DIPN Isomere zurückzuführen (Fragmentierungsunterschiede). Abb. 3.2.2-3: SIM-Chromatogramme von DIPN aus Papierextrakt (m/z 155, 197)

17.00 17.10 17.20 17.30 17.40 17.50 17.60 17.70 17.80 17.90 18.00 18.100

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

Time-->


17.83

17.00 17.10 17.20 17.30 17.40 17.50 17.60 17.70 17.80 17.90 18.000

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

110000

120000

130000

140000

150000

160000

170000

180000

Time-->


17.83

m/z 155 m/z 197

Gr. 2 Gr. 2 Gr. 1

Gr. 1

Anmerkung: Die Unterschiede im Peakmuster der beiden SIM-Chromatogramme sind auf die Unterschiede in den Massenspektren der einzelnen DIPN Isomere zurückzuführen (Fragmentierungsunterschiede).

m/z 155 m/z 197

Gr. 2

Gr. 1

Gr. 1

Gr. 2



Tab. 3.2.2-1: Verhältnisse der Peakflächen der Gruppe 2 zu Gruppe 1 bei 2 SIM-Massen (m/z 155, 197)

m/z Standardlösung Papierextrakt Gruppe 1 Gruppe 2 Verhältnis Gruppe 1 Gruppe 2 Verhältnis Fläche Fläche Gr. 1/Gr. 2155

3560 7240 0,49 5850 14120 0,41

197

7570 18990 0,40 12410 36860 0,34

Gr. 1/Gr. 2

Bei ersten Extraktionsversuchen von Papierproben wurde festgestellt, daß es Unterschiede in den Peakmustern zwischen dem aus Proben extrahierten DIPN-isomerengemisch und dem verwendetem Standard gab (vgl. Abb. 3.2.2-2 und Abb. 3.2.2-3). Die Isomeren der ersten Gruppe waren im Verhältnis zu denen der Gruppe 2 in den Probenextrakten schwächer vertreten als im Standard (siehe Tab. 3.2.2-1). Es lag demnach eine Diskriminierung der leichterflüchtigeren Isomeren in den Proben vor. Durch einen Vergleich der Peakmuster eines Extraktes aus einem Wieder-findungsversuch und dem Standard konnte ausgeschlossen werden, daß diese Diskriminierung während der Extraktion auftritt. Wenn man davon ausgeht, daß im verwendeten DIPN-Standard die Isomerenverteilung in etwa mit der des industriell verwendeten DIPN übereinstimmt, dann müßte diese Diskriminierung im Zeitraum von der ersten Verwendung des DIPN bis zur Analyse erfolgt sein. Dies ließe sich durch die leichtere Verflüchtigung der leichterflüchtigen Isomere der Gruppe 1 er-klären. Abb. 3.2.2-4: Massenspektrum von zwei unterschiedlichen DIPN-Isomeren

120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 2200

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

220000

m/z-->


128129

141152

155

165

197

212

120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 2200

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

110000

120000

130000

m/z-->


128129

141

152

155

165

197

212

Peak aus Gruppe 1

Peak aus Gruppe 2

Zur Ermittlung der Gehalte wurden die Peaks der jeweiligen Gruppe als Summe integriert. Bedingt durch die oben beschriebene Diskriminierung werden in Proben für



die Isomere der Gruppe 1 niedrigere Ergebnisse erzielt als für die Gruppe 2. Die Unterschiede zwischen den Ergebnissen aus Gruppe 1 und Gruppe 2 lagen zwischen 4 und 30 % (meist im Bereich zwischen 15 und 20%). Daher wurde hier stets der Mittelwert aus den beiden Werten als Ergebnis angegeben. Da es, wie beschrieben, zwischen Standard und Proben Unterschiede im DIPN-Peakmuster gibt (vgl. Abb. 3.2.2-2 und Abb. 3.2.2-3) und da die einzelnen Isomere etwas unterschiedliche Massenspektren aufweisen (siehe Abb. 3.2.2-4 und Tab. 3.2.2-1), ergeben sich bei der Bestimmung Unterschiede in den Ergebnissen bei Verwendung unterschiedlicher Quantifizierungsmassen. Um diesen Fehler möglichst klein zu halten, wurden mehr als 15 Massen, die zusammen etwa 80% der Gesamtfläche des DIPN-Signals im SCAN-Modus ausmachen, zur Quantifizierung herangezogen. Eine Quantifizierung anhand der im SCAN-Modus erhaltenen Gesamtionenstrom-Chromatogramme wurde nicht durchgeführt, um zu vermeiden, daß durch Interferenzen koeluierender Verbindungen das Ergebnis verfälscht wird.

3.2.2 .3 Ext rakt ion von Proben aus dem Handel

Verschiedene Proben wurden mit den SFE-Methoden sowie naßchemisch untersucht und die dabei erzielten Ergebnisse verglichen. Bei diesen Proben handelte es sich um Papierverpackungen, die dazu verwendet werden offene Lebensmittel vor der Abgabe an den Verbraucher zu verpacken. Diese Verpackungen waren z.T. mit einer Kunststoffolie beschichtet. In Tab. 3.2.2-2 werden die Ergebnisse dieser Untersuchungen zusammengestellt.



Tab. 3.2.2-2: Zusammenstellung der Ergebnisse der Untersuchung von Papieren und Kunststoffolien

Ermittelte Gehalte in ppm

Proben-Nr.

Destillation HPLC

HP-Extraktor GC-MSD

ISCO-Extraktor

Anmerkungen

11146

Butterbrotpapier 0,24 0,73 -

11211

Packpapier für Backwaren 1,18 0,68 -

11212 beschichtetes Papier zur Verpackung von Lebensmitteln

34,2 22,0 Σ=90* *4x extrahiert

11459

Papiertüte für Brot 22,9 22,1 22,4

11460

Papiertüte für Backwaren 1,53 - 5,2

Pappschachtel für fritierte Backwaren

0,22 2,8 0,85

Papiertüte für Backwaren 0,40 2,0 -

12170

Butterbrotpapier 0,05 0,16 -

12368

0,07 0,27

Frühstücksbeutel aus Papier und Folie

2,32 mit Folie 0,48/2,65 -

Karton für Torten 4,6 7,6 -

13049 2,72 3,4/26 mit Folie

Einwickelpapier für Käse mit PE-Folie Beschichtet

6,52 4,7/28,6 3,9/11,9 mit Folie

Papierart

GC-MSD

11883

11884

Frühstücksbeutel -

12591

12813

Einwickelpapier für Wurst mit PE-Folie beschichtet

2,0/9,8

13050

Bei der Extraktion einiger wachshaltiger Proben mit dem Extraktor HP 7680T ist es zu Verstopfungen in der Festphasenfalle und in der Leitung, die von der Fest-phasenfalle zu dem Auffanggläschen führt, gekommen. Bei Extraktionen mit dem ISCO SFX 3560 traten diese Schwierigkeiten dagegen nicht auf. Bei der Interpretation der Ergebnisse aus der Tab. 3.2.2-2 ist zu beachten, daß das DIPN innerhalb verschiedener Papierschichten sehr unterschiedlich verteilt ist. Die große Streuung der Ergebnisse ist in erster Linie sicherlich auf diese Inhomo-genitäten (z.B. Klebeflächen, bedruckte Flächen) zurückzuführen. Bei mehreren Papieren wurde eine Doppelextraktion durchgeführt. Bei fast allen Papieren war im Extrakt der zweiten Extraktion DIPN nur noch in Spuren vorhanden. Die 1. Extraktion scheint daher nahezu vollständig zu sein. Bei einem Papier allerdings (Nr. 11211, siehe Tab. 3.2.2-2), das einseitig mit einer glänzenden Schicht beschichtet war, war trotz mehrerer Extraktionen weiterhin DIPN nachweisbar.



Tab. 3.2.2-3: Ergebnisse der Mehrfachextraktion eines beschichteten Papiers

Papier Nr. 11211

dynamische Extraktionszeit (min)

5 10 15 25 1. Extraktion 63 % 69 % 73 % 75 % 2. Extraktion 19 % 13 % 13 % 13 % 3. Extraktion 8 % 8 % 8 % 6 % 4. Extraktion 6 % 6 % 6 % 6 % 5. Extraktion 4 % 4 % n.d. n.d. Summe als

100 % gesetzt 100 %

100 %

100 %

100 %

Summe

86 ppm 86 ppm 90 ppm 83 ppm

Interessant ist, daß es zu einer Anreicherung von DIPN in den mit den Papieren in Kontakt stehenden Beschichtungsfolien kommt (siehe Tab. 3.2.2-2). Da mit Folien beschichtete Papiere zur Verpackung von fettreichen Lebensmitteln (z.B. Käse, Wurst) vorgesehen sind, ist dieser Befund im Hinblick auf mögliche Migrationen für die Lebensmittelüberwachung von Bedeutung.



3.2 .3 PCP (Pentachlorphenol ) aus Holz und Text i l ien


Pentachlorphenol wurde in der Vergangenheit häufig wegen seiner fungiziden Eigenschaften als Holzschutzmittel eingesetzt. Daneben wurde und wird es als Konservierungsstoff in der Papier- und Zellstoffindustrie, in der Textilindustrie, zur Konservierung von Leder, bei der Herstellung von Farben, Klebern und Leimen etc. eingesetzt.

Aufgrund seiner Toxizität wurde PCP nach und nach durch andere Stoffe ersetzt. Zwischenzeitlich ist seine Verwendung in vielen Bereichen verboten. In Deutschland ist es nach der Chemikalienverbots-Verordnung verboten Mittel in den Verkehr zu bringen, die PCP in einer Menge von über 0,1 % enthalten. Es sind Höchstmengen für PCP festgesetzt, deren Einhaltung im Rahmen der amtlichen Lebensmittelüber-wachung zu überprüfen sind (z.B. in Leder, Holz).

3.2.3 .2 Best immung von PCP


Nach dem derzeit im CVUA Stuttgart verwendeten Verfahren wird Phentachlorphenol mit Isooctan aus dem zerkleinerten Probenmaterial (Holz, Textilien) isoliert und nach Silylierung mittels GC-MSD bestimmt. Dazu werden 5 g Probe mit 200 ml Isooctan versetzt und 2 h lang unter Rückfluß-kühlung auf der Heizplatte oder im Wasserbad extrahiert. Der abgekühlte Extrakt wird filtriert und auf etwa 2-5 ml eingeengt. Anschließend wird der Extrakt in einen 25 ml Meßkolben überführt, mit Interner Standard-Lösung (HCB) versetzt und mit Isooctan zur Marke aufgefüllt. Bei positiven Befunden wird die Bestimmung wiederholt und die Kalibrierung erfolgt nach dem Standardadditionsverfahren.

3.2.3.2.2 SFE-Methode

3.2.3.2.2.1 Probenaufarbeitung PCP ist eine recht saure Verbindung (pKs=5,8). Die Abspaltung des Protons aus der Phenolgruppe wird durch die elektronenanziehende Wirkung der 5 Chloratome im Ring erleichtert. Daher wurden zur Extraktion des PCP saure Bedingungen eingestellt (vgl. Kap. 3.1.4.7.2).



Abb. 3.2.3-1: Strukturformel von PCP

ClCl

Cl

Cl Cl

OH

Pentachlorphenol Je nach Größe und Dichte des Ausgangsmaterials werden 0,5 bis 2 g Probe in ein Becherglas eingewogen. Die Probenmatrix wird mit ca. 150 bis 200 µl 2%iger Schwefelsäure versetzt und mit Wasser befeuchtet. Die befeuchtete und angesäuerte Probe wird mit einem Adsorbens (Hydromatrix) vermengt und in die Extraktionshülsen überführt.

3.2.3.2.2.2 Extraktion mit ISCO SFX 3560 Die Extraktion wurde ausgehend von den bisherigen Erfahrungen bei folgenden Bedingungen durchgeführt: Extraktor ISCO SFX 3560 • Extraktionsdruck CO2-Druck 330 bar • Extraktionstemperatur 55 °C • Restriktortemperatur 55 °C • Flußrate (Restrikor) 1,8 ml/min • Statische Extraktionszeit 2,5 min • Dynamische Extraktionszeit 25 min • Vorlage im Auffanggefäß 5 ml Aceton-Acetonitril-Gemisch (2:1) • Temperatur der Vorlage 10 °C. Der Extrakt wird im Stickstoff-Strom vorsichtig auf etwa 1 ml eingeengt.

3.2.3.2.2.3 Derivatisierung mit PFB-Br Die Derivatisierung erfolgt im Vorlagegefäß. Dazu wird der eingeengte Extrakt mit 200 µl 25% iger Kaliumcarbonat-Lösung (Katalysator) und 200 µl 15 %iger PFB-Br-Lösung in Acetonitril versetzt. Das verschlossene Gefäß wird 3 h im Heizblock auf 65 °C erwärmt. Anschließend wird die organische Phase im Stickstoffstrom entfernt und die Derivate in 1 ml Isooctan, das den Internen Standard enthält (PCB IUPAC Nr. 101), aufgenommen. Noch vorhandenes Wasser wird mit Na2SO4 (wasserfrei) gebunden. Die organische Phase wird in ein GC-Vial überführt und zur GC-MSD-Bestimmung eingesetzt.



3.2.3.2.3 Wiederf indungen und Untersuchung PCP-halt iger Seide

Zur Ermittlung der Wiederfindungsrate wurde eine PCP-freie Probe insgesamt 3 mal mit 10 µg PCP dotiert und wie oben beschrieben aufgearbeitet. Die Wieder-findungsraten lagen zwischen 95 und 97 %. Das Extraktionsverhalten von gealterten PCP-Rückständen könnte jedoch anders sein als das von dotierten. Für weitere Untersuchungen (siehe Tab. 3.2.3-1) wurde deshalb ein Seidenpulver verwendet, das gealterte PCP-Rückstände enthielt. Diese Probe wurde im Rahmen eines Ringversuches zur Verfügung gestellt. Tab. 3.2.3-1: Untersuchungsergebnisse der PCP-haltigen Seidenprobe PCP-Gehalt (angegebener Gehalt)

30 mg/kg

naßchemisch ermittelter Gehalt

5 mg/kg

mit der SFE-Methode ermittelter Gehalt

28 mg/kg

Wiederfindung bei der SFE, Aufstockung mit 15 µg PCP

99 %

3.2.3.2.4 Optimierung der Extraktion

Folgende Parameter wurden variiert um zu überprüfen, ob die Extraktion von PCP noch verbessert werden kann: - höhere Flußrate, - höhere Extraktionstemperatur, - längere statische Extraktionszeit, - höherer Extraktionsdruck, - Durchführung einer zweiten Extraktion. Die Untersuchungen wurden mit einer Holzprobe durchgeführt, bei der nach der naßchemischen Methode ein PCP-Gehalt von 5,2 mg/kg ermittelt wurde. Tab. 3.2.3-2 zeigt die bei Anwendung verschiedener Extraktionsbedingungen ermittelten PCP-Gehalte.



Tab. 3.2.3-2: Ermittelte PCP-Ergebnisse in einer zerkleinerten Holzprobe bei Variation der Extraktionsbedingungen Extraktionsbedingungen ermittelter PCP-Gehalt (mg/kg) 1. Extraktion 2. Extraktion naßchemische Methode 4,9 5,6 5,0 n.n. n.d. SFE-Methode (wie 3.2.2.3.2.2) 4,1 4,0 0,7 SFE, Fluß 2,5 ml/min 4,1 0,81 SFE, Extraktionstemperatur 65 °C 4,1 4,0 0,65 SFE, statische Extraktionszeit 5 min 4,1 4,0 0,64 SFE, Extraktionsdruck 500 bar 4,6 4,6 0,4 SFE, Extraktionsdruck 660 bar 0,64 4,6 4,5 Wie die Ergebnisse zeigen, führt eine Erhöhung des Extraktionsdruckes von 330 auf 500 bar zu einer deutlichen Erhöhung der PCP-Ausbeuten. Eine weitere Erhöhung des Druckes auf 660 bar brachte keine Vorteile mehr. Um zu überprüfen, ob die Extraktionszeit noch verkürzt werden kann, wurde ein weiterer Versuch durchgeführt, bei den die dynamische Extraktionszeit zwischen 10 und 35 min variiert wurde. Tab. 3.2.3-3 zeigt die Ergebnisse dieses Versuchs. Tab. 3.2.3-3: PCP-Ergebnisse einer Holzprobe bei Variation der Extraktionszeit Extraktionsbedingungen 1. Extraktion 2. Extraktion naßchemische Methode 4,9 5,6 5,0 n.n. SFE-Methode (wie 3.2.2.3.2.2) 4,1 4,0 0,7 SFE*, dyn. Extraktionszeit 10 min 3,1 3,2 0,45 SFE*, dyn. Extraktionszeit 15 min 3,5 3,6 0,21 SFE*, dyn. Extraktionszeit 20 min 4,0 4,3 0,17 SFE*, dyn. Extraktionszeit 25 min 4,6 0,15

4,6 SFE*, dyn. Extraktionszeit 35 min 4,6 * Extraktionsdruck 500 bar

ermittelter PCP-Gehalt (mg/kg)

SFE*, dyn. Extraktionszeit 30 min

Nach diesen Untersuchungen sind die optimierten Extraktionsbedingungen: Extraktor ISCO SFX 3560 • Extraktionsdruck CO2-Druck 500 bar • Extraktionstemperatur 55 °C • Restriktortemperatur 55 °C • Flußrate (Restrikor) 1,8 ml/min • Statische Extraktionszeit 2,5 min • Dynamische Extraktionszeit 25 min • Vorlage im Auffanggefäß 5 ml Aceton-Acetonitril-Gemisch (2:1) • Temperatur der Vorlage 10 °C.



3.2.3 .3 Untersuchung von P lanproben

Mit der optimierten Extraktionsmethode wurden einige Planproben auf ihren Gehalt an PCP untersucht. Die Ergebnisse im Vergleich zur herkömmlichen Analysen-methode sind in Tab. 3.2.3-3 dargestellt. Tab. 3.2.3-3: PCP-Gehalte in Planproben, Extraktion mit SFE im Vergleich zum naßchemischen Verfahren Gehalt an PCP (mg/kg)

Proben-Nr. SFE-Methode Mittelwert

SFE-Methode naßchemisches

Verfahren 4191 4,6; 4,7; 4,5 4,6 4,9; 5,6; 5,0; n.n. 6280 12,7; 15,3; 15,8 14,6 2,2; 0,6; 0,7; 0,8 5057 0,22; 0,23 0,23 n.n.

Seidenpulver 30,0; 32,2; 30,7 30,9 5,0

3.2.3 .4 Faz i t

Wie Tab. 3.2.3-3 zeigt, werden mit der SFE-Extraktion zum Teil erheblich höhere Gehalte an PCP festgestellt als nach einer Extraktion mit Isooctan. Ausschlaggebend für diese deutlich verbesserte Extraktion dürften sein: • Zurückdrängung der Dissoziation des PCP durch Einstellung des pH-Wertes und • die Zugabe von Wasser als Modifier bei der SFE-Extraktion, wodurch

Wechselwirkungen zwischen dem PCP und Bestandteilen der Holzmatrix reduziert werden.

Vorteile der SFE-Extraktion sind der geringere Lösungsmittelverbrauch, der geringere Zeit- und Arbeitsaufwand und die damit verbundenen geringeren Kosten [116].



3.2 .4 Extrakt ion von Ant iox idant ien aus Kunststof f


Die einzelnen Kunststoffe weisen unterschiedlich günstige physikalische und chemische Eigenschaften auf. Sie haben in der Regel für sich allein nicht die hinsichtlich Verarbeitung, Gebrauch und Stabilität benötigten Eigenschaften, sondern sind oft spröde, lichtempfindlich, wärmeunbeständig, hydrolyseanfällig, gas- oder wasserdampfdurchlässig. Durch Zugabe weiterer Stoffe, sog. Additiven und Verarbeitungshilfsstoffen, werden die gewünschten eigenschaften eingestellt. Typische Zusatz- und Hilfsstoffe sind: Weichmacher, Stabilisatoren, Gleitmittel, Füllstoffe, Antistatika u.a.. Wärme, energiereiche Lichtstrahlung (UV), Luftsauerstoff sowie Feuchtigkeit schädigen polymere Werkstoffe derart, daß ein Kettenabbau stattfindet, wodurch sich die mechanischen Eigenschaften der Kunststoffe verschlechtern. Ein Zusatz von Stabilisatoren (Antioxidantien und UV-Stabilisatoren) erhöht die Lebensdauer von Kunststoffen. Antioxidantien werden zum Schutz gegen thermische Alterungserscheinungen sowie gegen Oxidationen eingesetzt. Beispiele für diese Additive sind sterisch gehinderte Phenole, Thioether und Organophosphite [128].

3.2.4 .2 Best immung von Ant iox idant ien


Die Antioxidatien werden aus Polyolefinen isoliert und mit HPLC-DAD oder densitometrisch bestimmt. Dazu werden 5 g zerkleinertes Kunststoffmaterial mit 75 ml Toluol versetzt unter Rückflußkühlung erwärmt. Dabei löst sich das Polyolefin auf. Zur Fällung des Polymer gibt man in die noch heiße Lösung ca. 150 ml Ethanol. Die abgekühlte Lösung wird über ein Faltenfilter filtriert und der Niederschlag mit Ethanol gewaschen. Das Filtrat wird am Rotationsverdampfer auf ca. 5 ml eingeengt, dabei fällt noch etwas Polymer aus. Nach erneutem Filtrieren, Nachwaschen und Einengen wird der Extrakt mit Ethanol auf 10 ml aufgefüllt und zur HPLC oder Densitometrie eingesetzt.

3.2.4.2.2 SFE-Methode

3.2.4.2.2.1 Probeneinbringung in die SFE-Hülse Der zerkleinerte Kunststoff wird direkt in eine Extraktionshülse eingewogen.



3.2.4.2.2.2 Extraktion mit ISCO SFX 3560 Die Extraktion wurde bei folgenden Bedingungen durchgeführt: Extraktor ISCO SFX 3560 • Extraktionsdruck CO2-Druck 440 bar • Extraktionstemperatur 120 °C • Restriktortemperatur 50 °C • Flußrate (Restrikor) 1,5 ml/min • Statische Extraktionszeit 5 min • Dynamische Extraktionszeit 30 min • Vorlage im Auffanggefäß 5 ml Acetonitril • Temperatur der Vorlage 10 °C. Die Bestimmung der Antioxidantien erfolgt direkt aus dem erhaltenen Extrakt mittels HPLC-DAD.

3.2.4.2.3 Untersuchung von Proben mit bekannter Rezeptur

Da durch Dotierung von Kunststoffen im Labor die natürlichen Verhältnisse von Proben praktisch nicht simulierbar sind, machen Wiederfindungsversuche meist wenig Sinn. Zur Entwicklung und Validierung von Methoden sollte deshalb Proben-material zur Verfügung stehen dessen Rezeptur bekannt ist. Antioxidantien werden jedoch dazu eingesetzt, Oxidationen am Polymer zu verhindern, sie werden dabei selbst oxidiert und damit verbraucht. Dies bedeutet, daß die in der Rezeptur angegebene Menge an Antioxidantien im Endprodukt bereits nicht mehr vorhanden zu sein braucht. Zur Bewertung der SFE-Methode wurden 6 Proben mit bekanntem Gehalt an drei Antioxidantien untersucht. Die Ergebnisse werden mit denen der bisher gebräuch-lichen naßchemischen Methode verglichen.

3.2.4.2.3.1 untersuchte Antioxidantien In Tab. 3.2.4-1 sind die Antioxidantien aufgeführt, die in den zur Verfügung stehenden Proben mit bekannter Rezeptur verwendet wurden.



Tab. 3.2.4-1: untersuchte Antioxidantien Abkürzung Chemische Bezeichnung Summen-

formel Molekulargewicht

Handels-bezeichnung

A1

Tetrakis (methylen(3,5-di-tert.-butyl-4-hydroxycinamat)-methan

C73H100O1

2 1168 Irganox 1010

A2

n-Octadecyl-ß-(4’-hydroxy-3,5 di-tert.-butylphenyl)-propionat

C35H56O4 530 Irganox 1076

Tris-(2,4-di-tert.-butylphenyl)-phosphit

C42H63O3P 647 Irgafos 168 A3

Im folgenden werden die Abkürzungen A1, A2 und A3 verwendet.

In Tab. 3.2.5-2 sind die zur Verfügung gestandenen Proben und deren Rezeptur-angaben bezüglich A1, A2 und A3 aufgeführt.

3.2.4.2.3.2 Probenmaterial

Tab. 3.2.4-2: untersuchtes Probenmaterial Bezeichnung Abkürzung Gehalt an Antioxidanz (mg/100g)

nach Rezeptur A1 A2 A3 Schale, klein Probe 1 36 - 72 Schale, groß Probe 2 4,5 - 14

Probe 3 65 - 180 Daplen Str. 150 RC Probe 4 16 18 35 Attane SC 4103 Probe 5 - 63 120 Amaco PP 100-GA02 Probe 6 30 - 112

Polybatch PAO 1490

3.2.4.2.3.3 Untersuchungsergebnisse Die zur Verfügung gestandenen Proben 1-6 mit bekanntem Gehalt an Antioxidantien wurden mittels SFE extrahiert und z.T. auch mit der naßchemischen Methode aufge-arbeitet. In der folgenden Tab. 3.2.3-3 werden die erzielten Untersuchungs-ergebnisse aufgeführt.



Tab. 3.2.4-3: Untersuchungsergebnisse Probe Gehalt an A1

(mg/100g) Gehalt an A2

(mg/100g) Gehalt an A3

(mg/100g) SFE naßchem. SFE naßchem. SFE naßchem.Probe 1 12,7 12,4 - - 34,4 23 Probe 2 1,55 - - - 5,4 - Probe 3 22,5 n.d. - n.d. 88,5 n.d. Probe 4 7,85 n.d. 6,75 n.d. 12 n.d. Probe 5 - n.d. 20,9 n.d. 59,5 n.d. Probe 6 14,8 n.d. - n.d. 58,1 n.d. Anmerkung: n.d.: nicht durchgeführt

3.2.4.2.3.4 Variation der SFE-Parameter Folgende Parameter wurden variiert um zu überprüfen, ob die Extraktion von Antioxidantien noch verbessert werden kann: - höhere Flußrate, - höhere Restriktortemperatur, - höherer Extraktionsdruck. Die restlichen Parameter der Extraktionsmethode wurden gleich belassen. Die Untersuchungen wurden mit Probe Nr. 4 durchgeführt. Die folgende Tab. 3.2.3-4 zeigt die Ergebnisse bei verschiedenen Extraktions-bedingungen. Tab. 3.2.4-4: SFE-Ergebnisse bei Variation der Extraktionsbedingungen, Probe 4 ermittelter Antioxidantien-Gehalt

(mg/100g) A1 A2 SFE-Methode (wie 3.2.5.3.2.2) 15,0 8,9 SFE, Fluß 2,5 ml/min 14,6 10,0 SFE, Restriktortemperatur 60 °C 15,1 11,1 SFE, Extraktionsdruck 550 bar

Extraktionsbedingungen

18,4 11,0 Die Bestimmung von A3 bereitete aufgrund von Zersetzungen Probleme. Eine Quantifizierung wurde deshalb nicht vorgenommen. Aus Tab. 3.2.4-4 wird ersichtlich daß durch Erhöhung des Extraktionsdruckes auf 550 bar die Extraktionsausbeuten von A1 am deutlichsten gesteigert werden können, während A2 schon bei milderen Bedingungen gut extrahiert werden kann.

3.2.4 .2 .4 Faz i t

Aus den erzielten Ergebnissen der oben beschriebenen, zur Orientierung dienenden Untersuchungen, können folgende Folgerungen gezogen werden. Die SFE ist für die



Extraktion von Antioxidantien aus Kunststoffen prinzipiell gut geeignet. Die Verwendung hoher Drucke begünstigt die Extraktion. Da mit dem Gerät der Fa. HP Drucke bis maximal 350 bar erreichbar sind, scheint der Extraktor der Fa. ISCO für diesen Aufgabenbereich geeigneter zu sein. Bezüglich Extraktion und Probenzerkleinerung sind noch weitere Untersuchungen erforderlich.



4. SCHLUßFOLGERUNGEN

4.1 BEWERTUNG DER SFE ALS EXTRAKTIONSVERFAHREN

Die bisherigen Untersuchungen und Ergebnisse haben gezeigt, daß die SFE ein Extraktionsverfahren ist, das für verschiedene Aufgaben im Bereich der Lebensmittel-überwachung erfolgreich eingesetzt werden kann. Pestizidrückstandsanalytik: Im Bereich der Pestizidrückstandsanalytik hat sich die SFE als eine sehr gute Alternative zu vielen gängigen naßchemischen Extraktionsmethoden erwiesen. Vorteilhaft bei der SFE sind neben dem geringeren Lösungsmittelverbrauch, der geringere Arbeitsaufwand und der hohe Probendurchsatz. Dadurch sind SFE-Methoden in der Regel wesentlich kostengünstiger als entsprechende naßchemische Verfahren. Mit der hier vorgestellten SFE-Multimethode werden bei einem geringen Arbeitsaufwand Ergebnisse erzielt, die mit denen herkömmlicher Multimethoden vergleichbar sind. Vorteilhaft bei der SFE-Methode ist vor allem die Tatsache, daß die SFE-Extrakte in der Regel so rein sind, daß ein aufwendiges Clean-up entfällt. Für zahlreiche Pestizide wurden Wiederfindungsversuche durchgeführt und bei niedrigen Schwankungen gute Wiederfindungen erzielt. Physikalische begründet sind die Limitationen der SFE bei der Extraktion polarer Analyten. Hier ist die SFE nur bedingt einsetzbar. (z.B. zur Extraktion von sauren oder basischen Verbindungen nach einer pH-Wert Einstellung). Diese Problematik stellt sich allerdings auch bei vergleichbaren naßchemischen Verfahren. Als besonders interessant hat sich die Kombination SFE-Extraktion und GC/MSD-Bestimmung erwiesen. Bei bestimmten Applikationen (saure und basische Pestizide und thermolabile Verbindungen wie N-Methylcarbamate und Organozinn-Pestizide) bietet sich darüber hinaus die LC-MSD als Bestimmungsverfahren an. Bedarfsgegenständeanalytik Die durchgeführten Untersuchungen (z.B. PCP aus Holz, Di-Isopropyl-Naphthalin aus Papier, Antioxidantien aus Kunststoff) haben gezeigt, daß die SFE prinzipiell vielfältig im Bereich der Bedarfsgegenständeanalytik eingesetzt werden kann.



4.2 BEWERTUNG DER VERWENDETEN EXTRAKTIONSGERÄTE

SFE-7680T der Fa. Hewlett-Packard: Das Gerät ist vom Funktionsprinzip her variabel und bietet dem Anwender gute Möglichkeiten, Extraktionsmethoden zu entwickeln und zu optimieren. Die Hand-habung ist sehr einfach und komfortabel. Druck- und Temperaturbereiche scheinen ausreichend für Anwendungen in der Pestizidanalytik. Das Gerät bietet zudem einen Clean-up-Schritt, der der Extraktion nachgeschaltet ist (fraktionierte Elution aus der Festphasenfalle). Das Geräte weist jedoch auch einige Mängel auf: Bei den relativ häufig auftretenden Undichtigkeiten, wird die Sequenz abgebrochen, Kühlung der Falle und Heizung der Extraktionskammer werden dabei allerdings nicht abgeschaltet. Dadurch wird unnötig Kühl-COin der Sequenz verbleiben u.U. für längere Zeit bei Raumtemperatur und werden dadurch meist unbrauchbar. Besser wäre es, wenn nach einer gewissen Zeit die fehlerhafte, undichte Probe übersprungen und die Sequenz fortgeführt würde.

Das Volumen der Extraktionshülse ist auf 7 ml begrenzt, wodurch auch die einsetzbare Probenmenge limitiert wird. Zwar reicht die Einwaage für viele An-wendungen aus, bei einigen Anwendungen wäre jedoch eine größere Probenmenge günstiger.

2 verbraucht. Die nachfolgenden Proben

Die Kühlung ist vom Prinzip her umständlich (häufiger Wechsel der Gasflasche nötig), laut und relativ teuer.

SFX 3560 der Fa. ISCO:

Bei dem Gerät der Fa. ISCO werden die Extrakte nicht an einer Festphasenfalle aufgefangen sondern in eine Lösungsmittelvorlage eingeleitet. Vorteilhaft gegenüber dem Gerät der Fa. HP ist die Tatsache, daß bei diesem Gerät wesentlich höhere Drucke eingesetzt werden können. Höhere Drucke in Kombination mit höheren Temperaturen sind z.B. im Bereich der Bedarfsgegenständeanalytik erforderlich. Darüber hinaus bietet sich die Möglichkeit durch eine zweite Förderpumpe dem überkritischen Kohlendioxid andere Lösungsmittel in beliebigem Verhältnis zuzumischen oder auch Extraktionen mit einem herkömmlichen Lösungsmittel durchzuführen (Accelerated Solvent Extraktion). Die Kapazität der Extraktionshülsen ist mit 10 ml größer als bei dem HP-Gerät, so daß größere Probenmengen eingesetzt werden können. Bei dem Gerät der Fa. ISCO traten insgesamt weniger Undichtigkeiten auf als beim Gerät der Fa. HP. Dies ist darauf zurückzuführen, daß die Extraktionshülsen sich während der Extraktion in einer unter Druck stehenden Extraktionskammer befinden (Druckausgleich). Dafür sind mehrmals Probleme mechanischer Art aufgetreten, die jedoch problemlos repariert werden konnten. Nachteilig bei diesem Gerät ist, daß Unregelmäßigkeiten im Fluß zu Verlusten von Analyten in der Falle durch Verflüchtigung führen können. Im Vergleich zu dem Extraktor der Fa. HP ist die Bedienung etwas unbequemer.



4.3 ALLGEMEINE ANALYTISCHE ERKENNTNISSE

Matrixeffekte Bei der Optimierung der gaschromatographischen Bestimmung von Pestiziden wurde festgestellt, daß Matrixbestandteile im Probenextrakt einen großen Einfluß auf die Bestimmung verschiedener Substanzen haben. Diese Matrixbestandteile wirken bei der Gaschromatographie „schützend“ auf Pestizide, indem sie aktive Stellen im Injektionssystem besetzen. Dadurch werden Wechselwirkungen der Pestizide mit den Oberflächen des Injektionssystems verringert. Eine Bestimmung von Pestiziden unter Verwendung von Kalibrierlösungen in reinem Lösungsmittel führt für einige Verbindungen zu falschen, überhöhten Werten. Um dies zu verhindern, ist die Erstellung von „Eichungen auf Matrix“ unerläßlich. Zerkleinerung (Homogenität) Aufgrund der geringen Probenmenge die für SFE-Extraktionen eingesetzt wird, ist eine gute Homogenität der zerkleinerten Proben erforderlich. Nur so können Ergebnisse erzielt werden, die für die Gesamtprobe repräsentativ sind. Bei Obst- und Gemüseproben ist dies durch eine Zerkleinerung in gefrorenem Zustand möglich. Im Bereich der Bedarfsgegenstände ist ebenfalls eine Feinzerkleinerung der Proben erforderlich, die jedoch erfahrungsgemäß größere Schwierigkeiten bereitet. 4.4 AUSBLICK

Ein verstärkter Einsatz der SFE in Pestizidrückstandslaboratorien würde viele Vorteile mit sich bringen. Mit Hilfe der SFE kann nicht nur der Probendurchsatz erheblich gesteigert werden, sondern auch durch die Automatisierung der Probenaufarbeitung die Vergleichbarkeit innerhalb der Laboratorien verbessert werden. Die Entwicklung von weiteren matrixbezogenen Multimethoden wäre vorteilhaft. Hierbei werden Stoffe, die in den jeweiligen Matrizes zu erwarten sind, gezielt erfaßt und zudem ggf. Eigenheiten der betreffenden Matrizes (z.B. pH-Wert, Wasser-, Fettgehalt) berücksichtigt. Für Pestizide, die sich zwar mittels SFE gut extrahieren lassen, jedoch Probleme bei der Gaschromatographie bereiten, wäre der Einsatz der LC/MSD als Bestimmungs-verfahren sehr interessant (z.B. Uronsäurederivate). Für die Erfassung von polareren Verbindungen ist der Einsatz der beschleunigten Lösungsmittelextraktion (ASE), die ebenfalls ein automatisiertes Extraktionsverfahren ist, denkbar. Im Bereich der Bedarfsgegenständeanalytik wurden zwar bisher nur wenige Applikationen entwickelt. Es ist zu erwarten, daß die SFE für viele weitere Applikationen erfolgreich eingesetzt werden könnte. In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, daß das Verfahren auch für die Analytik von migrierten Stoffen in Lebensmitteln geeignet ist.



Die Problematik der Zerkleinerung von verschiedenen Bedarfsgegenständen konnte, mangels apparativer Ausstattung, nicht näher verfolgt werden. Ein ausreichender Zerkleinerungsgrad der Proben ist sowohl unter dem Aspekt der Homogenität als auch der Extrahierbarkeit als günstig zu bewerten.



5. ABKÜRZUNGEN

2,4-D : 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-essigsäure

a Wasseraktivität

BBU : (1-(2-Benzimidazoyl)-3-n-Butylharnstoff)

DDT : 1,1,1-Trichlo-2,2-bis(4-chlorphenyl)ethan

EC : electron capture

2,4-DB : 2,4-Dichlorphenoxybuttersäure

2,4-DP : 2,4-Dichlorphenoxypropionsäure

2,4,5-T : 2-(2,4,5-Trichlorphenoxy)-essigsäure

2,4,5-TP : 2,4,5-Trichlorphenoxypropionsäure

w :

AAS : Atom-Adsorptions-Spektroskopie

API : atmospheric pressure interface

BBA : Biologische Bundesanstalt

BG : Bestimmungsgrenze

BMG : Bundesministerium für Gesundheit

CH : Cyclohexan

CID : collision induced dissociation

CO2 : Kohlendioxid

CVUA : Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt

DAD : Dioden-Array-Detektor

DCIP : Dichlorisopropanol

DFG : Deutsche Forschungsgemeinschaft

DINP : Di-Isopropyl-Naphthalin

DMF : Dimethylformamid

EA : Ethylacetat

ECD : Elektroneneinfangdetektor

EDTA : Ethylen-diamin-tetra-essigsäure

EPC : electronic pressure control

FP : flammenphotometrisch

GC : Gaschromatographie

DDE : 1,1-Dichlor-2,2-bis(4-chlorphenyl)ethylen



GPC : Gelpermeationschromatographie

h : Stunde

HCB : Hexachlorbenzol

HEX : Hexan

HM : Höchstmenge

LC : liquid chromatography

PAK : polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe

HMZ : Halbwertszeit

HP : Hewlett-Packard

HPLC : high pressure liquid chromatography

Hymx : Hydromatrix

ICP : induktiv gekoppeltes Plasma

ISTD : interner Standard

IUPAC : International Union of Pure and Applied Chemistry

IO : Isooctan

KAS : Kaltaufgabesystem

LMBG : Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz

M : Molekulargewicht

MCPA : 2-(4-Chlor-2-methylphenoxy) essigsäure

MCPB : 2-(4-Chlor-2-methylphenoxy) buttersäure

MCPP : 2-(4-Chlor-2-methylphenoxy) propionsäure

MS : Massenspektrometrie

MSD : massenselektiver Detektor

m/z : Masse/Ladung

n.d. : nicht durchgeführt

NG : Nachweisgrenze

NMC : M-Methyl-Carbamate

NP : Stickstoff-Phosphor

ODS : Octadecylsilan

P : Druck

Pc : kritischer Druck

PCB : polychlorierte Biphenyle

PCP : Pentachlorphenol

PE : Polyethylen



PFB : Pentafluorbenzyl

PFB-Br : Pentafluorbenzylbromid

Po/w : Verteilungskoeffizient n-Octanol/Wasser

pKb : Basenkonstante

ppm : parts per million

RHmV : Rückstands-Höchstmengenverordnung

pKs : Säurekonstante

PVC : Polyvinylchlorid

RP : reversed phase

RT : Raumtemperatur

SCAN : scanning modus, Aufzeichnung aller Massen

s : Sekunde

Sdp. : Siedepunkt

SFC : supercritical fluid chromatography

SFE : supercritical fluid extraction

SIM : selected ion monitoring

STB : (3-Butyl-2,4-Dioxo[1,2-a]-s-Triazinobenzimidazol)

T : Temperatur

t0,5 : Halbwertszeit

TBME : tert.-Butyl-Metyl-Ether

Tc : kritische Temperatur

TCE : 2,2,2-Trichlorethanol

TEPP : Tetraethylpyrophosphat

TIC : Totalionenstrom-Chromatogramm, total ion chromatogram

UV : Ultraviolett

VO : Verordnung

XSE : Accelerated Solvent Extraction



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